Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposom doxorubin và đánh giá tác dụng trên khối u động vật

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUY N V N

NGHI N C U BÀO CHẾ THU C TI
LIPOSOME DOXORUBICIN VÀ ĐÁNH GIÁ
TÁC DỤNG TR N H I U ĐỘNG V T

U N V N THẠC S DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUY N V N

NGHI N C U BÀO CHẾ THU C TI
LIPOSOME DOXORUBICIN VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC
DỤNG TR N H I U ĐỘNG V T
U N V N THẠC S DƯỢC HỌC
HUY N NGH NH :
M

NG NGH

PH M

O H

S : 60 73 01

Người hướng dẫn khoa học :

PGS.TS. Phạm Thị
ThS.NCS.

HÀ NỘI 2012

inh Huệ

hánh Thị Nhi


LêI C¶M ¥N
Tôi xin gửi lời cảm ơn trân trọng nhất tới:
PGS. TS Phạm Thị Minh Huệ
Cô đã giúp tôi có được những định hướng ban đầu đúng đắn trong quá
trình thực hiện đề tài, nhờ đó tôi có thể hoàn thành được các mục tiêu của đề
tài đề ra. Trong quá trình tiến hành đề tài, cô cũng thường xuyên quan tâm và
đưa ra các góp ý quan trọng để đề tài được hoàn thiện hơn.
Xin trân trọng cảm ơn PGS.TS. Vũ Mạnh Hùng-Bộ môn Dược lý, Học
viện Quân y và ThS. Khánh Thị Nhi đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo tôi khi tiến

hành đề tài đặc biệt là khi đánh giá tác dụng của thuốc trên động vật.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các thầy cô, các anh chị kỹ
thuật viên của Bộ môn Bào chế- Đại học Dược Hà Nội, Bộ môn Dược lý –
Học viện Quân y, Phòng hiển vi điện tử - Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương đã
luôn tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian nghiên cứu thực nghiệm.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bè bạn đã động viên, giúp đỡ tôi
hoàn thành tốt đề tài của mình.


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
TT Viết tắt

Từ/ cụm từ đầy đủ

1

21PC

1,2-Diheneicosanoyl-sn -Glycero-3-Phosphocholin

2

CHL

Cholesterol

3

ĐVN

ược điển Việt Nam

4

DLS

Dynamic Light Scattering – Tán xạ ánh sáng động

5

DOX

Doxorubicin

6

DSPC

1,2-Distearoyl- sn -Glycero-3-Phosphocholin

7

DSPE

Distearoyl phosphatidyl ethanolamin

8

DSPE-

1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phospho ethanolamin-N-

PEG

{Methoxy (Polyethylene glycol)}

9

EE

Encapsulation Efficient - Hiệu suất liposome hóa

10

EPR

Enhanced Permeability and Retention effect - Hiệu ứng tăng
tính thấm và khả năng lưu giữ

11

EurP

European Pharmacopoeia ( ược điển hâu Âu)

12

GUV

Giant Unilamellar Vesicle – Liposome đơn lớp khổng lồ

13

HEPES

N-2- hydroxy ethyl piperazin-N‟-2-ethan sulfonic acid

14

HPLC

High Performance Liquid
năng cao)

hromatography (Sắc ký lỏng hiệu


15

ITG

Inhibition Tumor Growth - hỉ số ức chế sự phát triển khối u

16

KTTB

Kích thước trung bình

17

LTSL

Low Temperature Sensitive Liposome – Liposome nhạy cảm
nhiệt độ thấp

18

LUV

Large Unilamellar Vesicle – Liposome đơn lớp lớn

19

MLVs

Multi Lamellar Vesicle – Liposome đa lớp

20

MUV

Medium Unilamellar Vesicle – Liposome đơn lớp trung bình

21

MVVs

Multi Vesicular Vesicle – Liposome đa lớp

22

MWCO

Molecular Weight Cut Off - Giới hạn khối lượng phân tử

23

NTSL

Non Temperature Sensitive Liposome – Liposome không nhạy
cảm nhiệt độ
Oligo Lamellar Vesicle – Liposome đa lớp

24

OLVs

25

PB KTTP Phân bố kích thước tiểu phân

26

PDI

Polydispersity Index – hỉ số đa phân tán

27

PEG

Polyethylen glycol

25

PS

Polysulfone

26

RES

Reticuloendothelia System - Hệ lưới nội mô

27

SPC

Soy phosphatidyl cholin - Phosphatidyl cholin dầu đậu nành

28

SUV

Small Unilamellar Vesicle – Liposome đơn lớp nhỏ

29

TCCS

Tiêu chuẩn cơ sở


30

TKHH

Tinh khiết hóa học

31

TTSL

Traditional Temperature Sensitive Liposome – Liposome nhạy
cảm nhiệt độ cao

32

USP

United State Pharmacopoeia ( ược điển Mỹ)


ỤC ỤC
DANH

ỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT...........................................................................4

DANH

ỤC BẢNG.................................................................................................... 10

DANH

ỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ .......................................................................... 11

ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................................1
CHƯ NG 1 TỔNG QUAN .......................................................................................2
1.1. Doxorubicin...............................................................................................................2
1.2. Đại cương về liposome...........................................................................................5
1.2.1. Khái niệm và phân loại....................................................................................5
1.2.2. Các phương pháp bào chế liposome ......................................................... 10
1.2.3. Đưa thuốc vào liposome ............................................................................... 10
1.2.4. Đánh giá liposome tạo ra............................................................................. 12
1.3. Liposome doxorubicin........................................................................................ 13
1.4. Sơ lược về mô hình đánh giá tác dụng chống ung thư ........................... 21
1.4.1. Các dòng tế bào .............................................................................................. 21
1.4.2. Động vật thực nghiệm ................................................................................... 21
1.4.3. Phương pháp đánh giá tác dụng ................................................................ 22
1.4.4. Các chỉ tiêu đánh giá hiệu quả điều trị khối u........................................ 22
CHƯ NG 2 Đ I TƯỢNG VÀ PHƯ NG PHÁP NGHI N C U......... 24
2.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................................... 24


2.2. Nguyên vật liệu ..................................................................................................... 24
2.3. Phương tiện nghiên cứu..................................................................................... 25
2.4. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 26
2.4.1. Phương pháp bào chế liposome doxorubicin......................................... 26

2.4.2 Phương pháp đánh giá liposome tạo ra .................................................... 29
2.4.3. Phương pháp đánh giá chất lượng thuốc tiêm liposome doxorubicin
........................................................................................................................................ 32

2.4.4. Phương pháp đánh giá tác dụng thuốc tiêm liposome doxorubicin
trên chuột thực nghiệm ............................................................................................. 32
2.5. Phương pháp

l số liệu................................................................................. 34

2.6. Điều kiện thí nghiệm........................................................................................... 34
CHƯ NG 3

ẾT QUẢ THỰC NGHIỆ ........................................................ 35

3.1. ết quả ây dựng đường chuẩn DOX.......................................................... 35
3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các thông số kĩ thuật của quá trình bào
chế đến các đặc tính của liposome do orubicin ................................................ 36
3.2.1. Quá trình chế tạo liposome chưa mang dược chất ................................ 36
3.2.2. Quá trình làm giảm và đồng nhất kích thước của liposome ............... 36
3.2.3. Quá trình đưa doxorubicin vào liposome ................................................ 40
3.3. Bào chế thuốc tiêm liposome do orubicin .................................................. 46
3.3.1. Lựa chọn quy trình bào chế ......................................................................... 46
3.3.2. Đề xuất tiêu chuẩn thuốc tiêm liposome doxorubicin ........................... 52


3.3.3. Sơ bộ đánh giá độ ổn định của thuốc tiêm liposome doxorubicin ..... 53
3.4. Sơ bộ đánh giá tác dụng của thuốc tiêm liposome do orubicin trên
khối u chuột thực nghiệm.......................................................................................... 55
3.4.1. Đánh giá tác dụng của hỗn dịch liposome doxorubicin đối với thời

gian sống trung bình của chuột nhắt mang khối u dưới da............................. 55
3.4.2. Đánh giá tác dụng của hỗn dịch liposome doxorubicin đối với tỷ lệ
sống sót của chuột nhắt mang khối u dưới da .................................................... 56
3.4.3. Đánh giá tác dụng của hỗn dịch liposome doxorubicin đối với khối
lượng khối u dưới da của chuột sau 30 ngày...................................................... 57
3.4.4. Đánh giá tác dụng của hỗn dịch liposome doxorubicin đối với thể
tích khối u dưới da của chuột sau 30 ngày.......................................................... 58
3.4.5. Đánh giá tác dụng của hỗn dịch liposome doxorubicin đối với khối
lượng khối u cơ của chuột sau 30 ngày................................................................ 59
3.4.6. Đánh giá tác dụng của hỗn dịch liposome doxorubicin đối với thể
tích khối u cơ sau 30 ngày ....................................................................................... 60
CHƯ NG 4 BÀN U N ......................................................................................... 62
4.1. Về quy trình bào chế thuốc tiêm liposome do orubicin 2 mg/ml ....... 62
4.2. Về đánh giá tác dụng thuốc tiêm liposome trên khối u chuột.............. 70
ẾT U N VÀ ĐỀ XUẤT ...................................................................................... 73


DANH

ỤC BẢNG

Bảng 1.1

Một số chế phẩm doxorubicin trên thị trường………………………

4

Bảng 1.2

Phân loại liposome theo kích thước và cấu trúc……………………..

6

Bảng 1.3

Ưu nhược điểm của các phương pháp tinh chế liposome…………..

12

Bảng 1.4

Các tiêu chí đánh giá liposome…………………………………………

13

Bảng 2.1

Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu………………………………

24

Bảng 3.1

Diện tích pic của doxorubicin tại các nồng độ khác nhau…………

35

Bảng 3.2

Phân bố kích thước hệ liposome ở các điều kiện siêu âm khác nhau.

37

Bảng 3.3

Phân bố kích thước hệ liposome khi siêu âm thể tích nhỏ (10 ml)…

38

Bảng 3.4

Nồng độ DOX còn lại theo thời gian.................................................

41

Bảng 3.5

Ảnh hưởng của phương pháp đổi đệm đến hiệu suất liposome hóa...

43

Bảng 3.6

Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ DOX đến hiệu suất liposome hóa.............

45

Bảng 3.7

So sánh sự khác nhau của 2 mẫu liposome M7 và M8.......................

47

Bảng 3.8

Chất lượng thuốc tiêm liposome doxorubicin 2 mg/ml bào chế ở các
mẻ khác nhau…………………………………………………………….…

52

Bảng 3.9

Tiêu chuẩn cơ sở đề xuất của thuốc tiêm liposome doxorubicin……

53

Bảng 3.10

Chất lượng thuốc tiêm liposome doxorubicin của mẻ 1 trong thời
gian bảo quản……………………………………………………………..

54

Bảng 3.11

Thời gian sống trung bình chuột mang u dưới da sau 30 ngày …….

55

Bảng 3.12

Tỷ lệ chuột mang u dưới da sống sót sau 30 ngày ………..………….

56

Bảng 3.13

Khối lượng khối u dưới da của chuột sau 30 ngày………..…………

57

Bảng 3.14

Thể tích khối u dưới da của chuột sau 30 ngày………..………………

58

Bảng 3.15

Khối lượng khối u cơ trung bình của chuột sau 30 ngày ……………

59

Bảng 3.16

Thể tích khối u cơ của chuột sau 30 ngày………………………………

60

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1

Các cách mang dược chất của liposome …………………………………

5

Hình 1.2

Kích thước của một số loại liposome……………………………………..

6

Hình 1.3

Các loại liposome……………………………………………………………

8

Hình 1.4

Minh họa hiệu ứng EPR…………………………………………………….

9

Hình 1.5

Phương pháp đưa DOX vào liposome bằng chênh lệch amoni……….

15

Hình 1.6

Các phương pháp DOX qua màng liposome…………………………….

16

Hình 2.1

Mô hình thí nghiệm đổi đệm bằng phương pháp thẩm tích ..................

27

Hình 2.2

Cơ chế đổi đệm bằng lọc tiếp tuyến………………………………………

27

Hình 2.3

Mô hình lọc tiếp tuyến thao tác bằng tay............................................

28

Hình 2.4

Sơ đồ hệ thống lọc tiếp tuyến tự động…………………………………..

28

Hình 2.5

Sơ đồ bào chế liposome doxorubicin……………………………………

29

Hình 2.6

Sơ đồ chia nhóm đánh giá tác dụng chống ung thư……………………

34

Hình 3.1

Mối tương quan giữa diện tich pic với nồng độ DOX…………………

35

Hình 3.2

Ảnh chụp TEM liposome…………………………………………………

39

Hình 3.3

Hàm lượng của DOX theo thời gian khi ủ DOX với liposome ở 50 oC.. 42

Hình 3.4

Đồ thị so sánh hiệu suất liposome hóa M1 và M2................................

45

Hình 3.5

Sơ đồ Bào chế các lọ chứa bột DOX đông khô…………………………..

48

Hình 3.6

Sơ đồ bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin 2 mg/ml……………..

51

Hình 3.7

Thời gian sống trung bình của các nhóm chuột ……………………….

56


Hình 3.8

Tỷ lệ chuột mang u dưới da sống sót sau 30 ngày …………………….

57

Hình 3.9

Khả năng ức chế sự phát triển khối u dưới da…………………………

58

Hình 3.10

Thể tích khối u dưới da của chuột sau 30 ngày………………………..

59

Hình 3.11

Khả năng ức chế sự phát triển khối u cơ sau 30 ngày………………...

60

Hình 3.12

Thể tích khối u cơ của chuột sau 30 ngày………………………………

61


ĐẶT VẤN ĐỀ
Liposome là một trong những hệ mang thuốc mới đang nhận được nhiều sự
quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới nhờ có nhiều ưu điểm về khả năng
mang thuốc, kiểm soát giải phóng thuốc và khả năng đưa thuốc tới đích. Ứng dụng
lớn nhất của liposome hiện này là làm chất mang thuốc điều trị ung thư và đã có

một vài chế phẩm thương mại được bán trên thị trường với các dược chất như
doxorubicin ( oxil), daunorubicin ( aunoxome),…
Nhằm bắt kịp các tiến bộ khoa học công nghệ trong lĩnh vược y dược trên thế
giới, trong những năm gần đây, trường đại học

ược Hà Nội đã tiến hành nhiều đề

tài khoa học để đánh giá khả năng sử dụng liposome làm chất mang thuốc. Trong đó
liposome doxorubicin được nghiên cứu nhiều nhất và đã thu được một số kết quả
đáng khích lệ.

ác kết quả nghiên cứu cho thấy chúng ta đã từng bước nắm được

các kỹ thuật chế tạo liposome và cũng đã cho thấy tiềm năng của việc sử dụng
liposome doxorubicin trong điều trị ung thư.
Đề tài “Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin và đánh giá tác
dụng trên khối u động vật” được tiến hành để phát triển dạng thuốc tiêm liposome
doxorubicin trên cơ sở các kết quả nghiên cứu bào chế liposome đã thu được. Đề tài
được thực hiện với 2 mục tiêu:
1. Bào chế được thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml ở quy mô phòng thí
nghiệm và đưa ra tiêu chuẩn của thuốc tiêm liposome doxorubicin.
2. Sơ bộ đánh giá tác dụng của thuốc tiêm liposome doxorubicin trên khối u
chuột thực nghiệm.

1


CHƯ NG 1 TỔNG QUAN
1.1. Doxorubicin
Công thức cấu tạo:

- Công thức phân tử:
C27 H29 NO11.HCl
- Khối lượng phân tử:
579,99

Tên
pyranosyl)

khoa

học:

(8S,10S)-10-{(3-Amino-2,3,6-trideoxy-α-L-lyxo-hexo

oxy}-7,8,9,10-tetrahydro-6,8,11-tri

hydroxy-8-(2-hydroxy acetyl)-1-

methoxy-5,12-naphthacenedion [39].
Tính chất: Tinh thể hay bột vô định hình màu vàng cam, không mùi. Dung
dịch 5mg/ml có pH từ 4-5,5. Tan trong nước, methanol, acetonitril, tetrahydrofuran.
Không tan trong cloroform, aceton, ethyl ethe, benzen [39].
Doxorubicin là chất nhạy cảm với ánh sáng ở nồng độ thấp. Tuy nhiên, ở
nồng độ điều trị thì doxorubicin được cho là không bị phân hủy đáng kể bởi ánh
sáng và không nhất thiết phải có biện pháp riêng để bảo vệ doxorubicin khỏi ánh
sáng. Thực tế thì dung dịch doxorubicin trong Na l 0,9% có thể ổn định trong 24
ngày khi bảo quản trong lọ PV ở 25 o

và lâu hơn nếu bảo quản trong xylanh làm

bằng polypropylen ở 4 oC [39].
Dược động học
Sau khi tiêm tĩnh mạch, doxorubicin nhanh chóng phân bố đến cách mô phổi,
gan, tim, lách, thận. Doxorubicin bị chuyển hóa ở gan tạo thành doxorubicinol.

2


Khoảng 40 - 50% lượng doxorubicin bị đào thải qua mật trong 5 - 7 ngày ở dạng
chưa chuyển hóa; 5% bị đào thải qua nước tiểu trong 5 ngày. Doxorubicin không
qua được hàng rào máu não nhưng qua được nhau thai và bài tiết được qua tuyến
sữa [39].
ược động học của liposome doxorubicin khác hẳn so với doxorubicin dạng
tự do. Doxorubicin khi gắn với liposome đã PEG hóa có thời gian tồn tại trong vòng
tuần hoàn kéo dài hơn và ít phân bố tới các mô hơn. ác liposome doxorubicin phân
bố nhiều tới các mô ung thư có hệ mạch máu không bình thường.

ạng liposome

doxorubicin không PEG hóa cũng cho thấy nồng độ đỉnh doxorubicin toàn phần
trong huyết tương cao hơn so với khi sử dụng doxorubicin dạng thông thường [39].
Chỉ định
Doxorubicin có khả năng tiêu diệt nhiều loại tế bào ung thư và thường được sử
dụng cùng các hóa trị liệu khác để điều trị: u lympho dạng Hodgkin và không
Hodgkin, sacroma xương và mô mềm, bạch cầu cấp, u nguyên bào thần kinh, ung
thư bàng quang, ung thư phổi, ung thư vú, ung thư dạ dày, ung thư buồng trứng
[39].
Liều dùng
Dạng thuốc tiêm dung dịch: Pha loãng với dung dịch glucose 5% hoặc dung
dịch nước muối sinh lý 0,9% rồi truyền nhanh tĩnh mạch trong 3 phút hoặc lâu hơn.

Nếu chỉ điều trị bằng doxorubicin thì liều sử dụng là 60-75 mg/m2 tương
đương 1,2 – 2,4 mg/kg thể trọng, 3 tuần/lần. Hoặc truyền 1 lần/ngày liều 20 mg/m 2,
truyền trong 3 ngày cách nhau 3 tuần.
Nếu sử dụng cùng với thuốc chống ung thư khác thì giảm liều xuống từ 30 60 mg/m2 , truyền 1 lần trong 3 tuần.
Tổng liều không quá 450-550 mg/m2

3


Dạng liposome PEG hóa: Pha loãng bằng dung dịch glucose 5% để truyền
tĩnh mạch. Với liều dưới 90 mg pha trong 250 ml dung dịch glucose 5%, liều trên
90 mg pha loãng với 500 ml dung dịch glucose 5%.
Truyền tĩnh mạch liều 20 mg/m2 trong 30 phút, 2-3 tuần truyền 1 lần. Với điều
trị ung thư vú và ung thư buống trứng, liều điều trị là 50 mg/m 2, truyền trong 1 h, 1
lần trong 4 tuần. Điều trị đa u tủy xương: truyền tĩnh mạch liều 30 mg/m 2 vào ngày
thứ 4 sau khi sử dụng liệu pháp bortezoomid [39].
Dạng liposome không PEG hóa được sử dụng trong ung thư vú di căn với liều
tương tự như dạng doxorubicin tự do. Pha loãng chế phẩm bằng dung dịch Na l
0,9% hoặc dung dịch glucose 5% tới nồng độ 0,4-1,2 mg/ml, truyền tĩnh mạch trong
1 h cách nhau 3 tuần [39].
Doxorubicin có thể nhỏ trực tiếp vào bàng quang trong điều trị ung thư ác
tính. Nhỏ 50ml dung dịch doxorubicin 1 mg/ml trong 1h cách nhau 1 tuần hoặc 1
tháng [39].
Bảng 1.1: Một số chế phẩm doxorubicin trên thị trường
Dạng bào chế
Thuốc tiêm
dung dịch
Bột pha tiêm

Thuốc tiêm

liposome

Tên chế phẩm
Adorucin lọ 5 ml, 25 ml, 2 mg/ml
Adriamycin lọ 5 ml, 100 ml 2 mg/ml
Doxorubicin Ebewe lọ 5 ml/25 ml, 2 mg/ml
Adriblastina, lọ 10 mg, 50 mg
Doxorubicina servycal, lọ 10 mg, 50 mg

Hãng sản uất
Korea United
Pharma
Pfizer
Ebewe Pharma
Pharmacia Italia
Laboratorios IMA

aelyx, lọ 10 ml, 2 mg/ml

Schering
Phospholipidough

oxil, lọ 10 ml, 2 mg/ml

Sequus
pharm.(USA)

Lipo-DOX lọ 10 ml, 2 mg/ml
Myocet, lọ 10 ml, 2 mg/ml

4

TTYBiopharm
GP-Pharm


1.2. Đại cương về liposome
1.2.1. hái niệm và phân loại
Liposome có cấu tạo bao gồm một nhân nước ở giữa được bao bọc bởi một
hay nhiểu lớp phospholipid kép, có kích thước thay đổi từ hàng chục đến hàng ngàn
nanomet [1].

ấu tạo của liposome được minh họa ở hình 1.1 và hình 1.3. Thành

phần chính của liposome là phospholipid, cholesterol. Đây là những chất tương hợp
sinh học với cơ thể, và có thể phân giải được trong cơ thể nên có rất nhiều ưu điểm
khi sử dụng làm chất mang thuốc trong cơ thể.

Hình 1.1: Các cách mang dược chất của liposome: 1Dược chất trong khoang nước. 2- Dược chất nằm giữa lớp
lipid kép. 3- Dược chất gắn vào đầu phân cực của
phospholipid. 4- Dược chất liên kết với lớp lipid kép. 5Dược chất liên kết với đầu không phân cực của phân tử
phospholipid. 6- Dược chất hấp phụ trên bề mặ lớp lipid
kép
Trong dược học, liposome được ứng dụng làm hệ mang thuốc và mô hình tế
bào nhân tạo. Khi sử dụng liposome làm chất mang thuốc, dược chất có thể phân bố
trong khoang nước của liposome, phân bố giữa lớp phospholipid kép, tương tác và
gắn với đầu không phân cực của phân tử phospholipid hoặc hấp phụ trên bề mặt của
lớp phospholidpid kép tùy thuộc vào đặc tính thân dầu nước của dược chất và tương
tác hóa lí giữa dược chất với lớp phospholipid kép (hình 1.1) [33],[45]. Một số dược
chất chỉ ổn định trong một số điều kiện nhất định, tuy nhiên môi trường ổn định

nhất cho dược chất đôi khi lại không thích hợp với cơ thể do đó làm giảm khả năng
điều trị của dược chất. Những vấn đề này được giải quyết dễ dàng khi sử dụng

5


liposome làm chất mang thuốc do liposome có thể bao gói bên trong lớp lipid kép
môi trường tối ưu cho sự ổn định của dược chất nhưng lại được phân tán trong một
môi trường có điều kiện tương tự điều kiện sinh lý của cơ thể. Vì thế có thể coi
liposome là 1 hệ mang thuốc lý tưởng.
Bảng 1.2: Phân loại liposome theo kích thước và cấu trúc
oại liposome

Ký

ích thước

Số lớp lipid

hiệu

(nm)

Liposome đơn lớp nhỏ

SUV

20 – 100

1

Liposome đơn lớp trung bình

MUV

> 100

1

Liposome đơn lớp lớn

LUV

> 500

1

Liposome đơn lớp khổng lồ

GUV

> 1000

1

Liposome đa lớp nhỏ

OLV

100-1000

<5

Liposome đa lớp lớn

MLVs

> 500

5-25

Liposome đa nhân

MVVs

> 1000

-

Hình 1.2: Kích thước của một số loại liposome
Với ưu điểm trên, liposome nhanh chóng thu hút được sự quan tâm của các
nhà bào chế trong nghiên cứu phát triển hệ mang thuốc mới trong cơ thể .
Xét theo kích thước và số lớp, liposome được chia làm 3 loại chính: liposome
đơn lớp, liposome đa lớp (MLVs) và liposome nhiều túi (MVVs) (bảng 1.2) [34].

6


Xét theo cấu trúc lớp vỏ lại chia thành:
Liposome quy ước: là liposome có cấu tạo lớp vỏ chủ yếu là phospholipid và

cholesterol. Đây là dạng liposome đầu tiên được nghiên cứu. Liposome quy ước có
nhược điểm là rất dễ bị bắt và phá hủy bởi các đại thực bào trong máu và bởi hệ
thống lưới nội mô (RES - reticuloendothelial system) ở gan và lách; khả năng
hướng đích còn kém và thụ động, chủ yếu phụ thuộc vào kích thước của liposome
và khả năng đi qua khe hở thành mạch ở các mô ung thư, chưa kiểm soát được khả
năng giải phóng dược chất. Mặc dù vậy, nếu tế bào bị bệnh thuộc hệ thống thực bào
đơn nhân thì chính việc bị bắt giữ khi di chuyển trong hệ tuần hoàn lại là ưu điểm
của các liposome quy ước [36].
Liposome hiện đại: là các liposome đã thay đổi cấu trúc lớp vỏ nhằm khắc
phục nhược điểm của liposome quy ước. ác liposome hiện đại được phân loại rất
khác nhau và cũng không rõ ràng giữa các nhà nghiên cứu. Việc phân loại phụ
thuộc nhà nghiên cứu muốn nhấn mạnh tính chất nào của liposome như khả năng
tuần hoàn lâu trong cơ thể, khả năng hướng đích thụ động hay chủ động, khả năng
kiểm soát giải phóng thuốc, …
Liposome tuần hoàn dài (Long circulation liposome): Để có thể tồn tại lâu
trong hệ tuần hoàn, bề mặt vỏ của các liposome thường được đưa thêm các nhóm
phân tử thân nước có kích thước lớn như PEG, poly{N-(2-hydroxypropyl)}
methacrylamid, poly-N-vinylpyrrolidon, polyvinyl alcol, phức hợp của L-amino
acid với các polime phân hủy sinh học. Nhờ đó liposome thoát khỏi sự tấn công của
đại thực bào và hệ thống lưới nội mô tại gan, lách.

o khả năng tồn tại lâu trong

vòng tuần hoàn nên khả năng tập trung thuốc của liposome tại mô đích tăng. Khả
năng tập trung tại mô đích của các liposome loại này được gọi là hiệu ứng tăng tính
thấm và khả năng lưu (EPR – Enhanced permeability and retention effect) [36], [
41], [ 42]. Các liposome hướng đích nhờ hiệu ứng này được xếp vào nhóm hướng
đích thụ động.

7

Liposome miễn dịch (Immunoliposome): Tên gọi này chỉ các liposome được
gắn lên bề mặt các phân tử có khả năng nhận biết và liên kết với tế bào đích (các
nhóm nhận đích - target ligand). ác chất hướng đích đầu tiên được sử dụng là các
kháng thể IgG nên liposome này được gọi là liposome miễn dịch. Hiện nay đã phát
triển thêm nhiều nhóm nhận đích khác mà không phải là các kháng thể, nên các
liposome về sau đều gọi tên theo nhóm hướng đích được gắn, tuy nhiên chúng vẫn
xếp vào loại liposome miễn dịch (immunoliposome). Một số nhóm hướng đích khác
được nghiên cứu là: các kháng thể đơn dòng

53,

531,

19; kháng thể HER-

2; kháng thể kháng receptor folat (anti-FR); kháng thể kháng receptor tranferin
(anti- TfR)…[36], [ 42]. Các liposome nhóm này có khả năng hướng đích chủ động.

Hình 1.3: Các loại liposome:
A Liposome quy ước: a- thuốc tan trong nước; b-thuốc tan trong dầu
B. Liposome miễn dịch: c,d- kháng thể gắn trên bề mặt liposome
C: Liposome tồn tại lâu: e- các phân tử PEG
D: Liposome miễn dịch tồn tại lâu
E: Các dạng liposome với các chất hướng đích khác

8

Liposome miễn dịch tuần hoàn dài (Long-circualating Immunoliposome): Đây
là loại liposome kết hợp các ưu điểm của liposome tồn tại lâu và liposome miễn
dịch nhằm cải tiến hơn nữa khả năng mang thuốc tới đích của liposome. Đặc điểm
cấu tạo của liposome này s có lớp áo polyme bảo vệ ở bên ngoài và các chất hướng
đích s được gắn vào đuôi các phân tử polyme bảo vệ hoặc gắn lên vỏ liposome
[42].

Hình 1.4: Minh họa hiệu ứng EPR
ác nghiên cứu hiện nay tập trung vào kiểm soát giải phóng thuốc khỏi
liposome và đã chế tạo ra các liposome thông minh chỉ giải phóng thuốc khi nhận
được những kích thích đặc hiệu tại mô đích. ác liposome này được gọi là liposome
cảm ứng (Stimuli – sensitive liposome hay Trigger liposome). Trong thành phần
cấu tạo vỏ của các liposome cảm ứng có chứa một tỉ lệ nhất định các chất cảm ứng,
đó có thể là các phospholipid đặc biệt hoặc các polime có khả năng bị phân giải cấu
trúc về mặt vật lý hoặc hóa học khi nhận được tín hiệu kích thích tại mô đích. Tác
nhân gây kích thích có thể là thuộc tính đặc trưng tại mô bị bệnh như pH, tác nhân
oxy hóa khử, tác nhân phân giải cấu trúc tại môi trường mô bệnh (tác nhân nội internal trigger) hoặc có thể là do tác động từ bên ngoài như siêu âm và năng lượng
điện từ trường, nhiệt độ, (tác nhân ngoại - external trigger) [4], [ 10], [ 13], [ 23], [
25], [ 30], [ 36], [ 37], [ 38].
Các liposome thông minh có thể được PEG hóa bề mặt, trên các phân tử PEG
có thể được gắn thêm các nhiều nhóm phân tử khác nhau để thực hiện nhiều nhiệm

9


vụ khác nhau cùng lúc khi liposome di chuyển trong hệ tuần hoàn. Khi đó ta s có
các liposome thông minh đa chức năng [36].
1.2.2. Các phương pháp bào chế liposome
Liposome được chế tạo theo nhiều phương pháp khác nhau: phương pháp
hydrat hóa film lipid (phương pháp

angham), phương pháp loại chất diện hoạt,

phương pháp pha loãng alcol, phương pháp bốc hơi pha đảo, phương pháp nhũ hóa,
phương pháp đông khô, phương pháp sử dụng hệ thống kênh vi lỏng…[45], [29].
Việc lựa chọn phương pháp phụ thuộc vào:


Thuộc tính hóa lý của dược chất và của hợp chất dùng chế tạo
liposome.



Đặc tính của môi trường phân tán liposome



Nồng độ tác dụng của dược chất và độc tính tiềm tàng của nó.



Các kỹ thuật bổ trợ trong quá trình phân phối liposome vào cơ thể.



Sự phù hợp của kích thước, mức độ đa phân tán và thời gian tồn tại
của liposome với vị trí sử dụng hay với mô bệnh.



Độ lặp lại giữa các lô trong sản xuất và khả năng sản xuât của quy
mô lớn các liposome có độ an toàn và hiệu quả cao [33].

Tất cả các phương pháp bào chế liposome trên thường tạo ra hỗn hợp các loại
liposome khác nhau với các kích thước khác nhau (trừ phương pháp sử dụng hệ
thống kênh vi lỏng).

o đó liposome sau khi tạo ra thường được giảm kích thước và

đồng nhất kích thước bằng các phương pháp thích hợp.

ó 4 biện pháp thường sử

dụng để đạt được mục đích này: Siêu âm, nén qua màng, đồng nhất hóa ở áp suất
cao, đông chảy nhiểu lần. Thường có sự kết hợp các phương pháp làm đồng nhất và
làm giảm kích thước tiểu phân để đạt được hiệu quả mong muốn [45].
1.2.3. Đưa thuốc vào liposome
ược chất có thể đưa vào trong liposome theo cơ chế thụ động hoặc chủ động
Theo c ch th động:

ược chất được đưa vào liposome trong quá trình bào

chế liposome. Theo đó, dược chất thân nước s thêm vào pha nước, dược chất thân

10


dầu s thêm vào pha dung môi hữu cơ, sau đó s tiến hành bào chế liposome bằng
các phương pháp thích hợp. Đưa dược chất theo cơ chế thụ động có nhược điểm là
hiệu suất gắn dược chất thấp, dược chất có thể bị tách khỏi liposome trong quá trình

làm giảm kích thước và làm đồng nhất kích thước. Theo Xiaoming Xu [46], nếu
dược chất được chứa trong khoang nước, hiệu suất liposome hóa có thể dự đoán
được bằng công thức:

∑ (( ⁄ ) (

) (

)⁄ ∑ (

[

(

) ]

⁄ )

)

Trong đó: EE%: hiệu suất liposome hóa; Vin: thể tích môi trường trong liposome;
V: thể tích môi trường toàn phần liposome; ri: bán kính liposome; d: độ dày màng
lipid kép; Pi: xác xuất phân bố kích thước liposome; a: diện tích trung bình màng
lipid; c: nồng độ mol lipid.
Theo c ch ch động: s có 3 bước chính theo thứ tự sau:



ào chế liposome bằng các phương pháp thích hợp
Làm giảm kích thước liposome đến kích thước yêu cầu và đồng

nhất hóa về kích thước



Đưa dược chất vào liposome.

ược chất được đưa vào liposome theo cơ chế chủ động bằng cách tạo ra
chênh lệch năng lượng hai bên màng liposome, sự chênh lệch này s tạo động lực
để kéo dược chất từ môi trường bên ngoài vào liposome. ách đơn giản nhất để tạo
chênh lệch năng lượng là tạo ra chênh lệch nồng độ vật chất hai bên màng liposome.
Hiện nay hay sử dụng chênh lệch amoni, chênh lệch ion hay chênh lệch pH để tạo
động lực đưa dược chất vào liposome. Một số dược chất đã được đưa vào liposome
với hiệu suất cao bằng phương pháp này như: doxorubicin, mitoxantron,
ciprofloxacin, vincristin, và các vinca alkaloid [15]. ơ chế đưa dược chất s được
nêu chi tiết đối với liposome doxorubicin ở mục 1.3.

11


Bảng 1.3: Ưu nhược điểm của các phương pháp tinh chế liposome
ỹ thuật
Thẩm tích
Ly tâm

Ưu điểm

Nhược điểm

Hiệu suất cao (>99%)
Đơn giản

Dễ thu hồi mẫu

Tốn thời gian

Dễ thao tác

Hiệu suất thấp

Ly tâm kết
hợp siêu lọc

Hiệu suất cao ( >90%)
Tiết kiệm thời gian
Hiệu suất cao (>99%)
Lọc tiếp tuyến
Dễ thu hồi mẫu

Khó thu hồi mẫu
Cần tối ưu được tỉ lệ lọc

Mẫu bị pha loãng nên cần
Hiệu suất cao (90-99,99%)
Sắc ký lọc gel
phải chỉnh hàm lượng lại
Tiết kiệm thời gian
bằng lọc tiếp tuyến.
Liposome sau khi bào chế luôn chứa cả dược chất tự do và dược chất liposome
hóa. Trong một số trường hợp, dược chất tự do có thể gây ra các vấn đề về ổn định
của chế phẩm hoặc dược chất tự do có thể giảm hiệu quả điều trị, khi đó cần thiế t
phải tinh chế để loại bỏ dược chất tự do. ó 5 kỹ thuật có thể sử dụng cho mục đích

này là thẩm tích (dialysis), ly tâm, ly tâm kết hợp siêu lọc (ultra-centrifugation), lọc
thẩm tích ( diafiltration) hay lọc tiếp tuyến (tangential flow filtration / cross flow
filtration), sắc ký lọc gel.

u nhược điểm của mỗi phương pháp tinh chế được trình

bày trong bảng 1.3 [45].
1.2.4. Đánh giá liposome tạo ra
Bảng 1.4 liệt kê các tiêu chí đánh giá và phương pháp đánh giá chất lượng của
liposome [6], [ 34]. Ngoài các chỉ tiêu được đưa ra ở bảng 1.4, liposome vẫn phải
đáp ứng các chỉ tiêu chất lượng khác tùy thuộc vào việc liposome được sử dụng cho
dạng bào chế nào. Ví dụ, với thuốc tiêm liposome thì ngoài phải đáp ứng các chỉ
tiêu nêu ở bảng 1.4 thì còn phải đáp ứng thêm các chỉ tiêu về an toàn sinh học như
độ vô khuẩn, nội độc tố vi khuẩn.

12


Bảng 1.4: Các tiêu chí đánh giá liposome
Phương pháp đánh giá hoặc
thiết bị đánh giá

Tiêu chí đánh giá
Hàm lượng phospholipid

HPLC

Thành phần lipid

TLC, HPLC

Hàm lượng cholesterol
Chỉ tiêu
hóa học

HPLC
Phương pháp định lượng phù
hợp

Hàm lượng dược chất

Máy đo pH

pH
Độ thẩm thấu

Máy đo độ thẩm thấu

ung môi tồn dư
Hình dạng và cấu trúc bề mặt

Chỉ tiêu
vật l

hụp TEM, SEM

Kích thước và phân bố kích thước

LS; chụp TEM, SEM

Điện tích bề mặt

Phương pháp điện di

Thế Zeta

Phương pháp điện di
P 31NMR

Số lớp lipid
Khả năng giải phóng dược chất

Sử dụng tế bào khuếch tán hoặc
phương pháp thẩm tích
Thẩm tích; ly tâm; sắc ký lọc
gel.

Khả năng gắn dược chất
1.3. Liposome doxorubicin

Liposome doxorubicin là chế phẩm liposome đầu tiên được nghiên cứu thành
công và đã xuất hiện các chế phẩm thương mại trên thị trường với các đặc tính
mong muốn như hiệu suất gắn thuốc cao, khả năng tuần hoàn lâu trong cơ thể. Đây
cũng là mô hình liposome đầu tiên ứng dụng thành công phương pháp tạo chênh
lệch vật chất 2 bên màng (chênh lệch amoni) để tạo động lực đưa dược chất vào
trong khoang nước của liposome với hiệu suất rất cao (90-99%) [15]. Kỹ thuật chế

13