KHẢO sát các điều KIỆN bảo QUẢN và lưu TRỮ OLIGONUCLEOTIDE (PRIMER) sản XUẤT tại CÔNG TY SINH hóa PHÙ SA ỨNG DỤNG TRONG kĩ THUẬT PCR

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN BẢO QUẢN
VÀ LƯU TRỮ OLIGONUCLEOTIDE
(PRIMER) SẢN XUẤT TẠI
CÔNG TY SINH HÓA PHÙ SA,
ỨNG DỤNG TRONG KĨ THUẬT PCR
Người hướng dẫn: TS. NGUYỄN HỮU THANH
Người thực hiện: NGUYỄN DUY PHƯƠNG
Lớp
Khoá

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2019

: 14060302
: 2014 - 2019


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian thực hiện khóa luận, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của tất
cả mọi người.
Lời đầu tiên tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến bộ môn Công Nghệ Sinh Học,
khoa Khoa Học Ứng Dụng đã tạo điều kiện cho tôi được thực hiện đề tài này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị nhân viên của công ty TNHH MTV Sinh
hóa Phù Sa và các anh chị trong ban quản lý phòng thí nghiệm đã tận tình chỉ bảo, giúp
đỡ và tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi thực hiện đồ án tốt nghiệp này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành nhất đến thầy Nguyễn Hữu Thanh

và chị Huỳnh Thị Hồng Phượng đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy, động viên và giúp đỡ
tôi trong suốt quá trình tiến hành làm đề tài và hoàn thành bài báo cáo một cách tốt
nhất.
Đồng thời tôi cũng xin cảm ơn các bạn cùng khóa (2014 – 2019) đã luôn đồng hành,
giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài này.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến những người thân yêu trong gia đình tôi, những
người luôn quan tâm, theo dõi, động viên và giúp đỡ tôi trong những khi tôi cảm thấy
mệt mỏi và chán nản. Họ chính là nguồn động lực giúp tôi hoàn thành khóa luận này.
Xin chân thành cảm ơn.
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Duy Phương


CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH
TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự hướng
dẫn khoa học của TS. Nguyễn Hữu Thanh;. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề
tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây. Những số
liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác
giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo.
Ngoài ra, trong luận văn còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu
của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc.
Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm
về nội dung luận văn của mình. Trường Đại học Tôn Đức Thắng không liên quan đến
những vi phạm tác quyền, bản quyền do tôi gây ra trong quá trình thực hiện (nếu có).
TP. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 01 năm 2019
Tác giả

Nguyễn Duy Phương

TÓM TẮT
Với mục đích kiểm tra chất lượng của Oligonucleotide (Primer) trong kỹ thuật PCR
sau một thời gian sử dụng và đưa ra được khoảng điều kiện bảo quản khác nhau nhằm
đảm bảo giữ được chất lượng tốt nhất nên đề tài “Khảo sát các điều kiện bảo quản và
lưu trữ Oligonucleotide (Primer) sản xuất tại công ty Sinh Hóa Phù Sa, ứng dụng
trong kĩ thuật PCR” được khảo sát ở 3 điều kiện với hàm lượng phần trăm GC 32%
(GC thấp), GC 50% (GC trung bình), GC 68% (GC cao): Khảo sát điều kiện nhiệt độ
ảnh hưởng đến chất lượng Oligonucleotide (Nhiệt độ môi trường, nhiệt độ 4 oC, nhiệt
độ -20 oC; Khảo sát điều kiện pH ảnh hưởng đến chất lượng Oligonucleotide (pH=5,
pH=7, pH=9) so với điều kiện bảo quản thông thường trong TE 1X (pH=8.5) . Ba cặp
mồi GCF/R với trình tự:
GC32.Fw: AAAATCTGACTTTAGCACTAGATTC
GC32.Rw: TCAAACGAAACATTGTTACTGATGA
GC50.Fw: GCGAGCTTACTCATCACCAATCTG
GC50.Rw: GCTAACAGGACATTGCTACGTGAG
GC68.Fw: GGCGAGCTGACCCAGCACCCGATCT
GC68.Rv: GCTAGCAGGACGGTGCGCAGTGAGC
Cặp mồi GC32F/R có nhiệt độ gắn mồi thích hợp là 54,2 0C, cặp mồi GC50F/R có
nhiệt độ gắn mồi thích hợp là 60,2 0C, cặp mồi GC68F/R có nhiệt độ gắn mồi thích
hợp là 69 0C. Ba cặp mồi với chu kỳ nhiệt là Biến tính ban đầu: 95 0C trong 2 phút.
Khuếch đại 35 chu kỳ gồm các bước: Biến tính ở 95 0C trong 30 giây; Gắn mồi ở nhiệt
độ phù hợp với GC32F/R, GC50F/R, GC68F/R trong 30 giây; Kéo dài ở 72 0C trong
45 giây. Kéo dài cuối cùng ở 72 0C trong 5 phút. Ủ bảo quản ở 25 0C trong 2 phút. Ba
cặp mồi GCF/R phát hiện mẫu DNA với kích thước 550 bp đã được dòng hóa vào
Plasmid PUC19 (kích thước 2686bp).


MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC HÌNH ẢNH
DANH MỤC BẢNG


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
STT
cs.
PCR
qPCR
DNA
EDTA
TAE
TNHH MTV
TE
GC32.Fw/Rv
GC50.Fw/Rv
GC68.Fw/Rv
Tm
Taq
kb
bp
ng/µL
Bi.H2O
t0

Số thứ tự
Cộng sự
Polymerase Chain Reaction
Real-time Polymerase Chain Reaction

Deoxyribonucleotic Acid
Ethylenediaminetetraacetic acid
Tris – acetate - EDTA
Trách nhiệm hữu hạn một thành viên
“TE” có nguồn gốc từ các thành phần của nó: Tris, EDTA
và một phân tử Mg2+
Primer có Hàm
Forward/Reverse
Melting temperature
Thermus aquaticus
Kilobase
Base pair
Nano gam/micro Lit
Nước khử ion
Nhiệt độ

lượng

GC

32%,

50%,

68%


DANH MỤC HÌNH ẢNH
..................................................................................................................................... 35
Hình phụ lục 1e, 1f, 1g, 1h.........................................................................................36

Hình phụ lục 1i, 1j, 1k, 2a..........................................................................................37
Hình phụ lục 2b, 2c, 2d, 2e........................................................................................38
Hình phụ lục 2f, 2g, 2h, 2i..........................................................................................39
Hình phụ lục 2j, 2k, 3a, 3b........................................................................................40
Hình phụ lục 3c, 3d, 3e, 3f.........................................................................................41
Hình phụ lục 3g, 3h, 3i, 3j..........................................................................................42
Hình phụ lục 3k..........................................................................................................43


DANH MỤC BẢNG

CHƯƠNG 1
GIỚI THIỆU
1.1 Tính cấp thiết của đề tài
Năm 1953, James Watson và Francis Crick đã mô tả được cấu trúc sợi đôi DNA
[9] và đạt giải Nobel năm 1962 [3]. Hai ông đã mở ra một kỷ nguyên mới cho các nhà
Khoa học sau này tìm hiểu và nghiên cứu kỹ hơn về trình tự DNA của Người cũng như
của các loại sinh vật khác. Sự công nhận của James Watson và Francis Crick đã chỉ ra
rằng các chuỗi acid nucleic chiếm phần lớn kiểm soát chức năng các phân tử sinh học
dẫn đến một cuộc cách mạng trong sinh học phân tử.
Ngày nay, nhiều kỹ thuật sinh học phân tử được biết đến như: lai tạo gen, PCR,
Real-time PCR (qPCR),… đều sử dụng Oligonucleotide làm đầu dò phân tử, hoặc
đoạn mồi (Primer) được sử dụng trong PCR, qPCR nhằm khuếch đại một đoạn gen
mong muốn. Nhắc đến PCR không thể thiếu Oligonucleotide (Primer), chính vì thế
chúng có vai trò rất lớn trong kỹ thuật sinh học phân tử và chúng thường được tổng
hợp bằng phương pháp hóa học. Việc áp dụng các Oligo tổng hợp và các trình tự tương
tự của chúng đã được chú trọng phát triển do những tiến bộ gần đây trong tổng hợp
hóa học Oligo. [10]
Qua nhiều thập kỷ nghiên cứu tổng hợp hóa học Oligo trên thế giới và đã nghiên
cứu chế tạo thành công máy tổng hợp hóa học Oligo tự động [16], hiện nay Công ty

Sinh Hóa Phù Sa đã nghiên cứu và phát triển thành công chất mang rắn HIGH
PERFORMANCE Frit nhằm tối ưu hóa thời gian và gia tăng chất lượng Oligo.


Bên cạnh việc ứng dụng oligo trong các kỹ thuật sinh học phân tử đặc biệt trong
kỹ thuật PCR, vậy làm cách nào để duy trì chất lượng và sử dụng Oligo một cách tốt
nhất trong khoảng thời gian nhất định? Với đề tài “Khảo sát các điều kiện bảo quản và
lưu trữ Oligonucleotide (Primer) sản xuất tại công ty Sinh Hóa Phù Sa, ứng dụng trong
kĩ thuật PCR” được thực hiện với mục đích đưa ra các điều kiện bảo quản tối ưu
Primer và cung cấp cho khách hàng thông tin sử dụng và bảo quản thích hợp để có thể
sử dụng chúng với chất lượng tốt nhất, và làm tiền đề cho các hướng nghiên cứu tiếp
theo.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Khảo sát các điều kiện bảo quản khác nhau ảnh hưởng đến chất lượng Oligo và
được kiểm tra, so sánh kết quả bằng phương pháp PCR
1.3 Đối tượng nghiện cứu
Các đoạn Primer có hàm lượng GC khác nhau, DNA được tổng hợp bởi công ty
Sinh Hóa Phù Sa
1.4 Nội dung nghiên cứu
Các đoạn Oligonucleotide ban đầu được khảo sát có hàm lượng GC khác nhau
• Khảo sát điều kiện nhiệt độ ảnh hưởng đến chất lượng Oligonucleotide
• Khảo sát điều kiện pH ảnh hưởng đến chất lượng Oligonucleotide


CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
2.1 Giới thiệu vấn đề nghiên cứu
2.1.1 Tình hình nghiên cứu trong nước
Nước ta chưa có công trình nghiên cứu nào về đề tài liên quan đến bảo quản
Oligonucleotide (Primer). Tuy nhiên, hiện nay có một vài công ty đã phát triển được

công nghệ tổng hợp Oligo dựa trên các thành tựu khoa học nước ngoài như Công ty
Sinh Hóa Phù Sa nhưng họ chỉ dừng lại ở mức so sánh và đựa ra dự đoán cách thức
bảo quản cũng như thời gian dự trữ, chưa có hướng nghiên cứu chi tiết, vì thế họ đã
đưa ra cách bảo quản Oligonucleotide (Primer) dạng khô hoặc dạng ướt trong dung
dịch TE 1X (pH = 8.5) ở nhiệt độ từ -10 0C đến 4 0C và có thể sử dụng trong vòng 6
tháng kể từ ngày sản xuất. [11]. Kế đó là công Công ty Primer Diagnosis Healthcare
(PDH) BIO khuyến cáo nên bảo quản ở -20 0C dạng ướt (trong nước không chứa
enzyme phân giải Nucleic, trong dung dịch TE), khi đó sẽ lưu trữ được trong 18 tháng,
ở 4 0C lưu trữ được 9 tháng (trừ bảo quản trong nước không chứa enzyme phân giải
Nucleic), nhiệt độ môi trường lưu trữ được 2 tháng. [12]
2.1.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Trên thế giới hiện nay có rất ít nghiên cứu liên quan đến phương pháp bảo quản
cũng như điều kiện lưu trữ Oligo. Nhưng trước đó dựa theo hướng nghiên cứu bảo
quản DNA và được kiểm tra bằng phương pháp real-time PCR, với đề tài “Tác động
của phương pháp lưu trữ lâu dài đến sự ổn định của DNA chuẩn đối với Acid nucleic”
(Barbara Roder, Karin Fruhwirth, Claus Vogl, Martin Wagner, và Peter Rossmanith
năm 2010) với DNA chuẩn trích ly từ vi khuẩn Listeria monocytogenes được lưu trữ
và được khảo sát trong 100 ngày với nồng độ DNA là 10 5 copies và được lưu trữ trong
dung dịch glycerol-nước và dung dịch 50 % glycerol trong buffer 1X (20 mM TrisHCl, pH 8.4, 50 mM KCl,), với 2 mức nhiệt độ là 4 oC và -20 oC. Kết quả nghiên cứu


cho thấy DNA vi khuẩn được lưu trữ ở -20 oC và được lưu trữ trong dung dịch
glycerol-nước giảm chất lượng chỉ 1.3 lần so với ban đầu. Còn ở nhiệt độ 4 oC trong
dung dịch glycerol-buffer giảm chất lượng 7 lần so với ban đầu. [4]
Công ty Integrated DNA Technologies (IDT) được xem là công ty lớn về tổng
hợp Oligonucleotide đã nghiên cứu và chỉ ra cách bảo quản Oligo dạng ướt trong dung
dịch TE pH 8.0, hoặc trong nước không chứa enzyme phân giải Nucleic (Nuclease-free
water), hoặc dạng khô ở các nhiệt độ -20 0C, 4 0C, 37 0C. Khi lưu trữ trong -20 0C ở cả
ba dạng được 24 tháng, ở 4 0C được 60 tuần, ở 37 0C trong dung dịch TE pH 8.0 được
150 tuần, trong dạng khô được 42 tuần, trong nước không chứa enzyme phân giải

Nucleic được 6 tuần. [15]. Kế đó là Công ty Bio SYNTHESIS hướng dẫn cách bảo
quản Oligonucleotide để tránh trường hợp lặp lại nhiều lần chu kỳ đóng băng
Oligonucleotide, vì vậy nên chia nhỏ lượng Oligonucleotide ra làm nhiều phần sử
dụng trong khoảng 1-2 lần chu kỳ đóng băng, sau đó lưu trữ trong dung dịch ở nhiệt
độ -20 oC sẽ được 1-6 tháng, ở nhiệt độ môi trường được 1-7 ngày. Đối với Oligo lưu
trữ dạng đông khô ở nhiệt độ -20 oC sẽ được 6 tháng đến 2 năm, ở nhiệt độ môi trường
được 2 tháng đến 1 năm. [14]
2.2 Lược khảo về vấn đề nghiên cứu
2.2.1 Oligonucleotide
Theo báo cáo của công ty Twist Bioscience tại San Francisco cho biết sau khi
James Watson và Francis Crick đã mô tả thành công sợi đôi DNA, đến năm 1955
Michelson và Todd lần đầu tiên đã tổng hợp thành công dinucleotide TpT và cũng là
nguồn gốc tạo ra thuật ngữ Oligonucleotide. [13]
Oligonucleotide hay gọi tắt là Oligos là những đoạn DNA/RNA ngắn và chúng
được tạo thành bởi sự liên kết của nhiều phân tử nucleotide. Chúng được tổng hợp
bằng phương pháp hóa học trong phòng thí nghiệm và chúng là nền tảng cho sự phát
triển trong sinh học phân tử, sinh học tổng hợp và công nghệ sinh học.


Oligonucleotide thuộc một loại deoxynucleotide luôn đóng một vai trò quan trọng
trong sinh học phân tử hiện nay. Oligos được ứng dụng vào nhiều mục đích khác nhau
như PCR, qPCR, sàng lọc gen, chuẩn đoán bệnh, giải trình tự,… [17] và có lẽ phương
pháp PCR là phương pháp phổ biến nhất hiện nay với các mục đích nhằm khuếch đại,
nhân bản, phát hiện đột biến,… các đoạn gen.
Các Oligonucleotide thường được thiết kế và tổng hợp từ 13-25 nuclotide, chúng
được sử dụng làm đầu dò để phát hiện các trình tự gen cụ thể mà chúng có thể bắt cặp
bổ sung với trình tự đó. Sau khi bắt cặp với trình tự mục tiêu, nhằm phát hiện sự bắt
cặp đó, nó thường được kiểm tra bằng cách cho liên kết với một điểm đánh dấu huỳnh
quang đã được thiết kế riêng. Chính vì thế, Oligonucleotide mang một chức năng quan
trọng nhất trong ứng dụng làm đầu đò phân tử để phát hiện các trình tự DNA hoặc

RNA mục tiêu.
Các oligonucleotide được tạo thành từ 2’- deoxyribonucleotides gọi là các đoạn
mồi (Primer) và chúng được sử dụng để liên kết với trình tự DNA cụ thể và được DNA
polymerase tổng hợp kéo dài trong phản ứng PCR. Các đặc điểm chính của một
Oligoucleotide sẽ quyết định hiệu quả và độ đặc hiệu là nhiệt độ nóng chảy, cấu trúc
thứ cấp và thiết kế mồi. Vì thế, việc lựa chọn trình tự hoặc nhiệt độ không tối ưu sẽ
dẫn đến khuếch đại không đặc hiệu hoặc phát hiên sai trình tự mục tiêu. [2]
2.2.2 Kỹ thuật PCR
1

Định nghĩa

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction – phản ứng chuỗi trùng hợp) là một
kỹ thuật phân tử, cho phép phát hiện các gen mục tiêu trong một mẫu DNA với mục
đích khuếch đại DNA mục tiêu lên hàng ngàn hoặc hàng triệu bản sao. Nhà khoa học
Kary Mullis là người đầu tiên phát triển kỹ thuật này vào năm 1983 và kể từ đó được
xem là kỹ thuật thiết yếu trong sinh học phân tử. [5]
2

Nguyên tắc


Theo Gaurav Solanki (2012) [6], phản ứng PCR là một phản ứng gồm nhiều chu
kỳ lặp đi lặp lại nhiều lần được thực hiện bởi các Protein đặc biệt là DNA Polymerase,
các nucleotide gồm: base adenine (A), thymine (T), cytosine (C) và guanine (G), các
đoạn mồi (Primer). Mỗi chu kỳ gồm 3 bước chính:
• Bước 1: Biến tính (Denaturation): ở nhiệt độ cao (90 0C - 97 0C), phân tử DNA
mạch kép bị tách thành 2 mạch đơn trong vòng 30 giây đến 1 phút. Hai mạch
đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho quá trình tổng hợp bổ sung hai mạch
DNA mới.

• Bước 2: Bắt cặp (Annealing): nhiệt độ được hạ xuống, thấp hơn nhiệt độ nóng
chảy (melting temperature – Tm) của mồi, tại đó mồi bắt cặp bổ sung với mạch
khuôn DNA. Nhiệt độ bắt cặp dao động từ 50 0C – 70 0C. Mỗi mồi có một nhiệt
độ nóng chảy riêng nên thời gian bắt cặp có thể kéo dài từ 30 giây đến 1 phút.
• Bước 3: Kéo dài (Elongation – Extension): Nhiệt độ được tăng lên đến 72 0C
tạo điều kiện tối ưu cho DNA polymerase hoạt động. Dưới sự tác động của
DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào ví trí theo sau mồi theo
nguyên tắc bắt cặp bổ sung với mạch khuôn. Thời gian kéo dài tùy thuộc vào độ
dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường trong khoảng từ 30 giây đến vài
phút.
3

Thành phần tham gia phản ứng

Theo Frank H. Stephenson và cs., (2016), gồm các thành phần chủ yếu [7] :
• DNA/RNA mạch khuôn
DNA mạch khuôn chứa đoạn DNA hoặc đoạn gen mục tiêu cần khuếch đại như
DNA mạch thẳng, DNA mạch vòng, DNA plasmid, cDNA hoặc RNA,…
• Mồi (primer)
Mồi là một đoạn nucleotide ngắn (oligonucleotide) hỗ trợ cho quá trình nhân đôi
của DNA cần khuếch đại trong phản ứng PCR. Mồi có một số loại như mồi phổ quát,
mồi đặc hiệu, mồi thoái hóa và mồi có gắn phóng xạ đanh đâu huỳnh quang. Vì thế,


một trong những yếu tố quyết định độ đặc hiệu của phản ứng PCR là sự lựa chọn đúng
loại mồi cần sử dụng, vì nếu lựa chọn sau mồi sẽ làm ảnh hưởng lớn đến kết quả của
phản ứng. Do đó, phải tìm hiểu càng nhiểu thông tin về trình tự DNA thì càng dễ chọn
được mồi tốt nhất. Cặp mồi gồm mồi xuôi và mồi ngược sẽ bắt cặp bổ sung vào hai
đầu của đoạn DNA mục tiêu đồng thời quyết định độ đặc hiệu của một phản ứng PCR.
Tiêu chuẩn của mồi:

- Chiều dài mồi: Chiều dài mồi tối thiểu khoảng 18 base, thường có chiều dài từ 18
base đến 24 base.
- % GC: Hàm lượng GC khoảng 40% - 60% cho kết quả tối ưu nhất vì nó có ảnh
hưởng đến nhiệt độ nóng chảy của mồi.
- Kẹp GC: Có ít nhất 1 G hoặc 1 C ở đầu 3’, tại đó sẽ giúp mồi liên kết mạnh hơn
với mạch khuôn. Tránh trường hợp ở đầu 3’, trong 5 base đầu tiên có nhiều hơn 3 G
hoặc 3 C bởi vì chúng có thể làm cho liên kết ở đầu 3’ quá mạnh dẫn đến mồi bắt cặp
không đặc hiệu.
- Nhiệt độ nóng chảy của mồi (Tm): Nhiệt độ nóng chảy tăng theo độ dài mồi, độ dài
tối ưu của mồi là khoảng 18 - 24 nucleotide với nhiệt độ nóng chảy khoảng 50 0C đến
75 0C.
• Enzyme chịu nhiệt (Taq DNA polymerase)
Đây là một loại enzyme được sử dụng trong quá trình tổng hợp mạch DNA mới.
DNA polymerase không bị biến tính ở nhiệt độ cao và hoạt động tối ưu ở 72 0C.
Enzyme chịu nhiệt được sử dụng đầu tiên chiết xuất từ vi khuẩn Thermus aquaticus
được phân lập từ suối nước nóng ở Vườn Quốc gia Yellowstone, Hoa Kỳ. Ngày nay,
có nhiều enzyme polymerase chịu nhiệt khác đã phát hiện và được sử dụng như Pfu
DNA polymerase chiết xuất từ Pyrococcus furiosis, Tth polymerase chiết tách từ
Thermus thermophilus.
• Các deoxyribonucleotide triphosphate (dNTPs)


Gồm Adenine (dATP), Thymine (dTTP), Cytosine (dCTP), Guanine (dGTP )
được sử dụng với mục đích kéo dài đoạn mồi.
• Dung dịch đệm (Buffer)
Buffer là một dung dịch cần thiết để tạo điều kiện hoạt động tối ưu cho Taq DNA
polymerase. Buffer có tác dụng làm ổn định pH môi trường nhằm đảm bảo cho các
DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Buffer thường bao gồm: Tris-HCl 100 µM pH = 8
ở 25 0C, Gelatin 0,01%, MgCl2 2 mM..
• Magie (Mg)

DNA polymerase hoạt động tốt khi có sự xuất hiện của ion Mg 2+. Mỗi phản ứng
PCR cần một nồng độ ion Mg2+ khác nhau. Nếu nồng độ Mg2+ thấp thì phản ứng không
đặc hiệu, tạo ra ít sản phẩm PCR. Nếu nồng độ Mg 2+ cao sẽ tạo ra nhiều sản phẩm phụ.
Mg2+ được bổ sung trong phản ứng PCR thường ở dạng MgCl2.
2.2.3 Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di
4

Nguyên tắc

Điện di là một kỹ thuật được sử dụng để phân tách các đoạn DNA, RNA hoặc
protein dựa trên kích thước và điện tích của chúng. Dựa trên kích thước và điện tích
của phân tử và nhờ và dòng điện trường, chúng sẽ di chuyển qua gel theo các hướng
khác nhau hoặc ở tốc độ khác nhau, cho phép chúng có thể tách ra khỏi nhau. Khi các
phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, tùy vào điện tích của chúng mà
chúng sẽ di chuyển về cực âm (-) hay cực dương (+). Các acid nucleic mang điện tích
âm vì chúng có gốc phosphate mang điện tích âm, vì thế khi đặt trong môi trường tích
điện, nó sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương. Phương pháp này sử dụng một dung
dịch đệm dẫn điện và tạo môi trường điện trường đồng nhất, tiếp đến là một bản gel
giúp phân tách các phân tử, đồng thời sử dụng chất nhuộm phân tử để có thể phát hiện
vị trí các phân tử trên gel sau khi thực hiện kỹ thuật điện di. Tùy vào mục đích khác
nhau mà ta sử dụng các bản gel khác nhau như: gel polyacrylamide được dùng để phân
tách các phân tử protein và các phân tử DNA có chiều dài nhỏ hơn một kilobase pair


(kb, 1 kb = 1000 base pair_bp), còn gel agarose phân tách hiệu quả các phân tử DNA
hoặc RNA có kích thước từ 100 bp - 25 kb [8]. Tuy nhiên, sự lựa chọn giữa gel
agarose và gel polyacrylamide phụ thuộc vào nhiều yếu tố như chi phí, độ phân tách,
…
5

Ưu và nhược điểm của gel agarose và gel polyacrylamide

Theo Patricia Barril và Silvia Nates (2010) [1]:
 Gel agarose
- Ưu điểm: không độc hại, đổ khuôn nhanh chóng và dễ dàng, phân tách tốt các
phân tử DNA có kích thước lớn, có thể phục hồi mẫu bằng cách làm tan chảy gel, bằng
enzyme, muối,…
- Nhược điểm: chi phí cao, Band mờ, khó phân tách các mẫu có trọng lượng phân
tử thấp,…
 Gel polyacrylamide
- Ưu điểm: Band rõ, phân tách tốt các phân tử có trọng lượng thấp,…
- Nhược điểm: Độc hại ở dạng monomer, gel dễ bị bể,…


CHƯƠNG 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian – Địa điểm thực hiện
3.1.1 Thời gian
Từ 10/2018 đến 01/2019
3.1.2 Địa điểm
Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Sinh hóa, Công ty TNHH MTV
Sinh hóa Phù Sa.
3.2 Mẫu nghiên cứu
Các trình tự Oligonucleotide (Primer) được thiết kế và lắp ráp tại công ty Sinh Hóa
Phù Sa đã biết trước nồng độ phần trăm GC
3.3 Thiết kế thí nghiệm
3.3.1 Thiết kế Primer
Trình tự đoạn Oligonucleotide (Primer) được thiết kế thủ công và được kiểm tra hàm
lượng GC bằng phần mềm Oligo Calc.
Trình tự Primer và hàm lượng phần trăm GC được nêu ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Trình tự đoạn Primer
Oligo
name
GC32.Fw
GC32.Rv
GC50.Fw
GC50.Rv
GC68.Fw
GC68.Rv

Trình tự (5'-3')

%GC

Tm

Length

AAAATCTGACTTTAGCACTAGATTC
TCAAACGAAACATTGTTACTGATGA
GCGAGCTTACTCATCACCAATCTG
GCTAACAGGACATTGCTACGTGAG
GGCGAGCTGACCCAGCACCCGATCT
GCTAGCAGGACGGTGCGCAGTGAGC

32
32
50
50
68

68

59,2
59,2
65,2
65,2
74
74

25
25
24
24
25
25

3.3.2 Chuẩn bị DNA template (DNA khuôn)


Quy trình tổng hợp DNA khuôn (DNA Plasmid) được thiết kế và lắp ráp bởi Công
ty Sinh Hóa Phù Sa
DNA Plasmid: kích thước 3236 bp, trong đó đoạn gen mục tiêu có kích thước 550
bp và đoạn Primer đã được thiết kế ở bảng 3.1.
Ký hiệu :
- Gọi A là nồng độ DNA Plasmid GC32 được pha loãng
- Gọi B là nồng độ DNA Plasmid GC50 được pha loãng
- Gọi C là nồng độ DNA Plasmid GC68 được pha loãng
Bảng 3.2 Bố trí pha loãng nồng độ DNA Plasmid mục tiêu
Ký hiệu Nồng độ (ng/µl)
GC32

200
A1
A2
A3
A4
A5
A6
GC50
156.3
B1
B2
B3
B4
B5
B6
GC68
171
C1
C2
C3
C4
C5
C6

Nồng độ (Copies)
5.6 x 1010
1010
109
108
107

106
105
4.4 x 1010
1010
109
108
107
106
105
4.8 x 1010
1010
109
108
107
106
105

Pha loãng (Copies)
5 µl DNA + 23 µl Bi.H2O
10 µl DNA + 90 µl Bi.H2O
10 µl DNA + 90 µl Bi.H2O
10 µl DNA + 90 µl Bi.H2O
10 µl DNA + 90 µl Bi.H2O
10 µl DNA + 90 µl Bi.H2O
5 µl DNA + 17 µl Bi.H2O
10 µl DNA + 90 µl Bi.H2O
10 µl DNA + 90 µl Bi.H2O
10 µl DNA + 90 µl Bi.H2O
10 µl DNA + 90 µl Bi.H2O
10 µl DNA + 90 µl Bi.H2O

5 µl DNA + 19 µl Bi.H2O
10 µl DNA + 90 µl Bi.H2O
10 µl DNA + 90 µl Bi.H2O
10 µl DNA + 90 µl Bi.H2O
10 µl DNA + 90 µl Bi.H2O
10 µl DNA + 90 µl Bi.H2O

3.3.3 Phương pháp tiến hành
6

Lựa chọn mồi và DNA

 Cặp mồi được thiết kế có hàm lượng GC 32 % được thực hiện phản ứng PCR với
DNA Plasmid GC32


 Cặp mồi được thiết kế có hàm lượng GC 50 % được thực hiện phản ứng PCR với
DNA Plasmid GC50
 Cặp mồi được thiết kế có hàm lượng GC 68 % được thực hiện phản ứng PCR với
DNA Plasmid GC68
7

Dung dịch bảo quản và nhiệt độ lưu trữ

Các Primer sau khi được tổng hợp và pha loãng về nồng độ 10 pmol/µL và bắt đầu lưu
trữ từ ngày 29/10/2018 trong dung dịch Bi.H 2O lần lượt có pH = 5, pH = 7, pH = 9 và
trong dung dịch bảo quản thông thường là TE 1X có pH = 8.5. Sau đó, ở tất cả các điều
kiện pH đều được chia đều thành 3 phần và bảo quản ở các nhiệt độ khác nhau là nhiệt
độ môi trường, nhiệt độ mát, nhiệt độ đá.
Ký hiệu:

+ t°p: Nhiệt độ môi trường
+ t°m: Nhiệt độ mát (4 oC)
+ t°đ: Nhiệt độ đá (-20 oC)
8

Khảo sát mồi

Các đoạn mồi sau khi được lưu trữ ở các điều kiện khác nhau lần lượt được thí nghiệm
cách nhau một tuần.
Mục đích: kiểm tra sự thay đổi về chất lượng sau thời gian bảo quản cũng như sử dụng
Ký hiệu:
Tm: Nhiệt độ nóng chảy của mồi
Ta: Nhiệt độ bắt cặp của mồi
Bảng 3.3 Dãy gradient nhiệt độ bắt cặp của mồi
Nhiệt độ gắn mồi
Tm
GC68.Fw
74
GC68.Rv
74
GC50.Fw
65.2
GC50.Rv
65.2
GC32.Fw
59.2
GC32.Rv
59.2
3.3.4 Bố trí thí nghiệm

Ta = Tm - 5
69
60.2
54.2


Thí nghiệm 1: Kiểm tra kích thước sản phẩm sau phản ứng PCR
Mục đích: kiểm tra xem Primer có bắp cặp đúng với DNA Plasmid không
Thang DNA chuẩn do công ty Sinh Hóa Phù Sa cung cấp
Bố trí thí nghiệm:
-

Các Primer có hàm lượng GC 32%, 50 %, 68 %
Dung dịch lưu trữ: TE 1X
Nhiệt độ lưu trữ: -20 oC
Số lần lặp lại: 2
Số đơn vị thí nghiệm: 2 x 3 = 6

Tiến hành thí nghiệm
-

Pha mix cho phản ứng PCR với các thành phần được trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.4 Thành phần tham gia phản ứng PCR

Thành phần

Nồng độ gốc

H2O khử ion
(Bi.H2O)

PSA buffer
PSA dNTPs
Taq polymerase
Cặp mồi (Primer)
DNA

Nồng độ cho 1
phản ứng

Thể tích 1 phản ứng
(µL)
41,5

10X
10 mM
2 U/µL
10 pmol/µL
**

1X
0.1 mM
0.04 U/µL
10 pmol/µL
105 copies

5
0,5
1
1
1

-

Tiến hành thí nghiệm với từng Primer vì mỗi Primer có nhiệt độ bắt sặp khác nhau

-

như được trình bày ở bảng 3.3
Sau đó tiến hành thực hiện phản ứng PCR trong 35 chu kỳ với chu kỳ nhiệt được mô
tả như sau:

95 °C

95 °C

3 phút

30 giây

72 °C 72 °C
45 giây 5 phút
Ta
30 giây

Hình 3.1 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR khảo sát mồi

25 °C
2 phút

-

Tiến hành điện di để so sánh với thang DNA chuẩn
 Thí nghiệm 2: Khảo sát các điều kiện bảo quản ảnh hưởng đến quá

trình bảo quản Oligo
Primer sau khi được tổng hợp và tinh sạch được bảo quản trong dung dịch
Bi.H2O ở pH = 5, pH = 7, pH = 9, và điều kiên bảo quản thông thường trong dung dịch
TE 1X ( pH = 8.5)
Mỗi điều kiện pH khác nhau được bảo quản trong 3 khoảng nhiệt độ tương ứng:
Nhiệt độ môi trường, nhiệt độ mát (4 0C), nhiệt độ đá (-20 0C)
Bố trí thí nghiệm
-

Số điều kiện pH khảo sát: 4
Số điều kiện nhiệt độ khảo sát: 3
Số lần lặp lại ở mỗi điều kiện pH: 3
Số đơn vị thí nghiệm: 4 x 3 x 3 = 36

Trong đó:
 Thí nghiệm 2.1: Khảo sát hàm lượng GC ảnh hưởng đến quá trình bảo
quản Oligo
Bố trí thí nghiệm:
-

Các loại Oligo có hàm lượng GC: 32%, 50%, 68%
Điều kiện bảo quản: Tất cả các Oligo được bảo quản trong dung dịch TE 1X (pH

= 8.5) ở nhiệt độ -20 oC
- Thời gian khảo sát: 10 tuần

- Số lần lặp lại: 3
 Thí nghiệm 2.2: Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình bảo
quản Oligo
Bố trí thí nghiệm:
-

Nhiệt độ bảo quản khảo sát: nhiệt độ môi trường, nhiệt độ mát, nhiệt độ đông

-

đá
Oligo có hàm lượng GC: 50%
Tất cả các Oligo được bảo quản trong dung dịch TE 1X (pH = 8.5)
Thời gian khảo sát: 10 tuần
Số lần lặp lại: 3


 Thí nghiệm 2.3: Khảo sát sự ảnh hưởng của dung dịch bảo quản đến quá
trình bảo quản Oligo
Bố trí thí nghiệm:
-

Dung dịch bảo quản khảo sát: Bi.H 20 (pH = 5), Bi.H20 (pH = 7), Bi.H20 (pH

= 9), TE 1X (pH = 8.5)
- Oligo có hàm lượng GC: 50%
- Tất cả các Oligo được bảo quản trong nhiệt độ đông đá
- Thời gian khảo sát: 10 tuần
- Số lần lặp lại: 3
 Tiến hành thí nghiệm theo mỗi tuần và được kiểm tra bằng phương pháp PCR

Bảng 3.5 Thành phần tham gia phản ứng PCR
Thành phần
H2O khử ion
(Bi.H2O)
PSA buffer
PSA dNTPs
Taq polymerase
Cặp mồi (Primer)
DNA

Nồng độ gốc

Nồng độ cho 1
phản ứng

Thể tích 1 phản ứng
(µL)
41,5

10X
10 mM
2 U/µL
10 pmol/µL
**

1X
0.1 mM
0.04 U/µL
10 pmol/µL
105 copies

5
0,5
1
1
1

(**: nồng độ DNA được nêu trong bảng 3.2)

• Tiến hành PCR, sử dụng nhiệt độ gắn mồi đã nêu trong bảng 3.2 trong 35 chu kỳ với
chu kỳ nhiệt như sau:


95 °C

95 °C

3 phút

30 giây

72 °C 72 °C
45 giây 5 phút
Ta
30 giây

25 °C
2 phút

Hình 3.2 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR khảo sát mồi

 Tiến hành chạy điện di sản phẩm khuếch đại để kiểm tra kết quả.
+ Đổ gel: cân 2 g Agarose và bổ sung vào 100 mL TAE 1X để được gel Agarose 2%,
đun sôi dung dịch để agarose tan hoàn toàn sau đó đổ vào khuôn gel đã được lắp sẵn
lược.
+ Sau khi gel đông, cắt gel sao theo kích thước phù hợp và để gel vào trong bể điện di
có chứa dung dịch TAE 1X với thể tích dung dịch sao cho ngập tới bề mặt miếng gel.
+ Tiến hành bơm mẫu vô gel Agarose 2% theo từng giếng: Hút 2 µL PSA Mix trộn đều
với 8 µL sản phẩm PCR của mỗi mẫu, sau đó bơm vào từng giếng trên miếng gel.
+ Tiến hành điện di ở hiệu điện thế 90V, cường độ dòng điện 400 mA trong 40 phút.
+ Quan sát kết quả dưới đèn UV và chụp hình gel.
Chỉ tiêu đánh giá: Sản phẩm PCR hiện ở band tương ứng của mồi. Band sản phẩm
càng sáng càng rõ và càng đậm thể hiện sự đặc hiệu của primer.
3.4 CÔNG CỤ NGHIÊN CỨU
3.4.1 Dụng cụ, hóa chất và thiết bị
3.4.1.1 Dụng cụ
- Parafine
- Các loại eppendorf: 0,2 mL; 0,5 mL; 1,5 mL; 2 mL
- Pipette tip: 0,5 µL - 10 µL, 200 µL
- Các pipettor: 100 µL, 20 µL - 200 µL, 0,5 - 10 µL
3.4.1.2 Hóa chất


-

Hóa chất PCR gồm H2O khử ion (Bi.H2O), Taq polymerase, dung dịch

-

đệm PCR (PSA buffer), PSA dNTPs
Hóa chất điện di: gel agarose (Ultra Clear Quick Dissolve Agarose),

chất nhuộm gen (PSA Mix Dye), dung dịch đệm TAE 1X (40 mM Tris

-

– acetate, 1 mM EDTA).
Hóa chất điều chỉnh pH: Trizma HCl, Trizma base
Hóa chất bảo quản và lưu trữ Primer: H2O khử ion (Bi.H2O), TE 1X.


3.4.1.3 Thiết bị
Bảng 3.6 Các thiết bị sử dụng cho thí nghiệm
ST
T

Mục đích sử
dụng

Tên thiết bị

Model

Nơi sản
xuất

1

Luân nhiệt

Máy PCR

PCR BioRad T100

2

Vortex

Máy Vortex

Mini Vortexer VWR Florida
Scientific Products
Mỹ

3

Ly tâm

Máy ly tâm

Digital CD-2012 Plus

4

Chụp ảnh gel

Máy chụp ảnh Major
gel
MUVB100

5

Đo nồng
DNA

6

Điện di
phẩm PCR

7

Cân khối lượng

Cân phân tích

8
Điều chỉnh pH
Máy đo pH
3.4.2 Các phần mềm sử dụng
-

–

Trung Quốc

Science California –
Mỹ

độ Máy đo nồng DeNovix DS – 11 FX
độ DNA
sản Bộ điện di

Mỹ

Mỹ

BioRad
PowerPac Mỹ
300 1655050
Ohaus PA214

Ohaus – Mỹ

Accumet AR50

Mỹ

Phần mềm Oligo Calc
Phần mềm Scienceprimer
Phần mềm thống kê phân tích dữ liệu IBM SPSS Statistics