Khảo sát và đánh giá phương pháp chiết cặp ion đo quang và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao định lượng chế chlorpheniramin maleate trong chế phẩm thuốc đa thành phần

BỘ Y TẾ

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
===== m =====

Nguyễn Việt H oà

KHẢO SÁT, ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP CHIế T
CẶP ION - ĐO QUANG VÀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG
HIỆU NĂNG CAO ĐỊNH LƯỢNG CHLORPHENIRAMIN
MALEATE TRONG CH ế PH ẩ M t h u ố c đ a t h à n h p h ầ n
Luận văn Thạc sĩ dược học
Chuyên ngành: Kiểm nghiệm Dược phâm r- Độc chất học
Mã sô: 030205

Người hướng dẫn khoa học:

PGS . TS. Trần Tử An
TS. Thái phan Quỳnh Như

HÀ NỘI - 2003


MỤC LỤC
Trang
ĐẬT VẤN Đề
Chương 1: T ổ NG QUAN

01
04

1.1.
1.1.1.
1.1.2.
1.2.
1.3.
1.3.1.
1.3.2.
1.3.3.
1.3.4.

04
04
04'
04
05
05
05
06
09

Công thức, tính chất của Chlorpheniramin maleate
Công thức
Tính chất
Tác dụng dược lý
Các phương pháp định lưọng Chlorpheniramin maleate
Phương pháp môi trườnơ khan
Phương pháp quang phổ tử ngoại
Phương pháp chiết cặp ion- đo quang
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chương 2: Đ ố i TƯỢNG, THIẾT BỊ, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

21

2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Các mẫu sử dụng trong khảo sá t phương pháp
2.1.2. Các mẫu sử dụng trong thử áp dụng phương pháp
2.1.3. Các chất đối chiếu
2.2. Thiết bị và hoá chất
2.2.1.Thiết bị
2.2.2.
Hoá chất
2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2 .3.1.Phương pháp chiết cặp ion - đo quang định lượng
Chlorpheniramin maleate trong thuốc đa thành phần
2.3.2.
Xây dựng phương pháp HPLC để định lượng đổng thời
Chlorpheniramin maleate và Phenylpropanolamin hydroclorid,
định lượng Paracetamol trong thuốc đa thành phần
2.3.3. So sánh phương pháp chiết cặp ion - đo quang
và phương pháp HPLC định lượng Chlorpheniramin maỉeate
2.3.4. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả

21
21
22
22

23
23
23
24

Chương 3: THỤC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

31

3.1.

24

26
29
29

Định lượng Chlorpheniramin maleate trong thuốc đa thành phần
bằng phương pháp chiết cạp ion- đo quang
31


3.1.1. Đánh giá phương pháp chiết cặp ion- đo quang
trong một số tiêu chuẩn cơ sở
3.1.2. Nồng độ và thể tích dung dịch thử
3.1.3. Khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại của dịch chiết
3.1.4. Khảo sát độ ổn định của dịch chiết
3.1.5. Khảo sát số lần chiết và lượng dung môi chiết
3.1.6. Khảo sát khoảng tuyến tính giữa độ hấp thụ
và nồng độ Chlorpheniramin maleate

3.1.7. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp chiết cặp ion - đo quang
3.1.8. Khảo sát độ đúng của phương pháp chiết cặp ion - đo quang
3.2. Xây dựng phương pháp HPLC định lượng đồng thời
Chlorpheniramin maleate và Phenylpropanolamin hydroclorid,
định lượng Paracetamol trong thuốc đa thành phần
3.2.1. Tóm tắt, đánh giá một số quy trình định lượng
Chlorpheniramin maleate trong thuốc đa thành phần
bằng phương pháp HPLC
3.2.2. Khảo sát chọn điều kiện sắc ký để định lượng đồng thời
Chlorpheniramin maleate và Phenylpropanolamin hydroclorid,
định lượng Paracetamol trong thuốc đa thành phần
3.2.3. Khảo sát khoảng tuyến tính giữa diện tích píc
và nồng độ các chất: Chlorpheniramin maleate,
Phenylpropanolamin hydroclorid, Paracetamol
3.2.4. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp HPLC
định lượng Chlorpheniramin maleate
3.2.5. Khảo sát độ đúng của phương pháp HPLC
định lượng Chlorpheniramin maleate
3.3. So sánh hiệu quả của hai phương pháp
trong việc định lượng Chlorpheniramin maleate
3.3.1. So sánh kết quả hai phương pháp
3.3.2. Đánh giá ưu, nhược điểm của hai phương pháp
3.4. Kết quả khảo sát thử áp dụng phương pháp

31
33
33
34
35
35

37
38

39

39

40

45
49
51
54
54
55
56

Chương 4: BÀN LUẬN VE KẾT QUẢ

57

KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

60
62


BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

HPLC: High performance Liquid chromatography

u v - VIS: Tử ngoại - Khả kiến.
TCCS: Tiêu chuẩn cơ sở.
kl/tt: Khối lượng trên thể tích,
vđ: Vừa đủ.
dd: Dung dịch.


1

ĐẬT VÂN ĐỂ

Với sự phát triển nhanh chóng của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là các thành
tựu khoa học của ngành dược, các dạng bào chế đa thành phần nhằm phối hợp tác
dụng dược lý giữa các hoạt chất ngày càng được sản xuất, lưu hành, sử dụng rộng
rãi và có mặt rộng khắp trên thị trường thuốc. Nhiều biệt dược đã trở nên quen
thuộc với người tiêu dùng. Trong số đó nhóm thuốc hạ nhiệt, giảm đau là phổ
biến nhất. Các biệt dược này thường phối hợp 2 hoặc 3 thành phần trong số các
chất: Paracetamol, Chlorpheniramin maleate, Phenylpropanolamin hydroclorid.
Chlorpheniramin maleate là một dược chất có tác dụng kháng Histamin có mặt
trong hầu hết các chế phẩm đã nói ở trên. Ngoài ra Chlorpheniramin maleate còn
được phối hợp trong các thuốc chống dị ứng, thuốc h o ...
Vì có tác dụng mạnh nên hàm lượng Chlorpheniramin maleate trong các
chế phẩm đều nhỏ ( 2 - 4 mg ), rất chênh lệch so với các hoạt chất khác. Chính vì
vậy phương pháp phân tích gặp nhiều khó khăn, phức tạp. Theo qui định của các
Dược điển hiện hành:Dược điển Anh-98 [5], Dược điển Châu âu -97 [17], Dược
điển Việt nam i n [20] thì Chlorpheniramin maleate không những phải định lượng
mà còn phải thử độ đồng đều hàm lượng. Có nghĩa là đòi hỏi phải có một phương

pháp định lượng có độ nhạy và độ chính xác cao. Trong khi đó hầu hết các Dược
điển chỉ có phương pháp định lượng đối với chế phẩm đơn thành phần, còn với
các chế phẩm đa thành phần thì tiêu chuẩn của các nhà sản xuất đưa ra rất khác
nhau: Phương pháp quang phổ tử ngoại, phương pháp chuẩn độ môi trường khan,
phương pháp so m àu...C ác phương pháp này thường phải chiết tách phức tạp,
tốn nhiều thời gian. Đặc biệt phương pháp chiết cặp ion- đo quang được đa số
tiêu chuẩn cơ sở (TCCS) áp dụng thì kỹ thuật tiến hành lại khác nhau, không đảm
bảo độ chính xác. Hơn nữa nếu trong chế phẩm có chứa 4 hoạt chất trở lên thì các


2

phương pháp này thường tỏ ra không hữu hiệu.Trong trường hợp này phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thường được áp dụng để định lượng các
chế phẩm trên.
Dược điển Mỹ 24 đưa ra các hệ dung môi để định lượng từng dược chất
trong thuốc đa thành phần ( trong đó có Chlorpheniramin maleate ) không qua
quá trình chiết tách [33]. Ở trong nước cũng đã có khá nhiều công trình nghiên
cứu cũng như một số tiêu chuẩn cơ sở đưa ra phương pháp HPLC định lượng
đồng thời Chlorpheniramin maleate và các thành phần khác trong thuốc đa thành
phần. Tuy nhiên các nghiên cứu trên mới chỉ được thực hiện trên từng chế phẩm
thuốc nhất định với những điều kiện phân tích khác nhau, mà chưa đưa ra được
một qui trình chung trong việc phân tích các thuốc đa thành phần đã nói ở trên.
Thực tế phân tích tại Viện kiểm nghiệm cho thấy cả phương pháp sắc ký pha
thuận và phương pháp sắc ký pha đảo đều được sử dụng, nhưng kết quả cho thấy
phương pháp sắc ký .pha thuận có độ lặp lại không ổn định, nhiều trường hợp chỉ
đạt 60 - 80% so với hàm lượng thực [15].
Như vậy trong thực tế kiểm nghiệm, việc định lượng Chlorpheniramin
maleate trong các chế phẩm thuốc đa thành phần vẫn còn là một vấn đề cần
nghiên cứu tiếp để lựa chọn được phương pháp và kỹ thuật tiến hành cho độ đúng

và độ chính xác cao.
Hiện nay do nhu cầu sử dụng và sản xuất các thuốc đa thành phần ở trong
nước cũng như nhập khẩu ngày càng tăng, đòi hỏi phải tăng cường công tác quản
lý, kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc. Để đáp ứng được điều đó cần phải có các
biện pháp quản lý chặt chẽ, đồng bộ và có những phương pháp kiểm nghiệm
thuốc phù hợp cho phép định lượng hàng loạt các chế phẩm cùng loại để tăng
lượng mẫu và có thể phân tích mẫu được nhiều lần. Mặt khác cùng với sự phát
triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật, nhiều máy móc thiết bị với kỹ thuật phân
tích hiện đại ra đời đã và đang được áp dụng vào thực tế kiểm nghiệm. Chính vì


3

vậy trong luận văn này chúng tôi tiến hành nghiên cứu nhằm đạt được những mục
tiêu sau:
- So sánh, đánh giá một số phương pháp định lượng Chlorpheniramin maleate
trong các thuốc đa thành phần.
- Đưa ra hai qui trình kỹ thuật thông dụng nhất để áp dụng định lượng
Chlorpheniramin maleate trong một số chế phẩm thuốc đa thành phần.


4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Công thức, tính chất của Chlorpheniramin maleate
1.1.1. Công thức[4]

ị ^ ^ N ( C H 3)2
^ /C O O H

COOH

- Công thức phân tử: C 16H 19C1N2, C4H 4O 4
- Khối lượng phân tử: 390,3
- Tên khoa học:
3 - ( - 4 Chlorophenyl) - 3 - (2 - Pyrydyl) - Propyl dimethylamine, hydrogen
maleate.

7.7.2. Tính chất [4], [18]
Bột kết tinh màu trắng, không mùi, tan trong 4 phần nước, 10 phần Ethanol
(96%), tan trong 10 phần Cloroform.
1.2. Tác dụng dược lý [14]
Chlorpheniramin maleate có tác dụng kháng Histamin do đối kháng tranh
chấp với Histamin trên thụ thể Hj, làm giảm tiết dịch ở niêm mạc mũi và đường
hô hấp trên.


5

1.3. Các phương pháp định lượng Chlorpheniram in maleate
1.3.1. Phương pháp môi trường khan[17],[26]
Chuẩn độ môi trường khan là phương pháp chuẩn độ acid và base yếu hoặc
muối của chúng trong môi trường không phải là nước, Chlorpheniramin maleate
là muối của base hữu cơ nên có thể áp dụng phương pháp này.
Trong

hỗn

hydrobromid,

hợp

có

Chlorpheniramin

Paracetamol,

maleate

với

Phenylpropanolamin

Dextromethorphan

hydroclorid.

Chiết

Dextromethorphan hydrobromid và Chlorpheniramin maleate với Cloroform,
bốc hơi hết Cloroform, hoà tan cắn trong acid acetic băng. Định lượng bằng dung
dịch acid Pecloric 0,1N với chỉ thị tím tinh thể hoặc đo thế (Dextromethorphan
hydrobromid có nhóm HBr nên không tham gia phản ứng).
1.3.2. Phương pháp quang p h ổ tử ngoại[2], [5], [8], [13]
Phương pháp quang phổ tử ngoại dựa trên sự hấp thụ năng lượng các bức xạ tử
ngoại làm thay đổi mức năng lượng của điện tử, do đó còn được gọi là phổ điện
tử.
-

Khi chiếu một chùm tia sáng đơn sắc có bước sóng X và cường độ I0 qua

dung dịch đồng nhất có nồng độ c , bề dày lớp dung dịch là 1. Khi đi qua dung
dịch, một phần ánh sáng bị hấp thụ, một phần bị phản xạ, phần còn lại (I) đi qua
dung dịch. Sự liên quan giữa các đại lượng được biểu thị theo phương trình:

D = l* Ậ = l g ^

Trong đó:

D là độ hấp thụ ánh sáng
T là độ truyền quang

(1 )


6

-

Định luật Lambert - Beer: Nếu không kể đến các yếu tố hoá lý thì độ hấp

thụ của dung dịch một chất ở bước sóng xác định tỷ lệ thuận với nồng độ dung
dịch và bề dày lớp dung dịch đem đo.
D = k .l.c

(2)

Trong đó: k là hệ số hấp thụ

c là nồng độ dung dịch
1 là bề dày của lớp dung dịch đem đo

Trong trường hợp

c = 1% (kl/tt), 1 = lcm ,

t°: 19 -

21°c thì hộ số hấp thụ k

được gọi là hệ số hấp thụ riêng, ký hiệu là EỊ hay E (1%, lcm ), khi đó ta có:

D = EỊ.l.C

(3)

Nếu nồng độ c biểu thị là mol/lit thì có hệ số hấp thụ phân tử.
Theo Dược điển Anh-98, Dược điển Ấn độ -96, Dược điển Nhật 13:
Chlorpheniramin maleate được chiết ra khỏi chế phẩm bằng ether, sau đó chiết
lớp ether bằng dung dịch acid sulfuric 0,25M. Đem đo độ hấp thụ ở bước sóng
265 nm/7 7], [23], [32].
Theo một số Tiêu chuẩn cơ sở trong nước, Chlorpheniramin maleate được
chiết ra khỏi hỗn hợp thuốc bằng Clorform, kiềm hoá và gạn lấy lớp cloroform.
Sau đó chiết bằng dung dịch acid acid sulfuric 0,5M , đo độ hấp thụ của dung
dịch thu được ở bước sóng 265 nm, từ đó xác định được hàm lượng
Chlorpheniramin.
1.3.3. Phương pháp chiết cặp ion - đo quang
•

Các đại lượng đặc trưng cho sự chiết[1], [2], [3],[13]

+ Hằng số phân bố: Nếu một dung dịch nước có chất A hoà tan được lắc với
một dung môi không hoà tan trong nước, thì khi quá trình phân bố A vào hai pha
cân bằng ta có:
Da = ^ L
a A( N)

(4)


7

Trong đó: DA là hằng số phân bố
aA(S), aA(N) hoạt độ của A trong hai pha.
Hằng số phân bố D đặc trưng cho chất chiết A, dung môi hữu cơ và nhiệt độ.
+Hẽ số phân bố: Trong nhiều trường hợp chất A tổn tại trong nước dưới
nhiều dạng khác nhau, khi lắc với dung môi một số dạng nằm cân bằng giữa hai
pha. Đặc trưng cho chiết xuất trong trường hợp này, người ta dùng hệ số phân bố.
Đó là tỉ số nồng độ của A trong hai pha.
ri -

4- w

(S')

t (5)

+Hiẽu suất chiết R:
Hiệu suất chiết là tỷ số giữa lượng chất A chiết bằng dung môi (£QS) so với

lượng chất A ban đầu ( XlQo)-

R=f o 7

(6)

• Nguyên tắc của của phương pháp chiết tạo cặp ion [1], [13]
Khi cho một ion tác dụng với một ion trái dấu có thể hình thành một cặp ion
giống như phân tử trung hoà điện và có thể chiết bằng một dung môi hữu cơ ít
gây phân ly.
A' + B+ <-> A' B+
Cặp ion này có hằng số phân ly là:
(7 )

Điều kiện để có thể chiết cặp ion:
- ít nhất một trong hai ion tạo cặp phải có khối lượng lớn và kỵ nước.
- pH của pha nước:
Nếu acid HA có hằng số điện ly Ka, để ion hoá 1% tạo ra A' thì:
pH > pKa- 2


8

Base B có hằng số điện ly Kb, để ion hoá 1% tạo ra BH+ thì:
pH < 16- pKb
Kết hợp hai điều kiện đó thì để tạo ra cặp ion [BH+A'] , pH pha nước phải nằm
trong giới hạn:
pKa- 2 < pH < 16- pKb
Quá trình chiết cặp ion tạo ra từ muối amoni bậc 4 R 4N+ và anion A' của acid
HA có thể hình dung như sau:

N

HA(N)

H+ + A'

R 4N+ + OHHF*

í
1ĩ

s

HA(S)

/

4ĩơ
^

\

R4NOH

fA '

1r

R4N+A-

Để chiết một ion, người ta đưa vào dung dịch nước một chất có khối lượng
phân tử lớn để tạo ra đối ion.
•

Các yếu tố ảnh hưởng đến chiết cặp ion [1 ]

+ Các tác nhân muối kết:
Khi thêm một chất gây muối kết ( chất điện ly) vào dung dịch nước sẽ làm
giảm khả năng hoà tan của nước, giảm hằng số điện môi của pha nước, làm cho
sự kết hợp ion dễ dàng. Vậy các chất gây muối kết làm tăng hiệu suất chiết cặp
ion.
+Ảnh hưởng của pH:
pH của dung dịch ảnh hưởng rất lớn đến quá trình tạo cặp ion. Nếu pH của
dung dịch làm cho một trong hai ion chuyển sang dạng phân tử thì không còn tạo
cặp ion nữa, có hai trường hợp:


9

- Nếu cả anion và cation là gốc của acid và base mạnh trong nước tức là các
ion không có tính acid, base thì pH không ảnh hưởng.
- Nếu một trong hai ion hoặc cả hai ion tạo cặp có tính acid hay base trong
nước thì pH có ảnh hưởng.
Ngoài ra còn có một số các yếu tố khác như nhiệt độ, sự tác động của chất hoà
tan khác...
•

Kỹ thuật chiết cặp ion - đo quang

Cho ion cần định lượng tạo cặp ion với một ion đối thu được sản phẩm ( có
màu hoặc không màu có đặc tính quang học). Sau đó chiết bằng dung môi hữu
cơ thích hợp rồi đem so màu hoặc đo quang.
Theo các tiêu chuẩn cơ sở, Chlorpheniramin maleate được tạo cặp ion với
Metyl da cam trong môi trường pH 4,4 - 4,6. Cặp ion này được chiết bằng dung
môi hữu cơ là Cloroform tạo dung dịch có màu vàng. Dung dịch này có độ hấp
thụ cực đại ở bước sóng 420 nm - 424 nm. So sánh độ hấp thụ của dịch chiết
mẫu thử và mẫu chuẩn ( tiến hành song song trong cùng điều kiện), sẽ xác định
được hàm lượng Chlorpheniramin maleate trong chế phẩm.
1.3.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
• Khái quát phương pháp HPLC [2], [7], [20], [32], [27]
Phương pháp HPLC là một phương pháp hoá lý dùng để phân tích, định tính,
định lượng các thành phần trong một hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau với hai
pha luôn tiếp xúc nhưng không hoà tan vào nhau: Pha tĩnh ( được bao bên ngoài
chất mang và được nhồi trong cột sắc ký) và pha động (dung môi rửa giải).
Trong quá trình sắc ký luôn xảy ra quá trình cân bằng động về sự phân bố của
chất tan vào pha tĩnh và pha động khi pha động luôn chảy qua cột với tốc độ nhất
định. Các chất cần phân tách trong dung dịch của hỗn hợp khi đưa vào cột sẽ
được hấp phụ hoặc liên kết với pha tĩnh tuỳ thuộc vào bản chất của cột và kiểu
sắc ký áp dụng. Pha động và mẫu thử được bơm qua cột sắc ký dưới áp suất cao.


10

Các chất cần phân tích sẽ di chuyển theo pha động qua cột với tốc độ khác nhau
tuỳ thuộc vào cấu trúc và tính chất của từng chất. Thời gian chất tan bị pha tĩnh
lưu giữ còn được quyết định bởi bản chất sắc ký của pha tĩnh, bản chất và thành
phần của pha động dùng để rửa giải chất tan ra khỏi pha tĩnh. Nói cách khác tốc
độ di chuyển của các chất qua cột tuỳ thuộc vào ái lực của chúng với hai pha. Kết
quả là các chất được phân tách khỏi nhau. Sự tách này đạt được là do quá trình

phân bố, hấp thụ hoặc trao đổi io n ...
Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được nhận biết bởi bộ phận phát hiện là
detector và được chuyển qua bộ phận xử lý kết quả. Tuỳ theo bản chất của chất
phân tích mà sử dụng detector thích hợp [30]. Kết quả sau khi xử lý sẽ được đưa
ra máy ghi hoặc hiển thị trên màn hình. Đường cong rửa giải sau một quá trình
sắc ký gọi là sắc ký đổ, nó thường có dạng như hình 1 :

Hình 1: Giản đồ sắc ký hai chất 1 và 2.


11

t0(thời gian chết): là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống sắc

ký.

tR(thời gian lưu): là thời gian kể từ khi chất cần phân tích được bơm vàocột cho
đến khi đươc phát hiện ở nồng độ cực đại của nó.
tR’ (thời gian lưu thực) = tR- 10.
ôt (độ lệch chuẩn): độ rộng nửa píc tại các điểm uốn tương ứng.
co05(độ rộng píc ở nửa chiều cao) = 2,354ôt.
cob (độ rộng đáy píc).
Tín hiệu phân tích định tính mỗi thành phần trong hỗn hợp là thời gian lưu của
chất đó trên cột hay vị trí của píc tương ứng trên sắc ký đồ. Tín hiệu phân tích
định lượng là diện tích píc hay chiều cao píc thu được phụ thuộc vào nồng độ
chất đó trong dung dịch đem phân tích.
• Các đại lượng đặc trưng trong HPLC[7], [13], [20], [34], [27]
+Hê số dung lương K ’:
Là đại lượng đặc trưng cho một chất, phụ thuộc vào bản chất của chất phân
tích và đặc tính của pha tĩnh và pha động, không phụ thuộc vào tốc độ dòng cũng

như chiều dài cột.

K =—

c

(8)

m

- Cs: lượng chất trong pha tĩnh.
- Cm: lượng chất trong pha động.
Mặt khác ta có:
K =— =
*0

= I b. _ 1
*0

(9 )

to

- Giá trị K ’ thấp, sự tách sẽ kém.
- Trên thực tế K ’ nằm trong khoảng từ 2 - 5 là tốt nhất.


12

- Giá trị K ’ lớn hơn chỉ dẫn đến sự doãng píc, độ nhạy thấp và thời gian lun

kéo dài.
+Đố chon loc a:
Là một đại lượng về hiệu quả tách của một hệ thống sắc ký. Hai chất chỉ được
tách ra khỏi nhau nếu chúng có giá trị K ’ khác nhau và được đánh giá thông qua
thừa số chọn lọc hay hệ số chọn lọc a.

ki

Ír,

( 10)

t0

+SỔ đĩa lý thuyết N:
Là một đại lượng đặc trưng cho một hệ thống phân tách. Đĩa lý thuyết được
định nghĩa như là một khu vực của hệ thống phân tách mà trong đó một cân bằng
nhiệt động học được thiết lập giữa nồng độ trung bình của một cấu tử trong pha
tĩnh và pha động. Số đĩa lý thuyết trên cột biểu thị hiệu lực của cột sắc ký và
được tính theo công thức:
2

2
N =

= 16

L*.J

kJ

*-R

= 5,54

^0,5

+Đổ phân giải R:
Để đặc trưng cho mức độ tách của hai chất trên một cột sắc ký người ta
thường sử dụng độ phân giải R giữa hai píc cạnh nhau. Độ phân giải giữa hai píc
(píc số một và píc số hai) được tính theo công thức sau:

^

_

^ R

,

~

l R | ) _

^ b . l “* " ^ 0 .2

Trong thực tế khi:

1 >1 7 7 ( t R 2 -

t

R ,

^ 0 ,5 .1 + ^ 0 ,5 .2

)

Q 2)


13

R = 0,75 ; hai pic tách không tốt, còn xen phủ nhau nhiều.
R = 1,0; hai píc tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4%.
R = 1,5 ; hai píc tách gần hoàn toàn, chỉ xen phủ 0,3%.
Độ phân giải phụ thuộc vào các hệ số k2’( hộ số dung lượng của cấu tử ra
sau), độ chọn lọc a và số đĩa lý thuyết N của cột thông qua phương trình:

a-l
R = ^V -n x —
x - ^kj- 74
a
l + k2

/1 o \
(13)

Như vậy, để tăng độ phân giải R ta có thể tăng số đĩa lý thuyết N ( dùng cột
dài hơn hoặc giảm tốc độ dòng pha động ), tăng k 2 ( bằng cách thay đổi thành

phần pha động), tăng a ( bằng cách thay đổi thành phần pha động hoặc thay loại
pha tĩnh).
+Phương trình Van-Deemter:
Phương trình Van-Deemter mô tả mối quan hệ giữa hiệu lực của cột sắc ký
hay chiều cao đĩa lý thuyết của cột tách với tốc độ dòng của pha động và các
thông số động học khác.

H = A.u0,33 + —+ c.u
Ư

Trong đó:

(14)

H là chiều cao đĩa lý thuyết

u là tốc độ dòng pha động
A,B,C là các hệ số động học thay đổi phụ thuộc vào từng cột sắc
ký và do các yếu tố sau quyết định :

-Sự khuy ếch tán xoáy.


L4

-Sự khuyếch tán phân tử.
-Tốc độ trao đổi chất khác nhau của các chất.
• Phân loại các kỹ thuật HPLC và ứng dụng [7], [13], [19], [28]
Theo cơ chế chia tách của sắc ký, nguời ta phân loại như sau:
- Sắc ký hấp phụ: Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh yếu khác nhau

của pha tĩnh đối với các chất tan và sự rửa giải của pha động để kéo chất tan ra
khỏi cột. Trong loại này có hai kiểu hấp phụ:
+ Sắc ký hấp phụ pha thuận: Pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực.
+ Sắc ký hấp phụ pha đảo: Pha tĩnh không phân cực, pha động phân cực.
- Sắc ký phân bố: Bản chất sự tách ở đây là sự phân bố động trong dòng chảy
của chất phân tích giữa hai pha: Pha động và pha tĩnh. Pha tĩnh là chất lỏng được
phủ lên bề mặt chất mang trơ nhồi trong cột tách. Sự tách một hỗn hợp dựa vào
qui luật phân bố.
- Sắc ký trao đổi ion: Sự tách ở đây là nhờ sự trao đổi ion giữa mẫu phân tích
và pha tĩnh. Các tính chất của cân bằng ion quyết định khả năng tách hỗn hợp.
- Sắc ký rây phân tử- sắc ký gel: Sự tách ở đây dựa theo kích thước phân tử
của chất cần phân tích được phân bố khác nhau vào trong các lỗ xốp của pha tĩnh.
Các phân tử có kích thước nhỏ sẽ chui vào sâu trong lỗ xốp nên được rửa giải ra
sau và ngược lại.
Trong nhiều trường hợp, ở 3 loại sắc ký đầu, để tăng hiệu quả tách người ta
còn sử dụng kỹ thuật tạo cặp ion. Mẫu thử được kết hợp với ion trái dấu đã thêm
vào trong pha động tạo ra một cặp ion chiết được bằng pha động hoặc một cặp
ion được pha tĩnh hấp phụ chống lại sự đi quá nhanh trong dung môi phân cực để
tạo sự chia tách hoặc một cặp ion được pha động rửa giải chống lại sự hấp phụ
quá mạnh của pha tĩnh phân cực.


15

•

Một s ố qui trình định lượng Chlorpheniramin maleate trong thuốc đa thành

phần bằng phương pháp HPLC
Ngày nay phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ngày càng được ứng dụng

rộng rãi trong các lĩnh vực nghiên cứu khoa học nói chung và trong lĩnh vực kiểm
nghiệm thuốc nói riêng. Phương pháp HPLC là phương pháp phân tích hiện đại,
tinh tế và hiệu quả, được dùng phổ biến để nghiên cứu các thành phần tong hỗn hợp.
Trong hầu hết các dược điển thông dụng hiện hành, chỉ có các chuyên luận
định lượng thuốc đơn thành phần, mà không có chuyên luận nào áp dụng cho các
thuốc đa thành phần chứa Chlorpheniramin maleate trừ Dược điển Mỹ 24 qui
định Chlorpheniramin maleate có thể được định lượng bằng phương pháp HPLC
[5], [17], [21], [26], [32], Phương pháp này được áp dụng cho thuốc có chứa ít
nhất 3 trong 4 thành phần [33]:

Hỗn hợp:

r

Paracetamol
Chlorpheniramin maleate
Phenylpropanolamin hydroclorid
Dextromethorphan hydrobromid

Điều kiện sắc ký: - Cột sắc ký: 4,6 mm X 15 cm chứa chất nhồi L n
- Pha động : Hỗn hợp Methanol và nước( 60: 40)có chứa 0,34 g
Kali dihydrophosphat; 0,15 g Triethylamin hydroclorid; 0,25 g Natri lauryl
sulfat; 0,1 ml acid Phosphoric trong 100 ml hỗn hợp.
- Tốc độ dòng 1,5 ml/phút
- Detector ƯV ở bước sóng 214 nm.
Việc định lượng Chlorpheniramin maleate cũng như các thành phần khác được
tiến hành riêng rẽ, với cách xử lý mẫu và điều kiện sắc ký khác nhau. Quá trình
này không phải chiết tách từng thành phần hoạt chất trước khi định lượng. Tuy
nhiên trong tất cả các Dược điển nói ở trên cũng chưa đưa ra được một hệ dung

16

môi nhằm định lượng đổng thời Chlorpheniramin maleate và các hoạt chất kể
trên bằng phương pháp HPLC.
Hiện nay ở nước ta có nhiều công trình nghiên cứu định lượng đổng thời
Chlorpheniramin maleate và một số hoạt chất trong các thuốc hỗn hợp bằng
phương pháp HPLC [6 ], [9], [10], [11], [12], [16]:
+Hỗn hợp:
Chlorpheniramin maleate
< Phenylpropanolamin hydroclorid
Dextromethophan hydrobromid
Điều kiện sắc ký: Cột sắc ký: ZORBAX SB- C18 (150x4,5 mm; 5|-im).
Pha động: Acetonitril: đệm phosphat
(Natridihydrophosphat

1,79

g;nước

cất

500

ml;

Triethylamin 2ml; acid phosphoric) pH = 2,5
Theo chương trình dung môi: Từ 0 - 12 phút ( 88:12), từ
1 2 - 1 8 phút (55:45).
Detector u v 262 nm.

Tốc độ dòng 1,2 ml/phút.
tR =10,77 phút, 8 % = 1,453.

+Hỗn hợp:

Paracetamol
Cafein
Chlorpheniramin maleate

Điều kiện sắc ký:

Cột sắc ký: ODS ( 250 X 4,6 mm; 5 |j.m).
Pha động: Methanol : đệm pH = 6,5 (3:7).
Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút.
Detetor u v 215 nm.
tR = 9,55 phút, £% = 1,4.


17

+Hỗn hợp:
' Paracetamol
Chlorpheniramin maleate
_Phenylpropanolamin HC1
Điều kiện sắc ký : Cột sắc ký : Lichrosorb Si 60 (250x4 mm; 5 |im).
Pha động: M ethanol: Đệm Amoni nitrat pH = 9,5 .
Theo chương trình dung môi: Từ 0 - 7 phút (100:0),
từ 7 - 16 phút (80:20)
Tốc độ dòng : 1,2 ml/phút.
Detector u v 257 nm.

tR = 21,7 phút, 8 % = 1,27.
+Hỗn hợp:

f Paracetamol
ị Chlorpheniramin maleate
Phenylpropanolamin hydroclorid

Điều kiện sắc ký : Cột sắc ký : ODS ( 150 mm;5(j.m).
Pha động : 640 ml Methanol, 360 ml nước, 10 ml acid
acetic khan, 1,5 mg Natri heptan sulfonat.
Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.
Detector UV: 257 nm.
+Hỗn hợp:
roclorid
Điều kiện sắc ký : Cột sắc ký Lichrosorb Si 60 (250x4 mm; 5 |0,m).
Pha động: M ethanol: Đệm Amoni nitrat pH 9,5 (9:1).
Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.
Detector UY 265 nm.
tR = 12,38 phút, 8 % = 1,5.


18

+ Hỗn hợp:

Paracetamol
Chlorpheniramin maleate
Phenylpropanolamin hydroclorid

Điều kiện sắc ký:

Cột sắc ký : L- 300.
Pha động: Đệm Phosphat (KH 2P 0 4 2,72 mg; nước cất
1000 ml; Triethylamin 2 ml; H 3PO 4) pH = 2,7 :
Acetonitril (60:40).
Tốc độ dòng: 1,5 ml/ phút.
Detector UV: 270 nm.
tR = 9,29 phút, 8 % = 1,26.

Ngoài ra còn khá nhiều tiêu chuẩn do các nhà sản xuất đưa ra nhằm áp
dụng định lượng Chlorpheniramin maleate cũng như các thành phần khác trong
thuốc đa thành phần. Các qui trình đã nêu được trình bày tốm tắt trong bảng 1.
N hận xét: Hầu hết các qui trình đều sử dụng phương pháp sắc ký hấp phụ pha
đảo. Pha tĩnh sử dụng là các hạt silica(Si02) có kích thước nhỏ ( 3 - 1 0 |im), đã
được trung tính hoặc alkyl hoá. Pha động là các dung môi phân cực như:
Methanol, Acetonitril, Triethylamin, Đệm phosphat pH 2,5; 2,7; Đệm Amoni
nitrat pH 6,5; 9,5. Tốc độ dòng 1,0- 1,5 ml/phút. Tín hiệu được nhận biết bởi
Detector u v ở các bước sóng 214, 215, 262, 265, 270 nm ( là các bước sóng tại
đó Chlorpheniramin maleate có độ hấp thụ cực đại hoặc khá lớn). Thời gian lưu
là 9,20; 12,38; 9,55; 10,77 phút. Sai số tương đối là 1,14; 1,26; 1,4; 1,453; 1,49.


19

Bảng 1: Tóm tắt một số qui trình định lượng Chlorpheniramin maleate
Qui trình
STT

Pha động

Cột sắc ký

Acetonitril :

S B -C 18

Đệm NaH2P 0 4

(4,5x150;

pH=2,5 (88:12)

5|xm)

Me : Đệm

Lichrosorb Si

amoni nitrat pH

60(4x250;

=9,5 (9:1)

5|j.m)

Me: Đệm

ODS

Phosphat pH

(4,6x250;

=6,5

5|am)

Me : Đệm

Lichrosorb Si

amoni nitrat pH

60(4x250;

=9,5 (1:1)

5|i.m)

Me: Đệm

ODS

Phosphat pH

(4,6x250;

=6,5 (2:8)

5|0.m)

Acetonitril:

Lichrosorb Si

Đệm phosphat

60(4x250;

pH =2,7 (8:2)

5(im)

Me : Đệm

ODS

amoni nitrat pH

(4,6x250;

=9,5 (9:1)

5|j.m)

Acetonitril:

L-300

(Tên thuốc)
Optux
1

Coderin
2

Corypadol
3

Andolfort
4

Parafort
5

Travie
6

Hadocol
7

Dotux
8

Đệm phosphat
pH =2,7 (6:4)

Tốc độ
dòng

(ml/phút)

Detector

1,2

262

uv
(nm)

Thời gian
lưu
(phút),
sai sô

Tài
liệu
tham
khảo

tR= 10,77

16

S%=1,453

1,0

260

Ír —7,8

10

8%=1,49

1,5

215

tR= 9,55

9

8%= 1,4

1,0

257

tR= 21,7

7

£%=0,21

1,5

224

tR= 1,34

12

S%=1,14

1,5

1,5

265

265

tR= 12,38

11

270

tR= 9,29

15

b%=1,26


20

Các phương pháp trên đều có ưu điểm tiến hành nhanh, chính xác, xử lý mẫu
không phức tạp. Tuy nhiên hầu hết các phương pháp mới chỉ được nghiên cứu áp
dụng cho một số biệt dược nhất định mà chưa đưa ra được một qui trình xử lý
mẫu chung và chương trình sắc ký chung nhằm phân tích một dạng thuốc nhất
định.
Như vậy, để định lượng Chlorpheniramin maleate cũng như các thành phần
khác trong các thuốc đa thành phần kể trên có rất nhiều phương pháp khác nhau.
Tuy nhiên hiện nay vẫn chưa có sự khảo sát, so sánh, đánh giá các ưu điểm,
nhược điểm, độ chính xác và khả năng áp dụng của các phương pháp đó trong
điều kiện thí nghiệm ở nước ta. Chính vì vậy trong luận văn tốt nghiệp này,
chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát, đánh giá, so sánh các phương pháp định lượng kể
trên nhằm tìm ra hướng chung nhất, hiệu quả nhất để định lượng
Chlorpheniramin maleate trong các thuốc đa thành phần.


21

CHƯƠNG 2: Đ ố i TƯỢNG, THIẾT BỊ,

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1. Đôi tượng nghiên cứu
2.1.1. Các mẫu sử dụng trong khảo sát phương pháp
•

Mẫu Mj là viên nén Pamin

- Công thức:
Paracetamol
Chlorpheniramin maleate

500 mg
2 mg

Số kiểm soát: 061201
Nơi sản xuất: Xí nghiệp Dược phẩm Hậu giang
•

Mãu M 2 là viên nang Flue-Cold cap

- Công thức:
Phenylpropanolamin hydroclorid
Chlorpheniramin maleate

25 mg
4 mg

Số kiểm soát: 020202.
Nơi sản xuất: Xí nghiệp Dược phẩm trung ương 26.
•

Mẫu M 3 là viên nén Decolgen forte:

- Công thức:
Paracetamol
Phenylpropanolamin hydroclorid
Chlorpheniramin maleate
Số kiểm soát: 108541.
Nơi sản xuất: United Pharma.

500 mg
25 mg
2 mg