TỐI ưu hóa điều KIỆN TÁCH CHIẾT POLYPHENOL từ lá đào TIÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP RSM và KHẢO sát KHẢ NĂNG KHÁNG OXY hóa từ lá và QUẢ đào TIÊN (crescentia cujute)

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT
POLYPHENOL TỪ LÁ ĐÀO TIÊN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP RSM VÀ KHẢO
SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA TỪ
LÁ VÀ QUẢ ĐÀO TIÊN (Crescentia
cujute)
Người hướng dẫn: Th.S ĐOÀN THIÊN THANH
Người thực hiện: TRẦN VƯƠNG GIA ĐẠI
Lớp:

14060301

Khoá:

18

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2019


TÓM TẮT
Sinh viên:

Trần Vương Gia Đại

Đề tài:”Tối ưu hóa điều kiện tách chiết polyphenol từ lá đào tiên bằng phương

pháp RSM và khảo sát khả năng kháng oxy hóa từ lá và quả đào tiên
(crescentia cujute L.)”.
Giảng viên hướng dẫn:

Th.S Đoàn Thiên Thanh

Địa điểm:

Phòng thí nghiệm Hóa Nông – Viện Công Nghệ Hóa

Học Thành phố Hồ Chí Minh
Đề tài này thực hiện nhằm khảo sát điều kiện thích hợp nhất để tách chiết
polyphenol từ lá và quả đào tiên. Từ đó, tối ưu hóa quy trình tách chiết polyphenol
từ mẫu có hàm lượng polyphenol cao hơn để thu nhận hàm lượng polyphenol cao
nhất và đánh giá sự tương tác qua lại giữa các yếu tố khảo sát ảnh hưởng đến hàm
lượng polyphenol. Bên cạnh đó, còn khảo sát khả năng kháng oxy hóa từ cao chiết
lá và quả đào tiên. Kết quả của đề tài nghiên cứu như sau:
Điều kiện thích hợp nhất để thu hàm lượng polyphenol từ lá đào tiên là: dung
môi methanol 60% với tỉ lệ nguyên liệu và dung môi là 1:20 trong thời gian 24 giở
ở nhiệt độ phòng. Và sau khi thực hiện phương pháp RSM, thì giá trị tối ưu để thu
được hàm lượng polyphenol từ lá đào tiên là dung môi methanol 59,3% với tỉ lệ
nguyên liệu và dung môi là 1:23,3 trong thời gian 30,73 giở ở nhiệt độ phòng. Điều
kiện thích hợp nhất để thu hàm lượng polyphenol từ quả đào tiên là: dung môi
methanol 70% với tỉ lệ nguyên liệu và dung môi là 1:15 trong thời gian 24 giở ở
nhiệt độ phòng.
Cao chiết từ lá đào tiên thể hiện hoạt tính chống oxy hóa tương đối cao với
giá IC50 của khả năng bắt gốc tự do DPPH là 39,79 (mg/mL). Cao chiết từ lá đào
tiên thể hiện hoạt tính chống oxy hóa với giá IC50 của khả năng bắt gốc tự do DPPH
là 77,22 (mg/mL).

CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng cây cỏ từ thiên nhiên để chữa bệnh và làm
nguồn dược liệu quí báu trong dân gian. Nước ta có diện tích tương đối không rộng
lớn nhưng có đường bờ biển dài và khí hậu nhiệt đới gió mùa, lượng mưa hằng năm
khá cao. Những điều kiện thuận lợi như vậy đã góp phần tạo nên một hệ sinh thái
thực vật đa dạng và phong phú. Theo thống kê gần đây, ước tính đất nước Việt Nam
có khoảng 10.000 loài, và có khoảng hơn 3.000 loài thực vật được sử dụng để làm
dược liệu trong dân gian. Vậy nên còn rất nhiều loài cây chưa được khai thác và đào
sâu vào công dụng của nó hoặc tìm hiểu được công dụng nhưng rất ít phổ biến rộng
rãi.
Ngày nay, khi con người luôn luôn dành sự quan tâm đặc biệt cho các vấn đề
liên quan đến sức khỏe và sắc đẹp thì các hợp chất thiên nhiên trong các loại cây cỏ
thiên nhiên lại được chú ý đến rất nhiều. Gốc tự do là một trong nguyên nhân gây ra
nguyên nhân lão hóa và rất nhiều bệnh tật bao gồm các bệnh lý về não, mắt, hệ
miễn dịch,… Ở mức độ nặng, gốc tự do còn gây nên ung thư các cơ quan. Từ đó,
các hợp chất tự nhiên có trong thảo dược như flavonoid, vitamin A, vitamin E,
anthocyanin,… được chú ý đến và sử dụng vì có thể bảo vệ cơ thể bằng khả năng
trung hòa các gốc tự do của chúng.
Hiện nay, các nhà khoa học đã tìm ra được rất nhiều hợp chất tự nhiên có tác
dụng nhất định đối với cơ thể trong các loài thảo dược, đưa các hợp chất này dưới
dạng thực phẩm chức năng và đưa ra thị trường. Các hợp chất tự nhiên có những ưu
điểm vượt trội hơn so với các hợp chất hóa học tổng hợp như hoạt tính kháng oxy
hóa, khả năng kháng khuẩn, kháng nấm,…
Cây đào tiên (crescentia cujute L.) được biết đến như là một loài thực vật
được sử dụng để lấy dược liệu chữa bệnh trong dân gian như ho, nhuận tràng, kích
thích tiêu hóa,… rất hiệu quả. Từ các bài báo cáo về nghiên cứu sơ bộ của đào tiên,

người ta tìm thấy trong thành phần hóa học của cây có chứa một lượng polyphenol.
Đây là một trong những hợp chất tự nhiên trong thực vật có hoạt tính kháng oxy
hóa, có ý nghĩa đối với sức khỏe con người.
Quá trình trích ly được biết đến rộng rãi như là một quá trình tách chiết hợp
chất có hoạt tính sinh học từ nguyên liệu (Chew et al.,2011). Quy trình khảo sát các
yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly hợp chất tự nhiên nhằm tìm được các điều
kiện thích hợp nhất cho hàm lượng hợp chất cao nhất thường được thực hiện theo
phương pháp truyền thống. Đó là, thay đổi theo các mức độ của một yếu tố và cố
định thông số của các yếu tố còn lại. Tuy nhiên, phương pháp truyền thống không
thể hiện được sự tương quan qua lại giữa các yếu tố với nhau trong một quy trình.
Để giải quyết vấn đề nêu trên thì phương pháp đáp ứng bề mặt (Response Surface
Method) ra đời. Đây là là phương pháp sử dụng toán học và xử lí thống kê cho phép
nghiên cứu sự tương tác giữa các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của quy trình,
đồng thời đưa ra dự đoán về giá trị tối ưu của các yếu tố (Plackett & Burman,
1946).
Từ những điều trên, đề tài:”Tối ưu hóa điều kiện tách chiết polyphenol từ
lá đào tiên bằng phương pháp RSM và khảo sát khả năng kháng oxy hóa từ lá
và quả đào tiên (crescentia cujute L.)” được thực hiện.


1.2 Mục đích đề tài
Tối ưu hóa các điều kiện tách chiết polyphenol từ lá đào tiên (crescentia
cujute L.) bằng phương pháp RSM nhằm tìm kiếm được các giá trị tối ưu của
các yếu tố ảnh hưởng nhằm thu được hàm lượng polyphenol cao nhất. Đồng
thời, sử dụng cao chiết để khảo sát khả năng kháng oxy hóa từ lá và quả đào
tiên.
1.3 Yêu cầu
Xác định các điều kiện cơ bản thích hợp nhất để tách chiết polyphenol từ lá và
quả đào tiên. Xác định được các giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng đến hàm
lượng polyphenol tách chiết được và thể hiện được sự tương tác giữa các yếu tố.

Xác định khả năng kháng oxy hóa của cao chiết từ lá và quả đào tiên.


CHƯƠNG II: TỔNG QUAN
2.1 Giới thiệu về cây đào tiên
2.1.1 Vị trí phân loại thực vật

Hình 2.1 Cây Đào Tiên (Crescentia cujete)
(Nguồn: />Danh pháp khoa học:

Crescentia cujete

Giới:

Plantae

(không phân hạng):

Angiospermae

(không phân hạng):

Eudicots

(không phân hạng):

Asterids

Bộ:

Lamiales

Họ:

Bignoniaceae

Chi:

Crescentia

Loài:

Crescentia cujute L. (Đỗ et al.,2004)

Tên gọi khác:

Cây bòng, cây trường thọ


2.1.2 Đặc điểm hình thái
Đào tiên là cây thuộc dạng thân gỗ trung bình, trong điều kiện tự nhiên có
thể đạt chiều cao trên 6m, tán lá rộng, xanh tươi quanh năm. Cây ra hoa và quả
quanh năm, sinh trưởng với tốc độ trung bình, sống được ở các điều kiện thời tiết
khác nhau. Cây ưa sáng, nhu cầu nước trung bình, nhân giống từ hạt. (Phạm et
al.,1999)
Lá xanh đậm, nhẵn, dày cứng, dạng thuôn dài mọc thành vòng, lá hình
muỗng, thon hẹp dài ở gốc, chóp thon, dài 10-15cm, rộng 3-4 cm, mọc khít nhau
thành chùm 3 lá hay hơn, đuôi lá men cuống. (Hình 2.2a)
Hoa thường mọc đơn độc ở đầu cành hay kẽ lá, to, buông rũ xuống, với cánh
tràng màu vàng xanh, gốc màu đỏ tía, điểm các hạt nhỏ, hợp thành ống loe ở đỉnh

trên chia thành 2 môi, có 4 nhị. (Hình 2.2b)
Quả mọng hình cầu hoặc hình trứng đường kính 6-12 cm, giống dạng quả
bưởi, vỏ quả cứng có màu xanh; trong quả có thịt (còn gọi là cơm hay nạc), màu
trắng, vị chua, trong đó có nhiều hạt dẹt nhỏ, vỏ hạt dày và cứng. Nhưng cơm quả
một khi nạo ra, để ngoài trời rất nhanh chóng bị chuyển sang màu đen. (Hình 2.2a)

b

a

Hình 2.2 Bộ phận của cây đào tiên
a) Quả và lá

b) Hoa

(Nguồn: /> />

2.1.3 Nguồn gốc, phân bố
Họ núc nác (Bignoniaceae) là một họ lớn với rất nhiều chi, chủ yếu là ở vùng
nhiệt đới trừ một số chi ở vùng ôn đới. Chi Crescentia là một chi của 7 loài ở vùng
nhiệt đới châu Mỹ từ Mexico và Tây Ấn đến vùng Amazon của Brazil. Cây đào tiên
(Crescentia cujute) là một loài cây được trồng rộng rãi trong suốt thời tiền sử và
phạm vi ban đầu của nó vẫn chưa được khám phá ra. (Phạm et al., 2006)
Ngày nay, đào tiên được trồng ở hầu khắp các nước nhiệt đới Cựu lục địa. Có
hai loài được nhập vào Đông Nam Á là C. alata và C. cujete. Ở Việt Nam, chi
Crescentia chỉ có một đại diện là đào tiên (C. cujete), và được trồng ở chủ yếu là
các tỉnh ở phía nam, từ Quảng Ngãi, Bình Định đến hầu hết các tỉnh ở đồng bằng
sông Cửu Long.
Cây đào tiên là cây ưa sáng, ưa khí hậu nóng ẩm của vùng nhiệt đới, cũng có
thể sinh sống ở mọi điều kiện khác nhau kể cả điều kiện khắc nghiệt nhất, trồng

được trên nhiều loại đất. Tuy nhiên cũng cần phải chăm sóc cây đúng cách không
nên để cây thiếu nước sẽ héo cho ra quả không mọng, đẹp. Thời điểm thích hợp
nhất để trồng cây non chính là mùa xuân, khi đất ẩm ướt và có mưa phùn. Cây con
sẽ phát triển nhanh đặc biệt là không phải chăm quá nhiều.
Muốn cho cây đào tiên được ra hoa và kết được nhiều quả, chúng ta cần có
những kế hoạch cũng như cách chăm sóc vô cùng kỹ lưỡng. Bởi lẽ cây đào tiên có
quả mang lại giá trị vô cùng lớn. Yêu cầu về đất trồng phải đảm bảo đủ dinh dưỡng
ở mức trung bình, thông thoáng và thoát nước tốt, có hàm lượng hữu cơ cao. Trong
quá trình trồng cây Đào tiên cần phải bón phân lân và phân đạm để kích thước tăng
trưởng cho cây. Mỗi năm nên bón khoảng 4 lần chia đều theo các tháng.
Quá trình trồng cây đào tiên cần để ý tới các loại sâu bệnh như thối gốc, chảy
mủ…Những loại bệnh này sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho loài nấm Phythopthora
spp phát triển. Cần phải tránh những loại bệnh này bằng cách phun thuốc Aliette
2,5%, Ridomil 2% để phòng bệnh. Ngoài ra cây đào tiên cũng hay bị bệnh loét, sâu
bò vẽ, bọ xít xanh, sâu đục thân đục cành cần phòng trừ bệnh ngay từ đầu. Để đảm


bảo không bị hưởng bởi thuốc bảo vệ thực vật có thể tự bắt sâu bằng móc sắt, hoặc
phun những loại thuốc đặc trị theo hướng dẫn trên bao bì.
Cây đào tiên có thời gian trồng và thời gian thu hoạch khoảng từ 4-5 năm so
với các giống cây ăn quả khác. Quả đào tiên có hình cầu hoặc hình trứng, trông
giống như quả bưởi, lớp vỏ màu xanh, lúc non mỏng, già vỏ cứng dần.
2.1.4 Thành phần hóa học và tác dụng dược lý
Vỏ rễ đào tiên chứa β – sitosterol, acid ursolic, acid vanillic và acid 4 –
hydroxybenzoic. Quả thu hái ở Việt Nam chứa 15 chất, trong đó có 3 iridoid
glucosid, 5 iridoid, 2 chất 3 – hydroxyoctanol glycoside, 3 chất 2,4 – pentanediol
glycoside và 2 chất 4 – hydroxyl – 2 pentanon. (Đỗ et al.,2004)
Cao methanol vỏ rễ đào tiên có tác dụng ức chế các vi khuẩn gram dương.
Acid vanillic có nồng độ ức chế thấp nhất là 125 và 175 µg/ml đối với
Staphylococcus aureus và Bacillus subtilis tương ứng; và acid 4 – hydroxybenzoic

có nồng độ ức chế thấp nhất là 250 µg/ml đối với cả hai chủng vi khuẩn. (Đỗ et
al.,2004)
2.1.5 Công dụng
Quả đào tiên có thể ăn được nhưng phần lớn loại quả này được dùng làm
thuốc chữa bệnh. Do thành phần quả đào tiên có nhiều dược tính có thể điều trị
đươc khá nhiều loại bệnh có thể kể đến như nhuận trường, tẩy xổ và trị tình trạng
mất ngủ khá hiệu quả. (Đỗ et al.,2004).
Theo một số tài liệu cũng có nói rằng quả đào tiên có tác dụng tăng cường
tuổi thọ, trị được suy nhược cơ thể, dưỡng sinh lực và điều hòa được kinh lạc...
Ngoài ra, đào tiên còn làm siro trị viêm họng, ho, viêm họng mạn. Nhân hạt đào vị
đắng ngọt, tính bình, có công hiệu phá huyết tan ứ, có tác dụng hoạt huyết hành
huyết, làm tan huyết tự ứ, làm tan đờm, nhuận tràng, điều hòa chức năng cơ quan hô
hấp, giảm ho.


Trong điều trị lâm sàng, đào nhân còn thường dùng chữa trị bế kinh, đau
bụng kinh, cao huyết áp, viêm ruột thừa, tụ huyết sưng đau do chấn thương. Đối với
chứng liệt nửa người do tắc nghẽn mạch máu, đào nhân cũng có tác dụng điều trị
nhất định. Còn phần rễ đào dùng ngoài da có tác dụng chữa sưng đau, sắc uống có
thể chữa bệnh viêm gan vàng da. Nếu thường xuyên ăn trái đào tiên này nó còn giúp
bạn tăng cường tuổi thọ, trị được những suy nhược cơ thể hàng ngày, giúp điều hòa
kinh lạc…Nếu lấy trái đào tiên còn chưa chín hết sẽ có công dụng đặc biệt giúp
nhuận tràng, chống táo bón.
Ở một số nước khác, phần cơm của quả đào tiên được người ta nấu chín với
đường tạo thành một chất siro chữa ho hiệu quả. Phần vỏ đào tiên còn được các
nghệ nhân sử dụng để tạp hình, khắc chữ, khắc hình họa lên vỏ làm đồ thủ công mỹ
nghệ rất đẹp và đem lại giá trị kinh tế cao. Còn với người Việt ta, theo như kinh
nghiệm dân gian cha ông ta để lại, cây đào tiên có tính thảo dược, người ta dùng
quả để chữa nhiều bệnh như nhuận trường, tẩy xổ, làm mứt dẻo, chữa các chứng
mất ngủ, ăn không ngon…

 Một số bài thuốc kết hợp từ quả đào tiên:
Lấy quả chín xào với rượu đế trắng, còn nóng để vào vải mỏng, đắp lên chỗ đau,
bó lại hoặc bóp tay chân, có thể trị đau nhức khớp. Nếu dùng quả chín phơi thả
sương 1 đêm, sau đó phơi 2 nắng, ngâm rượu đế thơm ngọt và uống, sẽ có tác dụng
trị nhức mỏi.
Cơm quả đào tiên phơi khô cho héo, đem sắc nước uống sẽ giúp ăn được, ngủ
được; làm êm dịu những trường hợp bị căng thẳng thần kinh, tim hồi hộp; giúp
người gầy yếu, suy dinh dưỡng cảm thấy khỏe hơn; giúp bổ phổi, chữa ho và làm dễ
thở trong những trường hợp bị suyễn.
Bên cạnh đó, lấy cơm trái đào tiên cho vào rượu gạo với tỉ lệ 1:5 rồi ngâm từ 710 ngày, sau khi ngâm mỗi ngày bạn uống từ 2-3 lần, mỗi lần 30ml trước khi ăn
đảm bảo bạn sẽ ăn ngon miệng hơn rất nhiều đặc biệt nó rất tốt cho tiêu hóa nữa.


Nhuận trường, tẩy xổ, bằng cách dùng ruột quả đào tiên làm mứt dẻo, ngày dùng
3 lần, mỗi lần khoảng 10g sau bữa ăn.
Làm thuốc trị tình trạng ăn uống kém, mất ngủ và dùng làm thuốc bổ bằng cách
sau khi hái quả đào tiên xuống, để từ lúc có vỏ màu xanh chuyển sang màu đen, đập
lấy phần thịt bên trong (cũng màu đen) để ngâm rượu. Cứ ngâm 200g thịt quả đào
tiên kèm 10 quả chuối sứ khô nướng vàng và đem ngâm với 2 lít rượu ngon, ngâm
10 ngày là có thể lấy ra dùng được. Ngày dùng 3 lần, mỗi lần một ly nhỏ. Nên dùng
trước bữa ăn.
Giúp hỗ trợ trị ung thư gan, bổ thận bằng quả đào tiên già chín cây cắt làm đôi,
lấy ruột đen đem xào với khoảng 100g đường phèn. Nên nhớ: không đổ nước lã
vào, để lửa nhỏ, xào liên tục trong khoảng 40 phút (giống như nấu chè đặc). Bên
cạnh đó, bài thuốc này có thể giúp dễ đi tiêu và tăng cường khả năng chịu đựng của
con người với khí hậu nóng, lạnh bên ngoài, làm hạ huyết áp, êm dịu thần kinh.
Ở một số địa phương khác, quả đào tiên thường được dùng để ngâm rượu giúp
bồi bổ sức khỏe, trị ăn kém, mất ngủ...Bằng cách hái quả đào tiên để từ quả có vỏ
màu xanh chuyển sang màu đen, đập lấy phần thịt bên trong (cũng màu đen) để
ngâm rượu. Cứ ngâm 200 gram thịt đào tiên thì kèm 10 trái chuối sứ khô nướng

vàng và đem ngâm với hai lít rượu ngon, ngâm 10 ngày là có thể lấy ra dùng được.
Ngày dùng 3 lần, mỗi lần một ly nhỏ (30 ml), dùng trước bữa ăn.
2.1.6 Một số nghiên cứu về cây đào tiên
2.1.6.1 Một số nghiên cứu trong nước
Mặc dù có rất nhiều ứng dụng trong y học dân gian nhưng những nghiên cứu
khoa học về cây đào tiên trong nước vẫn còn rất hạn chế, hầu như không có.
Nghiên cứu khảo sát thành phần hóa học cao ethyl acetate của vỏ cây đào
tiên ở Phòng thí nghiệm Hợp chất Tự nhiên và Hóa dược, Khoa Hóa, Trường Đại


học Khoa Học Tự Nhiên – ĐHQG Tp. Hồ Chí Minh được thực hiện bởi Phạm Đức
Nhuận, Nguyễn Thị Thảo Ly, Nguyễn Diệu Liên Hoa vào năm 2015. Kết quả cho
thấy sự hiện diện của hợp chất acid oleanolic, acid 4-hydroxybenzoic, methyl 4hydroxybenzoic và acid vanillic thông qua quá trình phân lập và xác định cấu trúc
hóa học của 5 hợp chất trên từ cao etyl acetat của vỏ cây đào tiên thu hái ở thành
phố Hồ Chí Minh. (Phạm et al.,2015)
2.1.6.2 Một số nghiên cứu của nước ngoài
Nghiên cứu về hợp chất tự nhiên iridoids và iridoids glucosides từ quả đào
tiên do Tetsuo Kaneko, Nguyen Minh Duc và các cộng sự thực hiện vào năm 1997.
Nghiên cứu này sử dụng phương pháp NMR để xác nhận sự hiện diện của 8 hợp
chất iridoids và iridoid glucosides trong đó có 5 hợp chất iridoids mới có tên là
crescentins I, II, III, IV, V và 3 hợp chất iridoid glucosides mới có tên là
crescentosides A, B, C. (Kaneko et al.,1997)
Cùng năm dó, nghiên cứu về hợp chất tự nhiên n-alkyl glycosides và phydroxybenzoyloxy glucose từ quả đào tiên do Tetsuo Kaneko, Nguyen Minh Duc
và các cộng sự thực hiện. Nghiên cứu này chỉ ra rằng quả đào tiên có chứa 8 hợp
chất mới cùng với 4 hợp chất đã biết, acanthoside D, β-D-glucopyransoyl benzoate,
(R)-l-O-β-D-glucopyranosyl-l,3-octanediol, and β-D-fructofuranosyl 6-O-(phydroxybenzoyl)-α-D-glucopyranoside. Cấu trúc của những glycosides mới này
đượccấu tạo bởi 3 glycosides của (2R,4S)-2,4-pentanediol, 2 glycosides của (R)-4hydroxy-2-pentanone, 2 glycosides của (R)-l,3-octanediol và 6-O-(phydroybenzoyl)-D-glucose bằng phương pháp quang phổ và hóa học. (Kaneko et
al.,1998)
Nghiên cứu hoạt tính kháng nọc độc rắn của dịch chiết ethanol từ quả đào
tiên được thí nghiệm ở Mangalore, Ấn Độ vào năm 2012 do Shastry CS, Bhalodia

Maulik, và Aswathanarayana BJ thực hiện. Phát hiện của nghiên cứu này xác nhận
khả năng trung hòa nọc rắn trung bình của chiết xuất ethanol của quả đào tiên nhờ


vào sự hiện diện của các hợp chất tự nhiên alkaloid, flavonoid, glycoside, steroid và
tannin cần thiết cho sự phát triển của thuốc giải độc hóa học đối với nọc rắn.
(Shastry et al.,2012)

2.2 Dung môi tách chiết
Vì cây cỏ hoặc sinh khối (biomass) có cấu tạo hóa học thường là những chất
liệu đại phân tử tương đối trơ, không hòa tan trong dung môi hữu cơ. Do đó việc
khảo sát hợp chất tự nhiên được thực hiện bằng cách chiết lấy và khảo sát các chất
biến dưỡng thứ cấp có trọng lượng phân tử nhỏ.
Thông thường người ta muốn nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có tính ái dầu
(lyophilic) có mức độ phân cực khác nhau, tuy nhiên đôi khi cũng nghiên cứu các
hợp chất tự nhiên có tính ái nước (hydrophilic). Điều này được thực hiện bằng cách
chiết những hợp chất có trong cây lần lượt bằng các dung môi có tính phân cực tăng
dần hoặc chiết một lần lấy tất cả các loại hợp chất bằng cách sử dụng dung môi vạn
năng methanol (có thể chiết hầu hết các loại hợp chất tự nhiên).
Lựa chọn dung môi phải có tính trung tính, không độc, không quá dễ cháy,
hòa tan được hợp chất cần khảo sát; sau khi tách chiết xong dung môi đó có thể
được loại bỏ dễ dàng. Cần tránh các loại dung môi độc như benzene hoặc dễ cháy
do có nhiệt độ sôi thấp như diethyl ether.
Các dung môi được chia thành các nhóm không phân cực, phân cực aprotic,
và phân cực protic và được sắp xếp theo độ phân cực tăng dần. Độ phân cực được
tính bằng hằng số điện môi. (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)


Bảng 2.1 Tính chất của các dung môi phổ biến (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)
Dung môi

Công thức hóa
học

Điểm
sôi

Pentane

CH3-CH2-CH2CH2-CH3
C5H10

36°C

1.84

40°C

1.97

69°C

1.88

Cyclohexane

CH3-CH2-CH2CH2-CH2-CH3
C6H12

81°C

2.02

Benzene

C6H6

80°C

2.3

Toluene

C6H5-CH3

111°C

2.38

Chloroform

CHCl3

61°C

4.81

Cyclopentane
Hexane

Diethyl ether

Dichloromethane
(DCM)
Tetrahydrofuran
(THF)
Ethyl acetate

Hằng số
điện
môi
Dung môi không phân cực

CH3CH2-O-CH235°C
4.3
CH3
Dung môi phân cực aprotic
CH2Cl2

40°C

9.1

/-CH2-CH2-OCH2-CH2-\
CH3-C(=O)-OCH2-CH3
CH3-C(=O)-CH3

66°C

7.5

77°C

6.02

56°C

20.7

Dimethylformamide
(DMF)
Acetonitrile (MeCN)

H-C(=O)N(CH3)2

153°C

38

CH3-C≡N

82°C

37.5

Dimethyl sulfoxide
(DMSO)

CH3-S(=O)-CH3

189°C

46.7

Acetone

Dung môi phân cực protic

Tỷ
trọng

Moment
phân cực

0.626
g/ml
0.751
g/ml
0.655
g/ml
0.779
g/ml
0.879
g/ml
0.867
g/ml
1.498
g/ml
0.713
g/ml

0.00 D

1.3266
g/ml
0.886
g/ml
0.894
g/ml
0.786
g/ml
0.944
g/ml
0.786
g/ml
1.092
g/ml

1.60 D

0.00 D
0.00 D
0.00 D
0.00 D
0.36 D
1.04 D
1.15 D

1.75 D
1.78 D

2.88 D
3.82 D
3.92 D
3.96 D


Formic acid

H-C(=O)OH

101°C

58

n-Butanol

118°C

18

82°C

18

n-Propanol

CH3-CH2-CH2CH2-OH
CH3-CH(-OH)CH3
CH3-CH2-CH2-OH

97°C

20

Ethanol

CH3-CH2-OH

79°C

24.55

Methanol

CH3-OH

65°C

33

Acetic acid

CH3-C(=O)OH

118°C

6.2

Nước

H-O-H

100°C

80

Isopropanol (IPA)

1.21
g/ml
0.810
g/ml
0.785
g/ml
0.803
g/ml
0.789
g/ml
0.791
g/ml
1.049
g/ml
1.000
g/ml

1.41 D
1.63 D
1.66 D
1.68 D
1.69 D

1.70 D
1.74 D
1.85 D

2.3 Chất chống oxy hóa
Các chất chống oxy hóa là các chất làm ngăn chặn, làm chậm hoặc đảo
ngược quá trình quá trình oxy hóa các hợp chất trong tế bào của cơ thể (Jovanovic
& Simic, 2000; Lachman et al., 2000; Singh & Rajini, 2004). Dựa trên nguyên tắc
hoạt động, chất chống oxy hóa được phân loại thành bậc một và các chất chống oxy
hóa bậc hai. Các chất chống oxy hóa bậc một khử hoặc kết hợp với các gốc tự do do
kìm hãm pha khởi phát hoặc bẻ gãy dây chuyền phản ứng của quá trình oxy hóa. Ở
bậc hai, các chất này kìm hãm sự tạo thành gốc tự do (hấp thụ các tia cực tím, tạo
phức với các kim loại kích hoạt sự tạo gốc tự do như Cu, Fe, vô hoạt oxy đơn)
(Singh & Rajini, 2004; Rolland, 2004).
Hệ thống các chất chống oxy hóa của cơ thể người được cung cấp từ bên
trong và bên ngoài. Bên trong bao gồm các protein (ferritine, transferrine, albumine,
protein sốc nhiệt) và các enzyme chống oxy hóa (superoxyde dismutase, glutathion
peroxydase, catalase). Các chất oxy hóa từ bên ngoài là các cấu tử nhỏ được đưa
vào cơ thể qua con đường ăn uống như các loại vitamin C, E, các carotenoid, và các
hợp chất phenolic, các chất này có nhiều trong rau củ quả. Và được coi là các chất
chống oxy hóa tự nhiên hay còn gọi là hợp chất thứ cấp (Niki et al.,1995; Lachman
et al.,2000; Pincemail et al.,1998; Vansant et al.,1998). Chất chống oxy hóa được


coi như là chất dinh dưỡng có tác dụng giảm tác hại của các gốc tự do trên các tế
bào của cơ thể, và nó làm giảm những tổn thương bị các gốc tự do gây nên. Bên
cạnh đó, chất chống oxy hóa sẽ loại bỏ các gốc tự do để ngừa bệnh tật và giúp cải
thiện sức khỏe con người.
Chế độ ăn uống có nhiều rau quả là cách hiệu quả và đơn giản nhất nhằm
tăng cường hoạt động của hệ thống chống oxy hóa và ngăn ngừa các bệnh có nguồn

gốc stress oxy hóa. (Lại Thị Ngọc Hà & Vũ Thị Thư, 2009)

2.4 Một số hợp chất thứ cấp
2.4.1 Polyphenol (phenolic)
Hợp chất polyphenol gồm một nhóm chất tự nhiên có trong thực vật, phân tử
dạng phổ biến thường có nhiều vòng thơm mang một hoặc nhiều nhóm thế
hydroxyl. Hợp chất phenolic thường tan trong nước thường xảy ra khi kết hợp với
đường glycosides và có trong không bào. Nhiều thực vật trong tự nhiên được phát
hiện có sự hiện diện của các nhóm polyphenol khác nhau ở từng loài khác nhau.
Các hợp chất polyphenol được chia thành 3 nhóm khác nhau dựa vào cấu trúc hóa
học:
Nhóm hợp chất phenol C6-C1: acid gallic
Nhóm hợp chất phenol C6-C3: acid cafeic
Nhóm hợp chất phenol C6-C3-C6: catechin, flavonoid.
Phần lớn các hợp chất phenolic (và đặc biệt là flavonoids) có thể được phát
hiện trên sắc ký đồ dựa trên màu sắc hoặc phát huỳnh quang dưới tia cực tím. Các
sắc tố phenolic được nhận thấy rõ ràng màu vì vậy chúng được dễ dàng theo dõi
trong quá trình cô lập và tinh sạch. Các hợp chất phenolic đều có nhân thơm, do đó
đều cho thấy cường độ hấp thụ cao trong vùng UV của quang phổ. Vì vậy, phương
pháp quang phổ đặc biệt quan trọng đối với việc xác định và phân tích định lượng
hàm lượng polyphenol. (Harbone, 1973).


Hợp chất polyphenol tự nhiên đóng vai trò quan trọng trong các hệ sinh thái
mà đa số là thực vật. Ảnh hưởng của chúng trong các mô thực vật có thể được chia
thành các loại sau:
 Giải phóng và ức chế hormone tăng trưởng như auxin
 Chống bức xạ ion hóa và cung cấp sắc tố thực vật (V. Lattanzio et al.,
2006)
 Phòng chống các bệnh nhiễm trùng vi khuẩn (phytoalexins).

 Là phân tử tín hiệu trong sự chín của quả và quá trình phát triển khác.
(Huber et al.,2003)

Hình 2.3 Cấu tạo của theaflavin-3-galatte, là polyphenol có nguồn gốc từ thực vật
(ester của acid gallic và một gốc theaflavin)
(Nguồn: />2.4.2 Tannin
Tannin (hoặc tannoid) là một nhóm các chất tạo vị chát, là một polyphenol
bám vào và làm kết tủa protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác bao gồm acid amin
và alkaloid.
Các hợp chất tannin có rộng rãi ở nhiều loài thực vật, hoạt động và có chức
năng loại trừ các động vật ăn lá như sâu mọt, và vai trò trong việc điều hòa tăng
trưởng thực vật. Vị từ các tannin là nguyên nhân gây ra cảm giác khô và vị chát
trong miệng sau ăn hoa quả, uống rượu vang đỏ hoặc trà. Bên cạnh đó, cấu trúc và
hàm lượng của tannin bị thay đổi ở mỗi giai đoạn thu hoạch thực vật khác nhau.


Các gốc tự do được sinh ra và tích luỹ trong cơ thể, là nguyên nhân dẫn đến
bệnh tật và làm tăng tốc độ quá trình lão hoá cơ thể con người. Hợp chất
polyphenols trong tanin có tác dụng khử các gốc tự do ở mức độ cao. Ví dụ, acid
gallic và isoflavones có thể hấp thụ khoảng 5% với lượng catechin (flavonoid hay
flavan-3-ols) và glucoside thường thấp hơn. Các phenol hấp thụ ít nhất là
proanthocyanidins, galloylated catechin trong lá chè và anthocyanin (Manach et
al.,2005).

Acid gallic (tannin thủy phân)

Phloroglucinol (Phlorotannin)

Hình 2.4 Cấu tạo hóa học của acid gallic và phloroglucinol
(Nguồn: />

2.4.3 Terpenoid
Terpenoid, đôi khi được gọi là isoprenoid, là một nhóm lớn và đa dạng của
hợp chất hữu cơ tự nhiên có nguồn gốc từ terpen. Khoảng 60% sản phẩm tự nhiên
được biết đến là có chứa terpenoid, terpenoid chứa nhóm chức năng bổ sung thường
có oxy. (Firn R.,2010)
Terpenoid là dạng biến đổi của terpen, mà trong đó các nhóm methyl đã được
di chuyển hoặc bị loại bỏ, hoặc được thêm vào các nguyên tử oxy. Giống như
terpens, các terpenoid có thể được phân loại theo số lượng đơn vị isoprene bao gồm
các terpene gốc:
Hemiterpenoids, 1 đơn vị isoprene (5 carbon)
Monoterpenoids, 2 đơn vị isoprene (10C, có nguồn gốc từ monoterpen)
Sesquiterpenoids, 3 đơn vị isoprene (15C, có nguồn gốc từ sesquiterpen)
Diterpenoids, 4 đơn vị isoprene (20C, có nguồn gốc từ diterpen). Ví dụ:


retinols
Sesterterpenoids, 5 đơn vị isoprene (25C, có nguồn gốc từ sesterterpen).
(Specter, 2009)
Triterpenoids, 6 đơn vị isoprene (30C, có nguồn gốc từ tritepen). Ví dụ:
sterol.
Tetraterpenoids, 8 đơn vị isoprene (40C, có nguồn gốc từ tetraterpen). Ví dụ:
carotenoid.
Polyterpenoid với một số lượng lớn của các đơn vị isoprene.
Terpenoid từ thực vật được sử dụng rộng rãi nhờ vào các phẩm chất hương thơm
của nó và đóng vai trò quan trọng các phương thuốc thảo dược truyền
thống. Terpenoid tạo nên hương thơm của bạch đàn, hương quế, đinh hương, gừng,
màu vàng trong hoa hướng dương và màu đỏ trong cà chua. Những terpenoid phổ
biến thường được biết đến bao gồm tinh dầu bạc hà, long não, cannabinoid tìm thấy
trong cần sa, ginkgolide và bilobalide được tìm thấy ở loài Ginkgo biloba và
curcuminoid được tìm thấy trong củ nghệ và hạt giống mù tạt. Phương pháp

Salkowski có thể được sử dụng để xác định sự hiện diện của terpenoid. (Ayoola,
2008)

Hình 2.5 Cấu tạo của retinol (retinol là một diterpenoid)
(Nguồn: />2.4.4 Alkaloid
Alkaloid là một nhóm các hợp chất hữu cơ tự nhiên mà hầu hết đều có chứa
nguyên tố nitơ. Nhóm chất này cũng bao gồm một số hợp chất có tính trung hòa
hoặc acid yếu. Một số hợp chất có cấu trúc tương tự cũng có thể được coi như là


alkaloid. Ngoài các nguyên tố carbon, hydro và nito, alkaloid cũng có thể chứa oxy,
lưu huỳnh và các nguyên tố ở nhóm halogen và photpho. (Manske, 1965)
Alkaloid được sản xuất bởi một loạt các sinh vật gồm vi khuẩn, nấm, thực
vật và động vật, và có thể được tinh sạch từ dịch chiết thô từ những sinh vật trên
bằng chiết bằng acid-base. Alkaloid có nhiều dược tính bao gồm chống ung thư (ví
dụ như homoharringtonine), (Kittakoop et al.,2014), thuốc giảm đau (ví dụ như
morphine), (Raymond et al.,2010) kháng khuẩn (ví dụ như chelerythrine) (Qiu et
al.,2014).

Hình 2.6 Cấu tạo hóa học của colchicine alkaloid
(Nguồn: />2.4.5 Saponin
Saponin còn gọi là saponosid là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi trong
thực vật. Saponin có trong nhiều loài thực vật, cả thực vật hoang dại lẫn thực vật
gieo trồng. Có hai loại saponin, đó là saponin acid (triterpenoid saponin) và saponin
trung tính (steroid saponin). Saponin acid có mặt chủ yếu trong thực vật gieo trồng
còn saponin trung tính có mặt chủ yếu trong thực vật hoang dại, đặc biệt là trong
thảo dược. Nhóm cây đậu như đậu tương, đậu Hà lan, cỏ luzern… và một số cây cỏ
có tính chất tạo bọt như rễ cây sà phòng (soap root), vỏ cây sà phòng (soap bark)…
khá giàu saponin. (Sapa et al., 2009). Dựa vào cấu trúc của phần sapogenin, người

ta chia saponin ra làm 3 nhóm lớn là triterpenoid saponin, steroid saponin và
glycoalkaloid dạng steroid. (Riguera & Ricardo, 1997)
Dưới tác dụng của enzym có trong thực vật hay vi khuẩn hoặc do acid loãng,
saponin bị thuỷ phân thành các phần gồm genin gọi là sapogenin và phần đường
gồm một hoặc nhiều phân tử đường. Các đường phổ biến là D-glucose, D-galactose,
L-arabinose, acid galactunoic, acid D-glucuronic... Phần genin có thể có cấu trúc
cholan như sapogeninsteroi hoặc sapogenintriterpen dạng β-amirin (acid olenoic),
dạng α-amirin (acid asiatic), dạng lupol (acid buletinie) hoặc triterpen bốn vòng.
(Hostettmann & Marston, 1995)

Hình 2.6 Cấu tạo hóa học của saponin solanine
(Nguồn: />
2.5 Giới thiệu về phương pháp Response Surface Methods (RSM)
Tối ưu hóa đề cập đến việc cải thiện hiệu suất của một hệ thống, một quy
trình hoặc một sản phẩm để có được lợi ích tối đa từ nó. Thuật ngữ tối ưu hóa đã
được sử dụng phổ biến trong hóa học phân tích như là một phương tiện để tìm ra
các điều kiện để áp dụng một quy trình tạo ra phản ứng tốt nhất có thể. Theo truyền
thống, tối ưu hóa trong hóa học phân tích đã được tiến hành bằng cách theo dõi ảnh
hưởng của một yếu tố tại một thời điểm trên một phản ứng thử nghiệm. Kỹ thuật tối
ưu hóa này được gọi là một biến tại một thời điểm. Nhược điểm chính của nó là
không bao gồm các hiệu ứng tương tác giữa các biến được nghiên cứu. Để khắc


phục vấn đề này, việc tối ưu hóa các quy trình phân tích đã được thực hiện bằng
cách sử dụng các kỹ thuật thống kê đa biến. (Bezerra et al.,2008)
Trong số các kỹ thuật đa biến được sử dụng phổ biến trong tối ưu hóa phân
tích là phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM). Phương pháp phản ứng bề mặt là tập
hợp các kỹ thuật toán học và thống kê dựa trên sự phù hợp của phương trình đa thức
với dữ liệu thực nghiệm. Nó có thể được áp dụng tốt khi một phản ứng hoặc một

nhóm các phản ứng quan tâm bị ảnh hưởng bởi một số biến. Mục tiêu là để tối ưu
hóa mức độ của các biến này để đạt được hiệu năng quy trình tốt nhất. (Bezerra et
al.,2008)
2.5.1 Nguyên tắc
Một số giai đoạn trong việc áp dụng RSM như một công nghệ tối ưu hóa như
sau:
1. Thí nghiệm khởi đầu. Tiến hành các thí nghiệm sàng lọc (screening
design) nhằm lựa chọn các biến thí nghiệm sẽ tiếp tục được khảo sát,
tiếp đến phân tích mô hình rút gọn (đã loại bỏ các yếu tố ảnh hưởng
không đáng kể), nhằm xây dựng mô hình hồi quy bậc nhất mô tả hàm
mục tiêu.
2. Lựa chọn thiết kế thí nghiệm và thực hiện các thí nghiệm theo ma trận
thí nghiệm đã chọn.
3. Xử lý thống kê về toán học của dữ liệu thực nghiệm thu được thông
qua sự phù hợp của hàm đa thức.
4. Đánh giá hiệu suất của mẫu.
5. Xác minh sự cần thiết và khả năng thực hiện chuyển vị hướng tới khu
vực tối ưu
6. Có được các giá trị tối ưu cho từng biến được nghiên cứu.
Nhiều biến số có thể ảnh hưởng đến phản ứng của hệ thống nghiên cứu và
thực tế không thể xác định và kiểm soát các ảnh hưởng nhỏ từ mỗi biến số. Do đó,
cần phải chọn các biến có tác dụng chính. Thiết kế sàng lọc nên được đưa ra để xác
định biến nào trong số một số biến thực nghiệm và tương tác của chúng có ảnh


hưởng quan trọng hơn. Thiết kế giai thừa hai cấp đầy đủ hoặc phân đoạn có thể
được sử dụng cho mục tiêu là chủ yếu vì chúng hiệu quả.
Mô hình đơn giản nhất có thể được sử dụng trong RSM dựa trên hàm tuyến
tính. Đối với ứng dụng của nó, điều cần thiết là các phản ứng thu được phải phù hợp
với phương trình sau:

Trong đó, k là số lượng biến, β0 là số hạng không đổi, βi là các hệ số của các tham
số tuyến tính, xi đại diện cho các biến số và ε là phần dư liên quan đến các thí
nghiệm.
Do đó, để đánh giá độ cong, phải sử dụng đến mô hình bậc hai và một điểm
trung tâm trong thiết kế giai thừa hai cấp có thể được sử dụng. (Bezzera et al.,2008)
2.5.2 Công dụng của phương pháp RSM
 Là một phương pháp thống kê thực tế hiệu quả được áp dụng vào những quy
trình, thí nghiệm, thử nghiệm nhằm tiên đoán giá trị tối ưu của các yếu tố,
qua đó có thể tiết kiệm được chi phí và thời gian.
 Thể hiện được sự phản hồi qua lại lẫn nhau giữa các yếu tố khảo sát.
 Thu gọn phạm vi của các mức yếu tố khác nhau dẫn đến làm hợp lý hóa các
thông số kỹ thuật yêu cầu của nghiên cứu hoặc quy trình đó.
 Đảm bảo sự tương quan giữa các mô hình dự đoán và kết quả thực nghiệm.
 Mô tả kết quả tối ưu thông qua việc tối ưu hóa các yếu tố đưa ra của nghiên
cứu. (Khuri & Mukhopadhyay, 2010)
2.5.3 Ưu, nhược điểm của phương pháp RSM
 Ưu điểm:
- Có giá trị thực tế vì dữ liệu có được dựa trên thực nghiệm.
- Có thể áp dụng được nhiều quy trình, hệ thống, thí nghiệm nào có
-

các yếu tố khảo sát và sự ảnh hưởng nhất định của các yếu tố đó.
Thiết kế được thí nghiệm tối ưu một cách dễ dàng, nhanh chóng.
Tiết kiệm được chi phí và thời gian của đơn vị thực hiện. (Khuri &
Mukhopadhyay, 2010)


 Nhược điểm:
- Chưa chính xác hoàn toàn vì sự phản hồi sẽ không có giá trị đối

với những ảnh hưởng khác nằm ngoài các yếu tố được khảo sát.
(Khuri & Mukhopadhyay, 2010)
2.5.4 Một số mô hình thí nghiệm phổ biến trong phương pháp RSM
2.5.4.1 Mô hình Box-Behnken design (BBD)
Thiết kế này được phát triển bởi Box và Behnken vào năm 1960, nó cung
cấp 3 cấp độ cho mỗi yếu tố và bao gồm một tập hợp con cụ thể của các yếu tố. Box
và Behnken đã đề xuất cách chọn điểm từ sắp xếp của giai thừa ba cấp, cho phép
ước tính hiệu quả các hệ số bậc nhất và bậc hai của mô hình toán học. Theo cách
này, thí nghiệm sẽ hiệu quả và tiết kiệm hơn đối với thiết kế 3k tương ứng của
chúng. Việc sử dụng thiết kế BBD rất phổ biến trong nghiên cứu hoặc công nghiệp
vì đây là một thiết kế kinh tế và chỉ yêu cầu 3 cấp độ cho mỗi yếu tố được thiết lập
là −1, 0, 1. Bên cạnh đó, mô hình BBD được sắp xếp trong một khối đa diện, gần
như một hình cầu. Số thí nghiệm phải thực hiện là N= 2k (k-1) + cp trong đó k là
các yếu tố và cp (central points) là số thí nghiệm ở giá trị trung tâm được thực hiện
lặp lại. (Pazman, 1986)

Hình 2.6 Mô hình mô phỏng Thiết kế thí nghiệm dựa trên nghiên cứu tất cả
các yếu tố ở 3 cấp độ: thiết kế giai thừa ba cấp để tối ưu hóa (a) 2 yếu tố và (b) 3
yếu tố
(c) Thiết kế Box Behnken để tối ưu hóa 3 yếu tố. (Bezarra et al., 2008).


Ta có thể dễ dàng nhận thấy hình 2 (c) mô phỏng thiết kế Box Behnken để
tối ưu hóa 3 yếu tố với 13 điểm thử nghiệm. Trong khi đó thiết kế giai thừa tối ưu
hóa 33 ban đầu với 27 thí nghiệm (Hình 2 (b)), thì rõ ràng phương pháp RSM –
BBD kinh tế và hiệu quả hơn.
Mô hình BBD được áp dụng cho 3 yếu tố bao gồm tổ hợp 15 thí nghiệm,
trong đó có thí nghiệm trung tâm được thực hiện lặp lại 3 lần theo ma trận sau:

Bảng 2.2 Mô hình thiết kế thí nghiệm theo phương pháp RSM – BBD

Thí nghiệm

X1

X2

X3

1

-1

1

0

2

0

-1

-1

3

1

0

-1

4

0

1

1

5

0

0

0

6

0

0

0

7

1

1

0