Nghiên cứu ảnh hưởng của glycyl funtumin lên mức độ phiên mã survivin trên dòng tế bào BT474 và a549

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
BỘ MÔN HÓA SINH

ĐƢỜNG THỊ HỒNG NHUNG

NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA
GLYCYL FUNTUMIN LÊN MỨC ĐỘ
PHIÊN MÃ SURVIVIN TRÊN DÒNG
TẾ BÀO BT474 VÀ A549

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2018


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
BỘ MÔN HÓA SINH

ĐƢỜNG THỊ HỒNG NHUNG
MSV: 1301302

NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA
GLYCYL FUNTUMIN LÊN MỨC ĐỘ
PHIÊN MÃ SURVIVIN TRÊN DÒNG
TẾ BÀO BT474 VÀ A549
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Người hướng dẫn:

PGS. TS. Đỗ Hồng Quảng

Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa Sinh – Trƣờng ĐH Dƣợc HN
Viện Công nghệ sinh học - Viện hàn lâm
Khoa học-Công nghệ Việt Nam

HÀ NỘI – 2018


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đề tài khóa luận này, em đã nhận được rất nhiều sự động
viên, hỗ trợ và giúp đỡ đến từ các thầy các cô, các anh chị, bạn bè và người
thân trong thời gian qua. Đầu tiên, em xin được gửi lời cảm ơn tới toàn thể các
giảng viên của trường Đại học Dược Hà Nội, các bộ môn, các phòng ban, đã
dạy dỗ, truyền đạt những tri thức quý báu và luôn tạo điều kiện tốt nhất cho em
được học tập và rèn luyện trong suốt 5 năm học vừa qua. Em cũng xin chân
thành cảm ơn các thầy cô, anh chị và các bạn cùng nghiên cứu khoa học tại Bộ
môn Hóa Sinh, cũng như các thầy cô, anh chị và các bạn đang công tác tại
phòng Công nghệ tế bào động vật và phòng Ứng dụng ADN thuộc Viện hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ, tạo điều kiện và chỉ bảo cho em
trong suốt quá trình nghiên cứu.
Với tất cả sự kính trọng và ngưỡng mộ, em xin chân thành bày tỏ lòng
biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Đỗ Hồng Quảng - giảng viên Bộ môn Hóa sinh
trường Đại học Dược Hà Nội. Thầy là người đã truyền đạt cho em những kiến
thức, phương pháp và tác phong làm việc nghiêm túc, cẩn thận, người đã tận
tình hướng dẫn, giúp đỡ và động viên em, tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn
thành khóa luận tốt nghiệp này.
Em cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS Lê Quang
Huấn - trưởng phòng Công nghệ tế bào động vật Viện Công nghệ sinh học, TS.
Lê Thị Thùy Dƣơng - cán bộ phòng Ứng dụng ADN thuộc Viện hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam, là người đã hỗ trợ rất nhiều về mặt chuyên môn
trong suốt thời gian em nghiên cứu.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình và bạn vè đã động viên, cổ vũ và giúp
đỡ em trong suốt thời gian qua.
Xác nhận của GV hướng dẫn

Hà Nội, ngày tháng năm 2018
Sinh viên

Đƣờng Thị Hồng Nhung


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..............................................iv
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ......................................................................v
DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................................vi
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN .........................................................................................3
1.1.

Tổng quan về survivin .....................................................................................3

1.1.1.

Cấu trúc phân tử ..........................................................................................4

1.1.2. Chức năng sinh học của survivin ....................................................................5
1.1.2.1 Vai trò ức chế sự chết theo chương trình của tế bào .................................5
1.1.2.2 Survivin trong phân chia tế bào.................................................................8
1.1.2.3. Survivin trong sự hình thành mạch ..........................................................8

1.1.3. Vai trò của survivin trong ung thư ..................................................................9
1.1.3.1. Biểu hiện của survivin trong ung thư .......................................................9
1.1.3.2. Cơ chế phân tử của survivin trong ung thư ..............................................9
1.1.3.3. Ứng dụng của survivin trong chuẩn đoán và điều trị ung thư ................10
1.2.

Tổng quan phƣơng pháp đánh giá biểu hiện gen survivin ........................10

1.2.1. Quá trình biểu hiện gen.................................................................................10
1.2.2. Các phương pháp đánh giá mức độ biểu hiện gen survivin .........................11
1.2.2.1. Kỹ thuật PCR ............................................................................................. 12
1.3. Tổng quan về Glycyl funtumin ........................................................................16
1.3.1. Lịch sử nghiên cứu .......................................................................................17
1.3.2. Tác dụng dược lí của Glycyl funtumin ........................................................18
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU NGUYÊN VẬT
LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........................20
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu, trang thiết bị nghiên cứu ...........................................20
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................................20
2.1.2. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................21
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................21
2.2.1.

Nuôi cấy tế bào.......................................................................................... 21

2.2.2.

Tách chiết ARN.........................................................................................22


2.2.3.

Xác định độ tinh sạch và đo phổ hấp thụ bằng máy NanoDrop ...............22

2.2.4.

Phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện gen survivin ............................... 22

2.2.5. Xây dựng đường chuẩn real-time RT-PCR đánh giá biểu hiện gen ......24
survivin ...................................................................................................................24
2.2.6. Đánh giá ảnh hưởng của Glycyl funtumin lên mức độ phiên mã gen survivin . 24

2.2.7. Xử lý thống kê .............................................................................................. 25
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................................26
3.1. Kết quả...................................................................................................................26
3.1.1. Kết quả tách chiết và xác định độ tinh sạch bằng quang phổ hấp thụ .............26
3.1.1.1. Kết quả quét phổ hấp thụ của các mẫu sau tách chiết ...................................26
3.1.1.2. Kết quả đo nồng độ và chỉ số OD260/280 ........................................................27
3.1.2. Kết quả xây dựng đường chuẩn định lượng realtime RT-PCR ........................28
3.1.3. Kết quả đánh giá tác dụng của Glycyl funtumin lên mức độ phiên mã gen
survivin ...................................................................................................................29
3.1.3.1. Tại nồng độ 1,5 và 3,0 μg/ml .....................................................................29
3.1.3.2. Tại nồng độ 6,0 μg/ml................................................................................31
3.2. Bàn luận .............................................................................................................33
3.2.1. Về kết quả nuôi cấy tách chiết và xác định độ tinh sạch bằng quang phổ hấp
thụ ............................................................................................................................... 33
3.2.2. Về xây dựng đường chuẩn và đánh giá hiệu quả PCR ....................................34
3.2.3. Về đánh giá tác dụng của thuốc GF tại các nồng độ khác nhau lên mức độ
phiên mã gen survivin sau 24 giờ trên hai dòng tế bào .................................................35
KẾT LUẬN ..................................................................................................................37
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 39

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt
ADN
ARN
BIR
BIRC5
Bps
CARD
CC
cDNA
CP
F
FBS
GF
IAP
IARC
mARN
NST
NTC
OD
P/S
PBS
PCR
qRT-PCR
R
RT-PCR
snARN
TAE

tARN

Tên đầy đủ Tiếng Anh
Tên Tiếng Việt
Acid deoxyribonucleic
Acid ribonucleic
Baculoviral IAP repeat
Chuỗi lặp IAP
Baculoviral IAP repeat-containing
protein 5
Base pairs
Cặp base nitơ
Caspase Recruitment Domain
Vực trưng tập capase
Coiled Coil
Vùng CC ở đầu tận C
Complementary ADN
ADN bổ sung
Crossing Point
Chu kì ngưỡng
Forward primer
Mồi xuôi
Fetal bovine serum
Huyết thanh bào thai bò
glycyl funtumin
Inhibitors of Apoptosis
Chất ức chế sự chết theo chương
trình của tế bào
The International Agency
Cơ quan nghiên cứu Ung thư quốc

for Research on Cancer
tế
Message ARN
ARN thông tin
Nhiễm sắc thể
Non - template Control
Mẫu đối chứng
Optical Density
Mật độ quang
Penicillin/Streptomycine
Phosphate buffer saline
Dung dịch đệm phosphat
Polymerase Chain Reaction
Phản ứng chuỗi trùng hợp
quantitative RT-PCR hay
Phản ứng PCR phiên mã ngược
real-time RT-PCR
định lượng
Reverse primer
Mồi ngược
Reverse transcription
Phản ứng PCR phiên mã ngược
polymerase chain reaction
Small Nuclear ARN
ARN nhỏ ở nhân
Đệm Tris - Acetate - EDTA
Transfer RNA
ARN vận chuyển

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Cấu trúc phân tử protein survivin [36] .................................................. 4
Hình 1.2. Sơ đồ NST 17 và vị trí của gen survivin [7] ......................................... 5
Hình 1.3. Cơ chế ức chế apoptosis của survivin bằng cách ức chế caspase-9 [49] ... 6

Hình 1.4. Cơ chế ức chế apoptosis bằng cách gắn với SMAC/DIABLO [49] ..... 7
Hình 1.5. Cơ chế phát huỳnh quang của SYBR Green ………………………………15
Hình 1.6. Cơ chế phát huỳnh quang của taqman probe ……………………………..16

Hình 1.7. Hình ảnh bao bì thuốc tiêm Aslem [27] .............................................. 17
Hình 3.1. Phổ hấp thụ UV của các mẫu ARN chiết từ hai dòng tế bào BT474 và
A549 ...................................................................................................... 26
Hình 3.2. Đường biểu diễn chuẩn trên dòng tế bào BT474 ................................ 28
Hình 3.3. Đường biểu diễn chuẩn trên dòng tế bào A549 .................................. 28
Hình 3.4. Đồ thị Realtime RT-PCR tại mức nồng độ 1,5 và 3,0 μg/ml............. 29
Hình 3.5. Đồ thị Realtime RT-PCR tại mức nồng độ 6,0 μg/ml ...................................31


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Thành phần hỗn hợp mix 2 .........................................................................23
Bảng 2.2. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ............................................................. 23
Bảng 2.3. Trình tự cặp mồi và probe ...........................................................................23
Bảng 3.1. Kết quả nồng độ tinh sạch của các mẫu ARN đối với dòng tế bào BT474 27
Bảng 3.2. Kết quả nồng độ tinh sạch của các mẫu ARN đối với dòng tế bào A549 ..27
Bảng 3.3. Kết quả định lượng mức độ phiên mã gen survivin trên dòng tế bào BT474
tại mức nồng độ 1,5 và 3,0 μg/ml sau 24 giờ thử thuốc ............................... 30
Bảng 3.4. Kết quả định lượng mức độ phiên mã gen survivin trên dòng tế bào A549
tại mức nồng độ 1,5 và 3,0 μg/ml sau 24 giờ thử thuốc ............................... 30

Bảng 3.5. Kết quả định lượng mức độ phiên mã gen survivin trên dòng tế bào BT474
tại mức nồng độ 6,0 μg/ml sau 24 giờ thử thuốc ..........................................31
Bảng 3.6. Kết quả định lượng mức độ phiên mã gen survivin trên dòng tế bào A549
tại mức nồng độ 6,0 μg/ml sau 24 giờ thử thuốc ..........................................32


ĐẶT VẤN ĐỀ
Survivin là một protein thuộc họ những protein có khả năng ức chế sự chết theo
chương trình của tế bào - (IAP’s), gồm 142 acid amin có trọng lượng phân tử khoảng
16,5 kDa và được phát hiện từ thư viện bộ gen người năm 1977 [7, 9, 18, 20]. Survivin
có vai trò quan trọng trong quá trình apoptosis, sự hình thành mạch và sự phân chia tế
bào, vì vậy biểu hiện của gen này ở tế bào u liên quan chặt chẽ tới tiên lượng và mức
độ kháng trị liệu của khối u [7, 20, 36]. Có thể thấy việc đánh giá mức độ phiên mã
survivin giúp dự đoán tốc độ phát triển và đáp ứng với điều trị của khối u rất có ý
nghĩa trong lâm sàng. Từ đó giúp xây dựng một phương pháp in-vitro nhằm sàng lọc
các thuốc có tác dụng chống ung thư theo cơ chế ức chế gen survivin, tạo tiền đề cho
các nghiên cứu sau này.
Glycyl funtumin là dẫn xuất của funtumin (3α-amino-5α-pregnan-20-on) là
một aminosteroid được chiết xuất và phân lập lần đầu tiên năm 1958 từ lá cây
Funtumia latifolia-staff (Apocynaceae) - một loại cây cỏ có ở miền Đông châu Phi [4,
6]; có tác dụng kích thích miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào theo
cơ chế hoạt hóa chức năng thực bào của đại thực bào và tăng chuyển hóa dạng lympho
bào [1]. Năm 1981, nhóm nghiên cứu của Giesen đã nuôi cấy tế bào ung thư gan trong
môi trường có glycyl funtumin nồng độ từ 3,3 – 106 µg/ml và trong các khoảng thời
gian 7h, 24h, 48h. Kết quả nghiên cứu cho thấy: ở nồng độ 6 µg/ml, sau 7h số lượng tế
bào bắt đầu giảm và toàn bộ tế bào ung thư gan chết hết sau 48 giờ [13]. Tại Việt
Nam, nghiên cứu của Đào Kim Chi (1984) chỉ ra glycyl funtumin nồng độ 6,0 μg/ml
ức chế sự phát triển của tế bào ung thư [3]. Một số nghiên cứu trước đây của nhóm tác
giả về tác dụng ức chế sự phiên mã gen survivin của glycyl funtumin đã được thực
hiện và cho kết quả khả quan: nghiên cứu của Lê Hà Phương (2016) cho thấy sau 48

giờ nồng độ 6,0 μg/ml GF ức chế 40% sự phiên mã gen survivin trên dòng tế bào ung
thư vú BT474 [5], nghiên cứu của TS Đỗ Hồng Quảng (2017) cho kết luận glycyl
funtumin nồng độ 6,0 μg/ml làm giảm sự phiên mã gen survivin trên dòng tế bào A549
sau 24 giờ. Do vậy việc tiếp tục nghiên cứu, làm rõ cơ chế và thử nghiệm ảnh hưởng
của glycyl funtumin lên mức độ phiên mã gen survivin tại các nồng độ khác nhau là
điều cần thiết. Từ đó xác định được mức liều cụ thể có tác dụng để hướng tới thử
nghiệm lâm sàng các pha cũng như xây dựng phác đồ điều trị khoa học và hiệu quả.


Do đó chúng tôi tiếp tục thực hiện đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của glycylfuntumin lên mức độ phiên mã survivin trên dòng tế bào BT474 và A549” với mục
tiêu: “ Đánh giá ảnh hưởng của glycyl funtumin tại các nồng độ khác nhau lên mức độ
phiên mã gen survivin trên hai dòng tế bào BT474 và A549 sau 24 giờ thử thuốc”


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về survivin
Survivin là một protein thuộc nhóm các protein ức chế sự chết theo chương
trình của tế bào (Apoptosis) - IAP’s; có chức năng ức chế quá trình Apoptosis , vận
chuyển nhiễm sắc thể trong quá trình phân bào và đóng vai trò quan trọng trong sự
hình thành mạch. Apoptosis là sự tự chết theo chu trình của tế bào (programmed cell
death-PCD) xảy ra trong các sinh vật đa bào. Giống như bất kỳ chu trình sinh học nào,
apoptosis có thể được kích hoạt hoặc ức chế bởi các yếu tố hóa học. Apoptosis được
kích hoạt thông qua hai con đường chính: ngoại sinh và nội sinh. Con đường ngoại
sinh thông qua các tín hiệu ngoại bào liên kết với các thụ thể trên màng tế bào để gây
ra cơ chế tự hủy tế bào còn con đường nội sinh liên đến tín hiệu bên trong tế bào thông
qua ty thể. Các chất ức chế apoptosis là một nhóm các protein chủ yếu hoạt động theo
con đường nội sinh, ngăn chặn sự chết theo chương trình của tế bào; nếu bị biến đổi
hoặc điều chỉnh không đúng cách sẽ là nguyên nhân dẫn đến ung thư hoặc các tác
động xấu khác cho tế bào. Một số có khả năng ngăn chặn các caspase - một họ

proteins cysteine đóng một vai trò quan trọng trong quá trình chết theo chương trình
của tế bào - apoptosis; điển hình bao gồm họ Bcl-2, chất ức chế viral Crma, và IAP’s.
IAP’s của con người được xác định có 8 loại, một số đồng đẳng của IPA’s đã
được xác định trong nhiều sinh vật. Các chất ức chế thuộc nhóm IAP’s được tìm thấy
ở hầu hết các tế bào động vật có xương sống từ bậc thấp đến bậc cao. 8 protein trong
nhóm đã được tìm thấy và xác định ở người bao gồm : BRUCE, ILP-2, XIAP, C-IAP1,
C-IAP2, NAIP, Livin và Survivin. IAP’s là một nhóm protein quan trọng quyết định
số phận của tế bào trong việc đáp ứng với các tín hiệu bất thường của gen, có chức
năng điều chỉnh sự chết theo chương trình của tế bào, do đó sự rối loạn trong chức
năng của IAP’s có thể dẫn tới sự hình thành và phát triển của khối u, phát sinh ung thư
hoặc sự kháng thuốc. Survivin là protein nhỏ nhất trong nhóm, biểu hiện ở tế bào ung
thư trong hầu hết các loại ung thư phổ biến nhưng hiếm biểu hiện ở các mô bình
thường tương ứng [43].


1.1.1. Cấu trúc phân tử
Về cấu trúc các IAP’s đều chứa khoảng 70 amino acid đươc gọi là chuỗi lặp lại
BIR ở đầu tận N, đóng vai trò quan trọng quyết định hoạt tính ức chế apoptosis. Các
protein trong nhóm có số lượng vùng BIR khác nhau nhưng đều có phần lõi cấu tạo từ
Cysteine và Histidine với cấu trúc (Cx2Cx6Wx3Dx5Hx6C); có vai trò ức chế hoạt
động của caspase thông qua một liên kết với kẽm có thể bám vào bề mặt các caspase.
Ngoài vùng BIR, một số IAP của virus, động vật có vú và côn trùng còn có một cấu
trúc dạng vòng ở đầu tận C liên quan đến hoạt động ubiquitin-ligase [19].

Hình 1.1. Cấu trúc phân tử protein survivin [36]
Trong số tất cả các IAP’s đã biết đến nay, Survivin là protein IAP’s nhỏ nhất
với một vùng BIR đầu tận N và vùng Coiled Coil(CC) cấu trúc dạng xoắn α-helix ở
đầu tận C và có dạng dimer ổn định trong dung dịch. Survivin hạn chế biểu hiện ở mô
của người trưởng thành và có vai trò quyết định trong việc phân chia tế bào và ức chế
apoptosis. Survivin biểu hiện mạnh ở hầu hết các loại ung thư ở người nhưng không

biểu hiện ở mô người trưởng thành khác biệt bình thường [22,44], vì vậy survivin trở
thành một marker ung thư đáng chú ý.
Gen survivin dài 14.7 kb , trọng lượng phân tử vào khoảng 16.5 kDa. Survivin
được mã hoá bởi gen BIRC5 (baculoviral IAP repeat-containing protein 5) [11] và có
cấu tạo gồm 4 exon và 3 introns gồm 476 nucleotide trên các đoạn nhiễm sắc thể
17q25 [12, 20, 36].


Hình 1.2. Sơ đồ NST 17 và vị trí của gen survivin [7]

Survivin còn có thêm các đồng dạng ghép nối, chèn thêm hoặc xoá một số
chuỗi mã hoá và không mã hoá trên gần như toàn bộ chiều dài gen survivin tạo thành
các phiên bản khác nhau với các chức năng khác nhau bao gồm survivin-2α; survivin
ΔEx3; survivin-2β; survivin-3β và survivin [23]. Các đồng dạng này được tìm thấy ở
các vị trí khác nhau trong tế bào: survivin ΔEx3 được tìm thấy trong nhân, survivin và
survivin-2β được tìm thấy trong tế bào chất [23, 25, 28]; survivin-2α phân bố đồng đều
trong nhân và tế bào chất [10]. Sự khác nhau giữa các đồng dạng ghép nối survivin và
vị trí trong tế bào điều hoà cân bằng giữa apoptosis và ức chế apoptosis. Chèn exon 2B
trong survivin-2β trong miền BIR làm tăng khả năng ức chế apoptosis Loại bỏ exon 3
trong survivin ΔEx3 làm ngắt miền BIR và giữ lại khả năng ức chế apoptosis [12].
1.1.2. Chức năng sinh học của survivin
Survivin có 3 chức năng chính : vận chuyển nhiễm sắc thể trong phân bào, ức
chế apoptosis và có vai trò trong sự hình thành mạch. Survivin có vai trò quan trọng
trong sự phát triển của phôi thai, nhưng hạn chế biểu hiện ở các mô đã biệt hoá.
Survivin được tìm thấy trong nguyên sinh chất của tế bào khối u nhưng một số nghiên
cứu cho thấy gen này cũng biểu hiện trong các tế bào trưởng thành bình thường, tế bào
tạo máu nguyên thuỷ, tế bào lympho T, bạch cầu đa nhân trung tính, tế bào gan, niêm
mạc đường tiêu hoá và các té bào nội mô mạch máu. Tế bào CD34 cũng có sự biểu
hiện của survivin trong tất cả các giai đoạn của chu kì tế bào [16].
1.1.2.1 Vai trò ức chế sự chết theo chương trình của tế bào

Sự biểu hiện quá mức của survivin làm ức chế cả con đường nội sinh và ngoại
sinh của quá trình apoptosis. Sự ức chế survivin gây ra các khiếm khuyết trong quá
trình apoptosis và những khiếm khuyết khác trong sự phân chia tế bào. Cơ chế ức chế


apoptosis của survivin vẫn chưa được làm rõ nhưng thông qua ức chế sự hoạt hoá
caspase 3 và 7, survivin đóng vai trò quan trọng trong ức chế quá trình apoptosis.
Apoptosis là quá trình tế bào chết theo chương trình đã được lập trình trong
gen, là một phần trong hoạt động sống của tế bào đảm bảo sự sinh trưởng và phát triển
hài hoà trong thời gian phát triển phôi thai, bảo vệ cơ thể và thay thế mô ở những cơ
thể trưởng thành [11]. Trường hợp bệnh lí, những tế bào không được cung cấp máu sẽ
trương lên, nứt, rách màng và gây vỡ tế bào dẫn tới thực bào hoặc tế bào bị teo lại,
màng tế bào trở nên sần sùi và nhân thường kết đặc.

Hình 1.3. Cơ chế ức chế apoptosis của survivin bằng cách ức chế caspase-9 [49]

Với sự tham gia của caspase - một nhóm các protease cysteine, Apoptosis được
khởi xướng bởi cytochrome c có khả năng liên kết với cardiolipin ở màng trong ty thể,
kích hoạt caspase-9. Sau đó caspase-9 tiếp tục kích hoạt caspase-3 và caspase-7 làm
nhiệm vụ tiêu diệt tế bào bằng cách ức chế và phân hủy những enzyme nhân đôi và
enzyme sửa chữa ADN; hoạt hoá những enzyme cắt ADN thành những mảnh nhỏ và
phá vỡ cấu trúc protein trong nhân; dẫn tới quá trình thực bào và sự thay thế bằng một
tế bào mới sau vài giờ [14] (Hình 1.3).


Nhiều giả thiết cho rằng survivin tương tác với caspase-3 và ức chế hoạt động
của caspase-3 [47] nhưng survivin không có cấu trúc vùng BIR tương thích với
caspase-3 như các IAP’s khác, . Một số nghiên cứu khác cho rằng survivin liên kết
trực tiếp với caspase-9 và ức chế hoạt động của caspase-9 [17]. Một cơ chế khác được
đề xuất cho sự ức chế caspase-9 là sự liên kết giữa HBXIP (hepatitis B A-interaction

protein) và procaspase-9. Một số nghiên cứu cho rằng XIAP cũng ức chế caspase cùng
với survivin.
Trong một cơ chế khác, survivin ức chế apoptosis bằng cách gắn với protein
pro-apoptotic được gọi là Secondary Mitochondria-derived Activator of Caspase
(SMAC/DIABLO). SMAC/DIABLO được phóng thích từ ty thể để kích hoạt caspase9. Song và cộng sự đã chứng minh survivin liên kết với SMAC/DIABLO dẫn tới ngăn
chặn quá trình apoptosis trong tế bào HELA [50] (hình 1.4).

Hình 1.4. Cơ chế ức chế Apoptosis bằng cách gắn với SMAC/DIABLO [49]

Survivin có vai trò quan trọng trong ức chế apoptosis và sự phân chia tế bào.
Biểu hiện của Survivin trong nguyên sinh chất hoặc ty thể có vai trò ức chế apoptosis
ngoại sinh lẫn nội sinh. Khi quá trình apoptosis không xảy ra hoặc bị ức chế, tế bào sẽ


không bị phá huỷ bởi sự chết theo chương trình và tế bào sẽ phân chia, tạo thành các tế
bào con với ADN bị tổn thương. Đây là một cơ chế dẫn tới phát sinh ung thư [31].
1.1.2.2 Survivin trong phân chia tế bào
Đây là chức năng quan trọng của survivin. Sự hoàn chỉnh của chu kì tế bào
phụ thuộc vào sự tổng hợp, biểu hiện và suy thoái của survivin. Survivin có vai trò
điều hoà sự phân chia tế bào ở pha G2/M. Trong chu kỳ tế bào, survivin đươc phát hiện
ở phần tâm ở kỳ đầu/kỳ giữa và có ở vùng giữa sợi thoi vô sắc ở kỳ sau/kỳ cuối, nhưng
không phát hiện được vào thời điểm kết thúc kỳ cuối [43]. Một số nghiên cứu đã chỉ ra
rằng survivin tồn tại ở tâm động cho đến kì giữa, sau đó đến phần giữa của thoi vô sắc
vào kỳ sau và tách về phía 2 cực ở kỳ cuối nguyên phân và phân bào giảm nhiễm [9].
Survivin trong nhân hoạt động như một thành phần quan trọng của phức hợp nhiễm
sắc thể (chromosome passenger complex - CPC) nhân, đóng một vai trò quan trọng
trong việc điều hòa sự phân chia tế bào. Survivin là một thành phần không thể thiếu
của phức hợp chromosomal passenger complex - CPC để đảm bảo sự phân tách hợp lý
của nhiễm sắc thể và cytokinesis trong quá trình phân chia tế bào.
CPC là một phức hợp hetero-tetrameric phức tạp xuất hiện tại các vị trí khác

nhau tại các thời điểm khác nhau trong nguyên phân, vai trò quyết định các hoạt động
quan trọng trong phân chia tế bào như quá trình phân chia nguyên sinh chất
(cytokinesis). Aura B kinase là enzyme của CPC còn 3 thành phần còn lại INCENP
(inner centromere protein), survivin và Borealin (còn được gọi là Dasra có chức năng
điều chỉnh và chức năng đích). INCENP đóng vai trò là protein khung và ổn định phức
hợp. Borealin thúc đẩy sự liên kết giữa survivin và INCENP, là yếu tố quyết định sự
ổn định của trung tâm CPC. Survivin là protein không thể thiếu trong CPC, đảm bảo
các hoạt động của CPC. Survivin còn có vai trò thúc đẩy sự polymer hoá tubulin và
điều chỉnh sự hình thành vi ống trong quá trình phân chia tế bào. Sự thay đổi của bất kì
thành phần nào đều có thể dẫn đến khiếm khuyết trong sự phân tách NST hay phân
chia nguyên sinh chất và dẫn tới rối loạn biểu hiện gen.
1.1.2.3. Survivin trong sự hình thành mạch
Cơ chế tăng sinh mạch của survivin đóng góp vào việc bảo tồn tính toàn vẹn của
vi cấu trúc hình ống và ức chế apoptosis ở tế bào nội mạc, làm cho tế bào này có khả
năng tồn tại và có chức năng bảo vệ tế bào ung thư [13,39]. Survivin làm phát triển các
khối u trung gian thông qua việc thúc đẩy sự hình thành mạch trong các tế bào ung


thư. Survivin làm tăng biểu hiện của VEGF. Tình trạng thiếu oxy thường xảy ra ở các
khối u làm tạo ra HIF-1. Biểu hiện quá mức của survivin làm tăng tổng hợp VEGF
thông qua cơ chế phức tạp phụ thuộc HIF-1 trong điều kiện thiếu oxy [39].
1.1.3. Vai trò của survivin trong ung thư
1.1.3.1. Biểu hiện của survivin trong ung thư
Survivin là chất ức chế quá trình apoptosis, được biểu hiện cao ở hầu hết các bệnh
ung thư và sự có mặt của nó liên quan đến tình trạng kháng với hoá trị liệu, tăng tái
phát khối u và sự sống còn của bệnh nhân [7, 20, 36]. Một số ung thư đã được chứng
minh có sự biểu hiện cao của survivin như ung thư phổi, ung thư dạ dày thực quản,
ung thư tuỵ, tử cung, buồng trứng, gan, miệng và ung thư da không ác tính [12].
Survivin được biểu hiện trong tất cả 60 dòng khối u của con người, với mức độ biểu
hiện cao nhất trong ung thư vú và ung thư phổi, biểu hiện thấp nhất trong ung thư thận

[29]. Biểu hiện quá mức của survivin luôn gắn với các khối u ác tính và âm tínhvới các
khối u lành tính hoặc không phải ung thư. Xét nghiệm ở tế bào niêm mạc hay tế bào da
bình thường cho kết quả âm tính với survivin, ngược lại một nghiên cứu chỉ ra 56%
ung thư miệng và 64% ung thư biểu mô tế bào vảy là dương tính với survivin [35].
Ngoài ra, phát hiện survivin trong nước tiểu cũng là một dấu hiệu chẩn đoán ung thư
bàng quang [28].
Survivin tham gia vào quá trình tăng sinh tế bào, tăng sinh mạch nuôi dưỡng
các khối u và sự tăng sinh này là rất mạnh, do đó làm mất hiệu quả điều trị bằng hoá trị
liệu. Một nghiên cứu trên các tế bào ung thư tuyến giáp còn sống sau 48h tiếp xúc với
cisplatin, doxorubicin, taxol đều phát hiện thấy sự gia tăng biểu hiện của survivin [40].
Ngoài ra, sự biểu hiện của các đồng dạng khác nhau của survivin cũng đem lại các ý
nghĩa đặc trưng cho từng loại. Một số nghiên cứu chỉ ra sự hiện diện của Survivin-2α
có thể bảo vệ các tế bào tuyến giáp [15, 30], còn Survivin-ΔEx3 là một dấu hiệu cho
ung thư tuyến giáp ác tính.
1.1.3.2. Cơ chế phân tử của survivin trong ung thư
Có nhiều cơ chế được đưa ra nhằm giải thích sự liên quan giữa biểu hiện của
survivin và sự phát triển các tế bào ung thư như khả năng ức chế quá trình apoptosis,
tham gia chu kỳ tế bào, hay thông qua sự tương tác vật lý với chức năng sốc nhiệt


protein 90, ức chế SMAC/DIABLO, liên kết với caspase ức chế apoptosis, p21
WAF1/Cip, CDK4 hoặc p53 tuy nhiên cơ chế cụ thể vẫn còn bỏ ngỏ.
P53 là một protein có vai trò ức chế khối u. Hai vị trí gắn với p53 đã được tìm
thấy trong promoter của survivin có thể dẫn tới mối liên kết chức năng giữa survivin
và p53 [34]. Ngoài ra survivin cũng quy định biểu hiện của gen p53 thông qua ức chế
sự tách phức hợp MDM2 làm tăng phân huỷ p53, từ đó dẫn đến sự suy giảm mức biểu
hiện protein p53 trong các tế bào có survivin biểu hiện quá mức [46].
Một con đường khác có liên quan đến biểu hiện của survivin trong ung thư là
tình trạng thiếu oxy ở khối u. Tình trạng thiếu oxy có thể dẫn tới nhiều quá trình sinh
học như sự hình thành mạch khối u, xâm lấn, di căn và kháng trị liệu. Để đối phó với

tình trạng thiếu oxy, HIF-1 một phức hợp protein cấu trúc dime gồm HIF-1α và HIF1β tăng biểu hiện làm kích hoạt phiên mã nhiều gen quan trọng đảm nhiệm chức năng
của tế bào trong điều kiện thiếu oxy. Một số nghiên cứu cho thấy HIF-1α làm tăng
biểu hiện của survivin trong ung thư vú, ung thư phổi và ung thư tuyến tuỵ [45].
1.1.3.3. Ứng dụng của survivin trong chuẩn đoán và điều trị ung thư
Do có mức độ biểu hiện cao rõ rệt trong nhiều bệnh ung thư và đóng vai trò như
nguyên nhân tiến triển ung thư, survivin đang được nghiên cứu rất nhiều và được xem
xét như một chỉ dấu ung thư [20]. Đặc biệt survivin không biểu hiện trong ty thể của tế
bào bình thường, như vậy survivin ty thể là dấu hiệu đặc trưng liên quan đến khối u và
ung thư. Đánh giá liên tục sự khác biệt về cơ chế hoạt động của survivin giữa bệnh
ung thư và tế bào bình thường có thể là minh chứng quan trọng đối với sự phát triển
của phương pháp điều trị anti-survivin chọn lọc và giảm tai biến ở mức tối thiểu.

1.2.

Tổng quan phƣơng pháp đánh giá biểu hiện gen survivin

1.2.1. Quá trình biểu hiện gen
Biểu hiện gen là quá trình mà thông tin từ một gen được sử dụng trong quá trình
tổng hợp một sản phẩm của gen mang chức năng . Các sản phẩm này thường là các
protein, nhưng trong các gen mã hóa không phải protein như ARN vận chuyển
(tRNA) hoặc các ARN nhỏ trong nhân (snRNA), sản phẩm là một ARN mang chức
năng .


Quá trình biếu hiện gen gồm 2 giai đoạn chính là phiên mã và dịch mã. Hầu hết
các tế bào trong cơ thể đều có bộ nhiễm sắc thể giống nhau và số lượng gen như nhau.
Tuy nhiên sự biểu hiện của gen được điều khiển rất chặt chẽ. Quy định gen cho
phép kiểm soát tế bào trên cấu trúc và chức năng, và là cơ sở cho sự khác biệt tế
bào, hình thái và tính linh hoạt và khả năng thích ứng của bất kỳ sinh vật nào. Việc
điều hòa gen làm nền cho sự thay đổi tiến hóa, vì việc kiểm soát thời gian, vị trí và số

lượng biểu hiện gen có thể ảnh hưởng sâu sắc đến các chức năng (hoạt động) của gen
trong tế bào hoặc trong sinh vật đa bào. Việc đánh giá mức độ biểu hiện của một gen
cụ thể được thực hiện thông qua việc phát hiện và đo lường các sản phẩm của gen đó
thông qua 2 giai đoạn phiên mã (ARN) và dịch mã (protein).
Trong di truyền học, biểu hiện gen là cấp độ cơ bản nhất mà tại đó kiểu gen tạo
ra kiểu hình, tức là tính trạng quan sát được. Các mã di truyền được lưu trữ
trong DNA được "giải thích" bởi biểu hiện gen, và các thuộc tính của biểu thức làm
phát sinh kiểu hình của sinh vật. Những kiểu hình như vậy thường được biểu hiện
bằng cách tổng hợp các protein kiểm soát hình dạng của sinh vật, hoặc hoạt động
như các enzym xúc tác các con đường trao đổi chất cụ thể đặc trưng cho sinh vật. Do
đó, việc điều chỉnh biểu hiện gen rất quan trọng đối với sự phát triển của sinh vật.
1.2.2. Các phương pháp đánh giá mức độ biểu hiện gen survivin
Trên thế giới biểu hiện gen survivin trong ung thư đươc nghiên cứu ở các giai đoạn
phiên mã và dịch mã. Để đánh giá mức độ phiên mã gen người ta sử dụng kỹ thuật
PCR và các biến thể để định lượng được số bản sao gen đích thông qua khuếch đại gen
lên nhiều lần từ mẫu ban đầu. Để đánh giá biểu hiện gen ở mức độ dịch mã, các nhà
nghiên cứu thường sử dụng kỹ thuật Western blot sử dụng một kháng thể có gắn
huỳnh quang hoặc phóng xạ để phát hiện protein đích dựa vào phản ứng kết hợp kháng
nguyên - kháng thể trên một pha rắn. Nghiên cứu mức độ phiên mã của mARN
survivin trong tế bào tại mô ung thư vú và tế bào ung thư vú lưu hành trong máu của
tác giả Nguyễn Minh Hiền 2014, tác giả đã xây dựng mô hình đánh giá biểu hiện
cDNA các gen survivin và hMAM và phản ứng RT-PCR khuếch đại gen để đánh giá
mức độ sao chép các gen này. Nghiên cứu của tác giả Đỗ Hồng Quảng nghiên cứu ảnh
hưởng của Glycyl funtumin lên mức độ phiên mã gen survivin trên dòng tế bào BT474
sủ dụng kỹ thuật Reatime RT-PCR để đánh giá mức độ phiên mã gen survivin trên


dòng tế bào này. Vì vậy, trong khuôn khổ nghiên cứu này, chúng tôi tiếp tục sử dụng
kỹ thuật Realtime RT-PCR để định lượng mức độ phiên mã gen survivin trên hai dòng
tế bào được lựa chọn sau khi thử thuốc tại các mức nồng độ khác nhau.

1.2.2.1. Kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp – Polymerase Chain Reaction) là
phương pháp invitro để nhân bản nhanh một đoạn ADN nào đó, có độ nhạy rất cao, mà
chỉ cần một khối lượng mẫu ban đầu hạn chế. Kỹ thuật tổng hợp ADN ngoài cơ thể
cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của kĩ thuật sao chép ADN trong cơ thể như:
đoạn cần nhân mở xoắn thành hai mạch đơn; cần có các cặp mồi (mồi xuôi, mồi
ngược); cần nguyên liệu và điều kiện môi trường thích hợp và enzyme ADN
polymerase. PCR dùng nhiệt độ cao 94o C tháo xoắn thay cho helicase kết hợp với
enzyme ADN polymerase chịu nhiệt và hệ thống điều nhiệt thích hợp cho từng giai
đoạn phản ứng tổng hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chủ động. Nhờ kỹ thuật
PCR mà với môt lượng nhỏ ADN ban đầu chúng ta có thể thu được đủ lượng ADN
cần thiết để tiến hành các thí nghiệm về ADN.
-

RT-PCR

Phản ứng chuỗi trùng hợp-phiên mã ngược hay gọi tắt là RT-PCR (Reverse
transcription polymerase chain reaction) là một trong nhiều biến thể của phản ứng
khuếch đại ADN (PCR), đã được phát minh và sử dụng như một phương pháp nhân
ARN và phân tích sau khi chuyển nó thành cADN nhờ phiên mã ngươc. RT-PCR có
thể dung để tách dòng, xây dựng thư viện cADN và tổng hợp probe. Kỹ thuật này gồm
2 phần: Tổng hợp cADN từ ARN nhờ phiên mã ngược (RT) và nhân bội phân tử ADN
đặc hiệu bằng phản ứng PCR.
RT-PCR là kĩ thuật kinh điển được sử dụng nhiều trong đánh giá sự biểu hiện
gen. Nhờ có phản ứng RT, ARN thay vì vẫn ở dạng nhạy cảm, dễ bị phân huỷ được
chuyển thành cADN bền hơn, thuận lợi hơn cho bảo quản và thực hiện các phép phân
tích. Số lượng ARN/cADN trong tế bào không nhiều, nhưng được khuếch đại lên hang
triệu lần, có thể dễ dàng phát hiện và định lượng chúng. Có 2 phương pháp thực hiện
kỹ thuật RT-PCR. Một phương pháp thực hiện 2 quá trình riêng biệt: tạo cADN từ
ARN bằng phản ứng phiên mã ngược và sử dụng cADN để thực hiện phản ứng PCR

(RT-PCR 2 bước). Phương pháp 2 sử dụng enzyme phiên mã ngược ngay trong ống


phản ứng PCR, gộp 2 giai đoạn RT-PCR vào 1 bước duy nhất. Cả 2 phương pháp này
đều đang được sử dụng trong nghiên cứu về biểu hiện gen.
Ngoài ra trong nhiều nghiên cứu biểu hiện gen khác, người ta so sánh sự biểu
hiện của gen đích với một gen luôn được biểu hiện ở mức ổn định trong tế bào, còn gọi
là gen housekeeping. Chính vì vậy, RT-PCR đánh giá một cách tương đối sự biểu hiện
gen, được sử dụng để nghiên cứu sàng lọc sơ bộ ban đầu cho sự biểu hiện gen bệnh lý,
tìm ra cơ chế phân tử và đích tác dụng của thuốc.
-

Real-time RT-PCR
qRT-PCR (quantitative RT-PCR hay real-time RT-PCR) là biến thể của RT-

PCR, trong đó kết quả khuếch đại ADN đích trong ống nghiệm được định lượng ngay
sau mỗi chu kì nhiệt của phản ứng thông qua tín hiệu huỳnh quang. Người ta thường
sử dụng thuốc nhuộm phát huỳnh quang xen vào ADN mạch kép hoặc dùng mẫu dò
ADN oligonucleotide được biến đổi để phát huỳnh quang khi lai với ADN bổ trợ.
Thông thường real-time PCR kết hợp với RT-PCR để định lượng mARN có hàm
lượng nhỏ, giúp nhà nghiên cứu định lượng mức độ biểu hiện gen một cách tương đối
tại một thời điểm cụ thể hoặc ở những tế bào hoặc mô cụ thể.
Thành phần phản ứng được bổ sung thêm các tác nhân phát huỳnh quang và
máy chu kì nhiệt được trang bị các bộ phận phát tín hiệu huỳnh quang. Các tác nhân
phát huỳnh quang được sử dụng có thể là chất màu huỳnh quang xen vào sợi đôi AND
(SYBR Green) hoặc các probe.
Các chất màu huỳnh quang như SYBR Green có ái lực rất cao với ADN sẽ xen
vào sợi đôi ADN và phát được ánh sáng huỳnh quang khi nhận được ánh sáng kích
thích. Nguyên tắc của kỹ thuật này là khi không có sự hiện diện sản phẩm khuếch đại
của PCR, chất huỳnh quang bị khuếch tán trong dung dịch PCR mix, do vậy tube phản

ứng không phát huỳnh quang hoặc tín hiệu huỳnh quang yếu khi nhận được nguồn
sáng kích thích. Khi có sự hiện diện sản phẩm khuếch đại của PCR, chất màu huỳnh
quang sẽ xen vào và tập trung trên sợi đôi ADN của sản phẩm khuếch đại, tube phản
ứng sẽ phát huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích (Hình 1.5). Chất màu
SYBR Green I có ưu điểm vượt trội hơn các chất màu chèn khác như màu huỳnh
quang nền rất thấp, khả năng chèn vào sợi đôi cao nhưng không làm cho các sợi đôi
gắn vào nhau khi bị biến tính nhờ vậy ít ảnh hưởng đến hiệu quả khuếch đại PCR.


Hình 1.5. Cơ chế phát huỳnh quang của SYBR Green
Cơ chế phát huỳnh quang của probe phức tạp hơn so với SYBR Green. Có
nhiều loại probe được sử dụng như: taqman probe, probe lai hoặc các loại probe khác.
Người ta cũng có thể sử dụng nhiều probe trong cùng một ống phản ứng để xác định
biểu hiện của nhiều gen khác nhau. Trong kỹ thuật này, real-time PCR mix ngoài các
thành phần cơ bản của PCR mix, còn chứa hai thành phần quan trọng để probe có thể
phát huỳnh quang được khi có sự hiện diện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ
DNA đích là :
(1) Taqman probe: là những oligonucleotides có trình tự bổ sung với một trình tự
đặc hiệu trên DNA đích và trình tự này dài khoảng 24-30 bases với đầu 5’ có
gắn chất huỳnh quang gọi là reporter còn đầu 3’ có gắn chất hấp phụ tương ứng
(gọi là quencher) để hấp thụ ánh sáng huỳnh quang phát ra từ reporter.
(2) Enzym Taq polymerase có hoạt tính 5’-3’ exonuclease có khả năng thuỷ giải
cắt bỏ probe khi probe bắt cặp lên sợi khuôn và cản đầu 3’ của mồi khi enzyme
kéo dài mồi tổng hợp sợi bổ sung.


Hình 1.6. Cơ chế phát huỳnh quang của taqman probe
Khi chưa có sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích, phân tử taqman probe
vẫn còn nguyên vẹn nên huỳnh quang phát ra được từ reporter ở đầu 5’ sẽ bị quencher
ở đầu 3’ của probe hấp phụ, do đó ống thử nghiệm sẽ không phát được huỳnh quang

khi nhận được nguồn sáng kích thích. Khi bắt đầu có sự xuất hiện sản phẩm khuếch
đại đặc hiệu,taqman probe sẽ bắt cặp vào sợi khuôn của sản phẩm; sau đó được
enzyme Taq polymerase cắt bỏ để kéo dài mồi tổng hợp nên sợi bổ sung. Reporter và
Quencher sẽ rời xa nhau và phát ra tín hiệu huỳnh quang (Hình 1.6). Càng nhiều sản
phẩm khuếch đại xuất hiện thí số lượng reporter tự do sẽ càng nhiều đến khi cường độ
huỳnh quang đủ mạnh, máy sẽ ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang và hiển thị trên
màn hình.
1.2.2.2. Kỹ thuật Western blot
Western blot còn có tên gọi khác là Western blotting hay phương pháp lai thấm
protein là kỹ thuật phát hiện protein bằng phương pháp điện di trên gel SDS – PAGE
(sodium dodecul sulfate – polyacrylamide gel electrotphoresis), thường sử dụng
antibody protein có gắn phóng xạ hoặc huỳnh quang để phát hiện protein đích mong


muốn/ Kỹ thuật này được ứng dụng rộng rãi trong chuẩn đoán các bệnh miễn dịch như
HIV - AIDS, viêm gan virus…
Kỹ thuật này bao gồm các giai đoạn xử lý mẫu tách protein từ tế bào rồi biến
tính bằng SDS và chạy điện di trên gel SDS – PAGE, tiến hành lai kháng khể hỗn hợp
bằng cách chuyển lên màng lai nitrocellulose (giữ nguyên vị trí phân tách trên gel) và
ủ với kháng thể sơ cấp tạo phức hợp protein – kháng thể sau đó ủ với kháng thể thứ
cấp tạo phức hợp protein – kháng thể sơ cấp – kháng thể thứ câp. Kháng thể thứ cấp
được gắn huỳnh quang hoặc đánh dấu phóng xạ và phát hiện bằng cách chụp màng lên
tấm phim X-quang.
Nhờ độ phân giải cao của gel và tính đặc hiệu của phản ứng miễn dịch kháng
nguyên –kháng thể, kỹ thuật Western blot thường được sử dụng để phân tích biểu hiện
protein cũng như đánh giá mức độ dịch mã của gen đích.

1.3. Tổng quan về glycyl funtumin
Glycyl funtumin là một aminosteroid được tìm ra, chiết xuất và phân lập từ năm
1958, tổng hợp toàn phần tại Việt Nam năm 1984 [24] và được sử dụng như một thuốc

hỗ trợ kích thích tăng cường miễn dịch với biệt dược Aslem. Aslem với thành phần
bao gồm hoạt chất chính GF 0,3 mg và tá dược NaCl 0,9% vừa đủ 1ml, bào chế dạng
dung dịch tiêm, được chỉ định hỗ trợ điều trị trong một số bệnh ung thư và nhiễm
khuẩn [27].
Công thức phân tử GF: C23H38O2N2.HCl
Tên khoa học: N-(aminoethanoyl) - 3α – amino - 5α – pregnan – 20 – on
hydroclorid [2]


Hình 1.7. Hình ảnh bao bì thuốc tiêm Aslem [27]

1.3.1. Lịch sử nghiên cứu
Năm 1958, Funtumin – (3α – amino - 5α – pregnan – 20 – on) lần đầu tiên đã
được chiết xuất, phân lập từ lá cây Funtumia lactifolia-staff Apocynaceae, một loại cây
ở miền Đông Châu Phi do Janot, Khương Hữu Quý và Goutarel tiến hành [4, 6].
Năm 1965, Nguyễn Đăng Tâm đã sử dụng Funtumin tự nhiên cũng như đồng
phân 3β – amino của nó làm khung steroid để tổng hợp các dẫn xuất aminoacyl steroid
(gắn nhóm carboxyl của các acid amin vào nhóm amin của steroid) tạo ra các dẫn chất
: Glycyl funtumin, Glycyl – glycyl funtumin, Phenyl – alanyl funtumin. Trong đó nhận
thấy N- glycyl funtumin là chất có tính kích thích miễn dịch mạnh và được lựa chọn để
bào chế tiếp thành chế phẩm thuốc ở dạng muối Hydrobromid và có tên là LHI.
Năm 1973, chế phẩm LHI đã được GS Tôn Thất Tùng áp dụng điều trị có kết quả
ung thư gan tiên phát, mở ra triển vọng to lớn trong đều trị những bệnh có liên quan
đến suy giảm miễn dịch như ung thư, AIDS…
Năm 1977, Đặng Hanh Phức và cộng sự đã bán tổng hợp được Glycyl funtumin
hydroclorid, đặt tên là ASLEM và được sản xuất dưới dạng thuốc tiêm ở quy mô
phòng thí nghiệm để tiến hành những thử nghiệm lâm sàng bước đầu trong điều trị bổ
trợ các loại ung thư: ung thư gan, ung thư phổi; nhiễm khuẩn ngoại khoa kết hợp với
kháng sinh và trong nhiễm virus khác…tại các bệnh viện: bệnh viện Hữu Nghị Việt
Đức, Viện Lao và Bệnh Phổi…

Những năm tiếp theo, các thử nghiệm khác về ASLEM cũng đã được tiến hành
như: thử tác dụng kích thích miễn dịch trên thửu nghiệm Jerne Cunningham, đánh giá
khả năng kích thích miễn dịch tế bào trên test phục hồi tạo Roétte E bị ức chế bởi