SÀNG lọc họ VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT KHÁNG CARBAPENEM, ENTEROCOCCUS KHÁNG VANCOMYCIN và VI KHUẨN SINH ESBL từ các BỆNH PHẨM lâm SÀNG tại KHOA hồi sức TÍCH cực, BỆNH VIỆN BỆNH NHIỆT đới TRUNG ƯƠNG năm 2017

B GIO DC V O TO

B Y T

TRNG I HC Y H NI

NGUYN TH QUNH

SàNG LọC Họ VI KHUẩN ĐƯờNG RUộT KHáNG
CARBAPENEM, ENTEROCOCCUS KHáNG
VANCOMYCIN Và VI KHUẩN SINH ESBL
Từ CáC BệNH PHẩM LÂM SàNG TạI KHOA HồI SứC
TíCH CựC,
BệNH VIệN BệNH NHIệT ĐớI TRUNG ƯƠNG NĂM 2017

CNG LUN VN THC S Y HC


H NI 2017
B GIO DC V O TO

B Y T

TRNG I HC Y H NI

NGUYN TH QUNH

SàNG LọC Họ VI KHUẩN ĐƯờNG RUộT KHáNG
CARBAPENEM, ENTEROCOCCUS KHáNG
VANCOMYCIN Và VI KHUẩN SINH ESBL
Từ CáC BệNH PHẩM LÂM SàNG TạI KHOA HồI SứC

TíCH CựC,
BệNH VIệN BệNH NHIệT ĐớI TRUNG ƯƠNG NĂM 2017
Chuyờn ngnh: Vi sinh y hc
Mó s: 60720115
CNG LUN VN THC S Y HC
Ngi hng dn khoa hc:
PGS.TS. Nguyn V Trung


HÀ NỘI – 2017


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
CLSI

Clinical and Laboratory Standards Institute

CRE

Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae

CTX

Co-trimoxazole

ESBL

Extented spectrum betalactamase

KPC

Klebsiella Pneumoniae carbapenemase

NDM1

New Delhi Metallo-beta-lactamase-1

NKBV

Nhiễm khuẩn bệnh viện

OXA

Oxacillin

VRE

Vancomycin-resistant Enteroccus


MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ..........................................................................................................1
Chương 1.................................................................................................................. 3
TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................................3
1.1. Họ vi khuẩn đường ruột kháng carbapenem (CRE)...................................................................3
1.1.1. Họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae)...................................................................3
1.1.2. Kháng sinh nhóm carbapenem [14][15].............................................................................3
1.1.3. Cơ chế đề kháng carbapenem của họ vi khuẩn đường ruột..............................................3
1.2. Enterococcus kháng vancomycin (VRE)......................................................................................5

1.2.1. Enterococcus........................................................................................................................5
1.2.2. Vancomycin..........................................................................................................................5
1.2.3. Cơ chế đề kháng vancomycin của Enterococcus................................................................5
1.3. ESBL và vi khuẩn sinh ESBL.........................................................................................................6
1.3.1. ESBL và vi khuẩn sinh ESBL..................................................................................................6
1.3.2. Cơ chế sinh ESBL..................................................................................................................6
1.4. Các kỹ thuật phát hiện CRE, VRE và vi khuẩn sinh ESBL [30][31]..............................................7
1.4.1. Kỹ thuật phát hiện họ vi khuẩn đường ruột kháng carbapenem.......................................7
1.4.2. Kỹ thuật phát hiện Enterococcus kháng vancomycin.........................................................8
1.4.3. Kỹ thuật phát hiện vi khuẩn sinh ESBL................................................................................8
1.4.4. Môi trường nuôi cấy chọn lọc [32][33][34]........................................................................9
1.5. Hệ thống định danh MALDITOP [35]..........................................................................................9
1.6. Các nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam.................................................................................9
1.6.1. Trên thế giới.........................................................................................................................9
1.6.2. Tại Việt Nam.......................................................................................................................12

Chương 2................................................................................................................ 14


ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........................................14
2.1. Đối tượng nghiên cứu...............................................................................................................14
2.2. Địa điểm nghiên cứu.................................................................................................................14
2.3. Thời gian nghiên cứu................................................................................................................14
2.4. Thiết kế nghiên cứu..................................................................................................................14
2.5. Cỡ mẫu: Chọn mẫu thuận tiện.................................................................................................14
2.6. Phương tiện thu thập số liệu và xử lý số liệu...........................................................................14
2.7. Đạo đức nghiên cứu.................................................................................................................14
2.8. Vật tư, trang thiết bị.................................................................................................................15
2.9. Sơ đồ nghiên cứu......................................................................................................................18
2.10. Quy trình tuyển bệnh nhân vào nghiên cứu và thu thập các mẫu bệnh phẩm....................19

2.10.1. Thời điểm bệnh nhân mới nhập viện:.............................................................................19
2.10.2. Thời điểm bệnh nhân đã điều trị tại khoa Điều trị tích cực:..........................................19
2.10.3. Thời điểm bệnh nhân ra viện..........................................................................................19
2.11. Quy trình xét nghiệm..............................................................................................................20
2.11.1. Nuôi cấy............................................................................................................................20
2.11.2. Định danh.........................................................................................................................21

Chương 3................................................................................................................ 21
DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU..................................................................21
3.1. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu.............................................................................22
3.1.1. Tỷ lệ bệnh phẩm dương tính và âm tính khi nuôi cấy trên môi trường chọn lọc............22
3.1.2. Tỷ lệ dương tính khi nuôi cấy trên môi trường chọn lọc theo loại bệnh phẩm...............22
3.2. Sàng lọc tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh trên các môi trường...............................................22
3.2.1. Sàng lọc tỷ lệ các vi khuẩn kháng kháng sinh trên môi trường CHROMagar CARBA......22
3.2.2. Sàng lọc tỷ lệ các vi khuẩn kháng kháng sinh trên môi trường CHROMagar VRE...........23
3.2.3. Sàng lọc tỷ lệ các vi khuẩn kháng kháng sinh trên môi trường CHROMagar ESBL..........24
3.2.4. Sàng lọc vi khuẩn kháng kháng sinh thường gặp theo loại bệnh phẩm..........................24


Chương 4................................................................................................................ 24
DỰ KIẾN BÀN LUẬN..........................................................................................24
DỰ KIẾN KẾT LUẬN..........................................................................................25
DỰ KIẾN KIẾN NGHỊ.........................................................................................25
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Điều kiện nuôi cấy vi khuẩn kháng kháng sinh.......................................................20
Bảng 2.2: Khuẩn lạc bắt màu trên môi trường CHROMagarTM CARBA.................................20
Bảng 2.3: Khuẩn lạc bắt màu trên môi trường CHROMagarTM VRE.....................................21

Bảng 2.4: Khuẩn lạc bắt màu trên môi trường CHROMagarTM ESBL....................................21
Bảng 3.1: Phân bố loài của họ vi khuẩn đường ruột kháng carbapenem trên môi trường
nuôi cấy CHROMagarTM CARBA.............................................................................................22
Bảng 3.2: Phân bố loài Enterococcus kháng vancomycin trên môi trường nuôi cấy
CHROMagarTM VRE.................................................................................................................23
Bảng 3.3: Phân bố vi khuẩn sinh ESBL trên môi trường nuôi cấy CHROMagarTM ESBL.......24
Bảng 3.4: Tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh theo loại bệnh phẩm đờm/dịch phế quản (nước
tiểu/ ngoáy trực tràng/ vết thương).......................................................................................24


DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1: Tỷ lệ bệnh phẩm dương tính và âm tính khi nuôi cấy trên 3 môi trường
chọn lọc tại thời điểm vào viện (nằm viện sau 24 h/ ra viện)........................................22
Biểu đồ 3.2: Tỷ lệ dương tính khi nuôi cấy trên môi trường chọn lọc theo loại bệnh
phẩm tại thời điểm vào viện (nằm viện sau 24 giờ/ ra viện).........................................22

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Kết quả dương tính của test Hodge..............................................................7
Hình 1.2: Kết quả dương tính của kĩ thuật đĩa đôi.......................................................9
Hình 2.1: Hình ảnh điển hình của vi khuẩn trên môi trường CHROMagarTM CARBA
......................................................................................................................................20
Hình 2.2: Hình ảnh điển hình của vi khuẩn trên môi trường CHROMagarTM VRE...21
Hình 2.3: Hình ảnh điển hình của vi khuẩn trên môi trường CHROMagarTM ESBL..21


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Kháng kháng sinh là một trong những vấn đề thách thức và là mối quan tâm

hàng đầu tại Việt Nam cũng như trên toàn thế giới. Ước tính có khoảng 700000
bệnh nhân tử vong/năm trên thế giới do tình trạng kháng kháng sinh gây. Con số
này được dự báo sẽ tiếp tục tăng lên đến 100 triệu ca tử vong vào năm 2050 Tình
trạng đề kháng kháng sinh tiếp tục gia tăng trên toàn cầu. Các chủng kháng thuốc,
đặc biệt là đa kháng gây nhiễm khuẩn bệnh viện đã đặt ra nhiều thách thức đối với
nhà lâm sàng do thiếu các kháng sinh điều trị có hiệu quả. Điều này đang thực sự
diễn ra tại nhiều bệnh viện, trong các khoa hồi sức tích cực tại các nước thu nhập
thấp và trung bình nơi mà một số bệnh nhiễm khuẩn không thể điều trị được [2].
Một số chủng vi khuẩn như Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas
aeruginosa, Acinobacteria baumannii đã kháng lại hầu hết các loại kháng sinh bao
gồm cả các kháng sinh phổ rộng hiện nay như cephalosporin và carbapenem Các
kháng sinh “thế hệ một” gần như không được lựa chọn trong nhiều trường hợp. Các
kháng sinh thế hệ mới, đắt tiền, thuộc nhóm lựa chọn cuối cùng cũng đang mất dần
hiệu lực.
Tỷ lệ các chủng E. coli, K. pneumoniae, Enterobacter spp. … sinh men betalactamase phổ rộng (ESBL - extended-spectrum beta-lactamases) đã vượt quá 50%.
Như vậy, chỉ còn nhóm kháng sinh cuối cùng là carbapenem như imipenem,
meropenem và doripenem được sử dụng để diều trị các nhiễm trùng do vi khuẩn
Gram âm [6]. Người ta đã tìm thấy chủng Klebsiella pneumoniae sinh enzyme KPC
và Escherichia coli sinh NDM1 phá huỷ carbapenem và lan truyền các gene đề
kháng cho các vi khuẩn khác. Hơn nữa, các chủng enterococcus spp. giảm nhạy
cảm với vancomycin và Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanii sinh
ESBL gây khó khăn trong lựa chọn kháng sinh điều trị [7].
Trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu về các loại vi khuẩn kháng vancomycin,
carbapenem và vi khuẩn sinh ESBL. Đây là các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện.
Nhiều nghiên cứu cho thấy NKBV làm tăng tỉ lệ tử vong, kéo dài thời gian nằm viện,


2

tăng việc sử dụng kháng sinh, tăng đề kháng kháng sinh và chi phí điều trị [1][2]. Tại

Mỹ, hàng năm ước tính có 2 triệu bệnh nhân bị NKBV, làm 90000 người tử vong,
làm tốn thêm 4,5 tỉ Dollar viện phí [2]. Một nghiên cứu năm 2007 cho thấy nguy cơ
nhiễm khuẩn bệnh viện có thể cao hơn từ 2 đến 20 lần đối với các bệnh nhân ở các
nước đang phát triển so với các bệnh nhân ở các nước phát triển . Vì vậy, sàng lọc và
phát hiện sớm các loại vi khuẩn này trên các bệnh phẩm lâm sàng có ý nghĩa quan
trọng trong chẩn đoán và điều trị cũng như dự phòng nhiễm khuẩn.
Tại Việt Nam, các nghiên cứu cho thấy vi khuẩn kháng kháng sinh phổ biến
nhất tại các bệnh viện gồm Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa và Acinotobacter baumanii. Tỷ lệ đề kháng kháng sinh tương đối cao và
có xu hướng gia tăng [9][10]. Tại Bệnh viện Bạch Mai tỷ lệ Klebsiella pneumoniae,
Escherichia coli sinh ESBL tăng từ 20% và 18% năm 2005 lên 34% và 42% năm
2008 [11] . Theo đánh giá của CDDEP cho giai đoạn 2011-2014, Việt Nam thuộc
nhóm nước có tỷ lệ Escherichia coli sinh ESBL từ 60-79% và Klebsiella
pneumoniae kháng carbapenem từ 20.1-49.9% . Nhiều nghiên cứu về vi khuẩn
kháng các kháng sinh thế hệ mới, nhưng chưa đủ thông tin để cung cấp một cách
chính xác, toàn diện và cập nhập về tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh trên các cơ
quan nhiễm trùng, tại các thời điểm điều trị cũng như là sàng lọc nhanh trên môi
trường nuôi cấy chọn lọc.
Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Sàng lọc họ vi khuẩn đường ruột kháng
carbapenem, enterococcus kháng vancomycin và vi khuẩn sinh ESBL từ các
bệnh phẩm lâm sàng tại khoa hồi sức tích cực, bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới
Trung Ương năm 2017”
Nhằm mục tiêu: Xác định tỷ lệ họ vi khuẩn đường ruột kháng carbapenem,
Enterococcus kháng vancomycin và vi khuẩn sinh ESBL từ các bệnh phẩm lâm sàng.


3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Họ vi khuẩn đường ruột kháng carbapenem (CRE)
1.1.1. Họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae)
Enterobacteriaceae là những vi khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy
ngộ, không có men oxidase, lên men đường glucose (sinh hơi hoặc không), khử
nitrat thành nitrit, có thể di động hoặc không, nhưng nếu di động thì có nhiều lông
xung quanh thân, không sinh nha bào. Các tác nhân kháng kháng sinh thế hệ mới
thường được đề cập đến gồm Escherichia coli, Klebsiella spp., Citrobacter spp.,
Enterobacter spp., Serratia spp. [13].
1.1.2. Kháng sinh nhóm carbapenem [14][15]
Carbapenem là kháng sinh nhóm beta lactam có phổ tác dụng rộng nhất, tác
động đến quá trình sinh tổng hợp vách vi khuẩn. bao gồm: Meropenem, ImipenemCilastatin, Ertapenem, Doripenem.
Meropenem: phổ tác dụng trên vi khuẩn gram âm kỵ khí và hiếu khí, gram
âm hiếu khí sinh ESBL( Extended Spectrum Beta Lactamase). Meropenem được
FDA chấp thuận điều trị nhiễm trùng ổ bụng, viêm màng não trẻ em > 3 tháng tuổi,
nhiễm trùng da/cấu trúc da biến chứng.
Imipenem- cilastatin: phổ tác dụng tương tự Meropenem
Ertapenem: phổ tác dụng trên vi khuẩn gram âm kỵ khí và hiếu khí. Nhưng
không giống với carbapenem khác, Ertapenem không tác dụng trên Pseudomonas
Aeruginosa. FDA chấp thuận điều trị viêm phổi cộng đồng, nhiễm trùng tiết niệu
biến chứng, nhiễm trùng khung chậu, nhiễm trùng da/cấu trúc da.
Doripenem: tác dụng trên vi khuẩn gram âm kỵ khí và hiếu khí.
1.1.3. Cơ chế đề kháng carbapenem của họ vi khuẩn đường ruột
Ngoài đề kháng tự nhiên, vi khuẩn còn có thể nhận được hoặc phát triển khả
năng đề kháng thuốc kháng sinh. Cơ chế kháng kháng sinh này được chia làm ba


4

nhóm chính: (i) làm giảm thiểu nồng độ kháng sinh trong nội bào bằng cách giảm
tính thấm của màng tế bào hoặc sử dụng các hệ thống bơm ngược; (ii) thay đổi các

đích của kháng sinh bằng cách tạo đột biến gen hay sửa đổi đích sau phiên mã; và
(iii) bất hoạt các kháng sinh bằng cách thủy phân hoặc thay đổi cấu trúc hóa học của
kháng sinh.
Phá hủy kháng sinh bằng cách thủy phân.
Hoạt động thủy phân kháng sinh bằng enzyme là cơ chế đề kháng phổ biến của
vi khuẩn mà ngay từ khi bắt đầu sử dụng kháng sinh trong điều trị đã được tìm thấy.
Người ta đã phân lập được enzyme carbapenemes từ họ vi khuẩn đường ruột,
đây chính là nguyên nhân gây nhiễm trùng bệnh viện rất nặng và khó điều trị [16].
Vi khuẩn sản xuất ra enzyme gây phân hủy hoặc làm bất hoạt kháng sinh
carbapenem. Sự đề kháng thường do sự hiện diện của plasmid mang gen mã hóa
enzyme kháng thuốc như enzyme KPC (Klebsiella Pneumoniae carbapenemase)
hay NDM-1 (New Dehli Metallo-lactamase 1). Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng sự
lan truyền các gen đề kháng carbapenem cũng như sinh ESBL này chủ yếu thông
qua plasmid và tranposon [17].
Giảm tính thấm.
So với các vi khuẩn Gram dương, vi khuẩn Gram âm bản chất có tính thấm
kém với đối với nhiều kháng sinh do cấu trúc vi thể của màng tế bào [18]. Kháng
sinh ưa nước thấm qua lớp màng ngoài bằng cách khoếch tán qua các Porin protein
ở màng ngoài. Trong hầu hết các vi khuẩn đường ruột, các porin lớn, ví dụ là các
protein màng ngoài OmpF và OmpC của E. coli, có chức năng là kênh dẫn truyền
không chọn lọc, vì vậy làm giảm tính thấm của màng ngoài tế bào và hạn chế sự
xâm nhập của kháng sinh vào tế bào là kết quả của cơ chế điều hòa của các porin
hoặc thay thế các porin bằng các kên dẫn truyền chọn lọc hơn. Đây là cơ chế được
thiết lập cho sự đề kháng kháng sinh của họ vi khuẩn đường ruột [19]. Do vậy đề
kháng carbapenems ở Enterobacteriaceae có thể xảy ra trong trường hợp vắng mặt
enzyme carbapenemase nhưng có đột biến làm giảm sản xuất porin hoặc xuất hiện
các đột biến allele porin [20].


5

Thay đổi đích tác động
Cách thay đổi các đích tác động của kháng sinh cũng là một phương tiện
hiệu quả trong đề kháng kháng sinh. Ngoài việc tạo đột biến trên gen mã hóa các
phân tử đích, phương thức bảo vệ các phân tử đích đã được tìm thấy có liên quan
đến đến cơ chế đề kháng của nhiều loại kháng sinh quan trọng. Ví dụ, khả năng
methyl hóa vị trí trước đây được cho là có liên quan đến đề kháng kháng sinh như
gen armA, mã hóa cho enzyme methyltransferase, tìm thấy ở các chủng
Enterobacteriaceae gây bệnh tại Bắc Mỹ, Châu Âu và Ấn Độ. Các gen rmt mã hóa
cho một methyltransferase khác, tìm thấy ở Bắc Mỹ, Trung và Nam Mỹ, và Ấn Độ
[21][22].
1.2. Enterococcus kháng vancomycin (VRE)
1.2.1. Enterococcus
Enterococcus là cầu khuẩn gram dương, hiếu kỵ khí tùy tiện, có trong hệ vi
khuẩn bình thường ở dạ dày ruột, gây bệnh cơ hội. Cho đến nay, khoảng 35 chủng
Enterococcus spp., nhiều nghiên cứu chỉ ra hai chủng gây bệnh chủ yếu và kháng
kháng sinh thế hệ mới là Enterococcus faecium và Enterococcus faeccalis [23].
1.2.2. Vancomycin
Vancomycin là kháng sinh có tác dụng diệt khuẩn bằng cách ức chế quá trình
sinh tổng hợp vỏ tế bào vi khuẩn, ở giai đoạn sớm hơn so với các kháng sinh nhóm
beta-lactam. Vancomycin còn tác động đến tính thấm của màng tế bào và quá trình
tổng hợp ARN của vi khuẩn. Chúng tác dụng trên hầu hết các vi khuẩn, với
Enterococcus, vancomycin không có hiệu lực cao như trên tụ cầu vàng kháng
methicillin MRSA, một số chủng Pseudomonas và các vi khuẩn không có lớp màng
peptidoglycan (Mycoplasma) [24].
1.2.3. Cơ chế đề kháng vancomycin của Enterococcus
Thay đổi đích tác động
Việc sử dụng kháng sinh trong điều trị nhiễm trùng thường làm cho vi khuẩn
nhanh chóng đề kháng. Vào những năm 1980, đề kháng loại kháng sinh
glycopeptides này đã được ghi nhận lần đầu tiên, sự đề kháng này là hậu quả từ sản

6

phẩm biến đổi đầu cuối của peptidoglycan tại vị trí D-Ala-D-Lac (VanA, VanB, và
VanD), hay D-Ala-D-Ser (VanC, VanE, và VanG), các biến đổi này tạo ra ái lực thấp
đối với glycopeptides. Các gen mã hóa cho enzyme biến đổi này như vanA và vanB
thường nằm trên nhiễm sắc thể hoặc plasmid, trong khi đó các vanC1, vanC2/3,
vanD, vanE và vanG thường tìm thấy trên nhiễm sắc thể [25].
1.3. ESBL và vi khuẩn sinh ESBL
1.3.1. ESBL và vi khuẩn sinh ESBL
Beta-Lactamase phổ rộng là một nhóm enzyme giúp vi khuẩn kháng lại
nhiều loại kháng sinh nhóm Beta lactam. Khi các chủng vi khuẩn sinh ESBL thì
đồng nghĩa với việc chúng kháng lại rất nhiều các kháng sinh, đặc biệt là nhóm
cephaslosporin.
Các vi khuẩn sinh ESBL được nghiên cứu nhiều gồm các chủng vi khuẩn
Gram âm Escherichia coli, Proteus spp, Klebsiella spp., Acinetobacter spp.,
Pseudomonas aeruginosa [26][27].
1.3.2. Cơ chế sinh ESBL
Phá hủy kháng sinh bằng cách thủy phân
Các β-lactamase đầu tiên có hoạt lực chống lại các kháng sinh β-lactam thế hệ
đầu, tiếp đó là các extended-spectrum β-lactamases (các β-lactamase phổ rộng - ESBL)
có hoạt tính chống lại oxyimino-cephalosporin [28]. Sự xuất hiện nhiều loại ESBL và
carbapenemases, bao gồm cả các IMP (imipenemase), VIM (Verona integron mã hóa
metallo β-lactamase), K. pneumoniae carbapenemase (KPC), OXA (oxacillinase) và
NDM enzyme trong các vi khuẩn Gram âm như K. pneumoniae, E. coli, P. aeruginosa
và A. baumannii, là dấu hiệu cho thấy vi khuẩn đã kháng lại toàn bộ các kháng sinh
nhóm β-lactam. Trong một số trường hợp, sự lan rộng của các chủng vi khuẩn kháng
thuốc là nguyên nhân làm gia tăng tỷ lệ đề kháng kháng sinh, trong khi đó, dạng đề
kháng qua gen di truyền trên plasmid cũng đã lan truyền rộng rãi.

Có hàng trăm biến thể của gen CTX-M (là gen mã hóa ESBL đóng vai trò
chính trong đề kháng cefotaxime cao hơn so với oxyimino-β- lactam). CTX-M14 và
CTX-M15 là những enzyme rất phổ biến trong các chủng vi khuẩn sinh ESBL, đặc
biệt là trong E. coli và K. pneumoniae đề kháng cephalosporin [29].


7

1.4. Các kỹ thuật phát hiện CRE, VRE và vi khuẩn sinh ESBL [30][31]
1.4.1. Kỹ thuật phát hiện họ vi khuẩn đường ruột kháng carbapenem
Các kỹ thuật dùng để chẩn đoán hiện nay chủ yếu dựa trên cơ chế phát hiện
carbapenemase. Trong đó, một số kỹ thuật đang được áp dụng phổ biến gồm:
Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán
Kháng sinh đồ bằng kỹ thuật khuyếch tán kháng sinh trong đĩa thạch từ
khoanh giấy tẩm kháng sinh còn được gọi là kháng sinh đồ theo phương pháp
Kirby-Bauer.
Kháng sinh được tẩm lên khoanh giấy với một nồng độ quy định, đặt lên đĩa
thạch dinh dưỡng đã được cấy vi khuẩn. Trong quá trình ủ, kháng sinh từ khoanh
giấy khuyếch tán ra môi trường thạch và ức chế sự phát triển của vi khuẩn, vì thế
tạo một vòng không có vi khuẩn mọc (vòng vô khuẩn) xung quanh khoanh kháng
sinh. Mức độ nhạy cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn thử nghiệm được
đánh giá qua sự phát triển của vi khuẩn sẽ bị ức chế khi kháng sinh đạt đến một
nồng độ nhất định. Đường kính vùng ức chế tỷ lệ thuận với mức độ nhạy cảm được
phiên giải ra các phân loại S (sensitive – nhạy cảm), I (intermediate – trung gian),
hoặc R (resistant – đề kháng) khi so sánh với bảng chuẩn CLSI cập nhật hàng năm.
Kỹ thuật Hodge
Sàng lọc các chủng sinh carbapenemase. Nếu chủng sản xuất carbapenemase
(dương tính) sẽ biểu hiện bằng các khuẩn lạc tạo hình nan quạt (do sự tăng sinh tại vùng
giao thoa giữa vệt cấy và chu vi vùng ức chế của chủng chỉ định E. coli ATCC 25922).
Chủng không sản xuất carbapenemase (âm tính) sẽ không biểu hiện sự tăng trưởng.

Hình 1.1: Kết quả dương tính của test Hodge


8

Kỹ thuật phát hiện Metallo- β-lactamase (MBL): Các kỹ thuật dựa trên sự
ức chế hoạt động của MBL bởi ethylene diamine tetra acetic (EDTA).
Một số kỹ thuật ứng dụng nguyên lý này: Thử nghiệm E-test MBL, thử
nghiệm khoanh giấy hiệp đồng và khoanh giấy kết hợp với EDTA.
Kỹ thuật nuôi cấy trên môi trường chọn lọc
Cơ chế chung để phát hiện khuẩn lạc kháng kháng sinh dựa trên sự thay đổi
màu của chất chỉ thị sẵn có.
1.4.2. Kỹ thuật phát hiện Enterococcus kháng vancomycin
Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán
Kháng sinh đồ bằng kỹ thuật khuyếch tán kháng sinh trong đĩa thạch từ
khoanh giấy tẩm kháng sinh còn được gọi là kháng sinh đồ theo phương pháp
Kirby-Bauer. Khoanh giấy có nồng độ kháng sinh vancomycin 30 µg đặt trên đĩa
thạch Mueller Hinton. Tùy theo kích thước của vòng vô khuẩn để đánh giá độ nhạy
cảm kháng sinh.
Kỹ thuật nuôi cấy trên môi trường chọn lọc
Cơ chế chung để phát hiện khuẩn lạc kháng kháng sinh dựa trên sự thay đổi
màu của chất chỉ thị sẵn có.
1.4.3. Kỹ thuật phát hiện vi khuẩn sinh ESBL
Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán
Kháng sinh đồ bằng kỹ thuật khuyếch tán kháng sinh trong đĩa thạch từ
khoanh giấy tẩm kháng sinh còn được gọi là kháng sinh đồ theo phương pháp
Kirby-Bauer.
Kỹ thuật đĩa đôi
Thử nghiệm sàng lọc kiểu hình các chủng sinh β-lactamase phổ rộng bằng

phương pháp đĩa đôi phát hiện sự cộng hưởng giữa một cephalosporin thế hệ thứ ba
và amoxicillin/clavulanic acid trên kháng sinh đồ, tạo nên vòng kháng khuẩn dạng
“nút chai champagne” trên các chủng sinh men ESBL.


9

Hình 1.2: Kết quả dương tính của kĩ thuật đĩa đôi
Kỹ thuật nuôi cấy trên môi trường chọn lọc
1.4.4. Môi trường nuôi cấy chọn lọc [32][33][34]
Trên thế giới hiện nay, có nhiều môi trường chọn lọc được phát triển để sàng
lọc trực tiếp các vi khuẩn kháng kháng sinh từ bệnh phẩn lâm sàng . Trong đó, các
đĩa thạch chọn lọc của CHROMagar.
• CHROMagarTM CARBA sử dụng cho sàng lọc họ vi khuẩn đường ruột
kháng Carbapenem với độ nhậy 85% trong khi nghiên cứu so sánh với các
môi trường khác có độ nhậy thấp hơn như CHROMAgar™-KPC (65%),
MacConkey (69%).
• CHROMagarTM VRE sử dụng cho sàng lọc Enterococci. Môi trường có độ
nhậy phát hiện vi khuẩn kháng vancomycin đạt 95.7% sau 24 giời nuôi cấy.
• CHROMagarTM ESBL có độ nhậy cao, phát hiện thấp < 100 CFU/ml.
1.5. Hệ thống định danh MALDITOP [35]
Là hệ thống định danh vi khuẩn tự động, tiên tiến, sử dụng công
nghệ MALDI-TOF (Matrix Assisted

Laser

Desorption

Ionization

Time-of-

Flight) định danh các loài vi khuẩn được thực hiện bằng ghi nhận các dải quang phổ
và phân tích các dải quang phổ với cơ sở dữ liệu có sẵn cho hơn 6000 vi sinh vật.
1.6. Các nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam
1.6.1. Trên thế giới
Nhiễm khuẩn bệnh viện
Nhiễm khuẩn bệnh viện (NKBV) được định nghĩa là “những nhiễm khuẩn xảy
ra sau 48 giờ kể từ khi vào viện, các nhiễm khuẩn này không xuất hiện hay ở trong


10

giai đoạn ủ bệnh lúc nhập viện”. Định nghĩa này bao gồm cả các nhiễm khuẩn của
bệnh nhân sau khi ra viện và nhiễm khuẩn nghề nghiệp trên các nhân viên y tế trong
bệnh viện [36] . Một số nghiên cứu chỉ ra rằng 70% các chủng vi khuẩn gây bệnh
trong bệnh viện đã kháng lại ít nhất 1 loại kháng sinh thường dùng trong điều trị.
Đặc biệt, một số chủng vi khuẩn như Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,
Pseudomonas aeruginosa, Acinobacteria baumannii đã kháng lại hầu hết các loại
kháng sinh bao gồm cả các kháng sinh mạnh nhất hiện nay như cephalosporin và
carbapenem [37][38]. Tình trạng sức khỏe, bệnh lý nền và việc tiến hành các thủ
thuật xâm nhập là những yếu tố nguy quan trọng nhất của NKBV. Chính vì vậy,
những bệnh nhân nằm tại các khoa ICU là những người có nguy cơ bị NKBV cao
nhất. Một nghiên cứu về giám sát NKBV tại các quốc gia Châu Âu chỉ ra rằng
những bệnh nhân tại ICU có nguy cơ mắc NKBV cao hơn từ 5-10 lần so với bệnh
nhân điều trị tại các khoa khác trong bệnh viện [39] .
Họ vi khuẩn đường ruột kháng carbapenem
Từ 1986 đến 1990, chỉ 2.3% trong 1825 mẫu Enterobacteriaceae phân lập kháng
imipenem. Năm 2004, tỷ lệ Klebsiella pneumonia kháng meropenem 0.6% và tăng lên
5,6% năm 2008 [40]. Theo mạng lưới chăm sóc sức khỏe quốc gia (NHSN-2007) 4%

chủng Escherichia coli và 10.8% chủng K. pneumoniae đã kháng lại carbapenem [41].
Ở châu Á, tỷ lệ họ vi khuẩn đường ruột kháng carbapenem vẫn thấp trong thời
gian nghiên cứu 2000-2012 với tỷ lệ kháng trung bình 0,6% (0,6-0,8%, imipenem) và
0,9% (0,7-1,2%, meropenem). Tỷ lệ kháng thuốc đối với imipenem và meropenem
trong Enterobacteriaceae thể hiện xu hướng leo thang đáng kể, trong đó E. coli,
Klebsiella spp., Enterobacer spp. và Klebsiella spp. chiếm tỷ lệ lớn nhất. Mức độ
kháng kháng sinh imipenem trong Enterobacteriaceae trong giai đoạn 2000-2012 như
sau: Serratia spp. (1.8%), Proteus spp. (1.6%), Klebsiella spp. (0,8%), Citrobacter
spp. (0,8%), Enterobacer spp. (0.7%) và E. coli (0.2%) [42].
Enterococcus kháng vancomycin
Nhiễm khuẩn do Enterococcus đề kháng với vancomycin (VRE) gia tăng
nhanh chóng và trở thành mối quan tâm chủ yếu trong lâm sàng. VRE được nhắc


11

đến lần đầu tiên tại Hoa Kỳ vào năm 1989, chiếm dưới 1% các chủng
Enterococcus được phân lập nhưng là mối đe dọa nghiêm trọng trong những năm
gần đây, chiếm gần 30% trong số 66,000 trường hợp nhiễm Enterococcus có liên
quan đến chăm sóc y tế và 1,300 trường hợp tử vong hàng năm [43].
E. faecium chiếm đa số trong các chủng đề kháng với vancomycin (77%),
đề kháng với nhóm beta-lactam (ampicillin) và aminoglycosid, là hai trong số các
kháng sinh được dùng để điều trị Enterococcus. Ngược lại, Enterococcus
faecalis ít gặp hơn các chủng Phần lớn các chủng VRE được báo cáo ở Hoa Kỳ
là Enterococcus faecium có vanA. Tỷ lệ ở Hoa Kỳ cao hơn ở châu Âu rất nhiều,
kháng vancomycin là 72,4% ở E. faecium và 9,6% ở E. faecalis trong tổng số các
chủng trên thu thập được từ các bệnh phẩm lâm sàng [44].
Vi khuẩn sinh ESBL
Escherichia coli và Klebsiella pneumoniae: được đánh giá là 2 trong số 3 tác
nhân gây nhiễm khuẩn đáng quan tâm nhất, có liên quan tới cả NKBV và nhiễm

khuẩn cộng đồng [40] . Tại Châu Âu, 17 trong số 22 quốc gia báo cáo tỷ lệ
Escherichia coli sinh ESBL chiếm 85-100% số chúng phân lập được và 13 trong số
21 nước báo cáo tỷ lệ tương tự với Klebsiella pneumonia sinh ESBL [45] . Báo cáo
năm 2011 tại Trung Quốc cho thấy 71% số chúng Escherichia coli và hơn một nửa
số chủng Klebsiella pneumonia phân lập được sinh ESBL [46] .Trong khi đó, tại
Canada và Úc tỷ lệ các chủng Enterobacteriaceae sinh ESBL ở mức thấp hơn, lần
lượt là 7% với Escherichia coli; 4% và 5% với Klebsiella pneumonia [47] .
Pseudomonas aeruginosa và Acinobacteria baumannii là căn nguyên quan
trọng gây NKBV ở những bệnh nhân suy giảm miễn dịch do các cơ chế kháng
kháng sinh của chúng. Một nghiên cứu từ năm 2001 đến 2006 tại bệnh viện ở
Brooklyn, New York cho thấy tỷ lệ đề kháng của P. aeruginosa với cefepime là
27-29%, imipenem là 30-31%, meropenem là 23%, ciprofloxacin là 41-44% [48]
.Các chủng Pseudomonas aeruginosa kháng kháng sinh chiếm tỷ lệ cao nhất là ở
các chủng phân lập được từ bệnh phẩm đường hô hấp dưới và thấp nhất ở các
chủng từ bệnh phẩm ở đường hô hấp trên[49]. Nghiên cứu của Siefert và cộng sự


12

tại Đức cho thấy có 87 đợt nhiễm khuẩn huyết do Acinobacteria baumannii trên
79 bệnh nhân, trong đó 91% bệnh nhân nằm tại khoa Điều trị tích cực, 99% có đặt
catheter trong lòng mạch, 70% có thở máy và 47% có phẫu thuật. Tại khu vực
Châu Á, tình trạng nhiễm khuẩn huyết do Acinobacteria baumannii được báo cáo
tại một số nước như Ấn Độ, Thái Lan, Hàn Quốc, Singapore dao động từ 10-30%,
tỷ lệ kháng với tất cả các kháng sinh gia tăng từ 50% lên tới trên 70%, trong đó có
đóng góp không nhỏ bởi khả năng sinh ESBL [50][51] .
1.6.2. Tại Việt Nam
Nhiễm khuẩn bệnh viện
Nghiên cứu về 4 loại vi khuẩn Gram âm gây NKBV phổ biến nhất tại các
bệnh viện đa khoa và chuyên khoa của Việt Nam, bao gồm Klebsiella pneumoniae,

Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Acinotobacter baumanii,cho thấy tỷ
lệ đề kháng kháng sinh tương đối cao và có xu hướng gia tăng [9]. Nghiên cứu ở
Bệnh viện đa khoa Trung Ương Huế cho thấy tỷ lệ cấy máu dương tính với
Acinotobacter baumaniilà 19% và đề kháng với kháng sinh imipenem là 45%
[52].Nghiên cứu trong 2 năm 2010-2012 tại một bệnh viện ngoại khoa đầu ngành
của miền Bắccho thấy có 69 trong tổng số 4.096chủng Enterobacteriaceae phân lập
được đã kháng carbapenem. Điều đáng báo động hơn là 47 (68.1%) trong tổng số
69 chủng này có mang NDM-1 [53].
Họ vi khuẩn đường ruột kháng Carbapenem
Từ 5/2008 đến 11/2009 đã có 1602 chủng trực khuẩn Gram âm dễ mọc
được nghiên cứu từ 16 bệnh viện trên toàn quốc. Kết quả cho thấy
Enterobacteriaceae còn nhạy cảm rất cao với carbapenems [54]. Theo đánh giá
của CDDEP cho giai đoạn 2011-2014, Việt Nam thuộc nhóm nước có tỷ lệ
Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem từ 20.1-49.9% [55] Nghiên cứu trong
2 năm 2010-2012 tại một bệnh viện ngoại khoa đầu ngành của miền Bắc cho thấy
có 69 trong tổng số 4.096 chủng Enterobacteriaceae phân lập được đã kháng
carbapenem. Điều đáng báo động hơn là 47 (68.1%) trong tổng số 69 chủng này
có mang NDM-1 [56].


13

Enterococcus kháng vancomycin
Tại Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về vấn đề này. Một nghiên cứu tại
bệnh viện tỉnh Đồng Nai năm 2012 cho thấy tỷ lệ enterococcus kháng vancomycin
chiếm 16,7 %, trong đó, E. facecalis chiếm 55.84% [57].
Vi khuẩn sinh ESBL
Nghiên cứu từ 1328 trực khuẩn Gram âm hiếu khí năm 2012 có 388 trực
khuẩn có khả năng tiết ESBL thấy vi khuẩn thường gặp là Escherichia coli
(37,65%), Enterobacter (32,73%), Klebsiella (33,33%), Pseudomonas (16,18%),

Proteus (7,09%), Acinetobacter (27,59%). Bệnh phẩm được phân lập chủ yếu là mủ
và các chất dịch chiếm 902/1328 mẫu bệnh phẩm chiếm tỉ lệ 67,92%, trong đó có tỉ
lệ ESBL là 263/902 (29,16%) [58]. Theo đánh giá của CDDEP cho giai đoạn 20112014, Việt Nam thuộc nhóm nước có tỷ lệ Escherichia coli sinh ESBL từ 60-79%
[12]. Một nghiên cứu khác năm 2009 tại Bệnh viện Nhiệt đới Trung Ương cũng cho
thấy tỷ lệ kháng thuốc của Acinotobacter baumanii rất cao, tới 90% với các kháng
sinh cephalosporin, quinolon, carbapenem [59]


14

Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Tất cả các mẫu bệnh phẩm ngoáy trực tràng, nước tiểu, đờm/dịch hút phế
quản, vết thương (nếu có) từ bệnh nhân đang điều trị tại khoa Điều trị tích cực.
• Tiêu chuẩn lựa chọn:
Tất cả bệnh phẩm đờm/ dịch hút phế quản, ngoáy trực tràng, vết thương lấy
thường quy tại bệnh viện.
•Tiêu chuẩn loại trừ: Không
2.2. Địa điểm nghiên cứu
Khoa Điều trị tích cực (ICU), Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương
2.3. Thời gian nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu dự kiến từ tháng 1/2017 đến hết tháng 12/2017 (12 tháng).
2.4. Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả tiến cứu
2.5. Cỡ mẫu: Chọn mẫu thuận tiện
2.6. Phương tiện thu thập số liệu và xử lý số liệu
- Phương pháp thu thập số liệu:
Các thông tin và số liệu của từng bệnh phẩm sẽ được ghi chép vào mẫu lấy
bệnh phẩm, mẫu bệnh án nghiên cứu (xin xem phụ lục).

- Phương pháp xử lý số liệu:
Sử dụng thuật toán thống kê y học (SPSS 22). Trong thống kê so sánh, sự khác biệt
được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05 với các phép so sánh trung bình, tỷ lệ…
2.7. Đạo đức nghiên cứu
- Nghiên cứu được dựa trên ba nguyên tắc cơ bản của đạo đức là tôn trọng,
không gây hại và tạo sự công bằng cho tất cả bệnh nhân.
- Tất cả bệnh nhân đều được giải thích rõ về mục đích, nắm được trách nhiệm
và quyền lợi cụ thể của mình, tự nguyện tham gia nghiên cứu và có quyền rút khỏi
nghiên cứu bất cứu lúc nào.


15

2.8. Vật tư, trang thiết bị
Trang thiết bị
- Tăm bông,
- Ống đựng nước tiểu,
- Bẫy đờm.
- Túi bóng sạch
- Que cấy
- Đèn cồn
- Tủ an toàn sinh học
- Máy định danh MALDITOP và hóa chất định danh
Hóa chất sinh phẩm:
- Đĩa thạch CHROMagarTM CARBA
CHROMagarTM CARBA
Thạch
Thành phần

Đặc điểm

Thạch 15.0 g/L
Pepton và men 17.0 g/L
Hỗn hợp chromogenic 1.0 g/L

pH
Bảo quản

Chất bổ sung 0.57 g/L
7.0 ± 0.2
2-80C

- Đĩa thạch CHROMagarTM VRE
CHROMagarTM VRE
Thạch
Thành phần

Đặc điểm
Thạch 15.0 g/L
Pepton và men 20.0 g/L
Hỗn hợp chromogenic 0.8 g/L

Chất bổ sung 1.7 g/L
pH
7.0 ± 0.2
Bảo quản
2-80C
- Đĩa thạch CHROMagarTM ESBL


16

CHROMagarTM ESBL
Thạch
Thành phần

Đặc điểm
Thạch 15.0 g/L
Pepton và men 17.0 g/L
Hỗn hợp chromogenic 1.0 g/L

pH
Bảo quản

Chất bổ sung 0.57 g/L
7.0 ± 0.2
2-80C


17

Bệnh nhân nhập viện vào ICU

Lấy bệnh phẩm
Mủ vết thương
Đờm khạc hoặc đờm hút khí phế quản
Nước tiểu
Ngoáy trực tràng
Dán nhãn/ điền phiếu thu mẫu/ để BP trong tủ lạnh

Bệnh nhân xuất viện hoặc chuyển khỏi ICU không?

Có – lấy các bệnh phẩm
ra viện

Không – bệnh nhân nằm ở
ICU trên 24 giờ

Lấy bệnh phẩm

Lấy mẫu hàng tuần (ngày 7, 14, 21, 28…)

Mủ vết thương
Đờm khạc hoặc đờm hút khí phế
quản
Nước tiểu
Ngoáy trực tràng
Dán nhãn / điền phiếu thu mẫu/ để
BP trong tủ lạnh

Mủ vết thương
Đờm khạc hoặc đờm hút khí phế quản
Nước tiểu
Ngoáy trực tràng
Dán nhãn / điền phiếu thu mẫu/ để BP trong tủ
lạnh.