Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn geniposid từ quả dành dành (fructus gardenia) phục vụ công tác kiểm tra chất lượng thuốc

Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

Ộ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HỘI




ỄN VIỆT H

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN GENIPOSID
TỪ QUẢ DÀNH DÀNH (Fructus Gardenia)
PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG THUỐC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

ỘI  


Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

Ộ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HỘI




ỄN VIỆT H

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN GENIPOSID
TỪ QUẢ DÀNH DÀNH (Fructus Gardenia)
PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG
THUỐC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
 ểm nghiệm thuốc – độc chất
ố



Người hướng dẫn khoa học: ễn Văn Tựu
ễn Tuấn Anh

ỘI – 


–
–

–

–

–

–


ỤC LỤC



ỜI CẢM ƠN
ỤC LỤC
ỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ỤC CÁC BẢNG
ỤC CÁC HẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ



CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
















ề chất đối chiếu (chất chuẩn)

ổng quan về dược liệu D
1.2.1. Đặc điểm thực vật vố
ộ phận d
ụng
ổng quan về nhóm hoạt chất 

1.4.1. Đặc điểm vất
ụng dược lý của Geniposid
ổng quan về chiết xuất, phân lập vế Geniposid
ề chiết xuất dược liệu
ề chiết xuất, phân lập ế Geniposid
ổng quan của một số phương pháp hoá lử dụng trong nghi
ứu đề t
ắc ký lớp mỏng (SKLM)
ắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
1.6.3. Đo nhiệt độ nóng chảy
1.6.4. Phương pháp đo phổ hồng nại (IR)
1.6.5. Phương pháp phân tích khối phổ (MS)
ổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
1.6.7. Phương pháp sắc ký cột























CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN, NỘI DUNG



VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU


ệu





Phương tiện nghiứu



ết bị, dụng cụ



ất, dung môi





ội dung nghiứu





Phương pháp nghiên cứu



CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM VẾT QUẢ





ạo lập chất chuẩn Geniposid từ vị dược liệu D



ết xuất, phân lập v ế Geniposid từ vị dược liệu


ết xuất Iridoid glycosid từ dược liệu D



ập Geniposid từ hỗn hợp các Iridoid glycosid



ế



3.1.2. Định tính Geniposid ế được



3.1.2.1. Định tính Geniposid tinh chế được bằng SKLM



3.1.2.2. Xác định nhiệt độ nóng chảy của Geniposid tinh chế
được
3.1.2.3. Đo phổ hồng ngoại của Geniposid tinh chế được



3.1.3. Xác định cấu trúc của chất chiết được



ết quả của phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC



ết quả của phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân

ựng vẩm định quy trỹ thuật để định tính, định
lượng Geniposid tinh chế được và xác định giới hạn tạp cất li
ủa Geniposid tinh chế được bằng HPLC với detector UV
ựa chọn phương pháp



ẩm định phương pháp HPLC đ ựa chọn để định lượng

ợp của hệ thống sắc ký



3.2.2.2. Tính đặc hiệu của phương pháp


















3.2.2.3. Đường chuẩn vảng tuyến tính



3.2.2.4. Độ lặp lại



3.2.2.5. Độ đúng



ới hạn phát hiện (LOD) với hạn định lượng (LOQ)



3.2.3. Định tính Geniposid tinh chế được bằng phương pháp
HPLC đựn
3.2.4. Định lượng Geniposid tinh chế được bằng phương pháp
HPLC đựng
3.2.5. Xác định giới hạn các tạp chất liủa Geniposid

ế được



ử dụng Geniposid tinh chế được lất chuẩn ph
ệm để định tính, định lượng Geniposid trong vị dược liệu

3.3.1. Định tính



3.3.1.1. Định tính Geniposid trong vị dược liệu Dằng
phương pháp SKLM theo DĐVN III
3.3.1.2. Định tính Geniposid trong vị dược liệu Dằng
phương pháp HPLC với detector UV
3.3.2. Định lượng Geniposid trong vị dược liệu Dằng
phương pháp HPLC với detector UV











CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN










ề qui trết xuất, phân lập vế đựng v
ấu trúc của Geniposid tinh chế được
ề định tính, định lượng Geniposid tinh chế được, xác định giới
ạn tạp chất liủa Geniposid tinh chế được bằng HPLC
ề việc sử dụng Geniposid tinh chế được lất chuẩn ph
ệm để định tính, định lượng Geniposid trong vị dược liệu


ẾT LUẬN VẾN NGHỊ






ẾT LUẬN



ẾN NGHỊ



ỆU THAM KHẢO



Ụ LỤC


ỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT









DĐVN III

ĐT
















PĐ







ẩn
ẩn + Thử
:Điện di mao quả ết hợp khối phổ

:Dược điển Việt Nam III
 sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký khi định lượng
ế được


ờ
lưu (phút)

ệ


ệ ố

ố đĩa

ất đố

ế













































































ận xét:
ết quả khảo sát tính ợp của hệ thống sắc ký cho thấy độ lệch chuẩn

tương đối (RSD) của thời gian lưu  ện tích pic trong các phép thử lần lượt l
 đều nhỏ hơn 1%, các giá trị của hệ số bất đối khá gần 1 (dao động
ừ 1,104 đến 1,1,17) thể hiện pic khá cân đối, số đĩa lý thuyết trung b  

ấy khả năng tách tốt của cột sắc ký. Như vậy hệ thống HPLC mử
ụng lợp để định tính, định lượng Geniposid tinh chế được.




3.2.2.2. Tính đặc hiệu của phương pháp
Để xác định tính đặc hiệu của phương pháp, chúng tôi tiến hắc ký mẫu
ắng (MeOH  ẫu), mẫu chuẩn Geniposid có nồng độ khoảng 100
ẫu thử với điều ện sắc ký đả trong mục 3.2.1.
ết quả thể hiện ở h






 ắc ký đồ xác định độ đặệủa phương pháp
ẫẩ ẫử ẫắ




ết quả phân tích cho thấy: Trắc ký đồ mẫu thử cho 1 pic có thời gian

lưu (t t) tương tự thời gian lưu của pic Geniposid ở sắc ký đồ của mẫu
ẩn (t     ắc ký đồ của mẫu trắng tại thời gian lưu của pic
ất hiện.

Như vậy phương pháp đ  ựng có độ đặc hiệu đáp ứng y  ầu dùng để

định tính và định lượng Geniposid.

3. Đường chuẩn vảng tuyến tính

Chúng tôi đến hảo sát ựng khoảng ến tính ữa ện tích
ắc ký v ồng độ chất phân tích, cụ thể như sau:
  ịch chuẩn gốc:  ẩn     methanol để được
ịch chuẩn gốc có nồng độ ảng 
 ịch chuẩn lệc: ừ dung dịch chuẩn gốc, chuẩn bị d ẩn pha
ới các nồng độ: 25   
 ến h ắc ký theo điều kiện như ở mục  ần lượt với  ịch
ẩn trong khoảng nồng độ trại các giá trị diện tích pic tương ứng.
ết quả khảo sát khoảng tuyến tính được tr ở bảng 3.1 

ảng 3.1 ết quả khảo sát khoảng tuyến tính của Geniposid
ịch

ồng độ ( 

ện tích pic 





































Phương trồi qui

  

ệ số tương quan






Đường chuẩn Geniposid

Diện tích (mAu.s)

5000000

y = 20031x - 44386

4000000

R2 = 0.9993

3000000
2000000
1000000
0
0

50

100

150

200

250

Nồng độ (mcg/ml)

 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ  ện tích
 ủa pic Geniposid
ận xét
ết quả khảo sát khoảng tuyến tính cho thấy trong khoảng nồng độ từ 25 đến
 ự liến tính chặt chẽ giữa nồng độ  ện tích

pic (phương trồi quy: y = 20031x  ệ số tương quan r = 0,9996).

3.2.2.4. Độ lặp lại
Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá qua định lượng 6 mẫu thử riệt
theo điều kiện sắc ký đựa chọn. Kết quả được tr ở bảng 3.1




ảng 3.1 ết quả khảo sát độ lặp lại
ẫu

ối lượng cân


ẩn



ử 1



ử 2



ử 3



ử 4



ử 5



ử 6



ện tích pic












Hàm lượng


















































ận xét
ết quả thử độ lặp lại của phương pháp cho thấy trong các điều kiện sắc ký đ 
ọn, độ lệch chuẩn tương đối thu được l  ỏ hơn 1%). Như vậy phương
 có độ lặp lại lốt.

3.2.2.5. Độ đúng
Độ đúng của phương pháp được ến hành theo phương pháp thêm chuẩn.




ến h


ịch chuẩn định lượng: ẩn bị dung dịch chuẩn Geniposid có nồng

độ khoảng 0,1 mg/ml trong methanol.


ịch thử:
  ịch chuẩn gốc th   ịch chuẩn Geniposid trong
ồng độ 0,1067 mg/ml.
  ịch thử gốc: Dung dịch G   ế được trong methanol
ồng độ 0,1707 mg/ml.
ẩn bị 5 dung dịch thử trong b định mức 25ml (đánh số từ 15) như


 ị ử ố

































 ị ẩ
ố
ến ắc ký theo điều kiện ở mục 3.2.1. các dung dịch chuẩn v ử, ại
ện tích pic đáp ứngỗi dung dịch được tiặp lại 2 lần để lấy giá trị trung

ết quả khảo sát độ đúng của phương pháp được thể hiện ở bảng 3.14




ảng 3.1 ết quả khảo sát độ đúng của phương pháp
ứ tự b











Đ











 






















































ả năng thu
ồi (%)












ện





ồi trung b  
 
ận xét:
ết quả cho thấy phương pháp có độ đúng tốt trong khoảng khảo sát với khả

năng tại   % và độ lệch chuẩn tương đối l 
ới hạn phát hiện (LOD) với hạn định lượng (LOQ)
ến hắc ký một dịch Geniposid chuẩn có nồng độ lần lượt l
 ới điều
ện sắc ký trại các giá trị ều cao v ện tích pic Geniposid (Bảng 



ảng   ết quả ị chiều cao vện tích pic của dẩn xác định



ệ

ề

























(không đáng kể













ận xét:

Pic Geniposid thu được trắc ký đồ dung dịch chuẩn Geniposid nồng độ
 ều cao h = 0,102 gấp  ần chiều cao nhiễu nền h = 0,015 
ịch chuẩn Geniposid nồng độ 0,033 mcg/ml th
 ị lẫn v ễu nền không xác định được  ậy ở nồng độ 
 được coi lới hạn phát ện của Geniposid (LOD = 0,067 mcg/ml)

 
 





 SKĐ xác đị
ẫắịẩồng độ 

* Xác định giới hạn định lượng: LOQ = 3,3 x LOD = 
. Định tính Geniposid tinh chế được ằng phương pháp HPLC đựng
ẩn bị các dung dịch chẩn vử như mục 3.2.1, phần bần lượt 10 µl
ỗi dung dịch chuẩn vử vệ thống sắc ký.




 ến h ắc ký theo điều kiện sắc ký đ  ả ở mục 3.2.1, phần a. Ghi thời

gian lưu ổ UV ủa pic Geniposid tr ắc ký đồ của dung dịch chuẩn v 
ịch thử.
 ết quả:
 ắc ký đồ của dung dịch thử cho pic có thời gian lưu (t = 9,47 phút) tương tự thời

gian lưu của pic Geniposid tắc ký đồ của dung dịch chuẩn (t  
ết quả nể hiện ở h 
 ến hồng phổ tại thời gian lưu pic Geniposid của mẫu thử vẫu chuẩn,
ết quả cho thấy phổ UV – ủa mẫu chuẩn v ẫu thử chồng khít l 
ịẩn vử đều cho cực đại hấp thụ ở bước sóng 239 nm. Kết quả
ồng phố cho thấy phổ thu được của mẫu thử vẫu chuẩn hoống nhau
ệ số similarity lần 1) thể hiện trong h  

 Xác định mức độ tinh khiết của pic sắc ký ằng phần mềm LCsolution, kết quả
 ấy pic của Geniposid trong sắc ký đồ của dung dịch thử l   ết (






 SKĐ địế đượ
 ịẩ 
 ịử  




  ồổ ủẫẩẫử

ịẩệ ố 

ịử ệ ố 

  ếả xác định độ ếủịẩ
ử

ận xét:


ết quả  ứng tỏ sản phẩm tinh chế được đúng l



ới kết quả xác định độ tinh khiết của pic Geniposid tr ắc ký đồ của dung
ịch thử (hệ số “peak purity” bằng 1,0000) đồng thời không phát hiện thấy




ạp nẫn vào pic Geniposid (“impurity: not detected”) khẳng định điều
ện sắc ký chúng tôi lựa chọn có khả năng tách tốt Geniposid

. Định lượng Geniposid tinh chế được ằng phương pháp HPLC đ 
ựng
 ến hành định lượng theo điều kiện sắc ký đọn ở mục 3.ần a
 ẩn bị các dung dịch chuẩn vử như mục 3.ần ẩn bị 2 mẫu
ẩn vẫu thử.
 ến hần dung dịch chuẩn 1, ghi lại diện tích pic để xác định các
ố của hệ thống sắc ký v ấy diện tích pic trung b ủa các lần tiêm để tính
ết quả định lượng cho 3 mẫu thử 1, 2 v 
 ến hần dung dịch chuẩn 2, lấy diện tích pic trung b ủa các
ần tiêm để tính kết quả định lượng cho 3 mẫu tử 4, 5 v
 ẫu thử tiần vấy diện tích pic trung bủa các lần ti
 Tính hàm lượng Geniposid theo công thức 1 (CT 1)


ết

quả

định

lượng

được

thể

hiện

ở

bảng







ận xét

Hàm lượng Geniposid tinh chế được đạt 98,88%, đạt y ầu cho một chất
ẩn đối chiếu của dược liệu. ết quả định lượng có độ lặp lại tốt (RSD=0,22%)

. Xác định giới hạn các tạp chất liủa Geniposid tinh chế được
 ảo phương pháp đinh lượng Geniposid trong dược liệu D  ằng
 ới detector UV theo DĐ Nhật 14, chúng tôi đ ảo sát lựa chọn được

chương trắc ký như sau:
ột: RP18 (250 x 4,6mm, 5 
ổ hấp ụ tử ngoại ở bước sóng 239

Pha động: Acetonitril – nước (12 : 88) (v/v).
ốc độ d
ể tích ti 
ời gian phân tích: 50 phút
 ẩn bị các dung dịch để ti ắc ký 
 ịch mẫu thử:   ột lượng chế phẩm trong methanol để được dung
ịch có nồng độ khoảng 1,0 mg/ml. (Chuẩn bị 2 dung dịch thử)
ịch mẫu chuẩn (a): ẩn trong methanol để được dung
ịch có nồng độ khoảng 10 
ịch mẫu chuẩn (b): ịch mẫu thử cho v

định mức 100 ml, thừa đủ, lắc đều.
ến h
 ẫu để lẫu trắng.
 ịch chuẩn (a), xác định thời gian lưu của pic geniposid.
 ịch chuẩn (b), xác định diện tích của pic tương ứng với geniposid
 ỗi dung dịch thử 2 lần, tiần dung dịch chuẩn a, cho máy chạy trong
ảng thời gian ít nhất gấp 2 lần thời gian lưu của pic geniposid, ghi sắc ký đồ.
ết quả xác định hàm lượng tạp chất của Geniposid thể hiện trong h 












 SKĐ xác địạấủế đượ
ịẩ ịẩ 
ịử 
ẫắ
 ần trăm diện tích của tất cả các pic phụ so với tổng diện tích của tất cả các
ất hiện trắc ký đồ của dung dịch thử. ại bỏ bất kỳ pic n 
ừ đó tính tổng phần trăm diện tích củạp, kết quả thể hiện ở bảng 3.16




ảng 3.16. ết quả xác định hàm lượng tạp chất
 ạ
ấ




ẫ
ầ

ẫ
ầ

ầ

ầ

ệ

ệ

ệ

ệ

ạ

ạ

ạ

ạ

ạ

ạ

ạ













ạ



lượ
ạ




















































































































































ổ
ạ



















ận xét:
  ết quả tr  ấy: Diện tích của bất kỳ pic n    

ắc ký đồ của mẫu thử đều nhỏ hơn hơn 0, ần diện tích của pic geniposid
ắc ký đồ của dung dịch chuẩn (b) (0,5 ổng diện tích của tất cả các pic
ụ cũng nhỏ hơn ần diện tích của pic geniposid trong sắc ký đồ của ịch
ẩn (b) (1
 Hàm lượng tạp xác định được lết quả nợp với các kết
ả xác định độ tinh khiết của Geniposid tinh chế được bằng các phương pháp

SKLM, đo nhiệt độ nóng chảy, phổ IR, chồng phổ UVVIS và phương pháp phân
ối phổ vộng hưởng từ hạt nhân.

ừ các kết quả tr  ôi đ đưa ra dự thảo ti ẩn của chất chuẩn
 ụ lục 

 ử dụng Geniposid tinh chế được l ất chuẩn ph  ệm để

định tính, định lượng Geniposid trong vị dược liệu D
3.3.1. Định tính:
3.3.1.1. Định tính Geniposid trong ị dược liệu D  ằng phương pháp
SKLM theo DĐVN III
ẩn bị các dung dịch đối chiếu vịch thử:
ịch đối chiếu: ịch geniposid 0,4% trong ethanol
ịch thử: ột dược liệu với 10 ml ethanol 75% khoảng 2 giờ tr
ủy ấm, lọc. Dịch lọc được dịch thử.

Điều kiện sắc ký:
 ản mỏng Silica gel 60 F (Merck) được hoạt hóa ở 100
 ển: Ethyl acetat      nước

 ốc thử hiện m
 Đèn tử ngoại bước sóng 254 nm



 ịch acid sulfuric 10% trong ethanol 96%
ến h
ấm riệt lản mỏng 5 ỗi dung dịch thử vịch đối chiếu.
ển khai xong, lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ ph ản mỏng
ưới đử ngoại ở bước sóng 254 nm rồi phun thuốc thử hiện mấy bản mỏng

ở 120 
ết quả:
ắc ký đồ của dung dịch thử có 1 vết có cắc vị R  
ới vết Geniposid trắc ký đồ của dung dịch đối chiếu  ảng 3.1


ốử
   ắc ký đồ định tính Geniposid trong vị dược liệu Dằng





ảng   ết quả định tính Geniposid trong vị dược liệu Dằng SKLM


ốử

ắ

ứ ự
ế

ị







ị
ử












ị
ẩ




ứ ự
ế

ị






























ắ
ị
ẩ

Tím đậ



ị
ử



ồ






đậ

1.2. Định tính Geniposid trong vị dược liệu D  ằng phương pháp
ới detector UV
ến hành như phần định lượng Geniposid trong vị dược liệu D ở

ục 
ết ả:
ắc ký đồ của dung dịch thử có 1 pic có thời gian lưu (t 

tương tự thời gian lưu của pic Geniposid trắc ký đồ của dung dịch chuẩn (t  

ồng phổ UV –  ủa pic Geniposid thu được từ dung dịch chuẩn v
ịch ử, kết quả hệ số similarity l
ết quả thể hiện ở h










 ếả địị dượệằng phương

 ịẩ 
 ịử
 ồổ  – ủ ẩ  ử

2. Định lượng Geniposid trong vị dược liệu Dằng phương pháp
ới detector UV
ến hành theo phương pháp của Dược điển Nhật 14:
ịch chuẩn: Cân ảng 10,0 mg Geniposid tinh chế được (h

lượng % và đ được lằng P ờ) cho