VN
U
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
ne
an
dP
ha
r
ma
c
y,
KHOA Y DƢỢC
LÊ THỊ THANH
ed
ici
PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC
CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT SAPONIN TỪ PHÂN
ĐOẠN BUTANOL PHẦN THÂN RỄ SÂM LAI CHÂU
ho
ol
of
M
(PANAX VIETNAMENSIS VAR. FUSCIDISCUS K.
KOMATSU, S. ZHU & S.Q. CAI)
Co
p
yri
gh
t@
Sc
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC
Hà Nội - 2018
VN
U
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
ma
c
y,
KHOA Y DƢỢC
ne
an
dP
ha
r
LÊ THỊ THANH
ho
ol
of
M
ed
ici
PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC
CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT SAPONIN TỪ
PHÂN ĐOẠN BUTANOL PHẦN THÂN RỄ
SÂM LAI CHÂU (PANAX VIETNAMENSIS
VAR. FUSCIDISCUS K. KOMATSU, S. ZHU
& S.Q. CAI)
Khóa
Ngƣời hƣớng dẫn
: QH.2013.Y
: 1. TS. Nguyễn Thị Duyên
2. PGS.TS. Dƣơng Thị Ly Hƣơng
Co
p
yri
gh
t@
Sc
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC
Hà Nội - 2018
VN
U
LỜI CẢM ƠN
y,
Khóa luận này là kết quả cho quá trình học tập, rèn luyện của tôi tại Khoa Y
Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và quá trình nghiên cứu, thực hành tại Khoa Hóa
ma
c
Thực vật – Viện Dược liệu.
Qua đây tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới:
ne
an
dP
hướng dẫn tôi hoàn thành đề tài khóa luận này.
ha
r
TS. Nguyễn Thị Duyên – Khoa Hóa Thực Vật – Viện Dược liệu, PGS.TS.
Dương Thị Ly Hương – Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, đã trực tiếp
Lãnh đạo, thầy cô công tác tại Khoa Y – Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã
giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi được học tập, nghiên cứu tại khoa suốt 5 năm học qua.
Cán bộ nghiên cứu khoa Hóa Thực vật – Viện Dược liệu, lãnh đạo Viện
Dược liệu, đặc biệt PGS.TS. Đỗ Thị Hà đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá
trình tiến hành thực nghiệm.
ici
Đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống và trồng cây Sâm Lai
ed
Châu (Panax vietnamensis var. fuscidiscus K. Komatsu, S. Zhu & S.Q. Cai)”, mã
ho
ol
of
M
số: KHCN-TB.16C/13-18, do ThS. Phạm Quang Tuyến chủ nhiệm đã hỗ trợ kinh
phí để thực hiện nghiên cứu.
Gia đình, bạn bè những người luôn luôn tạo điều kiện, quan tâm, giúp đỡ,
động viên tôi trong suốt thời gian học tập vừa qua.
Sc
Dù nhận được nhiều hướng dẫn và giúp đỡ nhưng bài khóa luận này không
tránh khỏi những thiết sót. Tôi rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của các
thầy cô để bài khóa luận của tôi được hoàn thiện hơn.
Co
p
yri
gh
t@
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 23 tháng 4 năm 2018
Sinh viên
Lê Thị Thanh
Phân đoạn butanol Sâm Lai Châu
BuOH
Butanol
CC
Sắc ký cột (Column Chromatography)
DCM
Dicloromethan
DCMLC
Phân đoạn DCM Sâm Lai Châu
DL/DM
Dược liệu/Dung môi
EtOH
Ethanol
GLUT4
Protein màng tế bào ở cơ vân, cơ tim, mỡ và mô khác
(Glucose transporter type 4)
HPLC
Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography)
IR
Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy)
LPS
Lipopolysaccharid
M
Khối lượng phân tử (Mass)
ma
c
Điểm nóng chảy (Melting Point)
Phổ khối (Mass Spectroscopy)
gh
t@
Sc
MS
Yếu tố nhân kappa B (Nuclear Factor- Kappa B)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance)
PCA
Phản ứng phản
Anaphylaxis)
PRT4
Pseudoginsenosid
yri
ha
r
Methanol
Mp.
NMR
ne
an
dP
ici
ed
ho
ol
of
M
Khối lượng/điện tích
MeOH
NF-κB
y,
BLC
m/z
Co
p
VN
U
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Rf
Hệ số lưu
SKĐ
Sắc ký đồ
vệ
thụ
động
(Passive
Cutaneous
Receptor của LPS (Tool-Like Receptor)
TLTK
Tài liệu tham khảo
TNF-α
Yếu tố hoại tử khối u (Tumor Necrosis Factor)
Treg
Regulary T cells
TT
Thứ tự
UV-Vis
Phổ tử ngoại (Ultra Violet – Visible)
v/v
Thể tích/ Thể tích
VKH&CNVN
Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
WLC
Phân đoạn nước Sâm Lai Châu
ha
r
ne
an
dP
ici
ed
ho
ol
of
M
Sc
gh
t@
yri
Co
p
VN
U
TLR4
y,
Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)
ma
c
TLC
VN
U
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Các saponin có cấu trúc dạng protopanaxadiol trong Sâm Việt Nam ........ 5
y,
Bảng 1.2. Các saponin có cấu trúc dạng ocotillol trong Sâm Việt Nam..................... 8
ma
c
Bảng 1.3. Các saponin có cấu trúc dạng oleanolic trong Sâm Việt Nam ................... 9
Bảng 1.4. Các saponin có cấu trúc dạng panaxatriol trong Sâm Việt Nam ................ 9
ha
r
Bảng 1.5. Các saponin có cấu trúc dạng dammarenediol trong Sâm Việt Nam ....... 10
Bảng 3.1. Dữ liệu phổ của hợp chất LC05 và MR2 .................................................. 26
Co
p
yri
gh
t@
Sc
ho
ol
of
M
ed
ici
ne
an
dP
Bảng 3.2. Dữ liệu phổ hợp chất LC07 và Rb1 .......................................................... 30
VN
U
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Hình vẽ Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv. ..................... 4
y,
Hình 1.2. Hình ảnh của Sâm Lai Châu Panax vietnamensis var. fuscidiscus. ........ 13
ma
c
Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn Sâm Lai Châu .............................................. 20
Hình 3.2. Sắc ký đồ phân đoạn Sâm Lai Châu, Sâm Việt Nam, phát hiện bằng
ha
r
thuốc thử H2SO4 trong cồn tuyệt đối, hơ nóng ........................................ 21
Hình 3.3. Sơ đồ phân lập hợp chất từ cao Sâm Lai Châu phân đoạn butanol ......... 23
ne
an
dP
Hình 3.4. Sắc ký đồ của MR2 và LC05. .................................................................. 25
Hình 3.5. Cấu trúc hợp chất LC05 (majonosid R2). ................................................ 28
Hình 3.6. Kết quả TLC LC07 với phân đoạn butanol. ............................................ 29
Co
p
yri
gh
t@
Sc
ho
ol
of
M
ed
ici
Hình 3.7. Công thức hợp chất LC07 (ginsenosid Rb1) ........................................... 32
VN
U
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
ma
c
y,
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ha
r
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 2
ne
an
dP
1.1. Tổng quan về Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv. ...................... 2
1.1.1. Vài nét về chi Panax L. ............................................................................ 2
1.1.2. Vị trí phân loại Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv. ........ 2
1.1.3. Đặc điểm thực vật Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv. ..... 3
ici
1.1.4. Phân bố Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv..................... 4
ed
1.1.5. Thành phần hóa học Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv. .... 4
1.1.6. Tác dụng sinh học của các hợp chất có trong Sâm Việt Nam Panax
ho
ol
of
M
vietnamensis Ha & Grushv. .............................................................................. 10
1.2. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu – Sâm Lai Châu ....................................... 11
1.2.1. Đặc điểm thực vật ................................................................................... 12
1.2.2. Phân bố ................................................................................................... 13
1.2.3. Mối quan hệ di truyền giữa Sâm Lai Châu và Sâm Việt Nam ............... 13
Sc
1.2.4. Thành phần hóa học ............................................................................... 14
1.2.5. Tác dụng sinh học................................................................................... 14
gh
t@
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 15
2.1. Đối tượng ........................................................................................................... 15
Co
p
yri
2.2. Hoá chất, thiết bị ................................................................................................ 15
2.2.1. Hoá chất .................................................................................................. 15
2.2.2. Thiết bị.................................................................................................... 15
2.3. Phương pháp chiết xuất phân lập và xác định cấu trúc hợp chất tinh khiết ....... 16
VN
U
2.3.1. Phương pháp chiết xuất và phân lập....................................................... 16
2.3.2. Phương pháp xác định và nhận dạng cấu trúc ........................................ 17
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................ 20
y,
3.1. Chiết các phân đoạn Sâm Lai Châu và phân lập các hợp chất từ cao phân
ma
c
đoạn butanol .............................................................................................................. 20
3.1.1. Kết quả chiết phân đoạn Sâm Lai Châu ................................................. 20
ha
r
3.1.2. Kết quả phân lập các hợp chất tinh khiết. .............................................. 22
3.1.3. Hằng số phân lập các hợp chất phân lập từ Sâm Lai Châu .................... 24
ne
an
dP
3.2. Biện luận cấu trúc các hợp chất phân lập được từ Sâm Lai Châu. .................... 25
3.2.1. Biện luận cấu trúc LC05 ........................................................................ 25
3.2.2. Biện luận cấu trúc LC07 ........................................................................ 28
Co
p
yri
gh
t@
Sc
PHỤ LỤC
ho
ol
of
M
TÀI LIỆU THAM KHẢO
ed
ici
3.3. Bàn luận.............................................................................................................. 32
3.3.1. Về chiết xuất ........................................................................................... 32
3.3.2. Về phân lập, tinh chế và nhận dạng cấu trúc các hợp chất ..................... 32
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 37
VN
U
ĐẶT VẤN ĐỀ
Nền kinh tế - xã hội ngày càng phát triển và hiện đại hơn, kéo theo đó là nhu
ma
c
y,
cầu chăm sóc sức khỏe cho con người ngày càng tăng. Một trong những sản phẩm
chăm sóc sức khỏe con người đó là dược phẩm. Với sự phát triển của khoa học công
ha
r
nghệ tiến bộ, các nhà khoa học luôn muốn tối ưu hóa công dụng của thuốc và hạn chế
tối đa tác dụng phụ của thuốc đó. Một trong các biện pháp hữu hiệu đang được áp dụng
đó là tạo ra các thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên thân thiện với con người.
“Sâm” là từ rất quen thuộc mà hay được dùng để nói về các loài dược liệu
ne
an
dP
quý hiếm thuộc chi Panax L.. Có lẽ khi nghe đến Sâm ai cũng biết đến những công
dụng tuyệt vời của nó như: thuốc bổ, tăng lực, chống suy nhược, hồi phục sức lực bị
suy giảm, kích thích nội tiết sinh dục, tăng sức chịu đựng, giải độc và bảo vệ gan,
điều hoà thần kinh trung ương, điều hoà tim mạch, hạ huyết áp, giảm đường
huyết…[53]. Cũng vì những công dụng đáng nể đó, các loài Sâm luôn được chú
trọng tìm kiếm, nghiên cứu và phát triển.
ed
ici
Việt Nam nổi tiếng với loài Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha &
Grushv), đây là một trong những loài Sâm có hàm lượng saponin rất cao. Năm
2013, Phan Kế Long cùng cộng sự đã phát hiện ra một thứ Sâm mới được đặt tên là
ho
ol
of
M
Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var. fuscidiscus), bậc phân loại dưới loài của
Sâm Việt Nam ở huyện Mường Tè, tỉnh Lai Châu [38]. Mặc dù các nghiên cứu sơ
bộ cho thấy Sâm Lai Châu cũng chứa hàm lượng saponin tương đối cao đem lại
những hiệu quả đáng chú ý, song cho đến nay, còn khá ít những nghiên cứu chi tiết
về thứ Sâm này.
Sc
Vì vậy, để làm sáng tỏ thành phần hóa học cũng như giá trị sử dụng của Sâm
Lai Châu (Panax vietnamensis var. fuscidiscus) chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân
lập, xác định cấu trúc của một số hợp chất saponin từ phân đoạn butanol phần
gh
t@
thân rễ Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var. fuscidiscus K. Komatsu, S.
Zhu & S.Q. Cai)” với 2 mục tiêu cần đạt được:
Co
p
yri
1. Chiết xuất và phân lập một số hợp chất từ phân đoạn n-butanol.
2. Xác định và nhận dạng cấu trúc của các chất phân lập được trong phân đoạn.
1
VN
U
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN
y,
1.1. Tổng quan về Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv.
ma
c
1.1.1. Vài nét về chi Panax L.
Chi Nhân Sâm (Panax L.) là một chi nhỏ trong họ Ngũ gia bì (Araliaceae).
ha
r
Toàn bộ chi Sâm (Panax L.) trên thế giới hiện đã biết chắc chắn có 14 loài và 1
dưới loài (thứ-var.). Sự phân bố của chi Panax L. trên thế giới cho thấy chúng chỉ
xuất hiện ở Bắc bán cầu, kéo dài từ vùng rừng núi giáp bờ biển phía Đông của Bắc
ne
an
dP
Mỹ bao gồm Bắc Hoa Kỳ và Tây-Nam Canada (có 2 loài P. quinquefolius và P.
trifoliatus) [6,32,33]. Vùng Đông Bắc Á (gồm Viễn Đông Nga, Đông Bắc Trung
ici
Quốc, bán đảo Triều Tiên và Nhật Bản) có 2 loài là P. ginseng và P. japonica.
Trung tâm phân bố của chi Panax L. có thể từ vùng Tây-Nam của Trung Quốc lan
tỏa xuống phía Bắc của Việt Nam. Thực chất khu vực này gồm 2 tỉnh biên giới kề
nhau là Vân Nam (Trung Quốc) và Lào Cai (Việt Nam), ở đây đang có tới 7 loài và
dưới loài (thứ) mọc hoàn toàn tự nhiên, 2 loài trồng là P. notoginseng (nhập từ Bắc
ed
Mỹ) và P. pseudoginseng (không tìm thấy trong hoang dại, nhưng giả thiết có
nguồn gốc từ vùng cận Himalaya hoặc là kết quả của lai tự nhiên giữa 2 loài gần gũi
Sc
ho
ol
of
M
nào đó). Đây có thể coi là trung tâm phân bố của chi Sâm (Panax L.) trên thế giới.
Ở Bắc Mỹ hiện có 3 loài (P. notoginseng, P. quinquefolius và P. trifoliatus). Giới
hạn cuối cùng về phía Nam của chi Panax L. là loài Sâm Việt Nam (Panax
vietnamensis) ở Miền Trung của Việt Nam, tại 14o 15’ vĩ độ Bắc [6].
Ở Việt Nam, cho đến thời điểm hiện nay, chi Panax có chắc chắn 5 loài,
trong đó có 2 loài nhập trồng là Tam thất (P. notoginseng) và Nhân Sâm (P.
ginseng) [6]. Ba loài mọc tự nhiên và đang cần phải bảo tồn là Sâm vũ diệp (Panax
bipinnatifidus Seem.), Tam thất hoang (P. stipuleanatus Tsai & Feng) và đặc biệt là
Sâm Việt Nam (P. vietnamensis Ha & Grushv) – loài đặc hữu hẹp của miền trung
Co
p
yri
gh
t@
Việt Nam [6].
Cho đến gần đây, loại Sâm Lai Châu, một cây thuốc mới, ít được biết đến ở
Việt Nam đã được Phan Kế Long cùng cộng sự (2013) xác định gần nhất với thứ Sâm
Lai Châu (Panax vietnamensis var. fuscidiscus K. Komatsu, S. Zhu & S.Q. Cai), một
thứ mới cho khoa học của loài Sâm Việt (P. vietnamensis Ha & Grushv) [38].
1.1.2. Vị trí phân loại Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv.
Sâm Việt Nam là một loài mới của chi Panax L., họ Nhân Sâm (Araliaceae),
2
VN
U
là loài thứ 20 thuộc chi Panax được phát hiện trên thế giới và là loài thứ 3 của chi
Panax L. được tìm thấy và công bố chính thức ở Việt Nam. Đây là loài đặc hữu của
ma
c
Giới: Plantae
Ngành: Magnoliophyta
Bộ: Apiales
Họ: Araliaceae
- Chi: Panax
- Loài: Panax vietnamensis Ha & Grushv.
ha
r
-
y,
hệ thực vật Việt Nam (Theo Trung tâm Sâm Việt Nam - 1993) [54].
Về phân loại Sâm Việt Nam [53]:
ne
an
dP
- Tên khác: Sâm Việt Nam, Sâm Ngọc Linh, Sâm Khu Năm, Thuốc Dấu.
- Tên nước ngoài: Vietnamese ginseng
1.1.3. Đặc điểm thực vật Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv.
Cây thân thảo sống nhiều năm, cao đến 1 m. Thân rễ mập có đường kính 3,5
cm, không có rễ, có củ gần hình cầu, đường kính 5 cm. Đốt trên cùng của thân rễ
ed
ici
tồn tại 1-4 thân. Thân nhẵn cao 40-80 cm, rỗng, có 3 mặt hơi tròn, có những rãnh
nhỏ dọc theo chiều dọc. Lá mọc vòng, thường có 4 (ít khi 3, 5, 6). Lá kép chân vịt
có 5 (ít khi 6, 7) lá chét, lá dài 7-12 cm (ít khi 15 cm). Lá chét trên cùng hình trứng
ngược hoặc hình mũi mác, dài 8-14 cm, rộng 3-5 cm, đầu lá thường nhọn đột ngột,
Sc
ho
ol
of
M
mũi nhọn kéo 1,5-2 cm, góc lá hình nêm, mép lá có răng cưa nhỏ đều, gân bên 19 (ít
khi 8-11) cập dọc theo gân chính và gân bên ở mặt trên của lá chét có nhiều lông
cứng dạng gai dài đến 3 mm, mặt dưới ít hơn. Cụm hoa dài 25 cm, gấp 1,5-2 lần
chiều dài của cuống lá, thường mang tán đơn độc ở tận cùng, đôi khi có thêm 1-4
tán phụ hoặc một hoa đơn độc. Tán hoa đường kính 2,5-4 cm, có 50-120 hoa. Hoa
màu vàng lục nhạt, đường kính hoa nở 3-4 mm. Bầu 1 ô, 1 vòi (chiếm 80%) đôi khi
có 2 ô, 2 vòi (chiếm 20%). Quả khi chín thường màu đỏ, thường có một chấm đen ở
trên đỉnh quả. Quả 1 hạt hình thân, quả 2 hạt có hình cầu hơi dẹt dài 7-10 mm, rộng
Co
p
yri
gh
t@
4-6 mm [4].
Sâm Việt Nam mọc dưới tán rừng ẩm, nhiều mùn, thích hợp với nhiệt độ ban
ngày từ 20°C-25°C, ban đêm 15°C-18°C. Sâm Việt Nam có thể sống rất lâu, thậm
chí trên 100 năm, sinh trưởng khá chậm. Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là thân
rễ, củ và ngoài ra cũng có thể dùng lá và rễ con. Vào đầu tháng 1 hàng năm, Sâm
xuất hiện chồi mới sau mùa ngủ đông, thân khí sinh lớn dần lên thành cây Sâm
trưởng thành có 1 tán hoa. Từ tháng 4 đến tháng 6, cây nở hoa và kết quả. Tháng 7
bắt đầu có quả chín và kéo dài đến tháng 9. Cuối tháng 10, phần thân khí sinh tàn
3
ici
ne
an
dP
ha
r
ma
c
y,
VN
U
lụi dần, lá rụng, để lại một vết sẹo ở đầu củ Sâm và cây bắt đầu giai đoạn ngủ đông
hết tháng 12. Chính căn cứ vào vết sẹo trên đầu củ mỗi mùa đông đến mà người ta
có thể nhận biết cây Sâm bao nhiêu tuổi, phải ít nhất 3 năm tuổi, tức trên củ có một
sẹo (sau 3 năm đầu Sâm chỉ rụng một lá) mới có thể khai thác, khuyến cáo là trên 5
năm tuổi. Mùa đông cũng là mùa thu hoạch tốt nhất phần thân rễ của Sâm [53].
ho
ol
of
M
ed
Hình 1.1. Hình vẽ Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv [55].
1.1.4. Phân bố Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv.
Cây Sâm được phát hiện ở độ cao từ 1200 m trở lên, đạt mật độ cao nhất ở
khoảng từ 1700-2000 m dưới tán rừng già, và cho tới nay chỉ có hai tỉnh Kon Tum
và Quảng Nam là có Sâm này. Sâm mọc tập trung dưới chân núi Ngọc Linh, một
ngọn núi cao 2578 m với lớp đất vàng đỏ trên đá granit dày trên 50 m, có độ mùn
cao, tơi xốp và rừng nguyên sinh còn rộng [53].
1.1.5. Thành phần hóa học Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv.
Co
p
yri
gh
t@
Sc
Thành phần chủ yếu trong các loài thuộc chi Panax L. nói chung hay Sâm
Việt Nam nói riêng là saponin sâm hay còn gọi là ginsenosid. Loại và tỷ lệ
ginsenosid khác nhau giữa các loài và giữa các bộ phân của loài. Theo nghiên cứu
tổng quan về Sâm Việt Nam – Panax vietnamensis đã công bố gần 50 hợp chất
saponin gồm các dẫn xuất của các dạng protopanaxadiol, ocotillol, oleanolic,
panaxatriol và dammarenediol [20]. Các cấu trúc saponin này có từ 2-6 phân tử
đường, chủ yếu là đường 6 cạnh gồm glucose, xylose và rhamnose.
Ngoài các ginsenosid, trong các bộ phận khác nhau của Sâm Việt Nam còn
có chứa polyacetylen, polysaccharid, flavonoid, daucosterin, chất nhầy, acid amin,
chất đắng, vitamin, cholin, pectin, dầu béo và tinh dầu [4].
4
VN
U
1.1.5.1. Cấu trúc các saponin Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv.
a. Các saponin có cấu trúc dạng protopanaxadiol.
TT
Tên
R1
R2
Ginsenosid Rb1
-Glc2-1Glc
2
Ginsenosid Rb2
-Glc2-1Glc
3
Ginsenosid Rb3
-Glc2-1Glc
4
Ginsenosid Rc
-Glc2-1Glc
5
Ginsenosid Rd
-Glc2-1Glc
6
Gypenosid XVII
-Glc
7
Notoginsenosid Fa
-Glc2-1Glc2-1Xyl
8
Notoginsenosid R4
9
Kiểu cấu trúc
-Glc6-1Glc
A
-Glc6-1Ara(p)
A
-Glc6-1Xyl
A
-Glc6-1Ara(f)
A
-Glc
A
-Glc6-1Glc
A
-Glc6-1Glc
A
-Glc2-1Glc
-Glc6-1Glc6-1Xyl
A
Quinquenosid R1
-Glc2-1Glc6-Ac
hoặc -Glc2-1Glc
-Glc2-1Glc6-Ac
hoặc -Glc2-1Glc
A
10
Yesanchinosid J
-Glc2-1Glc
6|
Ac
-Glc6-1Glc6-1Xyl
A
11
Ginsenosid Re
-Glc6-1Rha
-Glc
B
12
Ginsenosid 20gluco-Rf
-Glc2-1Glc
-Glc
B
13
Ginsenosid Rg1
-Glc
-Glc
B
14
Ginsenosid 20(S)- -Glc
Rh1
-H
B
15
Ginsenosid Rh5
-CH3
B
gh
t@
Sc
ho
ol
of
M
ed
ici
ne
an
dP
1
yri
Co
p
ha
r
ma
c
y,
Bảng 1.1. Các saponin có cấu trúc dạng protopanaxadiol trong Sâm Việt Nam [20]
-Glc
5
Vina-ginsenosid R8 -Glc2-1Glc
C
VN
U
-Glc
R1
R2
Quinquenosid L2
-Glc2-1Glc
18
Notoginsenosid R1
-H
19
Notoginsenosid R6
-H
20
Pseudo-ginsenosid
RS1
-H
21
Vina-ginsenosid R4 -Glc2-1Glc
-Glc
Kiểu cấu
trúc
-
D
-Glc2-1Xyl
-Glc
E
-Glc
-Glc61
αGlc
E
-Glc2-1Rha
6|
Ac
-H
-Glc
E
-Glc
E
Co
p
yri
gh
t@
Sc
ho
ol
of
M
ed
ici
17
R3
ha
r
Tên
ne
an
dP
TT
ma
c
y,
16
6
ma
c
y,
VN
U
Bảng 1.1. Các saponin có cấu trúc dạng protopanaxadiol trong Sâm Việt Nam (tiếp)
Tên
R1
R2
22
24(S)-Vinaginsenosid R9
-Glc2-1Glc
-Glc
23
24(R)-Vina-Glc2-1Glc
ginsenosid R9 (=
Majorosid F1)
-Glc
F
24
Vina-ginsenosid
R13
-Glc2-1Glc
-Glc
G
25
Ginsenosid Rh4
-Glc
ici
ne
an
dP
Tên
R1
-
H
R2
Kiểu cấu trúc
Ginsenosid 20(R)- -Glc
Rh1
-
K
27
Vina-ginsenosid
R25
-Glc
28
Vina-ginsenosid
R12
-Glc
Sc
26
-Glc
M
-
Co
p
yri
gh
t@
F
ed
ho
ol
of
M
TT
Kiểu cấu trúc
ha
r
TT
7
N
VN
U
b. Các saponin có cấu trúc dạng ocotillol
ha
r
ma
c
y,
Bảng 1.2. Các saponin có cấu trúc dạng ocotillol trong Sâm Việt Nam [20]
Tên
R1
29
24(S)-Majonosid R1
30
24(S)-Majonosid R2
31
Protopanaxatriol oxid II
32
24(S)-Pseudo-ginsenosid F11
33
ne
an
dP
TT
R2
-H
-Glc2-1Xyl
-H
-H
-H
-Glc2-1Rha
6|
Ac
-H
24(S)-Pseudo-ginsenosid RT4
-Glc
-H
34
Vina-ginsenosid R1
-Glc2-1Rha
-H
35
Vina-ginsenosid R2
-Glc2-1Xyl
-H
36
Vina-ginsenosid R5
-Glc2-1Xyl4-αGlc
-H
37
Vina-ginsenosid R6
-Glc2-1Xyl
-H
ho
ol
of
M
6
1
αGlc
-Glc2-1Xyl
Sc
Vina-ginsenosid R14
Co
p
yri
gh
t@
38
ed
ici
-Glc2-1Glc
8
-OH
VN
U
c. Các saponin có cấu trúc dạng oleanolic
39
Tên
R1
Ginsenosid Ro (=
-Glc
Chikusetsusaponin V)
40
Chikusetsusaponin
-H
Hemslosid-Ma3
-Glc
R4
R5
-H
-H
-H
-Glc
-H
-H
-H
-Glc
-H
-H
-Glc
-Ara(p)
ed
41
R3
ici
IVa
R2
ne
an
dP
TT
ha
r
ma
c
y,
Bảng 1.3. Các saponin có cấu trúc dạng oleanolic trong Sâm Việt Nam [20]
gh
t@
Sc
ho
ol
of
M
d. Các saponin có cấu trúc dạng panaxatriol
Bảng 1.4. Các saponin có cấu trúc dạng panaxatriol trong Sâm Việt Nam [20]
TT
Tên
R1
R2
Vina-ginsenosid R10
-Glc
-OH
43
Vina-ginsenosid R11
-Glc2-1Xyl
-OH
Co
p
yri
42
9
VN
U
e. Các saponin có cấu trúc dạng dammarenediol
TT
R1
Vina-ginsenosid R3
-Glc
R2
-Glc2-1Glc
ne
an
dP
44
Tên
ha
r
ma
c
y,
Bảng 1.5. Các saponin có cấu trúc dạng dammarenediol trong Sâm Việt Nam [20]
1.1.5.2. Cấu trúc các polyacetylen
Polyacetylen thường là các hydrocarbon mạch thẳng 17 và 18 carbon với
những nhóm chất liên kết. Đó là đặc điểm của đa số hợp chất có chứa một đầu là
ici
nhóm 3-hydroxyl (hoặc 3-oxo) heptadeca-1-en-4,6-diyn, đầu còn lại của hợp chất là
ed
chuỗi C7H15 [18,21,34].
1.1.6. Tác dụng sinh học của các hợp chất có trong Sâm Việt Nam Panax
ho
ol
of
M
vietnamensis Ha & Grushv.
Do có thành phần chính gồm các ginsenosid cho nên các các dụng sinh học
của Sâm hầu hết đều do ginsenosid đem lại.
- Tác dụng trên hệ thần kinh trung ương
Sâm Việt Nam liều thấp có tác dụng kích thích thần kinh, làm tăng hoạt động
Sc
vận động và trí nhớ, nhưng liều cao lại ức chế thần kinh [1].
- Tác dụng chống trầm cảm
gh
t@
Sâm Việt Nam có tác dụng chống trầm cảm ở liều uống một lần 200 mg/kg
hoặc liều 50-100 mg/kg dùng luôn 7 ngày ở chuột nhắt trắng, majonosid R2 tiêm
trong màng bụng có tác dụng chống trầm cảm ở cả 3 liều 3,1; 6,2; 12,5 mg/kg [1].
Co
p
yri
- Tác dụng tăng sinh lực
Sâm Việt Nam có tác dụng tăng sinh lực trong thí nghiệm chuột bơi, làm
tăng sinh lực chống lại mệt mỏi, giúp phục hồi sức lực [1].
10
VN
U
- Tác dụng sinh thích ứng
+ Trong stress vật lý, cho chuột nhắt uống Sâm Việt Nam liều 100 mg/kg có
5°C) làm kéo dài thời gian sống thêm cả chuột thí nghiệm [1].
y,
tác dụng làm tăng khả năng chịu đựng đối với nước nóng (37°C-42°C) và lạnh (-
ma
c
+ Trong stress cô lập, chuột nhắt trắng được nuôi riêng từng con trong 4
tuần, thời gian ngủ khi tiêm Natri barbital giảm đi 30%. Sâm Việt Nam liều uống
mg/kg làm thời gian ngủ trở lại gần bình thường [1].
ne
an
dP
- Tác dụng chống oxy hóa
ha
r
50-100 mg/kg hoặc hoạt chất majonosid R2 tiêm trong màng bụng liều 3,2; 12,5
Trên thí nghiệm in vitro dùng dịch nổi của mô não, gan và phân đoạn vi thể
gan của chuột nhắt trắng, saponin Sâm Việt Nam ở nồng độ 0,05-0,5 mg/ml có tác
dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành MDA (Malondialdehyd) là sản phẩm của
quá trình oxy hóa lipid màng sinh học [1].
ici
- Tác dụng kích thích miễn dịch
Bột chiết Sâm Việt Nam liều uống 500 mg/kg và majonosid R2 tiêm trong
ho
ol
of
M
ở chuột nhắt trắng [1].
ed
màng bụng có tác dụng làm tăng chỉ số thực bào trong thí nghiệm in vitro và in vivo
Dùng liều Escherichia coli gây chết chuột nhắt trắng. Nếu kết hợp dùng sâm
và majonosid R2 với liều trên sẽ làm tăng tỷ lệ số chuột sống sót. Có lẽ do thuốc làm
tăng tác dụng thực bào với E. coli [1].
- Tác dụng phục hồi máu
Trong thí nghiệm làm giảm hồng cầu và bạch cầu ở động vật thí nghiệm, Sâm
Sc
Việt Nam có tác dụng làm phục hồi số lượng hồng cầu và bạch cầu đã bị giảm [1].
gh
t@
- Các tác dụng dược lý khác
Sâm Việt Nam còn có tác dụng tăng cường nội tiết tố sinh dục, điều hòa hoạt
động của tim, tác dụng chống tăng cholesterol máu, tác dụng bảo vệ gan, có tác
dụng chống viêm và ức chế sự phát triển vi khuẩn Streptococcus gây bệnh viêm
Co
p
yri
họng ở người [1].
1.2. Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu – Sâm Lai Châu
Năm 2003, Zhu và cộng sự đã mô tả một thứ mới có tên khoa học Panax
11
VN
U
vietnamensis var. fuscidiscus K. Komatsu, S. Zhu & S.Q. Cai, bậc phân loại dưới
loài của Panax vietnamensis. Thứ này được phát hiện tại vùng Jinping, phía nam
tỉnh Vân Nam, Trung Quốc. Gần đây Phan Kế Long và cộng sự (2013) đã phát hiện
y,
thứ Panax vietnamensis var. fuscidiscus nói trên có phân bố ở tỉnh Lai Châu, Việt
Nam và được gọi tên là Sâm Lai Châu [38].
ma
c
1.2.1. Đặc điểm thực vật
Cây thảo, sống lâu năm. Cây mang hoa cao khoảng 0,5-0,8 m. Thân rễ nạc,
ha
r
dài 15-20 cm hoặc hơn. Thân mọc thẳng, hình trụ, đường kính 5-8 mm, lõi thân
xốp. Lá kép chân vịt, mọc vòng (3)-4(5-6) lá ở ngọn thân với 5-(6-7) lá chét. Các lá
ne
an
dP
chét không đều nhau, lá ở giữa to và nhỏ dần sang hai bên. Cuống lá dài 7-12 cm,
có khi lên tới 14 cm, không có lá kèm hoặc lá kèm nhỏ. Cuống lá chét dài (0,3)-0,81,4 cm, gốc có lông hình móc, dài khoảng 2 mm. Lá hình bầu dục, kích thước 8-12
x 2,5-3 cm. Mũi lá nhọn, dài 1,5-2 cm. Gốc lá hình nêm, mép lá khía răng cưa. Lá
có (6)-8-(10) cặp gân, gân chính và các gân bên đều phủ lông hình móc thưa, dài
khoảng 2 mm. Cụm hoa tán đơn hình cầu, đường kính 2,5-4 cm, mang khoảng 50-
ici
120 hoa. Cuống tán hoa dài 25-35 cm. Cuống hoa dài 1,5-2 cm. Hoa màu xanh nhạt
ed
hay vàng nhạt, mẫu 5, hiếm khi mẫu 6. Đài hoa hình tam giác, dài khoảng 0,2 mm.
Tràng thuôn, rời nhau, dài khoảng 2 mm. Đế hoa lúc đầu hơi lồi, sau phẳng và sẫm
ho
ol
of
M
màu dần. Nhị hoa màu trắng, hơi thò. Chỉ nhị hình sợi mảnh, dài khoảng 2,5 mm.
Bầu 2 ô, 2 vòi nhụy, phát triển thành quả, 1 ô thường tiêu biến. Quả dẹt, kích thước
7 x 6 mm, màu nâu đỏ đến nâu tím với núm nhụy màu đen khi chín [38].
Sâm Lai Châu ra hoa vào tháng 6-7, quả trưởng thành vào tháng 10-11, quả
Co
p
yri
gh
t@
Sc
chín vào tháng 5-6 năm sau [38].
12
VN
U
y,
ma
c
ha
r
ne
an
dP
ici
ed
Hình 1.2. Hình ảnh của Sâm Lai Châu Panax vietnamensis var. fuscidiscus [38].
Sc
ho
ol
of
M
1.2.2. Phân bố
Sâm Lai Châu xuất hiện trong giới hạn diện tích nhỏ của huyện Mường Tè,
tỉnh Lai Châu. Chúng được tìm thấy trong rừng rậm nguyên sinh mưa mùa nhiệt đới
chưa bị tác động hoặc tác động nhẹ [38].
Sâm Lai Châu phân bố ở độ cao 1900 m, thuộc phần trên của đai núi thấp và
phần dưới của đai núi cao. Nơi đây có độ tàn che ít nhất 70%, bao gồm các loài cây
phổ biến thuộc các họ: Orchidaceae, Rubiaceae, Euphorbiaceae, Moraceae,
Fagaceae, Acanthaceae và Fabaceae. Các loại đá mẹ ở đây là sa thạch rắn biến chất
gh
t@
sâu sắc pha trộn với đá phiến sét [38].
Co
p
yri
1.2.3. Mối quan hệ di truyền giữa Sâm Lai Châu và Sâm Việt Nam
Theo Phan Kế Long và cộng sự (2014), hai thứ Sâm Lai Châu (P.
vietnamensis var. fuscidiscus) và Sâm Việt Nam (hay Sâm Ngọc Linh, P.
vietnamensis Ha & Grushv. var. vietnamensis) của loài Sâm Việt (P. vietnamensis
Ha & Grushv) có quan hệ chị em [3]. Cụ thể khi so sánh khoảng cách di truyền giữa
loài Sâm Lai Châu và Sâm Việt Nam (hay Sâm Ngọc Linh) thì khoảng cách di truyền
rất thấp (0,7%) và số vị trí nucleotide sai khác của 2 loài này là 4 nucleotide [7].
13
VN
U
1.2.4. Thành phần hóa học
Các nghiên cứu về thành phần hóa học của Sâm Lai Châu còn rất hạn chế.
y,
Theo nghiên cứu của Zhu và cộng sự (2004), phần thân rễ Sâm Lai Châu Panax
vietnamensis var. fuscidiscus có chứa các hợp chất ginsenosid Rb1, ginsenosid Rc,
ha
r
ma
c
ginsenosid Rd, ginsenosid Re, ginsenosid Rg1, notoginsenosid R2, majonosid R2,
ginsenosid Ro [20,52]. Ngoại trừ notoginsenosid R2, các ginsenosid Rb1, ginsenosid
Rc, ginsenosid Rd, ginsenosid Re, ginsenosid Rg1, ginsenosid Ro cũng là những
thành phần hóa học có chứa trong Sâm Việt Nam (mục 1.1.5).
Tên
ne
an
dP
Bảng 1.6. Cấu trúc hóa học của notoginsenosid R2
R1
-Glc2-1Xyl
-H
ici
Notoginsenosid R2
R2
R3
-H
R4
-H
TLTK
[20,52]
Co
p
yri
gh
t@
Sc
ho
ol
of
M
ed
1.2.5. Tác dụng sinh học
Theo tìm hiểu các nghiên cứu, cho đến nay chưa có nghiên cứu nào đánh giá
tác dụng sinh học của Sâm Lai Châu. Tuy nhiên, dựa vào kết quả nghiên cứu thành
phần hóa học của Sâm Lai Châu [52] và các nghiên cứu về mối quan hệ di truyền
giữa Sâm Lai Châu và Sâm Việt Nam [3,7] ta có thể cho những dự đoán rằng Sâm
Lai Châu cũng có các tác dụng sinh học tương tự như Sâm Việt Nam.
14
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
VN
U
CHƢƠNG 2
ne
an
dP
ha
r
ma
c
y,
2.1. Đối tƣợng
- Dược liệu nghiên cứu là thân rễ của Sâm Lai Châu được cung cấp bởi Chủ
nhiệm đề tài KHCN-TB.16C/13-18, ThS. Phạm Quang Tuyến vào tháng 10/2016.
Dược liệu thu về được rửa sạch, thái lát mỏng, sấy khô ở 40-50oC đạt độ ẩm khoảng
5%, xay nhỏ và bảo quản trong túi nylon kín làm nguyên liệu nghiên cứu về mặt
hóa học.
2.2. Hoá chất, thiết bị
2.2.1. Hoá chất
Các dung môi hóa chất dùng trong phân tích đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt
Nam IV: Cồn 70%, nước cất hai lần, dung môi n-butanol, methanol, aceton,
dicloromethan.
ici
Bột silica gel pha thường (0,040-0,063 mm, Merck), bột silica gel pha đảo
YMC (30-50 µm, FuJi Silisa Chemical Ltd.).
ed
Chất hấp phụ SephadexTM LH-20 (Amersham Bioscience, Uppsala, Thụy Sỹ).
ho
ol
of
M
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60G
F254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm).
Dung dịch thuốc thử H2SO4 10% trong ethanol hơ nóng để phát hiện vết chất.
2.2.2. Thiết bị
Co
p
yri
gh
t@
Sc
- Các dụng cụ cần thiết dùng trong quá trình thực nghiệm: cột sắc ký, bình
cầu, bình nón, ống đong, ống nghiệm…
- Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (BUCHI).
- Tủ sấy Memmert, Binder-FD115.
- Bếp điện, bếp đun cách thủy.
- Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR.
- Đèn UV- Vilber lourmat, máy chụp ảnh UV.
- Máy siêu âm Power sonic 405.
- Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC).
- Phổ tử ngoại được ghi trên máy UV-VIS Cary, Khoa phân tích - Viện
Dược liệu.
- [α]D đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY polarimeter
15
VN
U
- Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass
Spectrometry, ESI-MS) được đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap của Viện
Hoá học Các hợp chất Thiên nhiên, VKH&CNVN.
y,
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR
của Viện Hoá học, VKH&CNVN.
ma
c
2.3. Phƣơng pháp chiết xuất phân lập và xác định cấu trúc hợp chất tinh khiết
ha
r
2.3.1. Phƣơng pháp chiết xuất và phân lập
Thân rễ Sâm Lai Châu được chiết xuất bằng phương pháp chiết ngấm kiệt
với dung môi cồn 70%. Tiến hành lọc loại bã dược liệu, gộp dịch lọc, cất thu hồi
dung môi dưới áp suất giảm thu được cao đặc. Cao này được hòa lại với nước và
ne
an
dP
chiết phân đoạn lần lượt với dung môi có độ phân cực tăng dần dicloromethan, nbutanol thu được các phân đoạn tương ứng.
Các hợp chất trong thân rễ Sâm Lai Châu được phân lập bằng phương pháp
sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel pha thường (0,040-0,063 mm, Merck),
silica gel pha đảo YMC C18 (30-35 mm, FuJisilisa Chemical Ltd.).
ici
Theo dõi, kiểm tra các phân đoạn của sắc ký cột bằng sắc ký lớp mỏng, thực
ed
hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60G F254 (Merck), RP-18 (Merck). Phát
hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc
ho
ol
of
M
thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol.
Thu gom, tinh chế các chất phân lập được bằng dung môi thích hợp. Kiểm tra độ
sạch của các chất phân lập được bằng sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi phù hợp.
Tiến hành:
+ Lựa chọn hệ dung môi thích hợp để rửa giải: khảo sát cao tổng bằng sắc ký
Sc
lớp mỏng với nhiều hệ dung môi khác nhau, chọn hệ dung môi có khả năng tách tốt
để làm dung môi rửa giải.
gh
t@
+ Chuẩn bị cột: cột sắc ký rửa sạch, sấy khô, lắp thẳng đứng trên giá cố định.
Lót một lớp bông xuống đáy cột. Cân một lượng thích hợp chất nhồi cột vào cốc có
mỏ, thêm dung môi thích hợp vào khuấy đều cho hết bọt khí thu được hỗn dịch. Mở
khóa cột, từ từ rót hỗn dịch đã chuẩn bị lên cột, vừa rót vừa gõ nhẹ, đều và đối xứng
yri
quanh thân cột. Sau khi đưa hết pha tĩnh lên cột, tiếp tục cho dung môi chảy liên tục
Co
p
qua cột đến khi cột hoàn toàn ổn định (có thể từ 5-10 giờ). Chú ý không được để cột
bị khô dung môi.
16