Luận văn nghiên cứu nhân giống cây oải hương lá xẻ bằng kỹ thuật nuôi cấy mô và vi thủy canh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
===

===

NGUYỄN THỊ THÚY MAI

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY
OẢI HƢƠNG LÁ XẺ (LAVANDULA DENTATA L.)
BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ

VÀ VI THỦY CANH

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
===

===

NGUYỄN THỊ THÚY MAI

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY
OẢI HƢƠNG LÁ XẺ (LAVANDULA DENTATA L.)
BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ

VÀ VI THỦY CANH
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. LA VIỆT HỒNG

HÀ NỘI - 2018


LỜI CẢM ƠN
Trƣớc hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến
TS. La Việt Hồng đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn ban Lãnh đạo trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà
Nội 2, Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội
2, đã tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận văn này.
Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận đƣợc sự giúp đỡ tận
tình của cô Mai Thị Hồng - Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật đã giúp đỡ,
đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành luận văn này, nhân đây tôi cũng xin chân
thành cảm ơn.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, tạo mọi
điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học tập cũng nhƣ hoàn thành
luận văn.
Mặc dù đã hết sức cố gắng nhƣng do điều kiện thời gian và trình độ
chuyên môn còn nhiều hạn chế nên không tránh khỏi những thiếu sót, tôi
rất mong nhận đƣợc sự góp ý của thầy cô để luận văn của tôi có thể hoàn
thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 15 tháng 11 năm 2018

Học viên

NGUYỄN THỊ THÚY MAI


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu nhân giống
cây Oải hƣơng lá xẻ (Lavandula dentata L.) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô
và vi thủy canh” là kết quả nghiên cứu của riêng tôi do TS. La Việt Hồng
hƣớng dẫn. Các số liệu, kết quả trong nghiên cứu này là trung thực và chƣa
đƣợc công bố.
Hà Nội, ngày 15 tháng 11 năm 2018
Học viên

NGUYỄN THỊ THÚY MAI


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BAP:

6-Benzyl amino purin

CT:

Công thức

ĐC:

Đối chứng

KI:

Kinetin

IAA:

Indol-3-axit axetic

IBA:

Indol butyric acid

MS:

Murashige và Skoog

NAA:

Napthlacetic acid

Nxb, NXB:

Nhà xuất bản

TDZ:

Thidiazuron

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ...................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ................................................................................ 2
3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 2
4. Phạm vi nghiên cứu .................................................................................. 2
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ..................................................... 2
NỘI DUNG ...................................................................................................... 4
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 4
1.1. Giới thiệu chung về cây Oải hƣơng lá xẻ .............................................. 4
1.1.1. Phân loại .......................................................................................... 4
1.1.2. Nguồn gốc và phân bố ..................................................................... 4
1.1.3. Đặc điểm thực vật học của cây Oải hƣơng lá xẻ. ............................ 5
1.1.4. Yêu cầu ngoại cảnh của cây Oải hƣơng lá xẻ ................................. 6
1.1.5. Giá trị sử dụng của cây Oải hƣơng lá xẻ ......................................... 6
1.2. Giới thiệu phƣơng pháp nhân giống cây Oải hƣơng in vitro ................ 8
1.2.1. Nhân giống cây Oải hƣơng từ mô phân sinh .................................. 9
1.2.2. Nhân giống cây Oải hƣơng thông qua sự phát sinh cơ quan ........ 12
1.3. Phƣơng pháp vi thủy canh .................................................................. 14
1.3.1. Sơ lƣợc về phƣơng pháp vi thủy canh ........................................... 14
1.3.2. Ƣu điểm của phƣơng pháp vi thủy canh ....................................... 15
1.4. Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Oải hƣơng lá xẻ Lavandula
dentata L. trên thế giới và ở Việt Nam.................................................... 16
1.4.1. Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Oải hƣơng lá xẻ
Lavandula dentata L. trên thế giới........................................................... 16
1.4.2. Tình hình nghiên cứu cây Oải hƣơng lá xẻ ở Việt Nam ............... 19
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................. 20


2.1. Đối tƣợng nghiên cứu .......................................................................... 20

2.2. Thời gian và điạ điểm nghiên cứu ....................................................... 20
2.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm............................................................ 20
2.3.1. Thiết bị .......................................................................................... 20
2.3.2. Dụng cụ ......................................................................................... 20
2.4. Môi trƣờng nuôi cấy ............................................................................ 20
2.5. Điều kiện nuôi cấy ............................................................................... 21
2.6. Phƣơng pháp nghiên cứu ..................................................................... 21
2.6.1. Bố trí thí nghiệm............................................................................ 21
2.6.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................... 22
2.7. Phƣơng pháp xử lý số liệu ................................................................... 26
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .......................... 27
3.1. Tạo vật liệu khởi đầu in vitro .............................................................. 27
3.2. Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro ................................................... 29
3.3. Ra rễ in vitro tạo cây hoàn chỉnh ......................................................... 31
3.4. Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên .................... 34
3.5. Thiết kế, thử nghiệm hệ thống vi thủy canh để rèn luyện cây Oải
hƣơng lá xẻ in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên ............................ 36
3.5.1. Thiết kế hệ thống vi thủy canh, xác định thời gian tạo lỗ
thoáng khí giữa hệ thống vi thủy canh và môi trƣờng ............................ 36
3.5.2. Ảnh hƣởng của tiền xử lý NAA, bổ sung NAA trực tiếp và
dung dịch dinh dƣỡng đến tỷ lệ ra rễ và sự sinh trƣởng của chồi cây
Oải hƣơng ................................................................................................ 39
3.5.3. Chuyển và huấn luyện cây Oải hƣơng từ hệ thống vi thủy canh
thích nghi với điều kiện tự nhiên ............................................................. 40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................... 42
1. Kết luận................................................................................................... 42


2. Kiến nghị ................................................................................................ 42
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN

VĂN ............................................................................................................... 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 44


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Công thức thí nghiệm tạo vật liệu khởi đầu .................................. 22
Bảng 2.2: Các công thức nghiên cứu ảnh hƣởng của BAP, Kinetin đến sự
tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro từ đốt thân cây hoa Oải
hƣơng ............................................................................................. 23
Bảng 2.3: Các công thức nghiên cứu ảnh hƣởng của NAA, IAA đến ra rễ
và tạo cây Oải hƣơng hoàn chỉnh ................................................. 24
Bảng 2.4: Ảnh hƣởng của giá thể đến tỉ lệ sống của cây Oải hƣơng ............ 25
Bảng 3.1: Kết quả tạo vật liệu khởi đầu in vitro từ đốt thân cây Oải
hƣơng lá xẻ .................................................................................... 27
Bảng 3.2: Kết quả ảnh hƣởng của BAP và KIN đến quá trình nhân nhanh
chồi cây Oải hƣơng in vitro sau 8 tuần nuôi cấy ........................... 29
Bảng 3.3: Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của NAA và IAA đến khả năng
ra rễ của chồi ................................................................................. 32
Bảng 3.4: Rèn luyện cây in vitro ngoài tự nhiên ........................................... 35
Bảng 3.5: Ảnh hƣởng của thời gian tạo lỗ thoáng khí giữa hệ thống vi
thủy canh và môi trƣờng đến tỷ lệ sống (%) của chồi cây Oải
hƣơng ............................................................................................. 38
Bảng 3.6: Ảnh hƣởng của tiền xử lý NAA, bổ sung NAA trực tiếp và
dung dịch dinh dƣỡng đến sự sinh trƣởng của chồi cây Oải
hƣơng ............................................................................................. 40


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Cây hoa Oải hƣơng lá xẻ (Lavandula dentate L.) ........................... 5
Hình 1.2: Hệ thống vi thủy canh (microponic).............................................. 15

Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu ........................................................................... 21
Hình 3.1: Kết quả tạo vật liệu khởi đầu in vitro từ đốt thân.......................... 28
Hình 3.2: Chồi cây hoa Oải hƣơng ................................................................ 31
Hình 3.3: Rễ cây Oải hƣơng lá xẻ in vitro ..................................................... 34
Hình 3.4: Rèn luyện cây Oải hƣơng lá xẻ in vitro ......................................... 36
Hình 3.5: Thiết kế hệ thống vi thủy canh đơn giản để huấn luyện cây Oải
hƣơng lá xẻ in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên. ................. 37
Hình 3.6: Sơ đồ quy trình nhân giống cây hoa Oải hƣơng lá xẻ
Lavandula dentata L. bằng kỹ thuật nuôi cấy mô và vi thủy
canh ................................................................................................ 41


1
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Cây hoa Oải hƣơng lá xẻ hay còn gọi là Oải hƣơng Pháp có tên khoa
học là Lavandula dentata L. là một loài thực vật có hoa thuộc họ Hoa môi
(Lamiaceae), có nguồn gốc từ Địa Trung Hải, các hòn đảo Đại Tây Dƣơng
và bán đảo Ả-rập. Đây là loài cây bụi thƣờng niên, hoa thƣờng có màu tím
đặc trƣng và mùi thơm nồng, thích nghi với những nơi có khí hậu ôn đới
khô và lạnh.
Lavandula là cây hƣơng liệu có giá trị thƣơng mại quan trọng và
thƣờng đƣợc trồng bằng hạt hay giâm cành bằng thân cây. Tuy nhiên, các
phƣơng pháp này thƣờng tốn nhiều thời gian mà hiệu suất không cao và
tổng hợp các chất thứ cấp thấp, chƣa kể đến các biến dị về kiểu gen và kiểu
hình. Cây Lavandula có nguồn gốc từ sự nhân giống in vitro đã cho thấy
năng suất cao và chất lƣợng tinh dầu tốt, đƣợc coi nhƣ là một giải pháp tuyệt
vời để vƣợt qua các vấn đề nhƣ sự thoái hóa giống đã đƣợc quan sát thấy ở
các giống Oải hƣơng trồng theo phƣơng pháp truyền thống [17].
Kỹ thuật nuôi cấy mô (hay còn gọi là vi nhân giống, nhân giống in

vitro) đã đƣợc nghiên cứu và thƣơng mại hóa trên nhiều đối tƣợng cây trồng
khác nhau, kỹ thuật này có ƣu điểm có thể nhân nhanh với số lƣợng lớn
trong thời gian ngắn, giữ đƣợc đặc tính di truyền của cây mẹ [6]. Phƣơng
pháp nhân giống này đáp ứng đƣợc nhu cầu về số lƣợng giống có chất lƣợng
cao, ổn định đáp ứng nhu cầu sản xuất trên quy mô rộng và cho chất chuyển
hoá có giá trị trong suốt cả năm mà không hạn chế theo mùa [62]. Tuy
nhiên, nuôi cấy mô theo phƣơng pháp truyền thống còn sử dụng quy trình
phức tạp và kéo dài. Việc nuôi cấy trong các điều kiện vô trùng có ảnh hƣởng
lớn đến sự tăng trƣởng và phát triển của cây con sau khi chuyển ra vƣờn ƣơm
(quá trình thuần hóa). Những hạn chế kể trên làm cho sản phẩm nuôi cấy mô


2
có giá thành tƣơng đối cao [67].
Hệ thống vi thủy canh là sự kết hợp giữa thủy canh và vi nhân giống,
có nhiều ƣu điểm vƣợt trội và là một kỹ thuật mới trong nuôi cấy mô. Các
bƣớc nuôi cấy phức tạp đƣợc rút ngắn; do đó, công lao động và thời gian
đƣợc giảm bớt; các bƣớc nuôi cấy ban đầu, nhân nhanh, tạo chồi, ra rễ đƣợc
thực hiện một cách liên tục. Trong đó, bƣớc ra rễ và thuần dƣỡng có thể kết
hợp thành một bƣớc.
Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu
nhân giống cây Oải hương lá xẻ (Lavandula dentata L.) bằng kỹ thuật
nuôi cấy mô và vi thủy canh.”
2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống cây Oải hƣơng lá xẻ
bằng kỹ thuật nuôi cấy mô và kỹ thuật vi thủy canh, nhằm góp phần đáp ứng
cây cây giống phục vụ nhu cầu cho con ngƣời.
3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu cho nuôi cấy in vitro từ đốt thân.
- Nghiên cứu tái sinh và nhân nhanh chồi Oải hƣơng in vitro.

- Nghiên cứu tạo cây Oải hƣơng in vitro hoàn chỉnh.
- Nghiên cứu rèn luyện cây Oải hƣơng in vitro thích nghi với điều kiện
tự nhiên.
- Nghiên cứu cải tiến, thử nghiệm hệ thống vi thủy canh để rèn luyện
cây Oải hƣơng in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên.
4. Phạm vi nghiên cứu
Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật, khoa Sinh – KTNN, trƣờng Đại
học Sƣ phạm Hà Nội 2.
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
5.1.Ý nghĩa khoa học
Đề tài góp phần bổ sung vào nguồn tài liệu nghiên cứu nhân giống in
vitro và vi thủy canh trên đối tƣợng cây Oải hƣơng lá xẻ (Lavandula dentata L.).


3
5.2.Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của đề tài là cơ sở cho nhân giống cây Oải hƣơng lá xẻ bằng
kỹ thuật nuôi cấy mô và kỹ thuật vi thủy canh, cung cấp cây giống sạch
bệnh số lƣợng lớn.


4
NỘI DUNG
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về cây Oải hƣơng lá xẻ
1.1.1. Phân loại
Giới: Plantea
Bộ: Lamiales
Họ: Lamiaceae
Chi: Lavandula

Loài: Dentata
Tên khoa học: Lavandula dentata L.
Tên Việt Nam: Cây Oải hƣơng lá xẻ
1.1.2. Nguồn gốc và phân bố
Cây Oải hƣơng lá xẻ hay còn gọi là Oải hƣơng Pháp có tên khoa học
là Lavandula dentata L. có nguồn gốc từ Địa Trung Hải, các hòn đảo Đại
Tây Dƣơng và bán đảo Ả-rập… [53]. Chi Oải hƣơng có khoảng 39 loài,
nhiều giống lai và gần 400 giống cây trồng đã có đăng ký [58].
Lavandula là một chi nhỏ thuộc các loài cây nửa bụi hoặc cây bụi
thuộc họ Bạc hà (Lamiacae) [5]. Thời kỳ ra hoa thƣờng từ tháng 6 đến tháng
8 [52]. Rất nhiều trong số đó có chất thơm và dƣợc tính đƣợc sử dụng rộng
rãi để chiết xuất tinh dầu. Nhu cầu tinh dầu hoa Oải hƣơng ngày càng nhiều,
tinh dầu hoa Oải hƣơng đƣợc sử dụng rộng rãi trong công nghiệp mỹ phẩm,
hƣơng liệu, dƣợc liệu, gia vị cho món ăn, ngoài ra còn có tác dụng trong
trang trí [53].
Tên khoa học chi Lavendula (Lavandula) bắt nguồn từ tiếng Latinh
―Lavare‖, chúng phân bố chủ yếu ở vùng Địa Trung Hải, bán đảo Ả Rập,
quần đảo Canary, Maderia, Bắc phi, Tây Nam Á và Ấn Độ.... Ở Việt Nam,
có khoảng 4 loài và một số giống lai đƣợc trồng chủ yếu ở Đà Lạt- nơi có


5
khí hậu mát mẻ và một số ít ở Hà Nội, vì chúng là loài hoa ƣa lạnh và khô,
không chịu đƣợc độ ẩm cao, nắng nóng [3].
Cây Oải hƣơng có hai loại: Lá lớn và lá nhỏ. Oải hƣơng lá nhỏ tuy lớn
chậm hơn nhƣng đƣợc yêu thích bởi hoa thơm và hoa đẹp hơn. Lavandula
dentata L. thuộc loại lá nhỏ.
1.1.3. Đặc điểm thực vật học của cây Oải hương lá xẻ.

Hình 1.1: Cây hoa Oải hƣơng lá xẻ (Lavandula dentate L.) [66]

Thân: Cây Oải hƣơng lá xẻ có thân nhỏ, cao từ 0,2 - 1m, cây phân
thành nhiều nhánh và mọc thành bụi. Toàn thân có lớp lông mỏng phủ
ngoài.
Lá: Cây có nhiều lá, lá nhỏ, hẹp, hình dải có mép hơi gập xuống,
không có cuống, màu xanh thẫm, mọc đối xứng. Bề mặt lá cũng có lông.
Đặc biệt, cây có mép lá xẻ nên đƣợc gọi là cây Oải hƣơng lá xẻ.


6
Rễ: Rễ cây dạng chùm, ƣa sống ở những nơi hơi kiềm, đất tơi xốp,
thoát nƣớc tốt.
Hoa: Hoa mọc thành chùm ở đỉnh, đối xứng hai bên, lƣỡng tính, mẫu 5,
đài và tràng hợp thành ống có hai môi rõ. Hoa Oải hƣơng có màu tím hoa cà,
ống hoa đƣợc sắp xếp liên tục vòng quanh cuống hoa. Cuống hoa dài, màu
xám, có góc cạnh. Thời kì ra hoa của cây là vào khoảng tháng 6 đến tháng 8
[63].
1.1.4. Yêu cầu ngoại cảnh của cây Oải hương lá xẻ
Những yếu tố nhƣ khí hậu, nguồn nƣớc…cũng có thể ảnh hƣởng tới
thành phần và tính chất của tinh dầu [8].
- Đất: phù hợp với đất cát hơi có tính kiềm hoặc trung tính, khả năng
thoát nƣớc tốt.
- Nƣớc: hoa Oải hƣơng không thích rễ thƣờng xuyên giữ nƣớc. Tƣới
nƣớc vào buổi sáng để tránh ánh nắng mặt trời, tránh làm gẫy dập lá dễ gây
hƣ hỏng, sinh sản của sâu hại và dịch bệnh.
- Ánh sáng: là cây ƣa sáng nên cần rất nhiều ánh sáng mặt trời và môi
trƣờng độ ẩm thích hợp. Nên có ít nhất 50

ánh sáng của mặt trời che khuất

trong mùa hè, tăng cƣờng thông gió để giảm nhiệt độ môi trƣờng xung

quanh.
- Nhiệt độ: nhiệt độ sinh trƣởng tốt nhất 15-25°C và từ 5-300C có thể
phát triển [65].
1.1.5. Giá trị sử dụng của cây Oải hương lá xẻ
Hoa Oải hƣơng đƣợc sử dụng rộng rãi để trang trí và tạo mật cho ong
bƣớm đến hút và cũng có thể trồng tái tạo cho các khu rừng bị cháy do hỏa
hoạn [53].
Trong y học cổ truyền, lá và hoa tƣơi của cây Oải hƣơng đƣợc sử
dụng để làm giảm đau đầu và đau khớp, dùng lá và hoa để xông cho ngƣời


7
bị cảm lạnh [7].
Tuy nhiên, giá trị kinh tế của Lavandula spp. chủ yếu liên quan đến
các đặc tính của các loại tinh dầu thƣờng đƣợc sử dụng trong ngành thẩm
mỹ và trị liệu. Tinh dầu Oải hƣơng đƣợc sử dụng rộng rãi trong sản xuất xà
phòng, nƣớc hoa, phụ gia thực phẩm và các sản phẩm khác, nhƣ các chất
làm dễ chịu hay là tác nhân kháng khuẩn [10].
Bằng chứng cho việc sử dụng Lavandula spp. trị liệu có thể đƣợc bắt
nguồn từ những ngƣời La Mã cổ đại và ngƣời Hy Lạp [60].
Tinh dầu Oải hƣơng đƣợc sinh ra từ tuyến lông trên bề mặt của lá và
có thành phần chính là các nhóm hidrocacbon không no, có khoảng từ 50
đến 60 trong số đó đã đƣợc xác [13]. Linalool và linalool acetate là các
nhóm hidrocacbon không no phong phú nhất trong các giống hoa Oải hƣơng
[34]. Thành phần của tinh dầu đƣợc xác định chủ yếu bởi kiểu gen, mặc dù
điều kiện môi trƣờng và nuôi cấy cũng có thể gây ảnh hƣởng lớn. Trong cây
thành phần tinh dầu cũng có sự sai khác giữa các mô khác nhau [45].
Thành phần hoá học của các loại tinh dầu trong lá của cây Oải hƣơng
lá xẻ có chứa tám hợp chất. Các thành phần hoá học chính trong tinh dầu thu
từ cây Oải hƣơng lá xẻ đƣợc xác định là α-terpinolen (51,13%) và camphor

(13,43%) có khả năng chống lại ấu trùng của Culiseta longiareolata
Macquart và Culex pipiens L., mở ra tiềm năng của sản phẩm tự nhiên này
có thể thay thế cho thuốc trừ sâu tổng hợp để kiểm soát muỗi [21]. Ngoài ra,
tinh dầu từ Oải hƣơng cũng gây độc với một số loại côn trùng, từ đó gợi ý
chúng có giá trị trong ngành công nghiệp hoá chất dùng trong nông nghiệp
[29].
Gần đây, các đặc tính dƣợc liệu của tinh dầu hoa Oải hƣơng đã đƣợc
nghiên cứu bởi Woronuk [60]. Những loại dầu này có thể đƣợc cơ thể ngƣời
hấp thụ qua ba đƣờng: hệ hô hấp, tiếp xúc trực tiếp qua da và đƣờng tiêu hóa


8
[49]. Tinh dầu đƣợc sử dụng rộng rãi trong hƣơng liệu và xoa bóp, có nhiều
lợi ích đã đƣợc công bố [10]. Dầu hoa Oải hƣơng đƣợc cho là có thể kích
thích giấc ngủ và đƣợc sử dụng rộng rãi để giảm bớt âu lo [30], [33]. Tinh
dầu của cây Oải hƣơng đã đƣợc đánh giá để điều trị chứng mất trí [54]. Chất
chiết xuất từ hoa Oải hƣơng cũng đã đƣợc báo cáo với các đặc tính thích
hợp cho việc quản lý các rối loạn hệ thần kinh trung ƣơng (Alnamer R A.
K., 2012) [8], [11].
Tinh dầu đƣợc chiết suất từ cây Oải hƣơng cũng đƣợc sử dụng trong
ngành công nghiệp thực phẩm do có tác dụng tăng cƣờng sức khỏe và dinh
dƣỡng. Kovatcheva-Apostolova và cộng sự (2008) còn nhận thấy rằng việc
bổ sung chiết suất Lavandula vera vào gà băm nhỏ giảm quá trình oxy hóa
lipid và sự phá hủy α-tocopherol trong thịt nấu chín, chứng minh tác dụng
chống sự oxy hóa thực phẩm [32].
1.2. Giới thiệu phƣơng pháp nhân giống cây Oải hƣơng in vitro
Theo tác giả George (2008), có 2 phƣơng pháp chính trong nhân
giống in vitro: nhân giống từ nách hoặc chồi đỉnh và nhân giống thông qua
sự hình thành các chồi non hoặc phôi soma. Phƣơng pháp đầu tiên yêu cầu
các mô phân sinh tồn tại từ trƣớc trong các mẫu cấy. Trong khi phƣơng pháp

thứ 2 liên quan đến việc xảy ra ngẫu nhiên và tạo phôi trực tiếp từ mô cấy
mà không có mô sẹo hình thành trƣớc (phát sinh cơ quan trực tiếp hoặc phôi
trực tiếp) hoặc gián tiếp khi chồi hoặc phôi tái sinh trên mô sẹo đƣợc hình
thành trƣớc đó hoặc trong nuôi cấy tế bào (phát sinh cơ quan hoặc phôi gián
tiếp). Trong hầu hết các loài (bao gồm cả hoa Oải hƣơng) cây trồng vi nhân
giống thƣờng đƣợc sản xuất bằng phƣơng pháp đầu tiên, vì sự ổn định di
truyền trong quá trình nhân giống in vitro đƣợc bảo đảm bằng cách tái sinh
từ các mô phân sinh có sẵn và sự hình thành chồi mới mà không xảy ra giai
đoạn tạo mô sẹo [24].


9

1.2.1. Nhân giống cây Oải hương từ mô phân sinh
Sự thành công của nhân giống in vitro phụ thuộc vào thành phần của
môi trƣờng dinh dƣỡng, nồng độ và sự kết hợp các chất điều hòa sinh trƣởng
thực vật, môi trƣờng nuôi cấy, kiểu gen và tình trạng sinh lý của cây giống,
và đặc biệt là mẫu cấy. Trong quá trình phát triển mô phân sinh, chồi đỉnh
hoặc các đoạn chứa chồi nách đƣợc nuôi cấy tạo nhiều chồi mới mà không
xảy ra giai đoạn tạo mô sẹo [48]. Nói chung nhân giống thông qua phát triển
mô phân sinh thƣờng đƣợc chia làm 4 giai đoạn [24]: tạo vật liệu khởi đầu
in vitro (giai đoạn 1); nhân nhanh chồi (giai đoạn 2); ra rễ tạo cây hoàn
chỉnh (giai đoạn 3) và cây thích nghi với điều kiện tự nhiên (giai đoạn 4).
a. Tạo vật liệu khởi đầu in vitro
Việc lựa chọn các mẫu để bắt đầu nuôi cấy phụ thuộc vào loại/ kiểu
nuôi cấy, mục đích của việc nuôi cấy và phụ thuộc vào loài đƣợc nghiên
cứu. Nhân giống thông qua sự phát triển của mô phân sinh thƣờng gặp phát
triển mô phân sinh đỉnh (meristem), chồi đỉnh (shoot tip) hoặc đốt thân
(stem segments). Nuôi cấy từ đốt thân là rất phổ biến trong nhân giống
Lavandula spp. bằng cấy mô.

Việc nuôi cấy cây Oải hƣơng in vitro liên quan đến việc khử trùng bề
mặt của mẫu cấy ban đầu. Về cơ bản, khử trùng bề mặt bằng Etanol sau đó
là dung dịch Natri hypochlorite thƣờng có hiệu quả khử trùng cao đối với
hầu hết các loài thuộc chi Lavandula.
Môi trƣờng nuôi cấy bổ sung BAP hoặc BAP bổ sung auxin (IAA,
IBA, NAA) đã đƣợc sử dụng để tạo mẫu in vitro ở một số loài (L. stoechas,
Lavandula viridis and L. vera) [15], [31]. Màu nâu của môi trƣờng đôi khi
đƣợc quan sát, theo báo cáo của Nobre (1996) cho môi trƣờng nuôi cấy in
vitro L. stoechasand, Zuzarte và cộng sự (2010) cho môi trƣờng nuôi cấy


10
của Lavandula pedunculata, nhƣng điều này có thể đƣợc ngăn chặn bằng
axit ascorbic trong môi trƣờng và thƣờng xảy ra trao đổi [62].
b. Nhân nhanh chồi
Hiệu quả nhân nhanh chồi đƣợc xác định chủ yếu bởi kiểu gen, các
yếu tố môi trƣờng in vitro và thành phần môi trƣờng. Ngoài ra, nó còn phụ
thuộc vào các yếu tố vật lý, hóa học khác nhƣ độ ẩm tƣơng đối, nồng độ
Ethylen, độ thoáng khí của bình nuôi cấy [16].
Môi trƣờng MS cơ bản đƣợc sử dụng rộng rãi cho các nghiên cứu liên
quan đến Lavandula spp. hoặc môi trƣờng ½ MS [15], [41]. Cytokinin là
chất điều hòa sinh trƣởng thực vật cần thiết và gần nhƣ bắt buộc cho quá
trình nhân nhanh chồi, đôi khi có thể kết hợp Cytokinin với nồng độ thấp
của Auxin. Theo Zuzarte (2010), nhân nhanh chồi Lavandula spp. đƣợc thực
hiện bằng cách bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy BAP [62]. Ngƣợc lại, việc
bổ sung NAA kết hợp BAP làm giảm đáng kể số lƣợng chồi trong nuôi cấy
L. vera và Lavandula dentata [21], [9]. Việc sử dụng nƣớc dừa mà trong đó
có chứa vitamin, axit amin và chất điều hòa sinh trƣởng tự nhiên thúc đẩy sự
nhân chồi ở loài L. latifolia và L. dentata [31].
Ở loài L. latifolia và L. dentata sự phát triển chồi bị ảnh hƣởng bởi

loại và nồng độ Cytokinin đƣợc sử dụng trong môi trƣờng nuôi cấy [31].
Trong nuôi cấy in vitro cây Oải hƣơng thƣờng dẫn đến tình trạng thừa
nƣớc (hay còn gọi là hiện tƣợng thủy tinh hóa, thủy tinh thể) [62]. Bệnh sinh
lý này thƣờng do các điều kiện in vitro nhân tạo, đặc biệt là độ ẩm, với sự có
mặt của Cytokinin dƣ thừa nhƣ BAP [51]. Ở loài L. stoechas, việc thừa
nƣớc có quan hệ với nồng độ BAP trong môi trƣờng nuôi cấy và bị ức chế
khi có sự hiện diện của Ads [45]. Thừa nƣớc cũng quan sát thấy ở loài L.
vera, L. dentata và L. pedunculata với BAP nồng độ cao [9], [21], [62].


11
c. Ra rễ
Chồi hoa Oải hƣơng nói chung có thể ra rễ ngay cả khi môi trƣờng
không có chất điều hòa sinh trƣởng thực vật – thuộc nhóm Auxin [62]. Tuy
nhiên, việc bổ sung NAA là cần thiết để đạt đƣợc hiệu quả cao trong cảm
ứng chồi ra rễ L. stoechas, L. vera, L. viridis và L. dentata [9], [21], [45]. Ở
nhiều loài Oải hƣơng , để chồi cây tạo rễ in vitro, chồi phổ biến đƣợc nuôi
cấy thử trong môi trƣờng ½ hoặc ¼ MS, Jordan và cộng sự (1998) sử dụng
môi trƣờng không chứa Auxin trong khi Echeverrigaray và cộng sự (2005)
sử dụng môi trƣờng bổ sung NAA cho số rễ tăng đáng kể [9].
Theo tác giả Dias và cộng sự (2002) việc tăng nồng độ đƣờng từ 58,4
lên 87,6 mM tăng tỷ lệ chồi tạo rễ in vitro ở loài L. viridisshoots [15].
Mensuali-Sodi và cộng sự (1995) chỉ ra rằng cảm ứng ra rễ cho chồi ở loài
(Lavandula×intermedia Emeric ex Loiseleur) bị ức chế bởi tiền chất Ethylen
nội sinh 1-aminocyclopropane và bởi các chất ức chế tổng hợp Ethylen, từ
nghiên cứu này đã dẫn đến giả thuyết là Ethylen nội sinh đóng vai trò cảm
ứng sự ra rễ in vitro [39].
d. Rèn luyện
Giai đoạn cuối cùng của việc nhân giống in vitro đòi hỏi phải rèn
luyện/ huấn luyện hiệu quả từ môi trƣờng nuôi cấy ra đất, thích nghi với

điều kiện sống tự nhiên [42]. Cây in vitro sống trong điều kiện sống nhân
tạo có nồng độ cao các chất dinh dƣỡng hữu cơ và vô cơ các chất điều hòa
sinh trƣởng thực vật, nguồn cacbon xác định, độ ẩm cao, ánh sáng yếu và
trao đổi khí sẽ gây ra những thay đổi về cấu trúc và sinh lý khiến cho thực
vật không thể thích nghi ngay khi đƣa ra môi trƣờng tự nhiên. Chúng cần
đƣợc thích nghi với môi trƣờng hoặc điều kiện nhà kính dần dần.
Sự thích nghi của cây Oải hƣơng in vitro nói chung cần đơn giản, với
sự ít thay đổi hình thái và quan trọng nữa là phải có tỷ lệ sống cao (70% ở L.


12
latifolia, 85-90% ở loài L. stoechas, 94% ở loài L. veraand và 80% ở loài L.
viridis). Tuy nhiên, tỷ lệ sống cũng ngày đƣợc cải thiện ví dụ nhƣ ở loài hoa
Oải hƣơng lá xẻ (L. dentata), Echeverrigaray và cộng sự (2005) cho rằng tỷ
lệ sống đạt 87

trong khi trƣớc đó theo Jordan và cộng sự (1998) thì tỷ lệ

sống chỉ 50-55% bởi Jordan và cộng sự (1998). Chất lƣợng của hệ thống rễ
là rất quan trọng cho sự thích nghi với môi trƣờng [21], [31].
1.2.2. Nhân giống cây Oải hương thông qua sự phát sinh cơ quan
Sự phát sinh cơ quan là con đƣờng tái sinh phổ biến nhất trong nhân
giống in vitro.
Tsuro và cộng sự (1999) đã quan sát ở loài L. vera và thấy rằng
Cytokinin loại ure N-(chloro-4-pyridyl)-N′-phenylurea (CPPU) có thể tạo ra
nhiều chồi, trong khi đó Cytokinin và BAP tạo ra chồi bình thƣờng. Môi
trƣờng hiệu quả nhất cho sự hình thành chồi là 0,4μM CPPU nhƣng kết quả
không hình thành rễ. Việc này sau đó đƣợc khắc phục bằng cách sử dụng hệ
thống nuôi cấy mở và một quy trình tái sinh cây hiệu quả cho hệ số nhân
chồi gấp 7 lần bình thƣờng [56]. Sau đó cùng một nhóm nghiên cứu về hình

thái và giải phẫu tinh dầu của loài L. veraphenotypic biến thể thu đƣợc khi
có BAP, cho rằng không có cây con tái sinh nào sản sinh ra nhiều tinh dầu
nhƣ giống gốc [55].
Falk và cộng sự (2009) đã sử dụng Thidiazuron (TDZ) để kích thích
sự phát triển của mô sẹo trên các mô lá bị kích thích trong 2 tuần, tiếp theo
chồi tự phát sau 2- 4 tuần trong môi trƣờng. Các chồi tái sinh đƣợc tách ra
và cấy trên môi trƣờng có bổ sung NAA. Hơn 80
đƣợc cho vào IBA 0,8

các chồi ra rễ khi chúng

và sau đó nuôi cấy trên môi trƣờng có chứa 0,05μM

NAA. Các nhà nghiên cứu đã sử dụng Ethyl methanesulfonate tạo đột biến
để tạo ra các giống mới và một trong những cây tái sinh tạo ra tinh dầu
nhiều hơn so với cây bố mẹ, cho thấy rằng cây Oải hƣơng đột biến có thể có


13
ích cho việc tổng hợp monoterpene và sesquiterpene trong thực vật [22].
Ghiorghiţă và cộng sự (2009) nghiên cứu hình thái của L. angustifolia
mô cấy (chồi đỉnh, lóng và lá) và quan sát thấy rằng các đốt thân cấy trên
môi trƣờng MS không bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng, trên môi trƣờng
MS cơ bản có bổ sung NAA và trên môi trƣờng có bổ sung chất điều hòa
sinh trƣởng khác hình thành cây con mới [25]. Dronne và cộng sự (1999a)
mô tả sự tái sinh chồi trong lavandin với kết quả tốt nhất đạt đƣợc ở 4 môi
trƣờng khác nhau. Mô sẹo đƣợc hình thành trong môi trƣờng MS có bổ sung
9μM BAP và 4,5μM NAA. Sau 2 tuần nuôi cấy mô sẹo đƣợc chuyển vào
môi trƣờng MS bổ sung 18μM BAP để tái sinh chồi, sau đó, để kéo dài chồi
cấy vào môi trƣờng MS có bổ sung 1μM gibberellic acid (GA) và rễ đƣợc

tạo ra với môi trƣờng MS bổ sung 1μM IBA [19]. Dronne và cộng sự
(1999b) so sánh giống Lavandin về khả năng tái tạo trong ống nghiệm và
chuyển gen thấy rằng cả hai quá trình đều phụ thuộc mạnh vào cây trồng.
Hiệu quả của việc hình thành chồi từ mô sẹo là 67% - 99% phụ thuộc vào
cây trồng và biểu hiện thoáng qua của E. Coli gen gusA (mã hóa enzyme βglucuronidas) đã đạt đƣợc trong tất cả 5 giống, hiệu quả của vi khuẩn
Agrobacterium trung gian ổn định, thể hiện qua việc sản xuất mô sẹo
kanamycinresistant dao dộng từ 3- 89% [17].
Nebauer và cộng sự (2000) cho rằng chuyển gen dựa vào vi khuẩn
Agrobacterium cho hoa Oải hƣơng tạo đột biến (L. latifolia) bao gồm bƣớc
tiền nuôi cấy trong 1 ngày cho các lá ( trên môi trƣờng tái sinh ) và thời gian
cấy ghép là 24 giờ, sau đó tái sinh bằng kanamycin [43]. Cách này đã đạt
đƣợc hiệu quả 6

cũng nhƣ biểu hiện gen chuyển trong tái sinh thực vật,

mặc dù Mishiba và cộng sự (2000) đã mô tả hình thức chuyển đổi khác sử
dụng mô sẹo thay vì cấy lá hiệu quả hơn [40]. Gần đây, Tsuro and Ikedo
(2011) đã mô tả tác dụng của Agrobacterium rhizogenesstrains tự nhiên trên


14
rễ lông lavandin hình thành, tái sinh cây trồng và nghiên cứu hình thái và
cấu tạo dầu thiết yếu của cây tái sinh [55].
Sự tái sinh cây Oải hƣơng nhờ sinh vật có thể sử dụng trong công
nghệ sinh học để cải thiện cây trồng. Biến đổi sinh dƣỡng và biến đổi gen là
kĩ thuật chính trong chi này, đặc biệt là để tạo ra những thay đổi cần thiết
của tinh dầu. Trong tƣơng lai phƣơng pháp này có thể sử dụng trong phạm
vi rộng hơn các đặc tính cho nông học (ví dụ nhƣ trao đổi sâu bệnh và khả
năng kháng bệnh) cũng nhƣ các mục đích y học.
1.3. Phƣơng pháp vi thủy canh

1.3.1. Sơ lược về phương pháp vi thủy canh
Vi thủy canh (microponic) là một phƣơng pháp sản xuất cây giống
kết hợp vi nhân giống (micropropagation) và thủy canh (hydroponic).
Trong đó, mô thực vật đƣợc cung cấp chất dinh dƣỡng ở quy mô nhỏ.
Phƣơng pháp này bƣớc đầu đã thể hiện những đặc tính ƣu việt và có thể
khắc phục nhiều nhƣợc điểm của các hệ thống vi nhân giống in vitro truyền
thống [27].
Thủy canh thƣờng đƣợc định nghĩa nhƣ là ―trồng cây trong nƣớc‖.
Tuy nhiên, thật ra việc cung cấp nƣớc và dung dịch dinh dƣỡng cho cây có
thể trực tiếp qua tiếp xúc giữa rễ và dung dịch nhƣ định nghĩa ở trên nhƣng
cũng có thể gián tiếp qua các giá thể trơ nên chúng ta có thể mở rộng định
nghĩa thuỷ canh là ―trồng cây không sử dụng đất‖ [36].
Thuật ngữ vi thủy canh (microponic) lần đầu tiên đƣợc mô tả bởi
Hahn và cs (1996) trên đối tƣợng cây hoa cúc để xem liệu nó có thể đơn
giản hóa các giai đoạn tăng trƣởng thực vật, ra rễ, thích nghi với môi trƣờng
và nhân giống với kết quả tốt hơn so với hệ thống in vitro thông thƣờng.
Kết quả cho thấy rằng, sự tăng trƣởng của cây hoa cúc trong hệ thống vi
thủy canh cao hơn nhiều so với cây cúc trong hệ thống in vitro [28]. Trong


15
hệ thống này, cây có thể tăng trƣởng nhanh hơn và khỏe mạnh hơn mà
không có sự thoái hóa, cũng không đòi hỏi phải tiến hành những bƣớc nuôi
cấy phức tạp nhƣ trong nuôi cấy in vitro. Ngoài ra, nó còn tiết kiệm thời
gian và công lao động, vì các giai đoạn nuôi cấy sơ cấp, nhân số lƣợng, ra
chồi và ra rễ đƣợc tiến hành liên tiếp [28].
Hệ thống này cũng đƣợc nghiên cứu trên đối tƣợng là cây hoa cúc
(Chrysanthemum grandiflorum ‗Bongwhang‘) nhằm mục đích làm giảm
một số khó khăn trong nuôi cấy in vitro nhƣ hiện tƣợng thủy tinh thể, giúp
đơn giản hóa quá trình nuôi cấy.

Trong các nghiên cứu trƣớc đây của Nhut và cộng sự (2005b) hệ
thống vi thủy canh (Hình 1.2) đã áp dụng thành công trên các đối tƣợng
cúc. Trong nghiên cứu này, hệ thống vi thủy canh đƣợc thực hiện với giá
thể film nylon ống và vật chứa là các hộp nhựa tròn Đại Đồng Tiến. Các
chồi cây có thể tiền xử lý với Auxin [44].

Hình 1.2: Hệ thống vi thủy canh (microponic).
1.3.2. Ưu điểm của phương pháp vi thủy canh
Vi thủy canh lấy ý tƣởng từ phƣơng pháp thủy canh để ứng dụng
cho giai đoạn cuối của quá trình nhân giống. Đặc điểm của phƣơng pháp
này là điều kiện nuôi cấy không cần vô trùng, có thể khắc phục một số
thiệt hại do nhiễm nấm, khuẩn. Vì thế, có thể giảm đáng kể chi phí đầu tƣ
vào hộp vô trùng, các cơ sở hạ tầng khác và việc điều khiển môi trƣờng