Nghiên cứu phương pháp định lượng 1 deoxynojirimycin trong lá dâu, cao lá dâu và viên nang morussan bằng sắc ký lỏng khối phổ ( LC MS)

B ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

B ộ YTẾ

TRƯỜNG ĐẠI
DƯỢC
HÀ NỘI
• HỌC
•
•
•

ĐÀO THỊ THANH NHÀN

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
1-DEOXYNo JIRIMYCIN TRONG LÁ DÂU,
CAO LÁ DÂU VÀ VIÊN NANG MORUSSAN
BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHổ (LC/MS)

LUẬN
VĂN THẠC
SỸ DƯỢC
HỌC
•
•
•
•

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ Đ ộ c CHẨT
MÃ SỐ: 607315

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Thái Duy Thìn
Ths. Trần Thị Bích Vân

HÀ NỘI, 2010
m


Lời cẵm ơ n

D ể hoồn thành luận văn tố t nghiệp thạc êỹ này, trước tiên tôi xỉn bồỵ tỏ lòn 2, b iết
ơn tới:

PGÔ. TÃ. Thái Duy Thìn
Thâ. Trần Thị Bích Vân
những người đỗ hướng dẫn tôi tận tỉnh trong suốt thời gian qua.
Tôi xin cỗm ơn sâu sắc

Tô. Trần Viột Hùng, người đã tận tâm giúp đ ỡ tôi trong

quổ trình tôi thực hiện đ ề tồi.
Tôi cũng xin gửi lời cẫm ơn tới

DÔ. Dương Minh Tân cùng cốc cán b ộ phòng Vật

lý đ o lường - Viện kiểm nghiệm Thuốc Trung ương đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ
tôi trong thời gian tôi làm thực nghiệm tại Phòng.
Tôi xin gửi tới toàn thổ giảng viên, cán b ộ Trường Đại học Dược Hồ Nội lời cam ơn
chân thành vì sự dìu d ắ t tôi trong su ố t thời gian tôi học tập tại đây.
Vồ cuối cùng, cho p h é p tôi hàỵ tỏ lòng b iết ơn tới b ố mẹ, gia đinh và bạn b è những người luôn dành cho tôi tỉnh thương yêu, sự quan tâm, động viên giúp đ ỡ chân tỉnh
đ ổ tôi hoàn thành được tố t nhất luận văn này.

Hà nội, ngồỵ thống năm 2010

Đào Thị Thanh Nhàn


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIế T TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT Vấ N Đ Ề ........................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỒNG Q U A N ................................................................................... 3
1.1. 1- DEOXYNOJIRIMYCIN..............................................................................3
1.1.1. Đặc điểm hóa l ý ........................................................................................ 3
1.1.2. Tác dụng dược lý ...................................................................................... 3
1.1.3. Các phương pháp định tính, định lượng l-deoxynojirimycin............. 5
1.2. LÁ D Â U .............................................................................................................7
1.1.1. Thu hái chế biến lá dâu.............................................................................. 8
1.1.2. Thành phân hóa học của lá d â u ................................................................8
1.2.3. Công dụng của lá d â u ................................................................................9

1.3. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ ....................................... 13
1.3.1. Vài nét sơ lược về sắc ký lỏng khối p h ố ...............................................13
1.3.2. Thiết bị sắc ký lỏng khối p h ổ ................................................................. 14
1.3.2.1. Pha đ ộ n g ............................................................................................14
1.3.2.2. Hệ thống b ơ m ....................................................................................15

1.3.2.3. Hệ tiêm mẫu....................................................................................... 15
1.3.2.4. Cột tách và pha tĩnh.......................................................................... 15
1.3.2.5. Detector khối p h ổ ............................................................................. 15
1.3.3. Một số kỹ thuật LC/M S...........................................................................21
1.3.3.1. Kỹ thuật phân tích toàn thang (Full scan)..................................... 21
1.3.3.2. Kỹ thuật phân tích chọn lọc ion (Selected Ion Monitoring)...... 21
1.3.3.3. Kỳ thuật MS/MS............................................................................... 21
1.3.3.4. Kỹ thuật SRM (Selected Reaction M onitoring)........................... 21

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u ........... 22
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN c ứ u ............................. 22
2.1.1. Hóa chất.................................................................................................... 22
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ ...................................................................................... 22

2.2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u ....... 23
2.2.1. Đối tượng nghiên cứ u..............................................................................23
2.2.2. Nội dung và phương pháp nghiên c ứ u ..................................................24
2.2.2.1. Xử lý m ẫ u ..........................................................................................24
2.22.2. Xây dựng chương trình sắc ký L C /M S ......................................... 26
2.2.2.3. Thâm định phương pháp phân tích đã xây dựng.......................... 27
2.2.2.4. Định tính và định lượng................................................................... 29
2.2.2.5. Tính toán kết quả và xử lý số liệ u ..................................................29
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ TH ựC N G H IỆM .....................................................31
3.1. KHẢO SÁT Đi ề u k i ệ n s ắ C KÝ LỎNG KHỐI PHổ ............................31
3.1.1. Xác định điều kiện khối phổ....................................................................31
3.1.2. Thiết lập chương trình LC /M S............................................................... 33


3.1.2.1. Điều kiện sắc k ý ...............................................................................33

3.1.2.2. Điều kiện khối p h ổ .......................................................................... 33
3.2. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐÃ XÂY D ự N G ....................................36
3.2.1. Độ tuyến tín h ............................................................................................36
3.2.2. Độ lặp lạ i.................................................................................................. 37
3.2.3. Độ đ ú n g .................................................................................................... 37
3.2.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng........................................... 38
3.3. KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG 1-DNJ TRONG

LÁ DÂu ,DỊCH CHIẾT

CAO LÁ DÂU, CAO LÁ DÂU VÀ VIÊN NANG MORUSSAN..................39
CHƯƠNG 4. BÀN L U Ậ N ...................................................................................47
4.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN c ứ u ....................................................................... 47
4.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u .................................................................48
4.2.1. Xử lý m ẫu .................................................................................................48
4.2.2. Phương pháp nghiên cứu........................................................................ 48

4.3. KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u .......................................................................... 49
Kế T LUẬN VÀ KIẾN N G H Ị..............................................................................50
TÀI LIỆU THAM KHẢO


ACN

:

Acetonitril

AF

:

Acid formic

APCI

:

Atmospheric pressure chemical ionization
(Ion hóa bang hóa học ở áp suất thường)

API

:

Atmospheric pressure ionization
(lon hóa ở áp suất thường)

APPI

:

Atmospheric pressure photo Ionization
(Ion hóa quang học ở áp suất thường)

DCLD

:

Dịch chiết lá dâu

DNJ

:

Deoxynoijirimyicn

ĐTĐ

:

Đái tháo đường

ED50

:

Effective dose
(Liều tác dụng tối đa lên 50% đối tượng thử)

ELSD

:

Evaporative Light Scattering Detector
(Bộ phận phát hiện tán xạ ánh sáng bay hơi)

ESI

:

Electron spray isonization
(Nguồn ion hóa phun điện tử)

FT-ICR

:

Fourier transform ion cyclotron resonance
(Phân tích cộng hưởng ion)

GC/MS

:

Gas Chromatography - Mass spectrometry
(Sac ký khí ghép khoi phổ)

HDL

:

High density Lipoprotein
(Lipoprotein tỉ trọng cao)


HILIC

:

Hydrophylic interactive Chromatography
(Sac kv tương tác thân nước)

HPAEC

:

High performance anion exchange Chromatography
(Sac ký trao đổi anion hiệu năng cao)

HPLC

:

High Performance Liquid Chromatography
(Sac ký lỏng hiệu năng cao)

IC50

:

Inhibit concentration
(Nồng độ ức che tối thiêu 50% đối tượng thử)

LC/MS

:

Liquid chromatography - Mass spectrometry
(Sac ký lỏng ghép khối phố)

LDL

:

Low density Lipoprotein
(Lipoprotein tỉ trọng thấp)

LOD

:

Limit o f detection
(Giới hạn phát hiện)

LOQ

:

Limit of quantitive
(Giới hạn định lượng)

MALDI

:

Matrix Assisted Laser Desorption Ionization
(Ion hóa theo cơ chế giải hấp phụ sử dụng nguồn laser)

NMR

:

Nuclear magnetic resonance
(Phô cộng hưởng từ hạt nhân)

PAD

:

Pulsed amperometric detection
(Detector đo xung ampe)

QIT

:

Quadrupole ion Trap
(Phân tích bẫy ion)

SKLM

:

Sắc ký lóp mỏng

SRM

:

Selected Reaction Monitoring
(Chọn lọc ion con sau phản ứng)


STZ

: Streptozotocin

TC

: Total cholesterol
(Cholesterol toàn phần)

TIC

:

Total ion chormatogram
(Sac đồ toàn ion)

TG

: Triglycerid

TOF

: Time of flight
(Phân tích thời gian bay)

TEN BANG

STT

BẢNG

1

Bảng 2.1

Cách pha dãy dung dịch chuân

2

Bảng 3.2

Các thông sô của khôi phô dùng đê xác định 1-DNJ

3

Bảng 3.3

Kêt quả khảo sát khoảng tuyên tính của 1-DNJ

4

Bảng 3.4

Kêt quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp

5

Bảng 3.5

Kêt quả khảo sát độ đúng của phương pháp

6

Bảng 3.6

Kết quả định lượng 1-DNJ trong các mẫu thử


STT

HINH

1

Hình 1.1

Cây dâu tằm Morns aỉba

2

Hình 1.2

Sơ đồ các thiết bị sắc ký lỏng khối phố

3

Hình 1.3

Các bộ phận của detector khối phổ

4

Hình 1.4

Mô hình nguyên lý kỹ thuật APCI

5

Hình 1.5

Mô hình nguyên lý kỹ thuật ESI

6

Hình 1.6

Mô hình nguyên lý kỹ thuật APPI

7

Hình 1.7

Mô hình nguyên lý kỹ thuật MALDI

8

Hình 1.8

Bộ phân tích tứ cực đơn (quadrupole)

9

Hình 1.9

Bộ phân tích bây ion QIT (quadrupole ion trap)

10

Hình 1.10

Bộ phân tích thời gian bay TOF (top of flight)

11

Hình 1.11

Bộ phân tích cộng hưởng ion (FT-ICR)

12

Hình 2.12

Bộ phân tích từ

13

Hình 2.13

Bộ phân tích ba tứ cực (triple quadrupole)

TEN HINH

Máy săc ký lỏng khôi phô
14

Hình 2.14
Thermo Finnigan LCQ advantage Max

15

Hình 2.15

Sản phâm viên nang Morussan của công ty Vimedimex


Mau lá dâu tằm thu hái ở thôn Nghĩa Trai, xã Tân
16

Hình 3.16
Quang, huyện Văn Lâm, tỉnh Hưng Yên sau khi sấy khô

17

Hình 3.17

Phô MS của dung dịch chuân 1-DNJ 10 |ig/ml

18

Hình 3.18

Phổ MS 2 của dung dịch chuẩn 1-DNJ 10 |ig/m
Sắc ký đồ mẫu C5 (2,5|ig/ml) phân tích LC/MS

19

Hình 3.19
ch ếđ ộ + E S l SIM 164
Đô thị biêu diên sự phụ thuộc tuyên tính giữa diện tích

2 0

Hình 3.20
pic và nồng độ 1-DNJ

21

Hình 3.21

Săc ký đô xác định LOD của dung dịch chuân 1-DNJ

2 2

Hình 3.22

Săc ký đô LC/MS của dung dịch chuân 1-DNJ 1 1-ig/ml

23

Hình 3.23

Săc ký đô LC/MS của dung dịch bột lá dâu

24

Hình 3.24

Săc ký đô LC/MS của dung dịch thử viên nang
Morussan
25

Hình 3.25

Săc ký đô LC/MS của mâu thử cao lá dâu

26

Hình 3.26

Săc ký đô LC/MS dịch chiêt côn 50% của cao lá dâu


ĐẶT VẤN ĐÈ
Lá dâu - hay còn gọi là tang diệp là một vị thuốc cô truyên được sử
dụng rất nhiều trong dân 2 Ĩan để chữa sốt, cho ra mồ hôi, cảm mạo, trừ đờm,

cao huyết áp, làm cho sáng mắt ... Gần đây, người ta phát hiện ra rằng, trong
lá dâu có chứa một hoạt chất có tên 1-deoxynojirimycin (1 - ĐNJ). Hoạt chât
này là một alkaloid có tác dụng ức chế enzym a-glucosidase (enzym xúc tác
thủy phân tinh bột thành đường và thúc đấy hấp thu đường qua màng tế bào)
và ức chế enzym disaccharỉdase, làm giảm lượng đường trong máu. Hiện nay,
ở một số nước như Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản đã nghiên cứu, sản xuât
và lưu hành một số loại thực phẩm chức năng có chứa lá dâu cho bệnh nhân
đái tháo đường (ĐTĐ).
Ớ Việt Nam, sản phấm chứa cao lá dâu điều trị ĐTĐ đã xuất hiện trên
thị trường, tuy nhiên chưa có phương pháp nào thích hợp cho việc định tính
và định lượng 1-DNJ. Hàm lượng 1-DNJ trong các mẫu thử nhỏ nên không
thể định lượng được bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng
detector u v . Bên cạnh đó, phân tử 1-DNJ không có liên kết nối đôi (liên kết
7Ì), do đó không hấp thụ tử ngoại khả kiến ở vùng 200 - 400 nm.
Đe góp phần xây dựng tiêu chuẩn cho các sản phấm chứa lá dâu hiện
đang lưu hành trên thị trường Việt Nam, chúng tôi đặt vấn đề Nghiên cứu
phương pháp định lượng l-deoxynojirimycin trong lá dâu, cao lá dâu và
viên nang Morussan bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS) với các mục tiêu
sau:
1. Xây dựng phương pháp định tính, định lượng 1 - D N J băng LC/MS.
2. Tiến hành định tính, định lượng 1 - D N J trong ỉả dâu, cao ỉá dâu và viên
nang Morussan chứa cao lá dâu băng phương pháp đã xây dụng.


Với những mục tiêu như vậy, chúng tôi mong muốn xây dựng một
phương pháp định tính, định lượng 1-DNJ nhanh chóng, chính xác và phù hợp
nhất với điều kiện của các cơ sở kiêm nghiệm tại Việt Nam, đồng thời góp
phân xây dựng tiêu chuấn cho sản phâm viên nang Morussan.

CHU ONG 1. TỎNG QUAN
1.1.1- DEOXYNOJIRIMYCIN
1.1.1. Đặc điểm hóa lý |3?l’|3S|’|39'
o Tên khoa học: 2- hydroxym ethyl, 3,4,5-Piperidinetriol
o Công thức hóa học

J— NH

)

' HCI

oh~oh
o Công thức phân tử: C6 H 13 NO 4 .HCI
o Phân tử lượng: 163,17.
o Nhiệt độ nóng chảy: 195-196°c.
1.1.2. Tác dụng dược lý
o

Hạ đường huyết, kìm hãm chứng tăng đường huyết sau ăn
1-DNJ được biết đến là một chất ức chế enzym glucosidase và enzym

dỉsaccharidase -

2

enzym chuyến hóa carbohydrat, làm giảm lượng đường

trong máu, có thê sử dụng trong dự phòng và điều trị bệnh ĐTĐ. Các nhà
khoa học cũng đã tiến hành nhiều nghiên cứu về tác dụng này của 1-DNJ.

Miyahara và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tác dụng kìm hãm
chứng tăng đường huyết sau ăn của dịch chiết lá dâu (DCLD) có chứa 1-DNJ.
Trong nghiên cứu này, chuột Wistar bình thường được cho ăn các loại
carbohydrat như sucrose, maltose, tinh bột, sau đó uống DCLD chứa 1-DNJ.
Khoảng liều thử nghiệm của DCLD là 0,02-0,5g/kg. Ket quả cho thấy với tác
dụng kìm hãm chứng tăng đường huyết sau ăn, liều tác dụng tối đa trên 50%
thử

(ED50) của DCLD chứa 1-DNJ là 0,1 lg/kg/ngày đối với chuột ăn


sucrose, 0,44g/kg/ngày đối với chuột ăn maltose và 0,38g/kg/ngày đôi với
chuột ăn tinh bột. Nghiên cứu này cũng thử nghiệm tác dụng ức chế enzym
disaccharỉdase ruột non của DCLD chứa 1-DNJ. Kêt quả thu được nông độ
ức chế 50% đối tượng thử (IC50) của DCLD đối với chuột ăn sucrose là 3,2
P-g/ml, isomaltose là 10 |Lig/ml, và maltose là 51 |LLg/ml. IC50 của 1-DNJ thành phần chính của DCLD - là 0,15 ịig/ml đối với chuột ăn sucrose and
0,21 |Lig/ml đổi với chuột ăn maltase. Tác dụng ức chế của DCLD lên enzym
amylase yếu.
Một nghiên cún khác của Kimura và các cộng sự cũng cho thấy bột lá
dâu đã làm giau 1-DNJ có tác dụng kìm hãm chứng tăng đường huyết sau ăn
ở người. Những người tình nguyện khỏe mạnh được chia thành 4 nhóm. Sau
khi sử uống 50g sucrose, nhóm đầu tiên không uống bột lá dâu làm giầu 1DNJ, ba nhóm còn lại uống lần lượt 0,4g; 0,8g và l,2g bột làm giầu 1-DNJ
(tương ứng với 6 mg, 12mg và 18mg 1-DNJ). Nồng độ glucose huyết tương
được xác định trước và sau khi tiến hành thử nghiệm. Ket quả cho thấy liều
dùng 0,8g và l,2g bột lá dâu làm giau 1-DNJ kìm hãm mạnh sự tăng đường
huyết sau ăn ở người bình thường.
o

Kháng virus: 1-DNJ có khả năng kháng đáng kế virus, với IC50 của
hoạt chất này là 1,2 - 2,5 ỊUg/ml, khả năng ức chế virus tăng lên khi tăng

nồng độ 1-DNJ. Dần xuất của 1-DNJ có thể kháng vivus HIV.

o

Ưc chê sự di căn các khối u.

o

Ngoài ra 1-DNJ còn có chức năng chống lại các gốc tự do, điều hòa hệ
thống miễn dịch...


1.1.3. Các phương pháp định tính, định luọng l-deoxynojirimycin |18|’|2S|’
129], |31|, 1321, [33], [35], [36]

Phân tử 1-DNJ không có liên kết đôi (liên kết ù), do đó không hấp thụ
tử ngoại khả kiến ở vùng 200 - 400 nm. Bên cạnh đó hàm lượng 1-DNJ trong
lá dâu thấp, bởi vậy không thể dùng phương pháp HPLC detector ƯV để định
tính, định lượng 1-DNJ. Nhiều nghiên cứu về phương pháp định tính, định
lượng hoạt chất này đã được tiến hành, sử dụng HPLC ghép nối nhiều loại
detector khác nhau như detector tán xạ bay hơi (ELSD), detector huỳnh quang,
detector đo xung ampe, HPLC ghép nối khối phổ.
Định tính 1-DNJ trong lá dâu bằng phưong pháp HPLC - ELSD
Toshiyuki Kimura và các cộng sự (Nhật Bản) đã tiến hành nghiên cứu
phương pháp định tính 1-DNJ trong lá dâu, trong huyết tương bằng phương
pháp HPLC detector ELSD ghép nối khối phổ (MS). Trong phương pháp này,
1-DNJ được tách ra từ dịch chiết lá dâu bằng cột TSKgel Amide-80. Sau khi
ra khỏi cột, 1-DNJ được phát hiện bang detector ELSD đồng thời được nhận
dạng bởi khối phố. Phương pháp này thiếu độ nhạy khi định tính 1-DNJ trong
lá dâu.

Định lượng 1-DNJ trong lá dâu bằng phương pháp HPLC detector
huỳnh quang
Trong phương pháp này, lá dâu sau khi chiết bằng dung môi HC1
0,05mol/l, được cho phản ứng tạo dẫn xuất với 9-fluorenylmnethyl
chlorformate (FMOC-C1). 1-DNJ được tách ra khỏi dịch chiết bằng cột sắc ký
HiQSiL C18, dung môi pha động acid acetic 0,1 % và acetonitril, tôc độ dòng
chảy là l,0ml/ phút. Detector huỳnh quang được đặt chế độ ẤEX = 254nm và
XEM= 322nm. Ket quả cho thấy có sự tách biệt rõ rệt giữa 1-DNJ và các tạp
chất trong lá dâu. Đường chuẩn tuyến tính trong khoảng nồng độ 0,567 |ig/ml
tới 34

|Lig/ml

với r - 0,9998. Độ thu hồi trung bình đạt 97,2%.


Định tính, định lượng 1-DNJ trong lá dâu bằng phưong pháp sắc
ký hiệu năng cao trao đối anion, detector đo xung điện (HPAEC-PAD)
Tadashi Yoshihashi và các cộng sự (Nhật bản) đã tiến hành xây dựng
phương pháp định lượng 1-DNJ trong các sản phấm chứa lá dâu bằng
HPAEC-PAD, đồng thời kiểm tra độ ổn định của 1-DNJ trong điều kiện nhiệt
độ. Ket quả cho thấy 1-DNJ được phân tách hoàn toàn với thời gian lưu là
7,26 phút. 1-DNJ ổn định ở nhiệt độ cao.
HPAEC-PAD là một phương pháp có tính chọn lọc cao với 1-DNJ.
Phương pháp này ưu điểm hơn hẳn các kỹ thuật HPLC khác xét về mặt chuẩn
bị mẫu, độ phân giải các píc và độ nhạy. Phương pháp này cho phép định
lượng 1-DNJ trong thực phấm nhanh chóng, đơn giản và chọn lọc, có thê ứng
dụng để định lượng hoạt chất này trong các sản phâm thực phâm chứa lá dâu.
Tính ổn định của 1-DNJ ở điều kiện nhiệt độ cao có thê là một gợi ý để sản
xuất sản phâm chứa lá dâu tiệt trùng

Định tính, định lưọìig 1-DNJ trong huyết tưoìig chuột bằng
phương pháp HILIC/MS
Trong phương pháp này, 1-DNJ sau khi tách khỏi huyết tương chuột
bằng cột TSKgel Amide-80 được nhận dạng và xác định bởi MS. Sau 30 phút
dùng 1-DNJ từ lá dâu (1 10mg/kg), nồng độ 1-DNJ huyết tương đạt tới đỉnh
(15|j.g/ml) và giảm nhanh sau đó. Ket quả cho thấy, nồng độ 1-DNJ trong
huyết tương phụ thuộc vào liều dùng khi cho chuột dùng 1-DNJ lá dâu ở các
nồng độ khác nhau (1,1; 11; 1 lOmg /kg /ngày). Các nhà khoa học không phát
hiện thấy có sự chuyển hóa 1-DNJ trong huyết tương, 1-DNJ lá dâu khi đưa
vào cơ thể được hấp thu nguyên vẹn và sau đó thải trừ nhanh chóng ra khỏi cơ
thể. Phương pháp HILIC/MS cũng có thể áp dụng để xác định nồng độl- DNJ
lá dâu ở nước tiêu và ở các mô.


Các nghiên cún trên cho thấy, các nước trên thế giới hiện đã xây dựng
được nhiều phương pháp hiện đại đế định lượng 1-DNJ, định lượng hoạt chất
này trong huyết tương, mô, nước tiếu và trong các sản phấm có chứa lá dâu.
Các phương pháp này đều dựa trên kỹ thuật cơ bản sắc ký lỏng hiệu năng cao,
ghép nối với thiết bị và các loại detector khác nhau. Tuy nhiên, ở Việt Nam,
chưa có một nghiên cứu nào được tiên hành đế xây dựng phương pháp định
lượng hoạt chất này. Sản phâm viên nang Morussan chứa cao lá dâu do Công
ty cố phần Y dược phấm Vimedimex sản xuất cũng chưa đưa ra được tiêu
chuấn về hàm lượng 1-DNJ, phương pháp định tính định lượng 1-DNJ. Bởi
vậy, chúng tôi tiến hành đề tài này với mong muốn bước đầu xây dựng một
phương pháp định lượng 1-DNJ trong lá dâu và các sản phấm chứa lá dâu một
cách đơn giản, chính xác, nhanh chóng và phù hợp nhất với điều kiện của các
cơ sở kiểm nghiệm trong nước, đồng thời đưa ra Bản dự thảo tiêu chuẩn cơ sở
cho sản phấm viên nang Morussan.
1.2. LÁ DÂU

Hình 1.1. Cây dâu tằm Morns alba
Cây dâu trắng hay còn gọi là dâu tằm, tên khoa học là Morus alba,
thuộc họ Dâu tằm Moraceae, được trồng ở nhiều vùng miền ở Việt Nam đế


hái lá nuôi tằm. Bên cạnh đó, nhiều bộ phận của cây dâu tằm được sử dụng
làm thuốc chữa bệnh như lá dâu, vỏ rễ cây dâu, quả dâu, cây mọc ký sinh trên
cây dâu, tổ bọ ngựa trên cây dâu, sâu dâu . [ 8 ] ’ 1401
Lá dâu - hay còn gọi là tang diệp là một vị thuốc cổ truyền được sử
dụng rât nhiêu trong các bài thuốc dân gian. Ngày nay, các nhà khoa học đã
chứng minh trong lá dâu có nhiều thành phần hóa học có tác dụng hạ đường
huyết, chổng oxy hóa, hạn chế rối loạn lipid máu ở bệnh nhân ĐTĐ, tăng
cường chức năng miễn dịch. Bởi vậy, có rất nhiều sản phấm có chứa lá dâu
điều trị ĐTĐ đã được nghiên cứu và sản xuất trên thế giới.
1.1.1. Thu hái chế biến lá dâu111’181
Lấy những lá bánh tẻ, không bị sâu, phơi nắng thật nhanh rồi phơi trong
râm cho khô mà vẫn giữ được màu xanh lục.
Lá dâu không mùi, vị nhạt, hơi đắng chát. Loại lá dâu lá to, nguyên,
không rách, không vụn nát, màu lục xám, dày khô, không bị sâu, không lẫn
tạp chất là tốt.
1.1.2. Thành phần hóa học của lá dâu[1] [7] [8] [2,] [22] [23] [34]
Trong lá dâu có chất cao su, caroten, tanin, rất ít tinh dầu, vitamin c,
colỉn (cholỉn), trigonenlin (trỉgonellin•), pentozan, đường, cancỉ malat và
canxi cacbonat. Gần đây, các nhà khoa học đã tìm ra trong lá dâu có chứa một
loại alkaloid có tên là

1

-deoxynojirimycin có tác dụng ức chế emyrn a-

glucosidase (emym xúc tác thủy phân tinh bột thành đường và thúc đẩy hấp
thu đường qua màng tê bào) và ức chế enzym disacharidase, làm giảm lượng
đường trong máu. Ngoài ra trong lá dâu còn có chất giả đường fagom in, các
chất chống oxy hóa a-tocopheroì, polyphenol, isoqiiercetrin.


Theo Y học co truyền, lá dâu vị đắng ngọt, tính lạnh, vào 2 kinh Can,
Phế, có tác dụng tán phong, thanh nhiệt (trừ cảm mạo, sốt nóng), dùng đê
chữa chữa sốt, cho ra mồ hôi, cảm mạo, trừ đờm, cao huyết áp, làm cho sáng
m ắt.[1]
Ngày nay, Y học hiện đại đã chứng minh trong lá dâu chứa nhiều thành
phần hoạt chất có tác dụng hạ đường huyết, chống rối loạn lipid máu, ngăn
ngừa xơ vữa động mạch, tăng cường chức năng miễn dịch, chống oxy hóa ...
Hạ đường h uyết[9]-[11]’[,7]-[20]' [23]'[24]-[28]-[39]
Do thành phần chứa 1-DNJ, lá dâu có tác dụng hạ đường huyết và kìm
hãm chứng tăng đường huyêt sau ăn. Tác dụng này có thê ứng dụng đê sản
xuất các sản phẩm chứa lá dâu dự phòng và điều trị ĐTĐ.
Ngăn ngừa rối loạn ỉỉpid máu, xơ vữa động mạch ở bệnh nhân
Đ T Đ U2ị[^]. [22],[26]
CÓ rất nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước đã tiến hành các nghiên
cứu về tác dụng ngăn ngừa rối loạn lipid máu, xơ vữa động mạch ở bệnh nhân
ĐTĐ.
Tác giả Nguyễn Quang Trung (Việt Nam) đã tiến hành nghiên cứu tác
dụng này của lá dâu trên chuột gây rối loạn lipid và ĐTĐ thực nghiệm. Ket
quả cho thấy, trong cùng điều kiện nuôi dưỡng, chuột ĐTĐ tình trạng rối loạn
lipid máu trầm trọng hon rất nhiêu so với chuột không bị ĐTĐ. Bột chiêt lá
dâu liều 300mg/kg/ngày và 600mg/kg/ngày sau 30 và 60 ngày điều trị đều có
tác dụng hạn chế rối loạn lipid máu ở chuột ĐTĐ, thế hiện qua các chỉ số TG,
TC, LDL-C tăng ít hơn, tỉ lệ HDL/LDL-C cũng giảm ít hơn so với nhóm
chuột ĐTĐ không được điều trị bằng bột chiết lá dâu.

Andallu B và cộng sự (Ấn độ) cũng đã tiến hành một nghiên cứu tác
dụng hạ đường huyết và chống rối loạn lipid máu của lá dâu ở những bệnh


nhân ĐTĐ typ 2. Trong nghiên cứu này, tác dụng hạ đường huyêt được đánh
giá bằng cách so sánh với tác dụng của thuốc điều trị tiếu đường cơ bảngỉỉbenclamid. Các thành phần lipid máu được xác định trước và sau khi điều
trị. Ket quả cho thấy bệnh nhân sử dụng lá dâu có cải thiện rõ rệt về khả năng
kiêm soát đường máu so với gỉibencỉamid. Ket quả phân tích mẫu máu và
nước tiêu trước và sau điều trị cho thấy lá dâu làm giảm rõ rệt nồng độ
cholesterol toàn phần trong máu ( 1 2 %, p < 0 ,0 1 ), triglyceride (16%, p < 0 ,0 1 ),
acid béo tự do (12%, p < 0,01), LDL (23%, p < 0,01), VLDL (17%, p < 0,01),
peroxid huyêt tương (25%, p < 0,01), peroxid nước tiểu (55%, p < 0,01), đồng
thời làm tăng HDL (18%, p < 0,01). Những bệnh nhân sử dụng glibenclamid
cũng cho thấy những tiến triên đáng kể trong việc kiểm soát đường máu,
nhưng những thay đôi về thành phần lipid máu không có ý nghĩa thống kê.
Chống oxy hóa[7]-[16]-[2,]™

6]

Govv-Chin Yen và cộng sự (Trung quốc) đã tiến hành nghiên cứu
“Chiết xuất và xác định các thành phần chống oxy hóa từ ỉá dâu (Morus
alba) ” Trong nghiên cứu này, lá dâu được chiết bằng dung môi methanol. Kết
quả cho thấy DCLD trong methanol ức chế 78,2% quá trình oxy hóa acid
linoleỉc, cao hơn hăn so với a-tocopheroỉ (72.1%). Tiến hành chạy sắc ký lớp
mỏng DCLD thu được 9 thành phần, hai trong số 9 thành phần đó (có thòi
gian lưu lần lưọt là Rti = 0,92 và Rt 2 = 0,68) có tác dụng chống oxy hóa tốt.
Hai thành phần này cho thấy khả năng ức chế peroxy hóa acid ỉinoleic lần
lưọt là 77,3 và 72,0 %. Tiến hành chạy SKLM làm tinh khiết thành phần 1
(Rt] = 0,92), thu được dẫn xuât (la)có tác dụng oxy hóa mạnh hơn chất ban
đầu với thời gian lưu Rt=0,87. Trong khi đó thành phần 2 không tạo nên dẫn

xuất nào. Các dừ liệu phô UV-Vis, NMR (phổ cộng hưởng từ hạt nhân) và
MS cho thấy thành phần chống oxy hóa của la và
carotene và a-tocopherol.

2

được xác định là /?-


Ỏ Việt Nam, hai tác giả Lê Ngọc Liễn và Phạm Thiện Ngọc (Bộ môn
Hóa sinh, trương đại học Y Hà nội) đã tiến hành nghiên cứu “Chiết xuất, xác
định hàm lượng polyphenol và đánh giá tác dụng chông oxy hóa của các mâu
bột chiết lá dâu”. Trong nghiên cứu nàv, polyphenol được chiết xuât băng
nhiều loại dung môi khác nhau, và xác định hàm lượng bằng hai phương pháp
Ferrous sulphat và phương pháp dùng thuôc thử Follin. Tác dụng chông oxy
hóa của bột chiết lá dâu được xác định thông qua tác dụng việc bảo vệ acid
linoleic khỏi sự peroxv hóa. Trong thí nghiệm, acid linoleỉc được ủ với
methanol 75% làm nhóm chứng, các nhóm thử bao gồm acid linoleic ủ với
dịch chiết lá dâu, so sánh mức độ peroxv hóa acid lìnoleic giữa nhóm chứng
và các nhóm thử. Ket quả cho thấy lá dâu được chiết bang methanol 75% thu
được hàm lượng polyphenol lớn nhất (2,62%). Nhóm thử ủ với dịch chiết lá
dâu có lượng acid linoleic bị peroxy hóa giảm so với nhóm chứng. Lá dâu
chiết bang methanol 75% có khả năng chống oxy hóa cao nhất, tiếp đến là
mẫu chiết bang methanol

1 0 0

%, mẫu chiết bằng dung môi n-hexan, mẫu chiết

bằng dung môi aceton và thấp nhất là mẫu chiết bằng dung môi ethylacetate

100%.

Khôi phục chứng năng mạch máu ỏ’ đối tượng ĐTĐ [30]
Naowaboot J và các cộng sự (Thái Lan) đã tiến hành thực nghiệm
chứng minh chuột ĐTĐ mạn tính điều trị lâu dài bằng DCLD sẽ làm tăng khả
năng đáp ứng mạch. Trong nghiên cứu này, chuột bình thường được gây ĐTĐ
thực nghiệm bang streptozotocin, sau đó cho sử dụng DCLD trong

8

tuần.

Kiêm tra nông độ glucose máu, huyêt áp, đáp ứng mạch với các chât vận
mạch của chuột gây ĐTĐ. Ket quả của nghiên cứu này cho thấy, chuột ĐTĐ
dùng DCLD liều 0,5 và lg/kg/ngày làm giảm nồng độ glucose máu rõ rệt, tình
trạng cao huyết áp cũng giảm mạnh. Đáp ứng mạch của chuột ĐTĐ dùng
DCLD đối với các chất giãn mạch giảm đáng kế, với acetyỉcholin (3-


30nmol/kg) giảm tương ứng từ 26% tới 44%, với Na nỉtropruside (110nmol/kg) giảm tương ứng từ 45% tới 77% so với chuột bình thường. Đáp
ứng mạch của chuột ĐTĐ dùng DCLD đối với chất co mạch phenylephrine
(0,01-0,l|j,mol/kg) tăng mạnh từ 23% đến 38% so với chuột bình thường.
Tăng cưòng chức năng miễn dịch [15]
Bharani SE và các cộng sự (Ấn độ) đã nghiên cún tác dụng của DCLD
trong methanol lên hệ thống miễn dịch trên chuột. Trong nghiên cứu này,
chuột được uống DCLD liều thấp (lOOmg/kg/ngày) và liều cao (lg/kg/ngày).
Ket quả cho thấy cả hai liều DCLD này đều làm tăng globulin huyết thanh và
ngăn ngừa tử vong ở chuột gây nhiêm vi khuân cúm bò Pasteurella multocida.
Hàm lượng kháng thể trong máu cũng tăng lên trong thử nghiệm ngưng kết
hồng cầu gián tiếp. Mặt khác, chỉ số thực bào tăng mạnh trong thử nghiệm độ

thanh thải carbon. DCLD còn tăng cường bảo vệ cơ thê rõ rệt trong thử
nghiệm gây giảm bạch cầu trung tính bởi cyclophosphamỉd. Ngoài ra, DCLD
cũng làm tăng độ bám dính bạch cầu trong thử nghiệm về độ bám dính bạch
cầu. Như vậy, DCLD làm tăng cả miễn dịch thế dịch và miễn dịch gian bào.
Ngoài ra, do có thành phần 1-DNJ, lá dâu còn có tác dụng kháng virus,
ức chế sự di căn khối u.
Những nghiên cún mới được tiến hành trong và ngoài nước cho thấy,
ngoài những công dụng mà dân gian tìm thấy trước đây, lá dâu còn chứa
những thành phần dược lý quan trọng có thể dùng để điều trị ĐTĐ typ 2,
chứng tăng đường huyết sau ăn, hạn chế rối loạn lipid máu ở bệnh nhân ĐTĐ
typ 2, chống oxy hóa, khôi phục chức năng mạch máu ở đối tượng ĐTĐ, tăng
cường chức năng miễn dịch ... Những nghiên cứu này là nền tảng cơ sở đê sản
xuất những sản phẩm đông dược có chứa lá dâu hỗ trợ trong điều trị ĐTĐ và
những biến chứng của căn bệnh này. Ớ Việt Nam, sản phâm chứa lá dâu -


Morussan cũng đã được công ty c ổ phẩn y dược phẩm Vimedimex sản xuất
nhằm hỗ trợ điều trị ĐTĐ.
1.3. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ [2]’[3]' t4M5M6Ui0],[i4],[i9].[27]
1.3.1. Vài nét sơ lược về sắc ký lỏng khối phổ
Sắc kí lỏng khối phổ LC/MS là kỹ thuật phân tích chất dựa trên sự kết
hợp sắc ký lỏng hiệu năng cao và phân tích khối pho. Sau quá trình thử
nghiệm dài, đến đầu những năm 1970, người ta mới kết nối thành công hệ
thống LC với MS. Nguyên nhân của sự chậm trễ này chủ yếu là do khó khăn
về kỹ thuật khi đưa dòng chất lỏng vào hệ thống có độ chân không cao của
máy khối phổ. Do đó, dù kỹ thuật sắc ký lỏng ra đời trước sắc ký khí nhưng
kỹ thuật sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) được thực hiện trước kỹ thuật sắc
ký lỏng ghép khối pho.
Phương pháp LC/MS thường được sử dụng trong phân tích dược phấm
để phân tích:

o Các hợp chất tương đối phân cực đến phân cực nhiều, khó bay hơi.
o Phân tích thuốc trong dịch sinh học.
o Phân tích các hợp chất tự nhiên trong cây thuốc.
o Trường hợp không sử dụng được các detector khác (không phát hiện
được bằng detector khác hoặc trong phân tích khẳng định).
P h ân tích kh ố i ph o có tín h chọn lọc, độ nhạy, độ đặc h iệu cao. G iớ i hạn

phát hiện có thể đến 10' 14 gam. Do vây, phân tích khối phổ ngày càng được
ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học công nghệ. Đặc biệt, dùng đê
phân tích hàm lượng siêu vết trong mẫu có thành phần phức tạp.


Van chọn lọc cột
Hệ tiêm mâu
Phân tích khối phố

Bộ phận thu nhận
cẩc mẳnh

Bộ phận
tách dòng
Bơm HPLC

0
0
0
0

0
0

0
0

0
0
0
0

0
0
0
0

0
0
0
0

0
0
0
0

Hình 1.2. Sơ đồ các thiết bị sắc ký lỏng khối phổ
1.3.2.1. Pha động
Pha động thường là hồn hợp hai dung môi hoà tan vào nhau đê có thế
tách chất với độ phân giải phù hợp. Trước khi sử dụng cần phải lọc (màng lọc
0,45 |am), đuổi khí hoà tan trong pha động. Vì khí hoà tan có thể làm biến
dạng píc, giảm hiệu lực cột, nhiễu đường nền. Có thế loại khí hoà tan bằng
cách: chạy siêu âm, sục khí trơ như h eli...

Có hai cách dùng pha động đế rửa giải:
o Đẳng dòng (rửa giải thường): Thành phần pha động không thay đôi
trong suốt quá trình săc ký.
o Gradient: Pha động là hỗn hợp của nhiều dung môi, thường sử dụng từ
2 đến 4 loại dung môi khác nhau. Tỷ lệ các thành phần thay đôi trong
quá trình sắc ký theo chương trình đã định.