XÁC ĐỊNH NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH HEMOPHILLIA a BẰNG kỹ THUẬT MICROSATELLITE DNA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

ĐỖ THỊ HIẾN

XÁC ĐỊNH NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH
HEMOPHILLIA A BẰNG KỸ THUẬT
MICROSATELLITE DNA

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

HÀ NỘI – 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

ĐỖ THỊ HIẾN

XÁC ĐỊNH NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH
HEMOPHILLIA A BẰNG KỸ THUẬT
MICROSATELLITE DNA
Chuyên ngành: Hóa sinh
Mã số: 60720106

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. Trần Vân Khánh


HÀ NỘI – 2016
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ
...............................................................................................
1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
...............................................................................................
3
1.1. Đặc điểm bệnh Hemophilia A.................................................................3
1.1.1. Những đặc điểm chung...................................................................3
1.1.2. Chẩn đoán bệnh Hemophillia A.......................................................5
1.1.3. Điều trị bệnh Hemophillia A...........................................................8
1.1.4. Cơ chế phân tử bệnh Hemophillia A..............................................10
1.2. Người lành mang gen bệnh Hemophillia A..............................................21
1.2.1. Đặc điểm chung............................................................................21
1.2.2. Đặc điểm chảy máu của người lành mang gen bệnh Hemophillia A22
1.2.3. Quản lý và điều trị dự phòng cho người lành mang gen bệnh
Hemophillia A.............................................................................24
1.2.4. Vai trò của việc xác định người lành mang gen bệnh......................24
1.3. Các phương pháp phát hiện người lành mang gen bệnh HA.....................25
1.3.1. Dựa vào hoạt tính yếu tố VIII........................................................25
1.3.2. Dựa vào phân tích phả hệ...............................................................25
1.3.3. Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử.................................................26
1.4. Tình hình nghiên cứu về người lành mang gen bệnh HA ở Việt Nam........37

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
...............................................................................................
40


2.1. Đối tượng nghiên cứu.............................................................................40
2.2. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu...................40
2.2.1. Trang thiết bị nghiên cứu...............................................................40
2.2.2. Dụng cụ nghiên cứu......................................................................40
2.2.3. Hóa chất nghiên cứu......................................................................41
2.3. Phương pháp nghiên cứu.........................................................................42
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu: Mô tả cắt ngang.............................................42
2.3.2. Nội dung nghiên cứu.....................................................................43
2.3.3. Địa điểm nghiên cứu.....................................................................43
2.3.4. Quy trình và các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu.......................44
2.4. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu............................................................53
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
...............................................................................................
54
3.1. Xây dựng quy trình xác định người lành mang gen bệnh hemophillia A
bằng kỹ thuật Microsatellite DNA...........................................................54
3.2. Xác định người lành mang gen bệnh hemophillia A bằng kỹ thuật
Microsatellite DNA trên các thành viên gia đình người bệnh....................63
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
...............................................................................................
65
DỰ KIẾN KẾT LUẬN
...............................................................................................
66
DỰ KIẾN KIẾN NGHỊ

...............................................................................................
66
TÀI LIỆU THAM KHẢO



DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1.
Hình 1.2.
Hình 1.3.
Hình 1.4.
Hình 1.5.
Hình 1.6.

Hình 1.7.
Hình 1.8.
Hình 1.9.
Hình 2.1.
Bảng 2.1.
Bảng 2.2.
Hình 3.1.
Hình 3.2.
Hình 3.3.
Hình 3.4.
Hình 3.5.
Hình 3.6.
Hình 3.7.

Các hình ảnh biểu hiện bệnh Hemophillia A..................................6
Sơ đồ đông máu theo con đường nội và ngoại sinh......................12

Cấu trúc gen và protein yếu tố VIII..............................................13
Kiểu gen và kiểu hình của bố mẹ và thế hệ con............................18
Phả hệ di truyền bệnh hemophilia A của các thành viên trong
Hoàng gia Anh..............................................................................25
Hình ảnh giải trình tự exon 14 gen F8 của DNA người mẹ và DNA
chị gái bệnh nhân bị đột biến del2605C. Mũi tên thẳng đứng chỉ vị
trí đột biến, các chữ số trên mũi tên chỉ vị trí nucleotid và acid
amin thay đổi.................................................................................26
Cơ chắt gen F8 thành 2 đoạn (ex).................................................27
Cơ Chen.CITE <EndNote><Cite>Ứng dụng của Microsatellite DNA trong phát hiện người lành
mang gen bệnh Hemophillia A.....................................................34
Các đoạn DNA đóng vòng sau khi nối bằng T4 ligate..................47
Bảng hiệu tên các cặp mồi đặc để khuếch đại các STR của gen FVIII..49
Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR khuếch đại STR.....49
Hình ảnh giải trình tự gen của gia đình mã số HA23...................52
Hình ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi DXS 1108
của gia đình mã số HA23..............................................................53
Sơ đồ phả hệ gia đình bệnh nhân mã số HA02.............................54
Hình ảnh multiplex PCR xác định đột biến intron 22 của gia đình
bệnh nhân HA02...........................................................................55
Hình ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi DXS 1108
của gia đình mã số HA23..............................................................56
Hình ảnh giải trình tự gen của gia đình mã số HA23...................57
Hình ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi DXS 1108
của gia đình mã số HA23..............................................................58


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hemophillia A (HA) là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể giới tính
X, gây nên do đột biến gen FVIII. Gen bệnh nằm trên nhiễm sắc thể X không
có allele tương ứng trên nhiễm sắc thể Y, do vậy người mẹ mang gen bệnh có
thể truyền bệnh cho 50% con trai và truyền gen bệnh cho 50% con gái của họ
[1],[2]. Bệnh có thể di truyền qua nhiều thế hệ và có nhiều người mắc bệnh
trong cùng một gia đình. Tại Việt Nam ước tính có khoảng 6000 người bị
bệnh Hemophillia [3],và khoảng 30.000 người mang gen bệnh Hemophillia A.
Mặc dù trong thời gian qua, công tác chăm sóc bệnh nhân Hemophillia A tại Việt
Nam đã có nhiều tiến bộ, số lượng người bệnh được chẩn đoán và quản lí đã
tăng lên đáng kể, tuy nhiên mới chỉ chiếm chưa tới 30%, còn đa số người mang
gen bệnh chưa được chẩn đoán và quản lí [4]. Chẩn đoán chính xác và điều trị
sớm căn bệnh này có ý nghĩa quan trọng nhằm hạn chế tối đa tình trạng chảy
máu cũng như giảm thiểu khả năng bệnh nhân trở thành tàn tật,giảm bớt ánh
nặng cho gia đình và xã hội.
Người phụ nữ mang gen bệnh là người có hoạt tính yếu tố VIII trong
máu giảm tuy nhiên nhiều trường hợp hoạt tính yếu tố VIII không giảm hoặc
giảm ít. Có thể khẳng định chắc chắn người phụ nữ mang gen bệnh, nếu
người đó có bố hoặc có hơn 2 con trai bị Hemophillia A . Người phụ nữ có
nguy cơ cao mang gen bệnh nếu người đó có 1 con trai bị bệnh Hemophillia A
hoặc là con gái của người mẹ mang gen bệnh; hoặc là chị em con dì với người
bị bệnh Hemophillia A [2]. Việc phát hiện người lành mang gen bệnh là cơ sở
khoa học cho công tác tư vấn di truyền, chẩn đoán trước sinh và chẩn đoán
tiền làm tổ (PGD), giúp ngăn ngừa sinh ra những đứa trẻ bị bệnh HA[5], tăng
hiệu quả trong tác phòng ngừa bệnh tật đồng thời nâng cao chất lượng chăm
sóc sức khỏe cộng đồng.


2

Ở Việt Nam, đã có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh Hemophillia A
như nghiên cứu đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng, tần suất mắc bệnh và đánh
giá hiệu quả điều trị bệnh bằng các chế phẩm thay thế [6],[7],[2],nghiên cứu
phát hiện người lành mang gen bệnh bằng phân tích một số yếu tố đông máu;
nghiên cứu phát hiện đột biến gen và phát hiện người lành mang gen bệnh sử
dụng các kỹ thuật sinh học phân tử... Cho đến nay, khoảng hơn 1000 đột biến
trên gen F8 đã được báo cáo. Với nhiều loại đột biến khác nhau như: đột biến
điểm, đột biến xoá đoạn, đột biến đảo đoạn…[8].Việc phát hiện người lành
mang gen bệnh thường được thực hiện bằng kỹ thuật phát hiện đột biến trực
tiếp trên gen F8 dựa vào đột biến chỉ điểm của người bệnh . Tuy nhiên do cấu
trúc gen FVIII lớn nên một số trường hợp không phát hiện được hoặc việc
phát hiện đột biến chỉ điểm gặp khó khăn, trong khi đó kỹ thuật phân tích gián
tiếp lại có thể phát hiện được người lành mang gen dựa vào xác định allele
đột biến. Kỹ thuật Microsatellite DNA là một trong các kỹ thuật phát hiện gián
tiếp được phát triển dựa trên kỹ thuật PCR cổ điển, bằng việc sử dụng các cặp
mồi có gắn huỳnh quang để khuếch đại vùng trình tự lặp lại ngắn STR (short
tandem repeat), sản phẩm PCR được điện di trên hệ thống máy giải trình tự gen
để phát hiện allele đột biến. Hiện nay ở Việt Nam, phát hiện người lành mang
gen bệnh hemophilia A bằng phương pháp gián tiếp sử dụng kỹ thuật
Microsatellite DNA vẫn chưa được triển khai. Xuất phát từ thực tế đó đề tài:
“Xác định người lành mang gen bệnh Hemophillia A bằng kỹ thuật
Microsatellite DNA” được tiến hành với 2 mục tiêu sau:
1. Xây dựng quy trình xác định người lành mang gen bệnh hemophillia A
bằng kỹ thuật Microsatellite DNA.
2. Xác định người lành mang gen bệnh hemophillia A bằng kỹ thuật
Microsatellite DNA trên các thành viên gia đình người bệnh.


3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm bệnh Hemophilia A
1.1.1. Những đặc điểm chung
1.1.1.1. Định nghĩa
Bệnh máu khó đông (Hemophilia) là một bệnh di truyền do thiếu hụt
hoặc bất thường chức năng của các yếu tố đông máu trong huyết tương: thiếu
hụt yếu tố VIII gây bệnh hemophilia A; thiếu hụt yếu tố IX gây bệnh
hemophilia B; thiếu hụt yếu tố XI gây bệnh hemophilia C. Bệnh hemophilia A
là bệnh rối loạn đông máu di truyền hay gặp nhất [9],[10].
1.1.1.2. Lịch sử nghiên cứu
 Từ thời kỳ cổ đại loài người đã biết đến bệnh máu khó đông, tuy nhiên
không có tên gọi chính thức cho nó. Hemophilia đựợc ghi nhận lần đầu tiên từ
thế kỉ thứ 2 khi các giáo sĩ Do thái cắt bao qui đầu cho trẻ em và nhận thấy có
một số trẻ trai bị chảy máu lâu cầm. Bác sỹ người Ả rập- Albucasis cũng miêu
tả những đứa trẻ bị chết do chảy máu vì những vết thương nhỏ.Từ năm 1803 1837các nhà khoa học đã phát hiện cơ chế di truyền lặn, liên quan đến nhiễm
sắc thể giới tính X và nhận thấy chỉ có nam giới mắc bệnh và không có khả
năng truyền bệnh cho con trai, người mẹ mang gen bệnh và truyền bệnh cho
con trai mình.
 Bệnh hemoliphia còn được biết đến như căn bệnh của hoàng gia vì nữ

hoàng Anh Victoria (1838-1901) mang gen bệnh này và truyền bệnh cho
nhiều Hoàng Gia khác[11].
 1872: William Leg mô tả chi tiết về đặc điểm lâm sàng bệnh Hemophillia.
 1893: Xác định thời gian đông máu kéo dài ở bệnh nhân Hemophillia.
 1937: Thiếu hụt yếu tố VIII được xác định là nguyên nhân bệnh Hemophila


4

 Năm 1944, Pavlosky nghiên cứu ở Buenos Aires cho thấy máu của
một bệnh nhân Hemophillia A có thể điều trị triệu chứng rối loạn đông máu
của bệnh nhân Hemophillia khác và ngược lại, khi tình cờ ông gặp hai bệnh
nhân bị thiếu hụt hai protein khác nhau - yếu tố VIII và yếu tố IX [12].
 1952: Yếu tố IX được xác định, phân biệt 2 loại Hemophillia A và B.
 1971: Hemophillia được phân biệt với bệnh von Willebrand.
 1982: Trình tự của gen yếu tố VIII được xác định
 1984: Gen yếu tố IX được giải mã.
Những phát hiện này cho phép chẩn đoán chính xác và xây dựng cơ sở
khoa học cho việc điều trị bệnh rối loạn đông máu di truyền.
1.1.1.3. Dịch tễ học bệnh Hemophillia A
Theo thống kê của tổ chức Hemophillia thế giới (WFH), hiện nay có
khoảng 250.000 người bệnh mắc bệnh Hemophillia và chỉ có khoảng 50.000
được điều trị đặc hiệu[13]. Tỷ lệ mắc bệnh Hemophillia A gần giống nhau ở
các vùng địa lý, các nước, các chủng tộc, tần suất mắc bệnh chung khoảng 30100/1.000.000 dân [14]. Tần suất mắc bệnh Hemophillia A là 1/4000 
1/5.000 trẻ trai [15],[16].
Tại Việt Nam, theo những thống kê không đầy đủ hiện tại có khoảng
6000 người bệnh Hemophillia trong đó chỉ có khoảng 20-30% được phát hiện
và điều trị. Số liệu điều tra những năm 19941996 về tình hình bệnh
Hemophillia ở miền Bắc Việt Nam cho thấy tỷ lệ bệnh Hemophillia là
2560/1.000.000 dân [15].
Hiện nay trên toàn quốc mới có khoảng 2.200 (chiếm gần 40%) người
bệnh được phát hiện và chăm sóc thường xuyên. Như vậy, tỷ lệ người bệnh
chưa được chẩn đoán và điều trị vẫn còn ở mức cao [17]. Tại Trung tâm
Hemophillia, Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương đang quản lý và điều


5

trị khoảng 1.200 người bệnh, trong đó bệnh Hemophillia A chiếm 85%, bệnh

Hemophillia B chiếm 13,16% và còn lại là những người bệnh bị các bệnh rối
loạn đông máu khác. Trung bình mỗi ngày có từ 80 đến 100 người bệnh tới
điều trị nội và ngoại trú [17],[4].
1.1.2. Chẩn đoán bệnh Hemophillia A
1.1.2.1. Chẩn đoán xác định bệnh Hemophillia A
- Tiền sử gia đình có người mắc bệnh.
+ Triệu chứng lâm sàng:
Bệnh Hemophillia đặc trưng bởi thời gian đông máu kéo dài và tăng
nguy cơ chảy máu. Biểu hiện lâm sàng chủ yếu là xuất huyết. Xuất huyết có
thể tự nhiên hoặc sau chấn thương nhẹ. Đặc điểm xuất huyết là các đám bầm
máu dưới da, tụ máu trong cơ, chảy máu ở các khớp[18],[19],[9].
Người mắc bệnh Hemophilia thường bị chảy máu khó cầm ở nhiều bộ
phận của cơ thể với các hình thức:
 Máu chảy khó cầm ở vết thương: đứt tay, chân, nhổ răng, bầm tụ máu
khi bị ngã;
 Khối máu tụ ở khớp, ở cơ: thường xuất hiện nhiều lần có tính lặp lại
ở một cơ, một khớp;
 Chảy máu ở niêm mạc: đái máu, đi ngoài ra máu, chảy máu chân
răng, chảy máu mũi.
+ Vị trí chảy máu:
 Nhiều nhất là tụ máu khớp trong đó khớp gối là hay gặp nhất rồi đến
khớp khuỷu, khớp cổ chân và khớp háng. Đây là loại chảy máu nguy hiểm vì
khi tái phát nhiều lần gây ra viêm khớp, biến dạng khớp.
 Khối máu tụ trong cơ và dưới cũng thường gặp và xuất hiện tự nhiên
hoặc sau chấn thương. Những cơ hay bị chảy máu như: cẳng chân, đùi, cánh
tay. Nếu không được điều trị sớm có thể gây hoại tử cơ hoặc gây liệt.


6
 Chảy máu vị trí khác : Bệnh nhân Hemophillia rất dễ bị chảy máu

nhưng hiếm gặp xuất huyết dưới da. Chảy máu từ vết cắt sâu hoặc xước da có
thể kéo dài và hồi phục sau vài ngày mà không cần điều trị. Chảy máu miệng,
lợi và mũi cũng hay gặp. Có thể xuất huyết tiêu hoá và đái máu.

Hình 1.1. Các hình ảnh biểu hiện bệnh Hemophillia A
(Nguồn:www.hemoviet.org.vn)
a. Biến dạng khớp do Hemophilia A

b. Tụ máu ở cơ và dưới

da
c. Tụ máu khớp khủy tay.

d. Xuất huyết niêm

mạc
-+ Dựa vào xét nghiệm cận lâm sàng:
+ Thời gian máu chảy kéo dài, thời gian đông máu kéo dài có thể hơn 1
giờ; chất lượng cục máu đông kém; thời gian Howel kéo dài…


7

+ Định lượng yếu tố VIII (FVIII) giảm hoặc không có.
+ Xét nghiệm DNA phát hiện đột biến gen F8.
+ Yếu tố Von- Willebrand bình thường.
+ Số lượng tiểu cầu bình thường.
1.1.2.2. Chẩn đoán thể bệnh Hemophillia A theo mức độ yếu tố VIII
Bình thường nồng độ FVIII ở người là 200 ng/ml. Trường hợp bị bệnh,
lượng yếu tố VIII giảm dưới 30%.

Nức độhường nồng
Mức độ

độ FVIII ở người

Biểu hiện chảy máu

là 200 ng
Chảy máu trong cơ, khớp (gối,
Nặng
(Chiếm 70%)

khuỷu, mắt cá).
<1% (<0.01)

Chảy máu 1-2 lần/ tuần
Chảy máu không cần lý do.
Chảy máu sau mổ, vết thương
nặng, nhổ răng.

Trung bình
(Chiếm 15%)

Chảy máu 1 lần/ tháng.

1-5% (0.01-0.05)

Hiếm khi chảy máu mà không
lý do

Nhẹ
(Chiếm 15%)

Thường không chảy máu, trừ
> 5-30% (0.05-0.3)

khi mổ hay vết thương nặng.

1.1.2.3. Chẩn đoán phân biệt:
- Bệnh Von-Willebrand:
Bệnh di truyền nhiễm sắc thể thường nên gặp ở cả nam và nữ.
Chủ yếu chảy máu ở niêm mạc.


8

Thời gian máu chảy kéo dài.
Yếu tố VIII: C thấp hơn 30%.
Yếu tố vWF: Ag giảm.
Ngưng tập tiểu cầu giảm.
- Hemophillia mắc phải:
 Cơ chế bệnh sinh: do cơ thể người trưởng thành sinh ra tự kháng thể
gây bất hoạt FVIII.
 Bệnh gặp ở độ tuổi trung niên, gặp cả ở nam và nữ.
 Biểu hiện chính là xuất huyết ở da và mô mềm; có thể đái ra máu, xuất
huyết dạ dày-ruột, xuất huyết hậu sản kéo dài; ít gặp xuất huyết ở khớp.
 Xét nghiệm: APTT kéo dài, FVIII thấp hơn 30%, có chất ức chế
FVIII theo thời gian; số lượng tiểu cầu bình thường.
- Những rối loạn di truyền khác gây kéo dài APTT: bao gồm giảm yếu tố
XI, XII, prekallikrein và kininogen trọng lượng phân tử cao, phân biệt dựa

vào định lượng yếu tố VIII, IX.
- Bệnh lý lưu hành kháng yếu tố VIII và yếu tố IX: trong một số bệnh tự
miễn (lupus) APTT kéo dài, nồng độ yếu tố VIII, IX giảm. Phân biệt bằng
cách trộn huyết tương người bệnh với huyết tương người bình thường, APTT
không được cải thiện trong trường hợp có kháng đông lưu hành.
- Rối loạn đông máu do tăng tiêu thụ yếu tố đông máu: gặp ở cả nam và
nữ, thường là biểu hiện rối loạn đông máu do một số bệnh khác như nhiễm
trùng, chấn thương nặng; ngoài giảm yếu tố VIII, các yếu tố khác cũng giảm
do tăng tiêu thụ.
1.1.3. Điều trị bệnh Hemophillia A
*. Nguyên tắc chung
- Trong điều kiện hiện nay nguyên tắc điều trị là cầm máu khi có chảy
máu và tụ máu.


9

- Chảy máu cấp nên được điều trị càng sớm càng tốt, tốt nhất là sau 2 giờ.
- Yếu tố đông máu cần được bổ sung để có thể đạt được hoạt tính trong
huyết tương đủ để cầm chảy máu.
* Điều trị đặc hiệu
Việc điều trị thay thế phụ thuộc rất nhiều vào tính chất của các chế phẩm
máu có sẵn và thời gian bán hủy của yếu tố đông máu. Thời gian bán hủy của
yếu tố VIII là 8-12 giờ, thời gian bán hủy có thể rút ngắn nếu người bệnh chảy
máu nhiều hoặc có chất ức chế.
a/ Huyết tương tươi đông lạnh
Được chiết tách từ máu tươi toàn phần trong thời gian < 6 tháng kể từ
khi lấy ra khỏi cơ thể người cho, sau đó bảo quản ở nhiệt độ - 30 0 C. Nồng độ
FVIII trong huyết tương tươi đông lạnh vào khoảng 0,6 – 0,8 đơn vị/ml [11].
Vì vậy, để truyền cho bệnh nhân Hemophillia A thì thể tích đưa vào lớn, nguy

cơ lây nhiễm các bệnh truyền qua đường máu cao [20]
b/ Tủa lạnh yếu tố VIII (tủa VIII, cryoprecipitate)
Được điều chế bằng cách làm tan huyết tương tươi đông lạnh ở 40C, ly tâm
lấy tủa và hòa tan trong 10- 15 ml huyết tương. Tuy nhiên, tủa lạnh FVIII cũng
chưa tinh khiết, còn nguy cơ lây nhiễm các bệnh truyền qua đường máu[21].
c/ Yếu tố VIII cô đặc
Được sản xuất từ huyết tương sau đó cô đặc và bất hoạt virus, có thời
gian bán hủy là 12-18 giờ. Các sản phẩm này đã hạn chế được việc lây lan các
bệnh truyền máu qua đường máu, tuy nhiên chưa loại trừ được 100% các
nguy cơ này. Sản phẩm FVIII cô đặc dễ bảo quản nhưng quá trình sản xuất
đòi hỏi phải có trang thiết bị, giá thành sản phẩm cao.
d/ Yếu tố VIII tái tổ hợp
Được sản xuất từ kháng thể đơn dòng. Sản phẩm có hiệu quả cao trong
điều trị do có hàm lượng FVIII cao. Điều trị an toàn, không có khả năng lây


10

truyền các bệnh qua đường máu. Tuy nhiên, sản phẩm có giá thành khá cao,
bảo quản khó khăn (ở -200C) nên chế phẩm này chỉ có sẵn ở những trung tâm
hay bệnh viện lớn
e/ Liệu pháp điều trị gen
Phương pháp điều trị gen đã được nghiên cứu thông qua quá trình
chuyển đoạn DNA mã hóa đoạn gen FVIII vào cơ thể người bệnh. Điều trị
bệnh ưa chảy máu bằng liệu pháp gen hứa hẹn nhiều lợi ích vì bệnh được gây
ra bởi khiếm khuyết gen, có thể điều trị để biến đổi một dạng bệnh từ thể
nặng thành thể nhẹ của bệnh ưa chảy máu. Sử dụng liệu pháp gen có thể kích
hoạt lên đến 150% hoạt động của FVIII [22] .Với nguồn cung cấp liên tục của
các sản phẩm gen, liệu pháp gen có thể chữa khỏi bệnh ưa chảy máu. Hiện
nay các nghiên cứu thực nghiệm trên chuột và chó đã chứng minh sự thành

công khi sử dụng liệu pháp gen điều trị [23]. Các nghiên cứu thực nghiệm lâm
sàng đang được tiến hành.
* Dự phòng chảy máu
- Cần hết sức tránh chấn thương.
- Tránh dùng các thuốc ảnh hưởng đến chức năng tiểu cầu, đặc biệt là
acetylsalicylic acid (Aspirin). Để giảm đau cho người bệnh có thể dùng
paracetamol hoặc paracetamol kết hợp codein.
- Tránh tiêm bắp, châm cứu.
- Tiêm văc xin đầy đủ, đặc biệt tiêm phòng viêm gan virut B và A (không
dùng đường tiêm bắp mà chuyển sang tiêm dưới da).
- Tập thể dục hàng ngày để tăng thể lực, tăng sức mạnh cơ bắp, giúp
khớp hoạt động tốt hơn và giúp hạn chế chảy máu cơ khớp. Tránh các hoạt
động thể thao mang tính chất đối kháng như boxing, đá bóng, đấu vật. Nên
tập bơi, đi bộ và đi xe đạp.
1.1.4. Cơ chế phân tử bệnh Hemophillia A


11

Bệnh Hemophillia A (còn gọi là bệnh máu khó đông) là một bệnh di
truyền do thiếu hụt hoặc bất thường chức năng của yếu tố đông máu huyết
tương - yếu tố VIII. Từ năm 1984, nghiên cứu của Vehar và cộng sự đã cho
thấy những hiểu biết đầy đủ về cấu trúc phân tử gen F8 tổng hợp protein yếu
tố VIII, mở đường cho các nghiên cứu về cơ chế phân tử bệnh Hemophillia A
và các dạng đột biến gen F8 gây bệnh.
1.1.4.1. Vai trò yếu tố VIII trong đông cầm máu
Bình thường yếu tố VIII có 3 hoạt tính:
+ Điều chỉnh thời gian đông huyết tương đó là đặc trưng của VIII: C;
+ Bị B chỉnh thời gian đông huyết tương đó là đặc trưng của VIII: C;
otein yếu tố VIII, mở đường cho các nghiên cứu về cơ chế phân tử bệnh

Hemophillia
+ Điều chỉnh thời gian chảy máu ở người bị Willerbrand gọi là hoạt
tính VIII – R: WF (Factor VIII Related Willebrand).
Càng ngày yếu tố VIII càng được coi như 1 chất trung gian quan trọng
trong các phản ứng giữa tiểu cầu và thành mạch, do đó nó có vai trò gây ra xơ
vữa động mạch.
Hoạt tính VIII: C ứng với yếu tố được gọi là kháng Hemophillia A là yếu
tố được kiểm soát bởi gen nằm trên thể nhiễm sắc X. Đây là yếu tố thu hoạch
được khi tủa lạnh, giúp vào việc hoạt hóa yếu tố X bởi yếu tố IXa trong đông
máu nội sinh, yếu tố này bị trung hòa bởi một kháng thể lưu hành có ở một số
người bị Hemophillia A[24].
Ho4]IN

EN.CITE


:

Ag

khi

tiêm

VIII

tinh

khite><Author>EdHemophillia A thì sliaêm VIII tinh khite><Author>E :

C. ì sliaêm VIII tiHemophillia A kháng nguyên VIII – R : Ag vng nguyên
VIII – Rkhite><Author>Edgington : C, VIII – R : Ag không cùng có m –
Rkhite><Author>Edgingtoau. Ngưuthor><Year>1973</Year><RecNum>


12

– R : Ag đưông cùng có m – Rkhite><Author>Edgingtoau. Ngưuthor>
[25].
Hoạt tính của Von – Willebrand hay yếu tố VIII – R: WF đó là 1 yếu tố
huyết tương mà thiếu nó được coi như do một sự thiếu hụt của tiểu cầu hoặc
thành mạch [26].
Cả 3 yếu tố trên tạo thành một phức hệ đại phân tử, dùng enzym để phân
lập có thể tách được thành những đơn vị có hoạt tính VIII – R : Ag, VIII – R :
WF còn VIII : C thì lượng ít hơn.
Đối với Hemophillia A người ta biết rằng ở những người bệnh này vị trí
kháng nguyên của yếu tố VIII vẫn bình thường vì nó tuy phản ứng với kháng
thể nhưng vị trí hoạt tính thì tổng hợp không bình thường, có thể là do một
acid amin thiếu hoặc bị thay thế hoặc bị ức chế [27].


13

Hình 1.2. Sơ đồ đông máu theo con đường nội và ngoại sinh
1.1.4.2. Cơ chế phân tử bệnh Hemophillia A
* Vị trí và cấu trúc của gen mã hóa yếu tố VIII
Gen quy định tổng hợp yếu tố VIII là một trong những gen lớn nhất
của cơ thể người,nằm ở vị trí Xq28 trên NST giới tính X, có kích thước dài
186 Kb gồm 26 exon, trong đó 24 exon có kích thước từ 62 bp đến 262 bp và
2 exon lớn nhất là exon 14 (3106 bp) và exon 26 (1958 bp), mã hóa 9 Kb

mRNA. Hiện đã biết có hơn 1300 đột biến trong gen này, hầu hết là mất,
thêm, đảo đoạn trong gen. Người có đột biến gen F8 biểu hiện thiếu hoặc
không tổng hợp được yếu tố VIII, làm rối loạn quá trình đông máu biểu hiện
thành triệu chứng lâm sàng của bệnh Hemophillia A [28],[29],[30],[31].

Hình 1.3. Cấu trúc gen và protein yếu tố VIII
(Nguồn: Ye Jee Shim, Kun Soo Lee (2010)
A) Vị trí gen yếu tố VIII trên NST giới tính X. B) Gen F8 bao gồm 25 intron
và 26 exon trong đó exon 26 mã hóa cho vùng 3’UTR; vùng intron 22 chứa 2


14

gen F8A và F8B. C) Phân tử mRNA được phiên mã có kích thước 9 kb. D)
Protein yếu tố VIII dạng tiền thân có 2332 acid amin, gồm vùng dẫn tín hiệu
(SP), các vùng chức năng lớn A1, A2, B, A3, C1, C2, các vùng chức năng xen
kẽ a1, a2, a3. Các yếu tố thuộc hệ thống đông máu như yếu tố X, Xa, IXa,
vWF, Phospholipid tương tác với yếu tố VIII tại những vị trí acid amin nhất
định. E và F) Các bước hoàn thiện phân tử protein F8 thành một yếu tố VIII
hoàn chỉnh được hoạt hóa.
* Protein do gen F8 mã hóa:
Protein yếu tố VIII gồm 2332 acid amin, trọng lượng phân tử
khoảng 300 kD. Bản chất protein yếu tố VIII là polypeptid có cấu trúc A1A2-B-A3-Cl-C2, gồm hai chuỗi: chuỗi nặng là đoạn A1-A2-B có kích thước
200 kD, chuỗi nhẹ là đoạn A3-C1-C2 có kích thước 80 kD. Cấu trúc của phức
hợp này được giữ ổn định nhờ sự tương tác giữa các liên kết ưa nước và kỵ
nước với yếu tố von Willebrand (vWF - là một kháng nguyên liên quan đến
yếu tố VIII) và Ca2+. Chuỗi nặng có đầu cuối là N, gồm các domain A 1-A2-B,
chuỗi nhẹ có đầu cuối là C, gồm các domain A 3-C1-C2. Vùng B được mã hóa
bởi một exon lớn và không có sự tương đồng với bất kỳ gen nào đã biết. Khi
thủy phân hoàn toàn domain B tạo thành asparagin, serin và threonin. Vùng B

không cần cho chức năng của protein yếu tố VIII và sau quá trình dịch mã,
domain B bị cắt khỏi chuỗi nặng của protein yếu tố VIII [30],[29],[32].
Protein yếu tố VIII được sản xuất chủ yếu từ tế bào gan, ngoài ra còn
được sản xuất tại thận, lách. Hàm lượng protein yếu tố VIII trong huyết tương
thấp (20-50 mg/ml). Đầu tiên, protein yếu tố VIII được tổng hợp như một
chuỗi đơn gồm 2351 acid amin ở lưới nội bào, sau đó được chuyển vào thể
Golgi. Tại đây đã xảy ra các phản ứng để hình thành phân tử của yếu tố VIII.
Nó được lưu thông dưới dạng tiền “cofactor” không hoạt động [33].
Protein yếu tố VIII được hoạt hóa nhờ quá trình phân giải bởi thrombin
hoặc yếu tố Xa với nguyên lý hoạt động cắt protein yếu tố VIII ở vị trí Arg


15

372 (chỗ nối A1-A2), vị trí Arg 740 (chỗ nối A2-B) và vị trí Arg 1689 (chỗ nối
B-A3). Khi vùng A2 tương tác với phức hợp A1/A3-C1-C2 thì protein yếu tố
VIII thực sự được hoạt hóa [34],[35].
* Các dạng đột biến gen F8 gây bệnh Hemophillia A
Có nhiều dạng đột biến gen F8 gây bệnh Hemophillia A. Nghiên cứu
của Oldenburg và cộng sự đã chỉ ra rằng các dạng đột biến điểm (thay thế
nucleotid gây đột biến sai nghĩa hoặc vô nghĩa) chiếm tỷ lệ cao nhất
(47,5%) tiếp đến là dạng đột biến đảo đoạn gồm đảo đoạn intron 1 và
intron 22 (36,7%), còn lại là đột biến xóa đoạn gen chiếm khoảng 10 –
15%. Tùy thuộc vào kiểu và vị trí đột biến trên gen F8 mà gây ra các thể
bệnh nặng nhẹ khác nhau [29],[36],[37],[38].
+ Đột biến điểm
Đột biến điểm gen F8 khi có sự thay đổi nucleotid trên gen, gây đột biến
vô nghĩa tạo mã kết thúc hoặc đột biến mất nucleotid gây lệch khung dịch mã
dẫn đén không tổng hợp hoặc tổng hợp protein không có chức năng. Nghiên
cứu của Shima và cộng sự chỉ ra rằng đột biến thay thế Arginin thành Histidin

tại vị trí 372 gây biến đổi vị trí cắt của thrombin và làm quá trình hoạt hóa
protein yếu tố VIII bị rối loạn, hoạt tính protein yếu tố VIII giảm mạnh còn 3
 5% [39]. Năm 2000, Jacquemin và cộng sự đã chứng minh đột biến thay thế
Serin thành Tyrosin tại vị trí 2119 (vùng C 2) làm giảm đột ngột khả năng
tương tác giữa protein yếu tố VIII và yếu tố vWF, dạng đột biến này thường
gặp ở thể nhẹ và trung bình. Điều đáng chú ý là mặc dù các đột biến nằm rải
rác trên 26 exon mà không tập trung vào một vùng hotspot, Goodeve A.C. và
Jochen Graw chỉ ra phần lớn các đột biến điểm đều có xu hướng xuất hiện ở
đoạn trình tự CpG gây thay thế acid amin Arginin thành một acid amin khác
hoặc tạo mã kết thúc, ví dụ: tại vị trí Arg 527, Arg531, Arg593, Arg 1689,
Arg1781, Arg1941, Arg2209, Arg2304 …[33],[38].


16

Theo thống kê, khoảng gần 60% các đột biến điểm ảnh hưởng tới
acid amin Arginin, phần lớn các người bệnh mang đột biến này đều ở thể
nặng [29],[38].
Do phần lớn các đột biến gây bệnh là đột biến điểm vì vậy cho đến nay
phương pháp giải trình tự gen được coi là một tiêu chuẩn vàng trong việc phát
hiện các đột biến gen F8 [39].
+ Đột biến đảo đoạn
Mặc dù không có vai trò trong việc mã hóa hay tham gia vào quá
trình hoạt hóa protein yếu tố VIII nhưng các vùng intron của gen F8 lại
là tác nhân chính gây ra các dạng đột biến đảo đoạn ở người bệnh
Hemophillia A thể nặng [40].
Dạng đột biến đảo đoạn phổ biến nhất là đảo đoạn intron 22, chiếm hơn
50% các thể bệnh nặng. Cách gen F8 một đoạn 500kb về phía đầu mút
telomere, nhiễm sắc thể X tồn tại hai vùng int22h2 và int22h3 có trình tự
tương đồng đến 99,9% với một đoạn thuộc intron 22 gen F8 (vùng int22h1).

Quá trình tái tổ hợp tương đồng giữa vùng int22h1 và một trong hai vùng
int22h2 và int22h3 chia cắt gen F8 thành 2 đoạn (exon 1-22 và exon 23-26)
cách nhau 400kb gây bất hoạt hoàn toàn gen mã hóa protein yếu tố VIII [32],
[40].
Hiện tượng tái tổ hợp tương tự cũng diễn ra giữa int1h1và vùng trình
tự tương đồng int1h2 cách gen F8 một đoạn 140kb về phía đầu mút
telomere gây nên dạng đột biến đảo đoạn intron 1 xuất hiện ở 5% các thể
bệnh nặng [32],[40],[41],[42].
+ Đột biến mất đoạn của gen yếu tố VIII
Đột biến mất đoạn lớn chiếm 2-5% người bệnh Hemophillia A thể nặng.
Có thể mất 1 exon hoặc mất toàn bộ gen. Cơ chế phân tử của dạng đột biến
này đã được kết luận là do quá trình tái tổ hợp dẫn đến hiện tượng lặp lại Alu.


17

Đột biến chèn đoạn lớn và hiện tượng Alu làm đứt gãy gen F8 và gây bệnh
Hemophillia A thể nặng. Xóa đoạn và chèn đoạn nhỏ cũng thường thấy trong
Hemophillia A thể nặng, trong đó thay đổi 1-55 nucleotid. Phổ biến nhất là
xóa hoặc chèn nucleotid Adenin vào exon 14, thường xảy ra trong vùng từ
c.3637 đến c.4379 [43].
+ Các dạng đột biến khác
Đột biến tại vị trí nối (splice site) và vùng promoter của gen được phát
hiện ở một số người bệnh [39].
Khi gen F8 bị đột biến, tế bào giảm hoặc mất khả năng tổng hợp protein
yếu tố VIII gây nên bệnh Hemophillia A. Đối với Hemophillia A vị trí kháng
nguyên trên protein yếu tố VIII vẫn bình thường nhưng các vị trí hoạt tính
thì bị thay đổi, thậm chí có thể chỉ là do mất, thêm hoặc thay thế một acid
amin trên chuỗi polypeptid làm cho các yếu tố đông máu huyết tương (IX,
X, ion Ca2+, Cu2+) không có vị trí bám trong quá trình đông máu hoặc yếu tố

vWF, X và các phân tử phospholipid tiểu cầu không có vị trí để bám vào khi
yếu tố VIII được hoạt hóa [44],[45].
1.1.3.3. Cơ chế di truyền bệnh Hemophillia A
Hemophillia A là bệnh di truyền lặn liên quan đến giới tính, bệnh là
hậu quả của bất thường phân tử protein do đột biến gen cấu trúc nằm trên
thể nhiễm sắc X. Nam giới có cặp nhiễm sắc thể giới tính XY, vì vậy 1
phần thể nhiễm sắc X không có sự tương đồng trên thể nhiễm sắc Y, nên
khi gen nằm trên đoạn đó (gen chỉ đạo tổng hợp yếu tố chống Hemophillia A)
bị thương tổn, đã biểu hiện bệnh. Ngược lại ở nữ giới, tất cả nhiễm sắc X
này có thể nhiễm sắc X kia tương đồng (cặp thể nhiễm sắc giới tính của nữ
là XX) nên phụ nữ mang một thể nhiễm sắc X đột biến vẫn không biểu hiện
bệnh vì đã được bù trừ. Nam giới bị bệnh tức là mang trong mình nhiễm


18

sắc thể X bị thương tổn, có thể đó là do hậu quả của một quá trình di truyền
phả hệ hoặc do đột biến.

Hình 1.4. Kiểu gen và kiểu hình của bố mẹ và thế hệ con
Cơ chế di truyền của bệnh:
1/ Bố bị bệnh, mẹ bình thường: 100% con gái là người mang gen bệnh
(XHX) và 100% con trai bình thường (XY).


19

2/ Mẹ mang gen bệnh, bố bình thường: 50% số con gái sẽ là người
mang gen bệnh ( XHX), 50% con gái bình thường (XX), 50% con trai bị bệnh
(XHY) và 50% con trai bình thường (XY).