NGHIÊN cứu đặc điểm THỰC vật và THÀNH PHẦN hóa học THEO ĐỊNH HƯỚNG tác DỤNG CHỐNG OXY hóa của cây “HỒNG RỪNG” THU hái tại SAPA, lào CAI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VĂN THÙY LINH

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ
THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH
HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA
CỦA CÂY “HỒNG RỪNG” THU HÁI
TẠI SAPA, LÀO CAI

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI – 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VĂN THÙY LINH

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ
THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH
HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA
CỦA CÂY “HỒNG RỪNG” THU HÁI

TẠI SAPA, LÀO CAI
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU - DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN
MÃ SỐ: 8720206
Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Mạnh Tuyển

HÀ NỘI - 2019


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này, em nhận được rất nhiều
sự quan tâm, động viên và giúp đỡ tận tình từ thầy cô, gia đình và bạn bè. Nhân dịp
này, em xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc đến:
PGS. TS. Nguyễn Mạnh Tuyển
Thầy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi để
em có thể hoàn thành luận văn.
Đồng thời em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: PGS. TS. Trần Thế Bách,
TS. Nguyễn Văn Tài đã hỗ trợ cho em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô, các bạn và anh chị tại bộ môn Dược học cổ
truyền, bộ môn Thực vật - Trường đại học Dược Hà Nội, bộ môn Hóa thực vật I, bộ
môn Dược lý - Viện Dược Liệu, Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật - Viện Hàn lâm
khoa học và công nghệ Việt Nam, Trạm kiểm lâm Núi xẻ - Sapa, Vườn quốc gia
Hoàng Liên đã hỗ trợ em trong suốt quá trình nghiên cứu.
Xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo, cùng toàn thể các thầy
cô giáo, các cán bộ Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện để em có thể lĩnh
hội những kiến thức quý giá về ngành Dược trong thời gian qua.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, người thân đã
luôn sát cánh, động viên em hoàn thành luận văn này.
Hà Nội, ngày 30 tháng 3 năm 2019.
Học viên

Văn Thùy Linh


DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt
C-NMR

13

Tên đầy đủ
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13

H-NMR
ALAT
ASAT
BuOH
CAT
CC
D.
DPPH
ESI-MS

(Carbon (13) Nuclear magnetic resonance)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
Alanin aminotransferase
Aspartat aminotransferase
Butanol
Catalase
Sắc ký cột (Column chromatography)
Diospyros

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
Phổ khối lượng ion hóa tia điện

EtOAc
EtOH
GSH
GSH - Px
IC50
IR
LOP
MBC
MDA
MIC
MS
NMR
ROS/RNS/RC

(Electrospray ionization mass spectrometry)
Ethyl acetat
Ethanol
Glutathion
Glutathion peroxidase
Nồng độ ức chế 50%
Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy)
Lipid Oxidation Product
Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu
Malondialdehyd
Nồng độ ức chế tối thiểu
Phổ khối (Mass Spectrometry)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance)

Reactive oxygen species/Reactive nitrogen species/Reactive

N
UV-VIS

chlorine species.
Phổ tử ngoại

1

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Tên viết tắt
CK
EDTA
HDL
LDL
MCF-7
NBT
SKLM

Tên đầy đủ
Creatin-kinase
Ethylenediaminetetraacetic acid
High-density lipoprotein
Low-density lipoprotein
Michigan Cancer Foundation-7
Nitro blue tetrazolium
Sắc ký lớp mỏng

SOD
TBA
TCA
TG

Superoxide dismutase
Tert-butyl alcohol
Trichloroacetic acid
Triglycerid

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN............................................................................................3
1.1. TỔNG QUAN CHI DIOSPYROS L.....................................................................3
1.1.1. Vị trí phân loại chi Diospyros L....................................................................3
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố.......................................................................3
1.1.3. Một số loài thuộc chi Diospyros L................................................................4
1.1.4. Tác dụng sinh học.......................................................................................10
1.1.5. Tổng quan về cây “Hồng rừng”..................................................................12
1.2. GỐC TỰ DO VÀ CHẤT CHỐNG OXY HÓA.................................................13
1.2.1. Gốc tự do....................................................................................................13
1.2.2. Chất chống oxy hóa....................................................................................14
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................15


2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU............................................................................15
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu..............................................................................15
2.1.2. Dụng cụ, hóa chất nghiên cứu.....................................................................15
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................................................16

2.2.1. Giám định tên khoa học và đặc điểm thực vật của cây nghiên cứu.............16
2.2.2. Nghiên cứu thành phần hóa học..................................................................17
2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu - đánh giá kết quả.............................................23
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.....................................................................24
3.1. VỀ THỰC VẬT...................................................................................................24
3.1.1. Đặc điểm thực vật.......................................................................................24
3.1.2. Giám định tên khoa học..............................................................................26
3.1.3. Đặc điểm vi phẫu thân và lá “Hồng rừng”..................................................26
3.1.4. Đặc điểm phần bột thân và lá “Hồng rừng”................................................29
3.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC, CHIẾT XUẤT VÀ SÀNG LỌC TÁC DỤNG
CHỐNG OXY HÓA IN VITRO CỦA CAO CÁC PHÂN ĐOẠN..........................31
3.2.1. Định tính sơ bộ một số nhóm chất hữu cơ chính trong lá “Hồng rừng”......31
3.2.2. Chiết xuất...................................................................................................36
3.2.3. Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa in vitro của cao các phân đoạn dịch chiết
bằng phương pháp dọn gốc tự do:.................................................................38
3.3. PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY
HÓA CỦA MỘT SỐ CHẤT TRONG PHÂN ĐOẠN ĐÃ LỰA CHỌN.................41
3.3.1. Phân lập......................................................................................................41
3.3.2. Xác định cấu trúc........................................................................................46
3.3.3. Thử tác dụng chống oxy hóa của các chất phân lập được bằng phương pháp
dọn gốc tự do................................................................................................51
Chương 4. BÀN LUẬN..............................................................................................55
4.1. VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT..............................................................................55
4.1.1. Đặc điểm về hình thái và giám định tên khoa học của loài nghiên cứu......55
4.1.2. Đặc điểm vi học của loài nghiên cứu..........................................................56
4.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC, CHIẾT XUẤT VÀ SÀNG LỌC TÁC DỤNG
CHỐNG OXY HÓA IN VITRO CỦA CAO CÁC PHÂN ĐOẠN..........................56
4.2.1. Định tính sơ bộ một số nhóm chất hữu cơ chính.............................................56
4.2.2. Chiết xuất...................................................................................................56

4.2.3. Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa in vitro của cao các phân đoạn dịch chiết
bằng phương pháp dọn gốc tự do..................................................................57
4.3. PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG
OXY HÓA IN VITRO CỦA MỘT SỐ CHẤT TRONG PHÂN ĐOẠN ĐÃ
LỰA CHỌN............................................................................................................... 58
4.3.1. Phân lập, xác định cấu trúc.........................................................................58
4.3.2. Thử tác dụng chống oxy hóa của các chất phân lập được bằng phương pháp
dọn gốc tự do................................................................................................61
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................63
KIẾN NGHỊ...............................................................................................................64
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1.

Thành phần hóa học của một số cây thuộc chi Diospyros L.......................5

Bảng 2.1.

Hỗn hợp phản ứng....................................................................................20

Bảng 3.1.

Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phương pháp hóa học.......34

Bảng 3.2.

Khối lượng các cao phân đoạn từ dịch chiết ethanol lá “Hồng rừng”.......38

Bảng 3.3.

Khả năng dọn gốc DPPH các cao chiết phân đoạn từ lá cây “Hồng rừng”.......38

Bảng 3.4.

Giá trị IC50 của các mẫu thử trên mô hình dọn gốc DPPH........................39

Bảng 3.5.

Khả năng dọn gốc Superoxide của cao chiết lá “Hồng rừng”...................39

Bảng 3.6.

Hoạt tính dọn gốc Superoxide của Quercetin...........................................40

Bảng 3.7.

Giá trị IC50 của các mẫu thử trên mô hình dọn gốc tự do Superoxide.......40

Bảng 3.6.

Khả năng dọn gốc DPPH các chất chiết phân đoạn từ lá “Hồng rừng”....52


Bảng 3.7.

Khả năng dọn gốc DPPH của Quercetin...................................................52

Bảng 3.8.

Khả năng dọn gốc Superoxide của các chất phân lập được......................53

Bảng 3.9.

Hoạt tính dọn gốc Superoxide của Quercetin...........................................53

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1.

Sơ đồ chiết xuất phân đoạn......................................................................18

Hình 3.1.

Đặc điểm cơ quan sinh dưỡng cây “Hồng rừng”......................................25

Hình 3.2.

Đặc điểm hoa lưỡng tính của cây “Hồng rừng”........................................25

Hình 3.3.

Đặc điểm hoa đực cây Hồng rừng............................................................26

Hình 3.4.

Đặc điểm quả và hạt “hồng rừng”............................................................26

Hình 3.5.

Vi phẫu thân “Hồng rừng”........................................................................27

Hình 3.6.

Vi phẫu lá “Hồng rừng”, phần gân lá.......................................................28

Hình 3.7.

Vi phẫu lá “Hồng rừng”, phần phiến lá....................................................29

Hình 3.8.

Ảnh bột thân “Hồng rừng”.......................................................................30

Hình 3.9.

Ảnh bột lá “Hồng rừng”...........................................................................31

Hình 3.10. Sắc ký đồ của cao toàn phần với hệ II ở các điều kiện quan sát..............35


Hình 3.11. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ lá loài.................................................37
Hình 3.12. Sắc ký đồ của cao EtOAc với hệ V ở các điều kiện quan sát....................42
Hình 3.13. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao EtOAc..............................................44
Hình 3.14. Sơ đồ phân lập chất từ cao phân đoạn EtOAc..........................................45
Hình 3.15. Cấu trúc hóa học của Quercetin................................................................46
Hình 3.16. Cấu trúc hóa học của Quercetrin..............................................................47
Hình 3.17. Cấu trúc hóa học của 4’-O-methyl myricetin...........................................48
Hình 3.18. Cấu trúc hóa học của 3-O-β-arabinofuranoside-4’-O-methoxy myricetin......50

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nước ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có điều kiện tự nhiên thuận
lợi cây cỏ phát triển rất đa dạng và phong phú. Ở Việt Nam, việc sử dụng thuốc có
nguồn gốc thảo dược đã có từ rất lâu đời, thuốc có nguồn gốc tự nhiên thường có
những ưu điểm độc tính thấp vừa có giá trị điều trị bệnh, vừa có giá trị bồi dưỡng,
phục hồi sức khỏe, tăng khả năng phòng trừ bệnh. Trên thế giới, các nhà khoa học hiện
đang chú trọng vào việc sàng lọc từ thiên nhiên để tìm ra các hoạt chất sinh học mới có
dược tính mạnh hơn, ít độc hơn. Và hiện nay, xu thế chung của toàn cầu là dùng những
loại thuốc có nguồn gốc thảo dược, thành phần từ tự nhiên để đảm bảo tính an toàn.
Năm 1954, bác sỹ Denham Harman là người đầu tiên nhận ra sự hiện hữu của
gốc tự do trong cơ thể với nguy cơ gây tổn thương tế bào. Gốc tự do có vai trò phân
hủy, tổng hợp hóa học thông qua bẻ gãy liên kết để tạo liên kết mới, làm sai lệch cấu
trúc và làm rối loạn thông tin trên những phân tử sinh học, vật chất di truyền tế bào.
Đây là những nguyên nhân gây nhiều bệnh lý: viêm, xơ vữa động mạch, sự thoái hóa
của hệ thần kinh, sự lão hóa của các cơ quan phủ tạng…
Chi Diospyros L thuộc họ Thị (Ebenaceae) là một chi lớn trên thế giới có hơn
500 loài, được phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới, đa dạng nhất là ở khu vực Đông
Nam Á, có một số loại thuộc Tây Á, Nhật Bản và Đông Nam nước Mỹ [12]. Ở Việt
Nam đã thống kê được 70 loài [5], trong đó có một số loài thuộc chi Diospyros L đã
được nghiên cứu trên thế giới với tác dụng chống oxy hóa, điều trị ung thư, tăng
cholesterol máu, hạ huyết áp, chống viêm, giảm đau….
Cây “Hồng rừng” là một trong những cây thuộc chi Diospyros L tồn tại và phát
triển tự nhiên trên địa bàn Lào Cai. Lá cây “hồng rừng” là một vị thuốc nam quý được
người dân địa phương sử dụng theo kinh nghiệm với mục đích điều trị các bệnh về gan
như: thanh lọc gan, hạ men gan, giải độc gan do rượu bia,... Với lợi thế về khí hậu, thổ
nhưỡng, tri thức bản địa của đồng bào dân tộc thiểu số về cây thuốc, ngoài việc sử
dụng rộng rãi các cây dược liệu quý có giá trị kinh tế như tam thất, đương quy, atisô,…

“Hồng rừng” cũng là một trong những cây được sử dụng làm thuốc trong thời gian gần
đây trên địa bàn tỉnh Lào Cai.

1


Do vậy, để góp phần nghiên cứu tạo cơ sở khoa học cho việc nâng cao giá trị sử
dụng của thuốc có nguồn gốc từ thảo dược chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu đặc
điểm vật và thành phần hóa học theo định hướng tác dụng chống oxy hóa của cây
“Hồng rừng” thu hái tại Sapa, Lào Cai” với mục tiêu sau:
1. Mô tả đặc điểm thực vật, vi học và giám định tên khoa học của cây “Hồng
rừng” thu hái tại Sapa, Lào Cai.
2. Nghiên cứu về thành phần hóa học, chiết xuất và sàng lọc tác dụng chống
oxy hóa in vitro của cao các phân đoạn dịch chiết lá cây “Hồng rừng”.
3. Phân lập, xác định cấu trúc và thử hoạt tính chống oxy hóa in vitro của một
số chất trong phân đoạn đã lựa chọn.

2


Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN CHI DIOSPYROS L.
1.1.1. Vị trí phân loại chi Diospyros L.
Theo hệ thống phân loại thực vật của Armen L. Takhtajan (2009) chi Diospyros
L có vị trí phân loại như sau: [1], [14].
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp Số (Dillenianae)
Liên bộ Đỗ quyên (Ericanae)
Bộ Thị (Ebenales)

Họ Thị (Ebenaceae)
Chi Diospyros L.
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố

 Đặc điểm thực vật
Cây gỗ hoặc cây bụi, rụng lá hoặc thường xanh lá. Lá mọc so le, nguyên [4]2.
Thỉnh thoảng có các vết mờ rải rác hoặc có các vết rỗ lớn [40].
Hoa thường đơn tính, khác gốc hoặc cùng gốc; hiếm khi lưỡng tính. Hoa đực
mọc thành xim ở nách lá; nhị từ 4 đến rất nhiều, thường kết hợp thành hai vòng xoắn.
Hoa cái thường đơn độc, mọc ở nách lá; nhị lớp 1-16 hoặc không có; bầu thường có 26. Đài hoa thường có 3-7 thùy. Tràng hoa hình chum, hình chuông, hoặc hình ống, 3-7
thùy rụng sớm. Quả thịt, mang đài to không rụng. Hạt 1-10 (hoặc hơn), thường hẹp
theo bề ngang [40].

 Phân bố
Chi Diospyros L là chi lớn nhất trong họ Ebenaceae, có khoảng 500 loài, phân bố
chủ yếu ở khu vực nhiệt đới (Ở Chấu Á có tới 200 loài) và một số nơi thuộc khu vực
ôn đới, trong đó đa dạng nhất là khu vực Đông Nam Á, chỉ có một số loài ở Tây Á,
Nhật Bản và Đông Nam nước Mỹ [13]. Trung Quốc có 60 loài nhiều nhất ở Đông Nam
và Tây Nam Trung Quốc [40]. Ở Việt Nam, chi Diospyros L có khoảng 70 loài [4],
trong đó có 9 loài cho gỗ có giá trị sử dụng, hai loài có quả ăn được là Hồng (D. kaki
L.f.) và Cậy (D. lotus L.) [6].

3


1.1.3. Một số loài thuộc chi Diospyros L.
1.1.3.1. Đặc điểm thực vật một số loài thuộc chi.
Diospyros kaki L.f.: Cây gỗ lớn cao tới 15m. Lá mọc so le, hình trứng hay trái
xoan, dài 6-18cm, rộng 3-9cm, đầu có mũi lồi ngắn, gốc lá nhọn dần, mặt trên lá màu
lục sẫm, mặt dưới có lông tơ nhạt. Hoa đực mọc chụm lại thành xim ở nách lá, có 2 lá

bắc, 14-24 nhị, thường là 16. Hoa cái mọc đơn độc, dài xẻ 5 thùy, bầu có 4 vòi nhụy và
4 ô, thường có vách giả chia làm 8 ngăn. Quả mọng từ 3,5-8cm, nhẵn, khi chín màu
vàng hay đỏ, mang đài tồn tại và không gập xuống. Hạt dẹt màu nâu vàng. Hoa tháng
4-6 và quả tháng 8-10 [3].
Diospyros mollis Griff: Cây gỗ nhỏ, nhánh trắng hay xám. Lá không lông, đen
lúc khô có kích thước thay đổi, dài 5,5-13cm; cuống lá có lông dài 3-6cm. Hoa đực
hợp thành xim 3-1 hoa nhỏ, màu vàng, mẫu 4; tràng hình lục lạc, 6-24 nhị. Hoa cái
đơn độc ở nách lá. Quả mọng, tròn 1-1,5cm, xanh, bao bởi đài hoa. Hạt thường 1, có
nội nhũ nhăn nheo. Hoa tháng 1, quả tháng 3-4 [3].
Diospyros lotus L.: Cây gỗ nhỏ, vỏ đen đen, nhánh non có lông. Lá mọc so le,
phiến lá hình bầu dục, gốc hơi không cân, dài 6-15cm, rộng 4,5-6cm, mỏng, mặt dưới
nhạt và có lông. Hoa màu vàng, 1-5 ở nách lá, mẫu 4, hoa đực và hoa cái riêng rẽ. Hoa
đực có 16 nhị; hoa cái có 8 nhị lép và bầu nhẵn với 6-8 ô. Quả mọng tròn nhỏ, 1-2cm,
vàng nâu rồi tím đậm đen khi chín. Hoa tháng 5-6, quả tháng 9-11[3].
Diospyros mariitima Blume: Cây gỗ có cành rũ xuống. Lá mọc so le, xoan hay
thuôn, tròn ở gốc, tù ở đầu, dài 5-26cm, rộng 4-9cm, dày, nhẵn, thường với hai tuyến ở
gốc, gần gân giữa, ở mặt trên, cuống lá dày, dài 8-13mm. Hoa gần như không cuống, ở
nách lá; hoa đực xếp 3-7 cái, hoa cái 1-2 cái. Quả hình cầu dẹp, hơi nhẵn, cao 2026mm, dày 22-26mm, có 4 ô, bao bởi đài đồng trưởng dạng chén. Hạt 1 trong mỗi ô,
dài 12-13mm, dẹp, màu nâu, bóng [3].
1.1.3.2. Thành phần hóa học một số loài thuộc chi
Nhiều loài trong chi Diospyros L. đã phân lập được một số thành phần hóa học
có hiệu quả cao trong điều trị bệnh. Theo nghiên cứu của U. V. Mallavadhani, Antani
K. Panda và Y. R. Rao và cộng sự đã có khoảng 300 chất hữu cơ đã được phân lập tư
chi Diospyros trong đó có số lượng lớn các triterpenes pentacyclic và juglone dựa trên
chất chuyển hóa 1,4 – naphthoquinone [47].(Bảng 1.1)

4


Bảng 1.1. Thành phần hóa học của một số cây thuộc chi Diospyros L.

Tên loài

Bộ phận
nghiên cứu

D. kaki

Lá

D. lotus

Rễ

D. mannii

Vỏ cây

D. melanoxylon

Lá

D. mespiliformis

Hạt

D. montana

Lá, vỏ cây

D. peregrina

Quả

D. mollis

Lá và cành

Thành phần hóa học
Tài liệu
tham khảo
phân lập được
- Triterpene: Lupeol, Betulin, Ursolic
acid, Taraxerol…
- Steroid: β-Sitosterol, Campesterol,
Stigmasterol
- Naphthoquinones: Plumbagin, 3[47]
methoxy-7-methyljuglone
Shinanolone, Diospyrin…
Flavonoid: Kampfero, Kampferol-3O-α-L-rhamnopyranoside…
- Triterpene: Lupeol, Oxyallobetulin,
Ursolic acid, β-Amyrin, Taraxerol…
- Steroid: β-Sitosterol
[47]
- Naphthoquinones: 7-Methyljuglon..
- Flavonod: Myricetin-3-O-α-Lrhamnopyranoside..
- Triterpene: Lupeol, Betulin…
[47]
-Triterpene: Lupeol, Ursolic acid,
Oleanolic acid…
- Steroid: β-Sitosterol..

[47]
- Naphthoquinones: 7-Methyljuglon,
2-methyl-5-methoxy-6-hydroxy-1,4naphthoquinone..
Triterpene: Betulin, Betulinic acid …
[47]
- Triterpene: Lupeol, Allobetulin,
Oxyallobetulin, Epi-Uvaol…
- Steroid: β-Sitosterol, β -Sitosterol
glucoside, Stigmasterol..
[47]
- Naphthoquinones: 7-Methyljuglon,
β'-Dihydrodiospyrin, Diospyrin,
chromenone ester, chromenone acid
- Triterpene: Peregrinol, Oleanolic
acid glycosides
- Steroid: β -Sitosterol glucoside..
[47]
-Flavonoid: Leucopelargonidin-3-Oα-L-rhamnopyranosid
- Triterpene: Lupenone, Taraxerol…
[47]
- Steroid: Stigmasterol

Nhóm triterpene là nhóm phổ biến nhất được tìm thấy trong chi Diospyros L.

5


bao gồm các chất đã được phân lập như: Peregrinol, ursolic acid, taraxerol…[47].

R1

R2

Taraxerol

α –H

β-OH

Taraxeryl acetate:
Taracerone

α-H
O

β-OCOCH3
O

Peregrinol

Lupeol
Betulin
Betuliniacid

R1
β-OH
β-OH
β-OH

R2

CH3
CH2OH
COOH

α-amyrin
Ursolic acid
Ursolic acid

R1
β-OH
β-OH
β-OCOCH3

R2
CH3
COOH
COOH

Epi-lupeol

α-OH

CH3

acetate
Ursolic acid

β-OCOCH2

COOH

Lupenone

O

CH3

palmitate
Ursolic acid

β-OCO(CH2 )16CH3

COOH

Betulinaldehyde

β-OH

CHO

stearate
α-amyrenone
Epi-uvaol
Uvaol

O
α-OH
β-OH

CH3

CH2OH
CH2OH

Sự đa dạng về cấu trúc của các hợp chất steroid là hạn chế và cho đến nay chỉ
có sáu chất chuyển hóa được phát hiện và phân lập từ các cây Diospyros L. [47].

6


R1

R2

β-sitosterol

H

CH3

β-sitosterol glucoside

gluc

CH3

Campesterol

Stigmasterol

Stigmasta - 4 - en - 3 – one

Stigmasta -5,6 - dihydro - 22 - en - 3β – ol

Chi Diospyros L. có một lượng lớn 1,4 – naphthoquinones đã được nghiên cứu
và chúng có thể được sử dụng làm dấu hiệu hóa học cho các nghiên cứu phân loại.
Plumbagin và 7 - methyljuglone là các naphthoquinon phân bố rộng rãi nhất và được
tìm thấy tích lũy với số lượng đáng kể trong một số loài Diospyros L. [47].

3-bromo-plumbagin: X =Br
3-chloro-plumbagin: X = Cl

3-methoxy -7-methyjuglone

7


3-hydroxy-glumbagin: X = OH

2-methoxy -7-methyjuglone

Chromenone ester

R =C2H5

Chromenone acid

R =H

Cyclodiospyrin

Neodiospyrin

3’-methoxydiospyrin
Các flavonoid được phân lập cho đến nay tất cả đều thuộc về phân lớp 3,5,7trihydroxyflavone. Lá D. kaki là nguồn tiềm năng cho các chất chuyển hóa này và cho
đến nay đã có flavonol glycoside và một số đã được báo cáo ức chế angiotensin
chuyển đổi hoạt động enzyme [47].

8


3,7,3,5’-tetrahydroxy-3’-methoxy-flavanone-4’o-α-L- rhamnopyranoside
R1

R2

R3

H

H

H

α-L-rhamnopyranoside

H

H

β-D-xylopyranoside

H

H

1.1.3.3. Kinh nghiệm sử dụng các loài Diospyros ở Việt Nam và trên thế giới
Ở Việt Nam, một số loài trong chi đã được nhân dân sử dụng làm thuốc theo
kinh nghiệm dân gian như:
Diospyros decandra Lour (Thị trái, Thị mười nhị): Thịt quả dùng an thần và
tẩy giun cho trẻ em, vỏ thân làm giảm đau vết thương, lá làm thuốc chữa phù thũng,
mụn nhọt…
Diospyros kaki Thunb (Hồng): Quả chữa suy dinh dưỡng, háo khát, ho có
đờm, trĩ, táo bón; tai hồng chữa nấc, đầy bụng không tiêu, đau bụng lạnh, nôn mửa;
(thị tất) chữa cao huyết áp, cầm máu chống sung huyết ở bệnh trĩ; vỏ thân, vỏ rễ chữa
băng huyết, đại tiện ra máu.
Diospyros candolleana Wight (Thị candolle): Rễ chữa thấp khớp, phù thũng
Diospyros ebenum Koenig ex Retz (Thị huyền): Gỗ làm thuốc giải độc, gây
nôn, tiêu sỏi.
Diospyros mollis Griff (Mắc nưa): Hạt chữa giun sán.
Diospyros lotus L (Cậy, Thị sen, Thị bị): Lá, vỏ thân chữa lở loét, chảy máu,
quả chữa táo bón, lỵ, làm thuốc giải nhiệt, tiêu khát, chống phiền nhiệt bất an, thúc đẩy
sự bài tiết [7].
Trên thế giới một số loài đã được nghiên cứu về tác dụng dược lý, theo nghiên
cứu của U. V. Mallavadhani, Antani K. Panda và Y. R. Rao và cộng sự các loài có
những tác dụng sau:
D. kaki: Lá giúp tăng tuổi thọ và giảm xuất huyết não và đột quỵ. Quả thể hiện

9

hoạt động chống oxy hóa mạnh mẽ. Vô hiệu hóa các độc tố vi khuẩn như Clostridium
tetani và bạch hầu Straphylococcus alpha và Bordetella ho gà
D. melanoxylon: Hạt có tính kháng khuẩn
D. mespiliformis: Hạt có tính kháng khuẩn
D. Montana: Lá có tác dụng kháng khuẩn và hiệu quả chống lại hầu hết các
sinh vật được thử nghiệm. Vỏ cây có tác dụng hạ sốt, giảm đau, chống viêm.
D. Peregrina: Quả có hoạt tính chống vi rút và hạ đường huyết, kháng khuẩn.
Toàn cây bỏ gốc giảm stress, viêm loét dạ dày và nhiễm độc gan.
D. exsculpta: Toàn cây bỏ rễ tác dụng trên hệ tim mạch.
D. zombensis: Vỏ rễ thể hiện độc tính tế bào chống lại tế bào ung thư đại tràng
ở người [47].
1.1.4. Tác dụng sinh học
Trong lá hồng (Diospyros kaki L.f) có hai thành phần chính là flavonoid và
triterpenoid [20], [21]. Trên thế giới đã có một số nghiên cứu về tác dụng sinh học
dựa trên hai thành phần hóa học từ lá của cây, trong đó có một số tác dụng sinh học
nổi bật như:
1.1.4.1. Tác dụng trên hệ tim mạch
Một số báo cáo đã chứng minh rằng lá hồng đã làm tăng lưu lượng máu động
mạch vành của thỏ, ếch và chó [30], [32], [42]. Các nhóm sử dụng dung dịch uống liều
cao (100mg/kg) và liều thấp (25mg/kg) được làm từ dịch chiết lá hồng đã làm giảm rõ
rệt nhịp tim và vùng nhồi máu cơ tim, giảm nồng độ CK và LDH trong huyết thanh.
Hơn nữa, flavonoid của lá hồng (PLF) ở liều 4mg/ml có thể làm giảm sự giải
phóng AST, CK, LDH và sản xuất MDA, cũng như tăng hoạt động của enzym SOD.
Điều đó cho thấy rằng PLF có tác dụng bảo vệ cơ tim [63].
Flavonoid lá hồng (PLF) làm giảm rõ rệt huyết áp và nhịp tim ỏ chuột khỏe
mạnh. Sau khi tiêm tĩnh mạch PLF ở liều 20,40 và 80mg/kg/ngày trong 4 tuần, huyết
áp giảm đáng kể phụ thuộc vào liều, so với nhóm chứng khỏe mạnh. Nhóm tác giả gợi
ý rằng PLF có thể điều chỉnh sự mất cân bằng của các chất hoạt hóa tim mạch bằng
cách tăng cường giải phóng các chất giãn mạch và làm giảm sự giải phóng của các
chất co mạch, dẫn đến tăng huyết áp [57].

Chống xơ vữa động mạch

10


Dịch chiết lá hồng có tác dụng chống xơ vữa động mạch thông qua khả năng
làm giảm triglyceride (TG) và cholesterol toàn phần và LDL-C, trong khi tăng tỷ lệ
HDL trong huyết ở chuột với chế độ ăn giảm chất béo [15], [44]. Dịch chiết của lá
hồng (diospyros kaki) giảm sự tích tụ lipid gan ở những con chuột béo phì, cải thiện
hoạt động của HMG-CoA và ACAT ở gan. Kết quả cho thấy dịch chiết lá hồng
(diospyros kaki) cải thiện nồng độ lipid huyết tương và gan, một phần thông qua việc
tăng lipid phân ở những con chuột ăn nhiều chất béo. Điều đó có thể là do tính chất
của các hợp chất phenolic và hàm lượng chất xơ cao trong dịch chiết lá hồng
(diospyros kaki) [39].
Cầm máu: Lá hồng (diospyros kaki) thường được sử dụng như là một chất cầm máu.
Năm 1956, trong báo cáo của Yamashita cho thấy dịch chiết lá hồng có tác dụng làm
giảm chảy máu niêm mạc và ngăn ngừa loét đường tiêu hóa [27].
1.1.4.2. Tác dụng chống đái tháo đường
Dịch chiết phân đoạn ethanol, ethyl acetat, n-butanol và nước từ lá hồng đã làm
giảm đáng kể lượng đường trong máu ở chuột bị tiểu đường với chỉ số kháng Insulin giảm
và tăng chỉ số nhạy cảm với Insulin. Chiết xuất nước của lá hồng (polysacaharide của lá
hồng) làm giảm đáng kể mức đường trong máu và cải thiện dung nạp glucose [68].
1.1.4.3. Hoạt tính kháng khuẩn
MIC (nồng độ ức chế tối thiểu) và MBC (nồng dộ diệt khuẩn tối thiểu) của lá
hồng đã được xác định là 0,313 và 0,625 g/ml chống ăn mòn thực phẩm và các mầm
bệnh do thực phẩm gây ra (Escherichia coli, Staphylococus aureus, Fluorescence
pseudomonas, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Proteus vulgaris) và tỷ lệ kháng
khuẩn trên 90%. Cao chiết ethanol và ethyl acetat từ lá hồng (diospyros kaki) đã có
hiệu quả đáng kể chống lại 6 loại vi khuẩn trên. Cao chiết nước có hiệu quả với nấm
hơn vi khuẩn. Chiết xuất n-butanol có hiệu quả khác nhau chống lại vi khuẩn, nhưng

không có tác dụng với nấm. Arakawa và cộng sự đã chứng minh hoạt tính kháng
khuẩn của lá hồng (diospyros kaki) là do tanin trong cây [68].
1.1.4.4. Tác dụng chống oxy hóa
Nghiên cứu dịch chiết flavonoid toàn phần chiết xuất từ lá hồng (diospyros
kaki) trên tế bào MC3T3-E1 với chất chống oxy hóa chuẩn rutin cho thấy dịch chiết
flavonoid toàn phần có tác dụng chống oxy hóa mạnh, có khả năng dọn các superoxide
anion và các gốc hydroxyl tự do ở mức độ vượt trội so với rutin, khả năng dọn gốc

11


1,1-diphenyl-2-pietylhydrazyl kém hơn so với nhóm rutin [62].
Các flavonoid được phân lập từ lá hồng (diospyros kaki) có tác dụng hạ huyết
áp và chống oxy hóa [27], [35]. Đặc biệt là flavonoid aglycones trong lá hồng như:
catechin, kaempferol và quercetin được báo cáo có hoạt động chống oxy hóa mạnh
mẽ; hoạt động khử sắt và ức chế quá trình peroxid hóa lipid [33].
1.1.5. Tổng quan về cây “Hồng rừng”
1.1.5.1. Đặc điểm thực vật
- Tên khoa học: Diospyros kaki Thunb. var. silvestris Makino [18].
- Tên đồng nghĩa:

+ Diospyros argyi H. Lév. [18].
+ Diospyros trichocarpa R.H. Miao [18].

- Chi Diospyros L. Họ đậu Ebenaceae.
Theo từ điển thực vật Trung Quốc loài Diospyros kaki Thunb. var. silvestris
Makino vỏ cây già có màu nâu đỏ, thân non màu xanh, phủ lông dày mịn màu trắng.
Đài hoa hình trứng. Tràng hoa đực 6-9 mm. Quả mọng 2-5 cm.
1.1.5.2. Phân bố
Diospyros kaki Thunb. var. silvestris Makino được phân bố nhiều ở một số

vùng của Trung Quốc như: An Huy, Bắc Kinh, Trùng Khánh, Quảng Đông, Hồ Nam,
…[64]. Trong cuốn “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” (2004) của Đỗ Tất Lợi,
Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam (2006) của Viện Dược Liệu chưa tìm
thấy thông tin của loài Diospyros kaki Thunb. var. silvestris Makino.
1.1.5.3. Thành phần hóa học
Phân lập từ dịch chiết MeOH của rễ loài Diospyros kaki Thunb. var. silvestris
Makino thu được dẫn xuất dicoumarol là: gerberinol; 11-methylgerberinol và dẫn xuất
4-hydroxy-5-methylcoumarin [59].
Phân lập chất từ dịch chiết CHCl 3 của rễ loài Diospyros kaki Thunb. var.
silvestris Makino thu được một số hợp chất: 4,4;-dimethoxy-6,6’-dimethyl-8,8’dihydroxy-2,2’-binaphthyl-1,1’-quinone; 7-methyljuglone; Lupeol; β-sitosterol;
Isodiospyrin; Butulinic acid. Tiến hành phân lập bằng phương pháp sắc ký cột pha
thuận từ dịch chiết MeOH của rễ loài Diospyros kaki Thunb. var. silvestris Makino
cũng thu được một số hợp chất sau: lupeol, 7-methyljuglone. Từ vỏ thân của loài
Diospyros kaki Thunb. var. silvestris Makino tiến hành phân lập chất từ dịch chiết vỏ

12


thân bằng dung môi CHCl3 thu được một số hợp chất sau: 7-methyljuglone; Lupeol;
Isodiospyrin [50].
1.1.5.4. Tác dụng sinh học
Mẫu nghiên cứu là quả của 6 loài khác nhau trong chi Diospyros L. bao gồm: Các
kiểu gen của Trung Quốc (1) D. Kaki. cv. Xingyangshuishi, (2) D. Kaki. cv.
Xiuningbianshi, (3) D. Kaki. cv. Zhouqumomoshi; kiểu gen của Nhật Bản là (4) D.
Kaki.cv. Jiro, (5) D. Kaki. cv. Zenjimaru; kiểu gen hoang dã (6) D. kaki. var. silvestris
Makino. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào 4 phương pháp: ABTS, DPPH, FRAP,
HRSA như được mô tả bởi Peng-Min Li et al. [41]. Kết quả chỉ ra các kiểu gen của D.
Kaki đều có hoạt tính chống oxy hóa. Phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) dấu vết
hợp chất polyphenolic bao gồm các thành phần: Galilic acid, (+)-Catechin, Chlorogenic
acid, p-hydoxybenzoic acid, 0-phtalic acid,Vanillic acid, caffeic acid, syringic acid, pcoumarin acid, ruttin, ferulic acid, phloridzin, quercetin; cho thấy acid galilic và quercetin

là thành phần phenolic có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất [56].
1.2. GỐC TỰ DO VÀ CHẤT CHỐNG OXY HÓA
1.2.1. Gốc tự do
Là những tiểu phân hóa học (nguyên tử, phân tử, ion..) có điện tử không cặp đôi
ở orbital hóa trị. Chúng có tác dụng chống oxy hóa cao, có vai trò phân hủy, tổng hợp
hóa học thông qua bẻ gãy liên kết để tạo ra liên kết mới, làm sai lệch cấu trúc và làm
rối loạn thông tin trên những phân tử sinh học, vật chất di truyền tế bào. Đây là nguyên
nhân của nhiều bệnh lý: viêm, thiếu máu cục bộ, xơ vữa động mạch, sự thoái hóa của
hệ thần kinh, sự lão hóa của các cơ quan phủ tạng… trong cơ thể gốc tự do được hình
thành qua hai con đường:
+ Nội sinh trong cơ thể: Chuỗi hô hấp tế bào trong ty thể, quá trình peroxyd hóa
lipid (LOP) và từ các phản ứng tạo gốc oxy hóa trong cơ thể.
+ Ngoại sinh do tác động của môi trường: các tia phóng xạ, bức xạ: ô nhiễm
môi trường gây ô nhiễm cơ thể như chất dị sinh là các hóa chất, trừ sâu, diệt cỏ gây
nhiều phản ứng Fenton nguy hiểm, stress oxy hóa là sự quá tải gốc tự do, làm mất cân
bằng nghiêm trọng giữa gia tăng đột biến các ROS/RNS/RCS và sự cạn kiệt các tác
nhân chống oxy hóa trong cơ thể [29].
1.2.2. Chất chống oxy hóa

13


Chất chống oxy hóa là chất có khả năng cho hoặc nhận electron của gốc tự do
để trung hòa gốc tự do đó, do đó làm giảm khả năng gây nguy hại của nó. Chất chống
oxy hóa làm chậm hoặc ngăn chặn sự phá hủy tế bào chủ yếu thông qua khả năng dọn
gốc tự do của chúng. Những chất oxy hóa có trọng lượng phân tử thấp có thể tương tác
một cách an toàn với các gốc tự do và chấm dứt chuỗi phản ứng trước khi các phân tử
quan trọng bị phá hủy. Các chất chống oxy hóa được chia thành hai loại:
Các enzym chống oxy hóa: superoxide dismutase, catalase và glutathione.
Các chất phi enzym: là các antioxidant không phải enzym được tổng hợp trong

cơ thể nhưng rất ít, chủ yếu là từ nguồn gốc thức ăn bổ sung. Các antioxidant sử dụng
chủ yếu: vitamin C, lipoic acid, coenzyme Q, vitamin E… mỗi antioxidant có tác dụng
riêng tới từng gốc tự do ở mỗi loại tế bào.
Trong tự nhiên có rất nhiều thực vật có thành phần có tác dụng chống oxy hóa:
vitamin E có trong đậu nành, cà rốt, xà lách… flavonoid và phenolic như: rutin,
catechin… chính vì vậy cần có thêm nhiều nghiên cứu phát hiện những thành phần hóa
học có trong thực vật có tác dụng chống oxy hóa [29].

14


Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu
- Mẫu có hoa, quả làm tiêu bản và giám định tên khoa học của cây.
- Lá của cây “hồng rừng” tại Sapa, Lào Cai làm nguyên liệu nghiên cứu hoạt
tính chống oxy hóa.
2.1.2. Dụng cụ, hóa chất nghiên cứu
Thiết bị và dụng cụ
- Các máy đo các loại phổ: Cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ tử ngoại (UVVIS), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS).
- Các máy đo nhiệt độ nóng chảy, năng suất quay cực. đo độ pH.
- Bình chạy sắc ký lớp mỏng, cột sắc ký, bếp điện, đèn tử ngoại.
- Tủ sấy
- Máy ly tâm
- Cân phân tích Precisa, cân kỹ thuật Sartorius
- Các dụng cụ thủy tinh thông thường tại phòng thí nghiệm
- Đĩa 96 giếng, micropipet và đầu típ các cỡ
- Máy đọc Microplate, Human reader.
Hóa chất nghiên cứu
- 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, Sigma

- Đệm Na2HPO4/NaH2PO4, Sigma
- Xanthine oxidase, Sigma
- Xanthine, Sigma
- Nitrotetrazolium Blue chloride (NBT), Sigma
- Nước cất 2 lần
- DMSO, Merk
- Methanol, Merk

15


- Ethanol 960
- Hóa chất dùng trong nghiên cứu đặc điểm thực vật: Javen, cloramin, acid
acetic, xanh methylen, đỏ son phèn, glycerin.
- Các dung môi dùng trong chiết xuất, phân lập như methanol, n-hexan, ethyl
acetat, chloroform, aceton đều đạt tiêu chuẩn công nghiệp.
- Các hóa chất thuốc thử đều đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của Dược
điển Việt Nam V.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Giám định tên khoa học và đặc điểm thực vật của cây nghiên cứu
- Quan sát, mô tả và chụp ảnh đặc điểm hình thái thực vật, điều kiện sinh trưởng
và phát triển của cây “hồng rừng”.
- Thu hái, làm tiêu bản mẫu cành mang hoa, quả và lưu giữ tiêu bản.
- Giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu trên cơ sở phân tích đặc điểm
hình thái thực vật, đặc điểm bộ phận sinh sản, so sánh với các tài liệu phân loại thực
vật của chi Diospyros L dưới sự hướng dẫn của các chuyên gia phân loại thực vật.
Nghiên cứu đặc điểm vi học: Soi bột và làm vi phẫu, thân, lá của mẫu nghiên
cứu. Quan sát các đặc điểm, mô tả và chụp ảnh tiêu bản dưới kính hiển vi.
Dược liệu được ngâm mềm với nước hoặc ethanol, cắt lát mỏng. Sau đó ngâm
nước Javen 30 phút để tẩy các chất trong các tế bào. Tiếp tục rửa với nước nhiều lần

rồi ngâm với acid acetic 15 phút, cuối cùng được rửa lại bằng nước. Nhuộm vi phẫu
thu được bằng xanh methylen trong thời gian 30s - 60s và nhanh chóng rửa lại bằng
nước. Đỏ son phèn được nhuộm tiếp theo trong khoảng 30 phút. Tiêu bản sau nhuộm
được rửa lại bằng nước. Đặt vi phẫu vào 1 giọt glycerin trên phiến kính, đậy lá kính.
Sau đó tiến hành soi tiêu bản dưới kính hiển vi quang học, chụp ảnh và mô tả vi phẫu.
Soi bột:
Dược liệu sau khi thu hái được sấy khô, nghiền bột, rây qua lưới được bột mịn.
Bột dược liệu được đặt lên trên phiến kính có sẵn giọt nước cất, đậy lá kính và quan
sát các đặc điểm dưới kính hiển vi quang học. Tiến hành chụp ảnh và mô tả các đặc
điểm bột dược liệu.

16