NGHIÊN cứu môi TRƯỜNG NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN THỦY TIÊN TRẮNG (dendrobium farmeri) và THỜI GIAN HUẤN LUYỆN ở GIAI đoạn vườn ươm

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG
-----o0o-----

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG IN VITRO
LAN THỦY TIÊN TRẮNG (Dendrobium farmeri) VÀ THỜI
GIAN HUẤN LUYỆN Ở GIAI ĐOẠN VƯỜN ƯƠM

Người hướng dẫn: TS. PHAN TƯỜNG LỘC
Người thực hiện: NGUYỄN THỊ THU TRINH
Lớp: 1406030
Khoá: 18
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2018


1

LỜI CẢM ƠN
Lời nói đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Phan Tường Lộc
đã tận tình hướng dẫn cũng như chỉ bảo, giải đáp mọi thắc mắc và hỗ trợ hết mình
cho tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin phép được tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám đốc Công ty TNHH
Nông Vinh đã tạo điều kiện cho tôi được thực hiện khóa luận. Đồng thời xin gửi lời
cám ơn đến quý cô chú, anh chị công tác tại công ty đã giúp đỡ tôi trong thời gian
thực hiện khóa luận.
Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu nhà trường, quý thầy cô bộ môn
Công nghệ sinh học đã truyền đạt những kiến thức bổ ích về lý thuyết lẫn thực tiễn,
tạo nền tảng cho kiến thức của tôi trong suốt thời gian học tập ở trường Đại học Tôn
Đức Thắng.

Xin cảm ơn tập thể lớp 14060301 và các bạn bè, anh chị đã động viên, giúp
đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận.
Cuối cùng, con xin cảm ơn ba mẹ đã cho con sắc vóc này, nuôi dưỡng và dạy
dỗ con thành người, cho con niềm tin và nghị lực để cố gắng trước mọi thử thách,
khó khăn.
TP. Hồ Chí Minh, tháng 1 năm 2019
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Thu Trinh


LỜI CAM ĐOAN
CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH
TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự hướng
dẫn khoa học của TS. PHAN TƯỜNG LỘC. Các nội dung nghiên cứu, kết quả
trong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây.
Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá
được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu
tham khảo.
Ngoài ra, trong khóa luận còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số
liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn
gốc.
Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách
nhiệm về nội dung khóa luận của mình. Trường đại học Tôn Đức Thắng không
liên quan đến những vi phạm tác quyền, bản quyền do tôi gây ra trong quá trình
thực hiện (nếu có).
TP. Hồ Chí Minh, ngày 23 tháng 01 năm 2019
Nguyễn Thị Thu Trinh

TÓM TẮT
NGUYỄN THỊ THU TRINH, Đại học Tôn Đức Thắng, tháng 01/2019.
“ NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN THỦY
TIÊN TRẮNG (Dendrobium farmeri) VÀ THỜI GIAN HUẤN LUYỆN Ở GIAI
ĐOẠN VƯỜN ƯƠM“
Giảng viên hướng dẫn TS. PHAN TƯỜNG LỘC
Đề tài được thực hiện tại công ty Trách Nhiệm Hữu Hạn Nông Vinh TP. HCM
Nội dung nghiên cứu gồm 4 thí nghiệm về ảnh hưởng của các chất điều hòa
sinh trưởng (BA kết hợp Kinetine trên môi trường MS và NAA kết hợp than hoạt
tính trên môi trường MS); ảnh hưởng của môi trường Hyponex liquid 6-10-5 đến sự
sinh trưởng và phát triển của lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) trong nuôi
cấy in vitro; ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến sự sinh trưởng và phát triển
của lan Thủy tiên trắng ở giai đoạn vườn ươm.
Các kết quả đạt được:
Môi trường MS kết hợp với BA ở nồng độ 0,5 mg/L và Kinetine ở nồng độ 0,5
mg/L là tốt nhất đến khả năng nhân chồi của lan Thủy tiên trắng in vitro với kết quả:
số chồi là 28,72; số lá 26,89 và chiều cao 2,03 cm.
Môi trường Hyponex có nồng độ 0,6 ml/L là thích hợp cho sự sinh trưởng và
phát triển chồi lan Thủy tiên trắng in vitro với kết quả: chiều cao chồi 3,63 cm, số lá
5,69, số rễ 5,69, chiều dài rễ 2,62 cm.
Môi trường MS kết hợp với NAA ở nồng độ 0,5 mg/L và than hoạt tính 0,5
g/L là tốt nhất đến khả năng tạo rễ của chồi lan Thủy tiên trắng in vitro với kết quả:
7,33 rễ và chiều dài rễ 2,90 cm.
Ở giai đoạn vườn ươm, cây con với thời gian huấn luyện 15 ngày cho tỷ lệ
sống cao và phát triển tốt nhất.


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN....................................................................................................i

LỜI CAM ĐOAN.............................................................................................ii
TÓM TẮT.......................................................................................................iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.......................................................................vii
DANH MỤC HÌNH......................................................................................viii
DANH MỤC BẢNG.......................................................................................ix
DANH MỤC BIỂU ĐỒ...................................................................................ix
CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU....................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề..............................................................................................1
1.2. Mục tiêu.................................................................................................2
1.3. Ý nghĩa...................................................................................................2
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU...........................................................3
2.1. Sơ lược về phong lan..............................................................................3
2.1.1. Giới thiệu chung về họ lan...............................................................3
2.1.2. Phân bố............................................................................................3
2.1.3. Đặc điểm hình thái...........................................................................1
2.2. Giới thiệu về lan Thủy tiên trắng............................................................2
2.2.1. Phân bố............................................................................................4
2.2.2. Đặc điểm hình thái, sinh thái...........................................................4
2.3. Kỹ thuật nhân giống in vitro...................................................................5
2.3.1. Vài nét về nhân giống in vitro..........................................................5
2.3.2. Các kỹ thuật nhân giống in vitro......................................................6


2.3.3. Quy trình nhân giống in vitro...........................................................7
2.3.4. Ưu thế của nhân giống in vitro.........................................................9
2.3.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến qui trình nhân giống in vitro..................9
2.4. Giới thiệu phân bón Hyponex liquid 6-10-5.........................................18
2.5. Các nghiên cứu trước đây liên quan đến đề tài.....................................19
2.5.1. Các nghiên cứu nước ngoài............................................................19
2.5.2. Các nghiên cứu trong nước............................................................20

CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.............................................22
3.1. Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm..........................................22
3.2. Nội dung nghiên cứu............................................................................22
3.3. Vật liệu nghiên cứu...............................................................................22
3.3.1. Nguyên liệu nuôi cấy.....................................................................22
3.3.2. Trang thiết bị và dụng cụ...............................................................22
3.3.4. Môi trường nuôi cấy......................................................................22
3.3.5. Điều kiện nuôi cấy.........................................................................23
3.4. Phương pháp thí nghiệm.......................................................................23
3.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA và Kinetine. .23
đến khả năng nhân chồi của lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri)..23
3.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ phân bón Hyponex
...............................................................................................................24
3.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính đến
khả năng tạo rễ của lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri)...............25
3.4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến. .25


khả năng sống của cây in vitro lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri)
ở giai đoạn vườn ươm............................................................................25
3.5. Xử lý số liệu.........................................................................................26
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...................................................27
4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA và Kinetine.........27
đến khả năng nhân chồi của lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri)..27
4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ phân bón Hyponex. . .31
4.3.i Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính đến....35
khả năng tạo rễ của lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri)...............35
4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến khả
năng sống của cây in vitro lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) ở giai đoạn
vườn ươm............................................................................................................. 39

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................43
5.1. Kết luận................................................................................................43
5.2. Kiến nghị..............................................................................................43
TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................44
PHỤ LỤC.......................................................................................................48


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
BA

:

6-benzyladenine

NAA

:

Naphthaleneacetic

Kinetin

:

6-furfurylaminopurin

MS

:

Murashige-Skoog

ĐC

:

Đối chứng

Cs

:

Cộng sự

TNHH

:

Trách nhiệm hữu hạn

NT

:

Nghiệm thức

DANH MỤC HÌNH


Hình 2.1. Một số loài lan Thủy tiên.................................................................3

Hình 2.2. Cấu tạo hoa lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri)....................3
Hình 2.3. Công thức cấu tạo của BA.............................................................15
Hình 2.4. Công thức cấu tạo của Kinetine......................................................16
Hình 2.5. Công thức cấu tạo của NAA...........................................................16
Hình 2.6. Phân bón Hyponex liquid 6-10-5....................................................17
Hình 4.1. Ảnh hưởng của nồng độ BA và Kinetine đến khả năng nhân chồi
của lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) sau 60 ngày nuôi cấy......................29
Hình 4.2. Ảnh hưởng của nồng độ phân bón Hyponex 6-10-5 đến số lá và số
rễ của chồi lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) sau 60 ngày nuôi cấy..........33
Hình 4.3. Ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính đến khả năng tạo rễ của lan
Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) sau 60 ngày................................................37
Hình 4.4. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến chiều cao và chiều dài rễ
của cây in vitro lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) ở giai đoạn vườn ươm. 39

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Các chất dùng khử trùng với nồng độ và thời gian khuyến cáo........7


Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ BA và Kinetine đến khả năng nhân chồi
của lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri)........................................................22
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ phân bón Hyponex 6-10-5 đến sự sinh
trưởng chồi lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri)...........................................23
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính đến khả năng tạo rễ của lan
Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri)....................................................................24
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến khả năng sống của cây in
vitro lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) ở giai đoạn vườn ươm..................25
Bảng 4.1. Ảnh hưởng ảnh hưởng của nồng độ BA và Kinetine đến khả năng
nhân chồi của lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) sau 30 ngày nuôi cấy.....26
Bảng 4.2. Ảnh hưởng ảnh hưởng của nồng độ BA và Kinetine đến khả năng
nhân chồi của lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) sau 60 ngày nuôi cấy.....27

Bảng 4.3. Ảnh hưởng của nồng độ phân bón Hyponex 6-10-5 đến sự sinh
trưởng chồi lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) sau 30 ngày nuôi cấy.........30
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ phân bón Hyponex 6-10-5 đến sự sinh
trưởng chồi lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) sau 60 ngày nuôi cấy.........31
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính đến khả năng tạo rễ của lan
Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) sau 30 ngày nuôi cấy..................................34
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính đến khả năng tạo rễ của lan
Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) sau 60 ngày nuôi cấy..................................35


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 4.1. Ảnh hưởng ảnh hưởng của nồng độ BA và Kinetine đến khả năng
nhân chồi của lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) sau 30 ngày nuôi cấy.....27
Biểu đồ 4.2. Ảnh hưởng của nồng độ BA và Kinetine số lá và số rễ của chồi
lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) sau 60 ngày nuôi cấy............................28
Biểu đồ 4.3. Ảnh hưởng của nồng độ phân bón Hyponex 6-10-5 đến sự sinh
trưởng chồi lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) sau 30 ngày nuôi cấy.........31
Biểu đồ 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ phân bón Hyponex 6-10-5 đến chiều cao
và chiều dài rễ chồi lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) sau 60 ngày nuôi cấy
................................................................................................................................. 33
Biểu đồ 4.5. Ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính đến khả năng tạo rễ của
lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) sau 30 ngày nuôi cấy............................35
Biểu đồ 4.6: Ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính đến khả năng tạo rễ của
lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) sau 60 ngày nuôi cấy............................36
Biểu đồ 4.7. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện cây con đến sự phát triển
của cây in vitro lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) ở giai đoạn vườn ươm. 39


1

CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Trong những năm gần đây việc trồng và kinh doanh lan nói chung và đặc biệt
là lan rừng ở nước ta phát triển rất mạnh. Trước đây việc trồng và sưu tầm lan rừng
chỉ dành cho các nghệ nhân hay những người có đam mê. Tuy nhiên hiện nay đời
sống của người dân không ngừng được cải thiện nhu cầu về tinh thần cũng tăng lên,
người dân có khuynh hướng tìm những cái quý hiếm, đẹp và lạ.
Với vẻ đẹp quyến rũ và mùi thơm thanh cao của lan rừng đã đáp ứng được
điều này, nắm bắt được nhu cầu đó nhiều người đã khai thác lan rừng một cách bừa
bãi số lượng lớn để cung cấp cho thị trường. Chính điều này cùng với việc diện tích
rừng tự nhiên ngày càng bị thu hẹp đã làm cho nhiều giống lan rừng trở nên hiếm và
có nguy cơ tuyệt chủng. Thủy tiên trắng được mệnh danh là nàng Kiều mang một
màu trắng tinh khôi làm lay động lòng người cùng với hương thơm dịu nhẹ, phát
hoa buông thoảng với chiều dài 30cm. Đây là loài lan quý rất có giá trị về thẩm mỹ
và tiềm năng kinh tế. Hiện nay giống lan này được khá nhiều người sưu tầm và khai
thác do hoa thường nở vào mùa xuân, đặc biệt lại thích hợp với điều kiện khí hậu
của khu vực Thành phố Hồ Chí Minh và một số tỉnh lân cận, nên ngày càng được
trồng rộng rãi và phổ biến.
Tuy nhiên, nhu cầu thưởng hoa của người dân ngày càng tăng mà số lượng
cây giống khai thác từ rừng hiện không cung cấp đủ. Vì vậy việc nghiên cứu
phương pháp và xây dựng quy trình nhân giống nhằm bảo tồn nguồn gen và cung
cấp cho thị trường là yêu cầu bức thiết. Các phương pháp nhân giống truyền thống
thường được áp dụng đối với lan là tách, chiết, giâm tuy nhiên cho hệ số nhân giống
thấp và cây dễ bị thoái hóa. Hiện nay phương pháp nhân giống in vitro được nghiên
cứu và áp dụng thành công trong sản xuất giống nhiều loại cây trồng khác nhau đặc
biệt là đối với nhân giống lan. Nhưng chưa có nhiều nghiên cứu đối với giống lan
thủy tiên trắng trong các loài lan rừng. Việc nhân giống lan này khá khó khăn và
chủ yếu là dùng phương pháp truyền thống nên hệ số nhân thấp và kém hiệu quả. Vì

2

vậy việc áp dụng nhân giống in vitro đối với lan thủy tiên trắng để phục vụ cho
công tác bảo tồn nguồn gen và nghiên cứu lai tạo đồng thời cung cấp giống cho thị
trường là điều rất cần thiết. Do đó đề tài “Nghiên cứu môi trường nhân giống in
vitro lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri)” được thực hiện.
1.2. Mục tiêu
Xác định được môi trường thích hợp cho sự phát triển chồi và tăng trưởng
trong quá trình nuôi cấy in vitro lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri); đồng
thời xác định thời gian huấn luyện thích hợp để tạo ra cây con có chất lượng tốt nhất
ở giai đoạn hậu cấy mô.
1.3. Ý nghĩa
Giúp việc nhân giống lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) hiệu quả với
môi trường tối ưu tạo ra nguồn vật liệu phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo và tạo
ra nguồn cây giống có chất lượng tốt để đáp ứng nhu cầu của thị trường.


3

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược về phong lan
2.1.1. Giới thiệu chung về họ lan
Trong thế giới các loài hoa, hoa lan là một trong những loài hoa đẹp nhất. Hoa
lan được coi là loài hoa tinh khiết, hoa vương giả cao sang, vua của các loài hoa.
Hoa lan không những đẹp về màu sắc mà còn đẹp cả về hình dáng lẫn hương thơm
quyến rũ. Cái đẹp của hoa lan thể hiện từ những đường nét của cánh hoa tao nhã
đến dạng hình thân, lá, cành duyên dáng ít có loài hoa nào sánh nổi. Hoa lan được
nhiều người yêu thích và đánh giá là một trong những loài hoa cao cấp trong thế
giới thảo mộc. Với 750 chi và 20.000 - 25.000 loài (theo A.L Takhtajan 1978), cùng
với những loài mới được khám phá và mô tả theo hàng năm. Họ phong lan chỉ đứng

thứ hai sau họ cúc trong ngành thực vật hạt kín và là họ lớn nhất trong lớp một lá
mần. Chính vì thế, hình thái, cấu tạo cũng như hệ thống phân loại của loài này hết
sức đa dạng và phức tạp [9]. Những nhà sang lập ngành Lan đáng kể nhất là triết gia
người Hy Lạp Theophrastus (372 - 287 TCN), và sau này là nhà thực vật học Thụy
Điển Linnaeus (1707 - 1778). Chính Theophrastus là người đầu tiên sử dụng từ Hy
lạp “Orchis” để chỉ nhóm lan.
2.1.2. Phân bố
Họ lan phân bố rất rộng từ 680 vĩ bắc đến 560 vĩ nam, tuy nhiên trung tâm phân
bố là ở các vùng nhiệt đới đặc biệt là châu Mỹ và Đông Nam Á. Càng đi xa vùng
nhiệt đới đến vùng cực thì sự phân bố họ lan cũng giảm dần. Việt Nam chúng ta
nằm trong khu vực Đông Nam Á là một trong hai trung tâm phát sinh của hoa lan.
Có vị trí địa lí đặc biệt nên nhìn chung họ phong lan của Việt Nam rất phong phú và
đa dạng. Theo thống kê sơ bộ, phong lan Việt Nam có khoảng 137 - 140 chi và trên
800 loài trong đó có nhiều chi loài mới hệ thực vật toàn cầu. [9]


1

2.1.3. Đặc điểm hình thái
Cơ quan dinh dưỡng
Giả hành (thân giả): chỉ xuất hiện trên các loài đa thân. Giả hành là bộ phận
rấtcần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của lan. Khác với thực vật có hoa khác,
giả hành là thân nhưng lại chứa diệp lục. Đây là bộ phận chứa nhiều chất dinh
dưỡng rất cần thiết cho sự phát triển giả hành mới sau khi trổ hoa và nghỉ ngơi. Giả
hành cũng là cơ quan dự trữ nước. Có sự biến động lớn về hình dạng giả hành của
các loài khác nhau.
Thân: Chỉ có ở loài lan đơn thân và một số loài của giống Dendrobium và
Epidendreum vừa có giả hành vừa có thân. Thân thường mang rễ và lá. Thân là cơ
quan chứa nước chất dinh dưỡng, mầm hoa và mầm lá, trên thân có đốt, trên mỗi
đốt mọc một nhánh lá hoặc bao lá.

Lá: Có sự biến động lớn về hình dáng cũng như kích thước tùy chủng loại
khác nhau. Đây là cơ quan dinh dưỡng của hoa lan, lá có thể mọc đối xứng qua gân
chính hay không. Đuôi lá có thể tròn, nhọn hay khuyết. Tuy nhiên, điểm chung nhất
ở các loài lan là lá thường dài hơn rộng gắn vào thân hay giả hành bởi cuống lá.
Căn hành (thân-rễ): Chỉ gặp lan đa thân là nơi cấu tạo các cơ quan dinh
dưỡng mới, trên căn hành có nhiều mắt sống, chết hoặc hưu niên. Do đó căn hành là
bộ phận quan trọng cho việc duy trì và phát triển số lượng lan theo phương pháp
chiết tách nhánh thông thường.
Rễ: Hệ rễ làm nhiệm vụ lấy nước, muối khoáng trên vỏ cây gỗ, hấp thu chất
dinh dưỡng, địa lan thì rễ mang nhiều lông hút.
Cơ quan sinh sản
Hoa: cấu trúc của hoa lan gồm 7 bộ phận: 3 lá đài, 3 cánh hoa và một trụ
mang hoa. Môi là một cánh hoa biến thái thành ở mức dộ cao chứ không phải cấu
trúc riêng. Hoa lưỡng tính đối xứng hai bên, bao hoa dạng cánh rời xếp thành hai
vòng. Hoa thường tập hợp thành cụm hoa hay chùm bông. [15]


2

Quả: thuộc loại quả nang nở thành 3 - 6 đường nức dọc, hạt rất nhỏ và nhiều
nên phát tán chủ yếu nhờ gió. Thường không có nội nhủ nên phôi hạt phát triển yếu
không phân hóa thành cơ quan. Hạt muốn nảy mầm cần có nấm cộng sinh. [9]
2.2. Giới thiệu về lan Thủy tiên trắng
Lan Thủy tiên trắng thuộc
Giới:

Plantae

Ngành:

Magnoliophyta

Lớp:

Liliopsida

Bộ:

Orchidales

Họ:

Orchidaceae

Chi:

Dendrobium

Loài:

Dendrobium farmeri

Lan Thủy tiên là loài lan thích nắng, phát triển tốt ở khí hậu nhiệt đới ẩm,
siêng ra hoa, có nhiều loại, mang nhiều màu sắc khác nhau. Một số loài phổ biến
như:
Thủy tiên tím (Dendrobium amabile)
Giả hành trắng, có màu nâu hoặc xanh đen, dài khoảng 40 – 100 cm, lá mọc so
le, thuôn nhọn và dài cứng, hoa mọc từ gốc lá, phát hoa màu tím, cánh trắng họng
vàng, chùm hoa buông thõng, dài 25 – 35 cm, nở vào cuối mùa xuân.
Thủy tiên vàng (Dendrobium palpebrae)

Thân vuông, cánh đài ngắn, giả hành hình thoi, lá xoan thon, dài 8 – 10 cm,
hoa mọc thành chùm, dài 25 – 30 cm, mỗi hoa to cỡ 5 cm, cánh hoa màu trắng, môi
hoa màu vàng. Thời điểm nở hoa vào khoảng tháng 1 âm lịch.
Thủy Tiên mỡ gà (Dendrobium densiflorum)
Giả hành có 4 cạnh, màu lục đậm, thân cây dài, lá to, rộng nhưng hơi mỏng.
Phát hoa dày, màu vàng, môi đậm. Đây là loài lan được trồng với mục đích sưu tầm
là chính bởi rất khó trồng và chăm sóc.


3

Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri)
Thân cây trung bình, gốc nhỏ, có khoảng 3 - 5 lá, không rụng lá. Hoa mọc
thành từng chùm, cánh trắng môi vàng, có mùi thơm dịu. Vì là loài lan dễ trồng,
không có mùa nghỉ nên nhiều người chơi lan thường chọn giống lan này cho vườn
lan của mình. [30]

Hình 2.1. Một số loài lan Thủy tiên
A. Lan Thủy tiên vàng (Dendrobium thyrsiflorum)
B. Lan Thủy tiên tím (Dendrobium amabile)
C. Lan Thủy tiên mỡ gà (Dendrobium densiflorum)

Hình 2.2. Cấu tạo hoa lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri)


4

2.2.1 Phân bố
Thủy tiên trắng hay còn gọi là Hoàng thảo thủy tiên trắng hoặc Kiều vuông có
nguồn gốc xuất sứ từ rất nhiều nơi đặc biệt vùng Đông Nam Á. Ở Việt Nam phân bố

chủ yếu ở Tây Nguyên và các tỉnh phía Nam. [33]
2.2.2 Đặc điểm hình thái, sinh thái
Đặc điểm hình thái
Thân: Phong lan thân ngắn, thân vuông 4 cạnh thẳng thường mọc dựng lên trên
hướng ánh nắng, thân cây thường cao từ 25 - 40cm, đường kính thân khoảng 1 - 2
cm tùy vào loại thân nhỏ (còi) và loại thân to (cây trưởng thành). Gốc nhỏ tròn thân
hơi phình ở khoảng giữa thân hình vuông, thân cây thường có màu xanh đậm và
xanh ánh vàng, thân già thường nhăn nheo nhưng vẫn dũ được dáng hình vuông,
nảy mầm và ra lá từ gốc vào dịp đầu năm.
Lá: Loại này ra rất ít lá, lá có bẹ lá ôm sát thân, có khoảng từ 3 - 5 lá, lá dài từ
7 - 10 cm và rộng khoảng 5 - 7 cm (hoặc có thể to hơn 7 cm, loại đặc biệt, dạng lá
mít), màu của lá thường có màu xanh đậm, màu xanh vàng tùy thuộc vào tình trạng
cây đủ nắng hoặc thiếu nắng. Lá mọc dạng so le và cách nhau từ 1 – 2 cm. Cổ lá
thường có khấc màu xanh trắng, trên lá cây có thể sẽ có nhiều gân và có thể có sọc
trắng mờ dọc theo lá, cuối từng chiếc lá sẽ có những vết khuyết nhỏ chéo giữa nửa
lá này và nửa lá bên kia. Thường cây đến cuối năm sẽ ngừng phát triển và rụng lá từ
dưới sau đó lan dần lên ngọn nhưng cây vẫn hút nước qua rễ để nuôi thân và cho
hoa năm tới.
Rễ cây: thuộc loại rễ chùm, đầu rễ có màu xanh trắng. Thân rễ thường có màu
trắng ngà và ít khi có màu khác. Cây ra rễ ở gốc và ở các cây ki con mọc ra trên
thân cây cũ. Với khí hậu nóng và không lạnh thì rễ mọc quanh năm, còn nếu có mùa
đông rễ cây sẽ ngừng phát triển hoăc phát triển rất chậm. Rễ cây bắt đầu ra sẽ có rất
nhiều đầu rễ sau đó theo năm tháng sẽ dài ra và tiếp tục ra nhiều rễ phân nhánh con
bám vào chất trồng để đi tìm hơi ẩm.
Hoa: Chùm hoa ở gần ngon, thường ở trên các giả hành đã rụng lá, hoa mọc
riêng lẻ xung quanh phát hoa thành chùm dài khoảng 25 – 30 cm. Hoa có màu trắng


5

ở cánh, họng có nhiều lông tơ mịn, môi màu vàng tươi có vành trắng ở mép, cũng
có loại hoa phớt hồng nhưng ít gặp hơn.
Đặc điểm sinh thái
Đây là loài thuộc giống Dendrobium ra hoa nhưng không rụng lá. Thủy tiên
trắng nở hoa thường vào mùa xuân, ra hoa vào khoảng từ tháng 1 đến tháng 3. Hoa
nở rải rác và có cây cho tận 2 lần hoa trong 1 năm. Độ bền của hoa khoảng 5 - 7
ngày nếu ở trong điều kiện nóng và khô, cũng có thể lên đến đến khoảng > 7 ngày
nếu thời tiết mát mẻ. [32]
Hoa lan Thủy tiên trắng là loại hoa lan ưa ẩm và thoáng gió. Ánh sáng từ 20 50% và độ ẩm trong không khí 70% - 80% là cây phát triển tốt. [33]
2.3. Kỹ thuật nhân giống in vitro
2.3.1. Vài nét về nhân giống in vitro
Nhân giống in vitro là một trong những ứng dụng chính của công nghệ tế bào
thực vật, sử dụng sự phát triển nhân tạo và nhân các điểm sinh trưởng hoặc các mô
phân sinh của cây. Theo các công trình thí nghiệm của Amato (1977), chỉ có đỉnh
sinh trưởng của chồi mới đảm bảo sư ổn định về di truyền, tiếp đến là mô phân sinh
với kích thước nhỏ, xử lý nhiệt để làm sạch bệnh là nguyên liệu tốt cho nhân giống.
[1]
Kỹ thuật nhân nhanh được ứng dụng phục vụ cho các mục đích chính như:
-Tạo quần thể cây trồng lớn và đồng nhất trong thời gian ngắn, với diện tích thí
nghiệm nhỏ, các điều kiện hóa lý được kiểm soát.
-Tạo được những cây con từ các loại mô như lóng thân, phiến lá, hạt phấn, phát
hoa…, mà nhân giống in vivo không thực hiện được.
-Tạo nguồn gen giống cây trồng sạch bệnh, đặc biệt là sạch virus thông qua
nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.
-Cải tiến giống, lai vô tính hay tạo giống mới bằng kỹ thuật chuyển gen.
2.3.2. Các kỹ thuật nhân giống in vitro
Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng
Theo Lê Trần Bình (1997), mô phân sinh nuôi cấy là mẫu được tách từ đỉnh

6

sinh trưởng có kích thước trong vòng 0,1mm tinh từ chóp của chóp đỉnh sinh
trưởng. Tuy nhiên trong thực tế việc nuôi cấy mẫu vật như vậy rất khó thành công,
người ta chỉ tiến hành nuôi cấy khi mục đích là làm sạch virut cho cây trồng. Nuôi
cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng được tiến hành phổ biến nhất ở các đối
tượng phong lan, dứa, mía...đỉnh sinh trưởng được tách với kích thước 5-10mm. [1]
Trong nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng cần chú ý tới tương quan
giữa độ lớn chồi, tỷ lệ sống và mức độ ổn định về mặt di truyền của chồi, thông
thường nếu độ lớn của chồi tăng thì tỷ lệ sống và mức độ ổn định di truyền tăng
nhưng hiệu quả kinh tế giảm và ngược lại. Nếu xét về nguồn gốc các cây tái sinh từ
nuôi cấy nguyên liệu ban đầu là mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng thì có ba khả
năng: cây phát triển từ chồi đỉnh (chồi ngọn); cây phát triển từ chồi nách phá ngủ;
cây phát triển từ chồ mới phát sinh. Tuy nhiên trong thực tế rất khó phân biệt được
chồi phá ngủ và chồi mới phát sinh. [17]
Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây
Vì tế bào thực vật có tính toàn năng nên ngoài khả năng tái sinh từ mô phân
sinh và đỉnh sinh trưởng, tế bào thực vật còn có thể tái sinh từ các bộ phận sau:
đoạn thân ở các đối tượng như thuốc lá, cam, chanh; mảnh lá như thuốc lá, cà chua,
bắp cải; cuống lá ở Nacissus; các bộ phận của hoa như súp lơ, lúa mì; nhánh củ ở
hành tỏi.
Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo
Trong điều kiện môi trường nuôi cấy chứa nhiều auxin, mô sẹo được hình
thành. Mô sẹo là một khối tế bào phát triển không có định hướng. Trong môi trường
phù hợp, mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Nuôi cấy mô sẹo được
thực hiện đối với những loài thực vật không có khả năng nhân giống đỉnh sinh
trưởng hoặc đối với những loại mẫu nuôi cấy không thể trực tiếp hình thành chồi.
Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ và từ một cụm tế bào mô sẹo
có thể tái sinh cùng một lúc cho nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy
nhiên mức độ biến dị tế bào soma rất cao trong quá trình nuôi cấy để tạo mô sẹo. [2]

7

2.3.3. Quy trình nhân giống in vitro
Nhân giống in vitro đã được chia thành 5 giai đoạn khác nhau, mỗi giai đoạn có
một chức năng riêng:
Giai đoạn 0: Chuẩn bị cây mẹ
Giai đoạn 1: Khử trùng mẫu cấy
Bảng 2.1. Các chất dùng khử trùng với nồng độ và thời gian khuyến cáo

Khử trùng mẫu cấy là giai đoạn tối quan trọng quyết định toàn bộ quá trình
nhân giống in vitro. Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra được nguyên liệu vô
trùng để đưa vào nuôi cấy in vitro.
Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên. Tuy
vậy, nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần
thử chắc chắn sẽ đạt kết quả.
Giai đoạn 2: Tái sinh và nhân nhanh
Mục đích của giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mô cấy.
Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất
auxin/cytokinin ngoại sinh được đưa vào môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, bên cạnh
điều kiện đó cũng cần quan tâm tới tuổi sinh lý của mẫu cấy. Thường mô non, chưa
phân hóa có khả năng tái sinh cao hơn các mô trưởng thành đã chuyên hóa sâu.
Người ta cũng còn nhận thấy rằng mẫu cấy trong thời kỳ sinh trưởng nhanh của cây


8

trong mùa sinh trưởng cho kết quả rất khả quan trong tái sinh chồi. Để tăng hệ số
nhân, ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hòa

sinh trưởng (auxin, cytokinin, gibberellin…), các chất bổ sung khác như nước dừa,
dịch chiết nấm men,…kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp.Tùy
thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sự
hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi) hay kích thích sự phát triển của các chồi
nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính.
Giai đoạn 3: Sự ra rễ in vitro
Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường ở giai
đoạn 2 sang môi trường tạo rễ. Thường từ 2 - 3 tuần, từ những chồi riêng lẻ này sẽ
xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này người ta thường bổ sung
vào môi trường nuôi cấy các auxin là nhóm hormon thực vật quan trọng có chức
năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy.
Giai đoạn 4: Sự thuần dưỡng
Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bước cuối cùng của quá
trình nhân giống in vitro và là bước quyết định khả năng ứng dụng quá trình này
trong thực tiễn sản xuất. Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống
dị dưỡng sang sống hoàn toàn tự dưỡng, do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại
cảnh (nhiệt độ, ánh sáng, ẩm độ, giá thể,…) phù hợp để cây con đạt tỷ lệ sống cao
trong vườn ươm cũng như ruộng sản xuất.
2.3.4. Ưu thế của nhân giống in vitro
Hệ số nhân cao, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất. Từ một cây trong
vòng 1 - 2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây. Nhân được số lượng cây lớn trong
một diện tích nhỏ, trong 1m2 có thể đến 18000 cây. [19]
Làm sạch bệnh cây trồng và cách ly chúng vơi nguồn bệnh, vì vậy đảm bảo
giống sạch bệnh; thuận tiện trong vận chuyển và bảo quản (cây giống giữ ở 40 0 C
trong hàng tháng vẫn cho tỷ lệ sống 95%). Đồng thời, có thể sản xuất quanh năm
mà không phụ thuộc vào mùa vụ, có tiềm năng công nghiệp hóa cao.


9

2.3.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến qui trình nhân giống in vitro
Ảnh hưởng từ mẫu cấy
Tùy vào mục đích thí nghiệm mà lựa chọn mẫu nuôi cấy sao cho phù hợp
đểđạt được hiệu quả cao nhất. Các nhân tố khi lựa chọn để chọn lựa mẫu nuôi cấy
bao gồm: kiểu gen, cơ quan được chọn, tuổi sinh lý, giai đoạn sinh trưởng, độ khỏe
của mẫu và nguồn mẫu. Mẫu được chọn phải được khử trùng, đảm bảo sạch bệnh,
không bị nhiễm khuẩn, nấm, virus và hoàn toàn sạch bệnh, mang đầy đủ nguồn gen
cần thiết và đảm bảo khả năng di truyền cho các cây con.
Ảnh hưởng từ nhiệt độ
Nhiệt độ thích hợp để nuôi cấy mô là từ 20 - 27º C. Nhiệt độ ảnh hưởng sâu
sắc đến sinh trưởng và phát triển cây in vitro qua những tiến trình sinh lý như hô
hấp hay hình thành tế bào và cơ quan.
Ảnh hưởng từ ánh sáng
Cường độ ánh sáng là một trong những yếu tố quan trọng trong quang hợp,
ảnh hưởng đến khả năng nuôi cấy in vitro cây có lá xanh. Tuy nhiên, ảnh hưởng đầu
tiên đến sự quang hợp là ảnh hưởng sinh lý. Ảnh hưởng quan trọng đến chồi, nhưng
lại tối cần thiết đến khả năng tạo rễ, cường độ ánh sáng cao hay thấp quá cũng đều
ảnh hưởng đến sự tăng sinh chồi. [7]
Thời gian chiếu sáng ảnh hưởng sâu sắc đến những đáp ứng sinh lý ở cây trồng
kể cả cây ngày ngắn đến những cây ngày dài và những cây thân gỗ. Đối với cây
trồng in vitro, thời gian chiếu sáng khoảng từ 10 – 15 h/ngày.
Chất lượng ánh sáng ảnh hưởng trực tiếp đến cây in vitro vì ánh sáng cao hơn
ánh sáng đỏ hay ánh sáng đỏ có ảnh hưởng đến biến đổi sinh lý trên cây như ra hoa,
chế độ dinh dưỡng và những hiện tượng khác như tăng sinh chồi in vitro bằng cách
xử lý cây mẹ với ánh sáng đỏ, ánh sáng đỏ và cao hơn ánh sáng đỏ ảnh hưởng đến
khả năng ra rễ của cành cắt in vitro.
Ảnh hưởng từ môi trường nuôi cấy
Một trong những yếu tố quan trọng nhất của sự phát triển và tăng trưởng hình

10

thái tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy mô và thành phần môi trường nuôi
cấy.Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy thuộc theo
loàivà bộ phận nuôi cấy. Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí
nghiệm thì thành phần môi trường cũng sẽ thay đổi. Môi trường còn thay đổi tùy
theo các giai đoạn phát triển của mẫu cấy. Môi trường nuôi cấy thông thường luôn
đầy đủ năm thành phần sau:
-Khoáng đa lượng
-Khoáng vi lượng
-Vitamin
-Nguồn Cacbon
-Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Tuy nhiên dựa theo mục đích thí nghiệm, người ta còn có thể bổ sung một số
các chất hữu cơ bổ sung như: nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai tây,...
cùng với chất làm thay đổi trạng thái môi trường: các loại agar.
Khoáng đa lượng
Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây
trồng trong điều kiện tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là
nitrogen, phosphorus, potassium, calcium, magnesium, sắt.
a. Nguồn nitrogen
Mô, tế bào thực vật trong nuôi cấy có thể sử dụng nitrogen khoáng như ammonium
và nitrate, đồng thời cũng sử dụng các dạng nitrogen hữu cơ như amino acid. Tỷ lệ
ammonium và nitrate thay đổi tùy theo loại cây và trạng thái phát triển của mô.
Nitrate được cung cấp dưới dạng muối Ca(NO3)2.4H2O, KNO3, NaNO3 hoặc
NH4NO3. Ammonium được cung cấp dưới dạng (NH2)2SO4 hoặc NH4NO3. Trong
một số ít trường hợp có thể cung cấp dưới dạng urea. Tổng nồng độ của NO3+ và
NH4- trong môi trường thay đổi tùy theo đối tượng nghiên cứu mục đích nghiên cứu
thí nghiệm. [13]
b. Nguồn Phosphorus

11

Phosphorus là nguyên tố quan trọng trong đời sống thực vật. Nó tham gia vào
vận chuyển và chuyển hóa năng lượng, sinh tổng hợp protein, acid nucleic và tham
gia vào cấu trúc màng. Trong môi trường nuôi cấy, P được cung cấp dưới dạng
mono hay dihydrogenphosphate potassium hoặc sodium. Ion phosphate hóa trị 1 và
2 có thể chuyển đổi lẫn nhau tùy thuộc vào độ pH.
c. Potassium
Kali là cần thiết để kích hoạt một số hệ thống enzyme, sự chuyển vị của
carbohydrate. K+ là một cation chủ yếu trong cây, giúp cây cân bằng các anion vô
cơ và hữu cơ. Ion K+ được chuyển qua màng tế bào dễ dàng và có hai vai trò chính
là điều hòa pH và áp suất thẩm thấu của môi trường nội bào. [13]
d. Magnesium
Magnesium là nguyên tố cần thiết cho sự sinh tổng hợp diệp lục tố và đồng
thời nó cũng tham gia vào cấu trúc của một số enzyme như enzyme vận chuyển
phosphate. Ion Mg+ là một ion linh động, có thể khuếch tán vào trong tế bào như
K+ vì vậy nó cũng có vai trò như một cation và có thể trung hòa anion và các acid
hữu cơ. Môi trường nuôi cấy mô thực vật thường chứa Mg với nồng độ không thay
đổi nhiều (trung bình 6,8 mM hoặc 5,3 mM). Thường MgSO4 là nguồn duy nhất bổ
sung nguồn ion Mg2+ cho mô nuôi cấy.
e. Calcium
Calcium cũng là một cation chủ yếu giúp cân bằng các anion trong cây.
Calcium có chức năng như một thành phần cấu trúc của thành tế bào, trong sự phân
chia và kéo dài tế bào. Calcium có khả năng liên kết các phân tử sinh học lại với
nhau do đó nó góp phần vào trong cấu trúc và hoạt động sinh lý màng tế bào và ở
phiến giữa thành tế bào. Sự hoạt động của nhiều loại enzyme khác của thực vật
cũng phụ thuộc vào ion Ca2+ vì calcium là đồng yếu tố với những enzyme phân giải
ATP.

Trong nuôi cấy tế bào ion Ca2+ đảm nhiệm vai trò trong sự phát sinh hình thái
đồng thời là sự cảm ứng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật đặc biệt là