NGHIÊN cứu sự mất ổn ĐỊNH VI vệ TINH TRONG UNG THƯ đại TRỰC TRÀNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP hóa mô MIỄN DỊCH

BỘ Y TẾ
BỆNH VIỆN K

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ

NGHIÊN CỨU SỰ MẤT ỔN ĐỊNH VI VỆ TINH
TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA MÔ MIỄN DỊCH

Chủ nhiệm đề tài

: TS.BS. Nguyễn Văn Chủ

Nhóm nghiên cứu

: Mai Thị Nhung

HÀ NỘI, NĂM 2018


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AJCC
cs
GPB
HE
HMMD
hpf
LS
MBH
MLH1
MMR

MSH2
MSH6
MSI
PMS2
TILs
TNM
UTBM
WHO
XN

: American Joint Committee on Cancer
: Cộng sự
: Giải phẫu bệnh
: Hematoxylin-Eosin
: Hóa mô miễn dịch
: High power field (Vi trường có độ phóng đại lớn)
: Lâm sàng
: Mô bệnh học
: mutL homolog 1
: Mismatch Repair
: mutS homolog 2
: mutS homolog 6
: MicroSattelite Instable
: postmeiotic segregation increased 2
: Tumor infiltrating lymphocytes (lympho xâm nhập u)
: Tumor, Node, Metastasis
: Ung thư biểu mô
: World Health Organization (Tổ chức y tế thế giới)
: Xâm nhập

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................3
1.1. Ung thư đại trực tràng được chia thành 3 dạng chính.............................3
1.1.1. Ung thư ĐTT không polyp di truyền - Hội chứng Lynch................3
1.1.2. Ung thư ĐTT MSI đơn lẻ.................................................................5
1.2. Cơ sở phân tử của ung thư ĐTT MSI.....................................................5
1.2.1. Tính mất ổn định vi vệ tinh..............................................................5
1.2.2. Cơ chế MMR ...................................................................................5
1.2.3. Đột biến gen MMR và nguy cơ ung thư...........................................6
1.3. MSI là một cơ chế duy nhất trong phát triển u.......................................6
1.3.1. MLH1, PMS2, PMS1 và MSH6.......................................................7
1.3.2. MSI-H và MSI-L..............................................................................8
1.4. Chẩn đoán MSI.......................................................................................9
1.4.1. Bộc lộ protein của MMR: Hoá mô miễn dịch..................................9
1.4.2. Hạn chế của HMMD trong chẩn đoán MSI....................................12
1.4.3. Nguyên lý cơ bản của hoá mô miễn dịch.......................................14
1.5. Vai trò dự báo sự đáp ứng với hóa trị của MSI.....................................16
1.6. Vai trò dự báo sự tiên lượng của MSI...................................................17
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..............18
2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu.........................................................18
2.2. Đối tượng nghiên cứu...........................................................................18
2.3. Thiết kế nghiên cứu...............................................................................18
2.4. Cỡ mẫu và chọn mẫu:...........................................................................18
2.5. Biến số và các chỉ số nghiên cứu..........................................................19
2.6. Công cụ và kỹ thuật thu thập thông tin.................................................20


2.6.1. Công cụ thu thập thông tin.............................................................20

2.6.2. Kỹ thuật thu thập thông tin.............................................................20
2.7. Xử lý và phân tích số liệu.....................................................................23
2.8. Khống chế sai số...................................................................................23
2.9. Đạo đức trong nghiên cứu.....................................................................23
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU........................................................24
3.1. Tình trạng MSI và thể lâm sàng............................................................24
3.1.1. Tình trạng MSI...............................................................................24
3.1.2. Thể lâm sàng ung thư ĐTT.............................................................25
3.2. Mối liên quan giữa MSI, thể lâm sàng với một số đặc điểm GPB-LS. 26
3.2.1. Mối liên quan với nhóm tuổi..........................................................26
3.2.2. Mối liên quan với vị trí u................................................................27
3.2.3. Mối liên quan với tình trạng hạch..................................................28
3.2.4. Mối liên quan với giai đoạn TNM sau mổ.....................................29
3.2.5. Mối liên quan với typ MBH...........................................................30
3.2.6. Mối liên quan với độ mô học.........................................................31
3.2.7. Mối liên quan với sự xâm nhập lympho vào mô u.........................32
3.2.8. Mối liên quan với phản ứng lympho dạng Crohn..........................33
3.2.9. Mối liên quan với sự xâm nhập thần kinh......................................34
3.2.10. Mối liên quan với sự xâm nhập mạch..........................................34
Chương 4: BÀN LUẬN.................................................................................36
4.1. Tình trạng MSI và thể lâm sàng............................................................36
4.1.1. Tình trạng MSI...............................................................................36
4.1.2. Thể lâm sàng ung thư ĐTT.............................................................38
4.2. Mối liên quan giữa MSI, thể lâm sàng với các đặc điểm GPB-LS.......40
4.2.1. Mối liên quan với một số đặc điểm lâm sàng.................................40
4.2.2. Mối liên quan với các đặc điểm giải phẫu bệnh.............................41


4.2.3. Mối liên quan với phản ứng của cơ thể..........................................44
KẾT LUẬN....................................................................................................47

KIẾN NGHỊ...................................................................................................48
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Tiêu chuẩn HMMD xác định MSI và thể lâm sàng...................19
Bảng 3.1. Tỷ lệ bộc lộ các dấu ấn.................................................................24
Bảng 3.2. Tỷ lệ không bộc lộ của các cặp dấu ấn........................................24
Bảng 3.3. Tình trạng MSI.............................................................................25
Bảng 3.4. Thể lâm sàng ung thư ĐTT..........................................................25
Bảng 3.5. Mối liên quan với nhóm tuổi.......................................................26
Bảng 3.6. Mối liên quan giữa thể lâm sàng với nhóm tuổi........................26
Bảng 3.7. Mối liên quan với vị trí u.............................................................27
Bảng 3.8. Mối liên quan giữa thể lâm sàng với vị trí u..............................27
Bảng 3.9. Mối liên quan với tình trạng hạch..............................................28
Bảng 3.10. Mối liên quan giữa thể lâm sàng với tình trạng hạch.............28
Bảng 3.11. Mối liên quan với giai đoạn TNM sau mổ...............................29
Bảng 3.12. Mối liên quan giữa thể lâm sàng với giai đoạn TNM sau mổ.29
Bảng 3.13. Mối liên quan với typ MBH.......................................................30
Bảng 3.14. Mối liên quan giữa thể lâm sàng với typ MBH........................30
Bảng 3.15. Mối liên quan với độ mô học.....................................................31
Bảng 3.16. Mối liên quan giữa thể lâm sàng với độ mô học......................31
Bảng 3.17. Mối liên quan với mô xâm nhập lympho..................................32
Bảng 3.18. Mối liên quan giữa thể lâm sàng với mô đệm lympho............32
Bảng 3.19. Mối liên quan với phản ứng lympho dạng Crohn...................33
Bảng 3.20. Mối liên quan giữa thể lâm sàng với phản ứng lympho dạng
Crohn..............................................................................................33
Bảng 3.21. Mối liên quan với sự xâm nhập thần kinh...............................34
Bảng 3.22. Mối liên quan giữa thể lâm sàng với sự xâm nhập thần kinh 34

Bảng 3.23. Mối liên quan với sự xâm nhập mạch.......................................34


Bảng 3.24. Mối liên quan giữa thể lâm sàng với sự xâm nhập mạch.............35


DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1. Nguyên lý cơ bản của kỹ thuật HMMD.........................................16


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh sinh của ung thư đại trực tràng (ĐTT) vẫn chưa rõ, thường được
xác định bằng 2 con đường phân tử của sự mất ổn định gen. Một là sự mất ổn
định nhiễm sắc thể, nó liên quan tới các gen ức chế ung thư hoặc gen ung thư
nào đó như là APC, KRAS và p53. Hai là sự mất ổn định vi vệ tinh (MSI) do
sự khiếm khuyết hệ thống sửa chữa bắt cặp sai và chiếm khoảng 15% tất cả
các ung thư ĐTT. Hầu hết ung thư ĐTT MSI (12%) là đơn lẻ, nó góp phần
vào sự methyl hóa quá mức chất hoạt hóa MLH1 mắc phải, được kèm theo
bởi kiểu hình methyl hóa đảo CpG. Khoảng 3% ung thư ĐTT MSI là ung thư
ĐTT liên quan tới hội chứng Lynch, là ung thư ĐTT không polyp di truyền
(HNPCC - Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer), một loại ung thư
ĐTT di truyền kinh điển .
Ung thư ĐTT khiếm khuyết hệ thống sửa chữa bắt cặp sai có đặc trưng
GPB-LS rõ ràng: bệnh nhân trẻ, vị trí gần, phản ứng đệm lympho dạng Crohn,
typ tế bào nhẫn hoặc chế nhày, thể tủy. Các bệnh nhân có MSI-H có tiên
lượng và đáp ứng với điều trị khác với các bệnh nhân ổn định vi vệ tinh
(MSS). Do vậy việc xác định MSI có ý nghĩa rất quan trọng, không chỉ để
sàng lọc hội chứng Lynch mà còn giúp phân biệt giữa ung thư ĐTT khiếm

khuyết hệ thống sửa chữa bắt cặp sai với ung thư ĐTT MSS, nó sẽ cung cấp
các thông tin có giá trị cho tiên lượng và việc cả thể hóa trong điều trị. Việc
chẩn đoán MSI ở mảnh sinh thiết có thể cung cấp các thông tin quan trọng
trong việc ra quyết định xử lý phẫu thuật ung thư ĐTT (cắt đoạn với cắt ĐTT
gần toàn bộ). MSI có thể gặp trong nhiều ung thư như ung thư nội mạc tử
cung, ung thư dạ dày, ung thư buồng trứng, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư
đường gan mật, đường niệu, u não và ung thư da. Trong đó ung thư gặp phổ
biến nhất là ung thư ĐTT … Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy MSI


2

trong ung thư ĐTT có nhiều ý nghĩa lâm sàng rõ rệt. So với các u có sự ổn
định hệ thống sửa chữa bắt cặp sai, các u có thiếu hụt có tỉ lệ tái phát và di căn
giảm, tỉ lệ sống sót cao hơn .
Với sự phát triển vượt bậc của ngành sinh học phân tử hiện nay, cho
phép phát hiện tương đối chính xác và ngày càng đầy đủ các dạng đột biến
gen quan trọng trong các dòng tế bào ung thư như ung thư phổi, u lympho,
ung thư ĐTT,…Có 3 con đường thay đổi gen hiện được nhận biết rõ trong
ung thư ĐTT: con đường mất ổn định nhiễm sắc thể (CIN), con đường mất ổn
định vi vệ tinh (MSI) và con đường methyl hóa đảo CpG. Đa số ung thư ĐTT
phát triển theo con đường mất ổn định nhiễm sắc thể (CIN), trong khi khoảng
15% từ con đường mất ổn định vi vệ tinh (MSI) .
Sự mất ổn định vi vệ tinh có thể được phát hiện bằng giải trình tự DNA
tại phòng sinh học phân tử hoặc gián tiếp qua việc xác định mất biểu hiện của
các protein tương ứng với các gen sửa chữa bắt cặp sai bằng phương pháp hóa
mô miễn dịch trong các phòng xét nghiệm thông thường của bệnh viện.
Ở Việt Nam, có nhiều nghiên cứu về lâm sàng, nội soi hoặc đặc điểm mô
bệnh học của ung thư ĐTT. Bên cạnh đó cũng có một số nghiên cứu về đột biến
gen theo con đường CIN (đột biến K-ras, mất APC,…). Tuy nhiên còn ít những

nghiên cứu về mất ổn định vi vệ tinh trong ung thư ĐTT. Vì vậy, chúng tôi tiến
hành nghiên cứu “Nghiên cứu sự mất ổn định vi vệ tinh trong ung thư đại trực
tràng bằng phương pháp hóa mô miễn dịch” với 2 mục tiêu:
1.

Xác định tình trạng mất ổn định vi vệ tinh (MSI) và các thể lâm sàng
trong ung thư đại trực tràng.

2.

Nhận xét một số mối liên quan giữa tình trạng mất ổn định vi vệ tinh
(MSI), thể lâm sàng với một số đặc điểm GPB-LS của ung thư ĐTT.


3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Ung thư đại trực tràng được chia thành 3 dạng chính
- Đơn lẻ
- Tính gia đình
- Di truyền: gồm 3 nhóm chính:
+ Sinh polyp u tuyến có tính gia đình (FAP),
+ Ung thư ĐTT không polyp, di truyền (HNPCC - Hội chứng Lynch). Hội
chứng Lynch được lấy theo tên nhà khoa học đầu tiên công bố về căn bệnh này.
+ Hội chứng giống Lynch.
1.1.1. Ung thư ĐTT không polyp di truyền - Hội chứng Lynch
Hội chứng Lynch chiếm khoảng 3-4% tổng số ung thư ĐTT và chiếm
1/3 tất cả các ung thư ĐTT liên quan đến dMMR / MSI. Hội chứng Lynch là
một hội chứng di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường, do những đột biến

gây bất hoạt ở những gen tham gia vào hệ thống sửa chữa bắt cặp sai (MMR):
MLH1, MSH2, MSH6 và PMS2, trong đó chủ yếu là gen MLH1 và MSH2 .
Do vậy ung thư ĐTT có thể được chia nhỏ thành 2 nhóm phân tử: mất ổn định
vi vệ tinh (MSI) và ổn định vi vệ tinh (MSS).
Bệnh nhân có hội chứng Lynch bắt đầu phát triển ung thư ĐTT ở thời trẻ
và tỷ lệ ung thư ĐTT tăng theo tuổi.
Bệnh nhân có hội chứng Lynch có nguy cơ phát triển ung thư ĐTT cao
nhất, tiếp đến là ung thư nội mạc tử cung. Bệnh nhân cũng có nguy cơ mắc
ung thư dạ dày, buồng trứng, đường tiết niệu, ruột non và tuyến tiền liệt.
Nguy cơ ước tính tích lũy ung thư ĐTT đến 70 tuổi đối với bệnh nhân hội
chứng Lynch là khoảng 50% trong trường hợp đột biến MLH1 hoặc MSH2.


4

Các bệnh nhân ung thư ĐTT có hội chứng Lynch ít có khả năng mang
đột biến KRAS so với các trường hợp ung thư pMMR / MSS và điều quan
trọng là thiếu đột biến BRAF V600E ở những bệnh nhân này. Trong số các
ung thư ĐTT dMMR / MSI, xét nghiệm đột biến BRAF V600E có thể được
thực hiện để phân biệt các trường hợp hội chứng Lynch với ung thư ĐTT
dMMR đơn lẻ.
Các tiêu chuẩn Bethesda đã được sửa đổi vào năm 2004 để hướng dẫn
lựa chọn bệnh nhân cho xét nghiệm hội chứng Lynch. Hướng dẫn chỉ ra rằng
các bệnh nhân sau cần được kiểm tra MSI :
1. Ung thư ĐTT được chẩn đoán ở bệnh nhân dưới 50 tuổi.
2. Sự có mặt của nhiều khối u ĐTT, hoặc các khối u khác liên quan đến
hội chứng Lynch, bất kể tuổi tác.
3. Ung thư ĐTT với đặc điểm mô học của khối u MSI-H được chẩn đoán
ở bệnh nhân dưới 60 tuổi.
4. Ung thư ĐTT được chẩn đoán ở một hoặc nhiều người có quan hệ họ

hàng với người có khối u liên quan đến hội chứng Lynch, với một trong số họ
được chẩn đoán ung thư dưới 50 tuổi.
5. Ung thư ĐTT được chẩn đoán ở hai hoặc nhiều người có quan hệ họ
hàng thứ nhất hoặc thứ hai với khối u liên quan đến hội chứng Lynch, bất kể
tuổi tác.
Những bệnh nhân có nghi ngờ về ung thư ĐTT di truyền cần được tư vấn
về di truyền học, từ đó có thể xác định được các đột biến về dòng họ và đánh
giá / sàng lọc các thành viên trong gia đình.
Các gia đình đáp ứng tiêu chí Amsterdam nhưng không có đột biến ở gen
MMR và khối u MSI-H, được gọi là ung thư ĐTT gia đình, type X .


5

1.1.2. Ung thư ĐTT MSI đơn lẻ
Khoảng 12-15% các ung thư ĐTT có kiểu hình MSI-H và 2/3 MSI-H là
các khối u ĐTT đơn lẻ.
Các ung thư ĐTT MSI-H đơn lẻ cho thấy sự mất MLH1 thường xảy ra
trong bối cảnh của kiểu hình methyl hoá đảo CpG (CIMP). CIMP đại diện cho
promoter methyl hóa quá mức mật độ cao của các gen trong ung thư. Sự im
lặng liên quan đến CIMP của gen MLH1 là nguyên nhân gây ra khoảng 80%
trường hợp, trong đó biểu hiện protein MLH1 / PMS2 bị mất.
Khoảng 50% các trường hợp dMMR đơn lẻ có đột biến BRAF (V600E)
và do đó cần để phân biệt chúng với hội chứng Lynch.
Bệnh nhân có ung thư ĐTT MSI-H đơn lẻ có hầu hết các đặc điểm lâm
sàng như hội chứng Lynch, tuy nhiên có các đặc điểm dịch tễ khác nhau bao
gồm tuổi chẩn đoán cao hơn, ưu thế ở nữ và tỷ lệ hút thuốc lá cao hơn.
1.2. Cơ sở phân tử của ung thư ĐTT MSI
1.2.1. Tính mất ổn định vi vệ tinh
Các vi vệ tinh được lặp lại đơn giản, thường là hai nucleotit, trên vùng

không mã hóa của ADN, cũng có thể nằm trong gen hoặc ở giữa gen. Các
trình tự vi vệ tinh ở các tế bào khiếm khuyết MMR dễ bị ảnh hưởng và có xu
hướng mở rộng hoặc thu hẹp chiều dài của trình tự vi vệ tinh từ thế hệ này
sang thế hệ khác. Dạng siêu đột biến dễ phát hiện này được gọi là tính mất ổn
định vi vệ tinh .
1.2.2. Cơ chế MMR (sửa chữa bắt cặp sai DNA)
Cơ chế sửa chữa bắt cặp sai được phát hiện đầu tiên ở vi khuẩn E. coli
được gọi là con đường MutHLS. Giai đoạn đầu của MMR liên quan đến 3 gen
là mutS, mutL và mutH mã hóa cho 3 protein tương ứng là MutS, MutL,
MutH. Cơ chế sửa chữa bắt cặp sai ở động vật có vú cũng hoạt động tương tự
như cơ chế hoạt động ở vi khuẩn (E. coli). Ở người đã xác định được các gen


6

có liên quan đến hoạt động của sửa chữa bắt cặp sai gồm có các gen human
mutL homolog 1 (hMLH1), human mutL homolog 3 (hMLH3), human mutS
homolog 2 (hMSH2), human mutS homolog 3 (hMSH3), human mutS homolog
6 (hMSH6), human postmeiotic segregation increased 2 (hPMS2), human
postmeiotic segregation increased 1 (hPMS1) . Trong đó phức hợp chứa gen
hMSH2, hMLH1có chức năng tương đương với mutS, mutL ở E. coli.
1.2.3. Đột biến gen MMR và nguy cơ ung thư
Phân tích di truyền các gen MMR ở người cho thấy rằng trên 90% bệnh
nhân mắc HNPCC là do đột biến ở hai gen MLH1 và MSH2. Riêng gen
MLH1 có tần số đạt đến 1/400 và gen MSH2 là 1/500 ở nhiều quần thể . Trong
số tất cả các đột biến gen được báo cáo trong hội chứng Lynch, gen MLH1 có
ảnh hưởng lớn nhất, ước tính chiếm khoảng 50% tổng số trường hợp, sau đó
là đến MSH2 (40%), MSH6 (10%) và PMS2 (<5%). Như vậy, gen MLH1 là
gen quan trọng nhất trong nghiên cứu ung thư ĐTT không polyp di truyền
(HNPCC).

Gen MLH1
Gen MLH1 nằm trên NST số 3p21, tương ứng với vùng gen MutL ở E.
coli, nằm giữa các gen TRANK1 và LRRFIP2 với 19 exon, có kích thước
khoảng 57,36 kb, mARN dài 2524 bp và protein được tổng hợp từ gen MLH1
gồm 756 axit amin.
1.3. MSI là một cơ chế duy nhất trong phát triển u
Stephen Thibodeau đang nghiên cứu các chuỗi lặp dinucleotide (một loại
vệ tinh nhỏ) giúp lập bản đồ gen và phân tích di truyền của sự mất dị hợp tử
(loss of heterozygosity – LOH) và tìm kiếm các gen ức chế khối u mới trên
NST 5q, 15q, 17p, và 18q trong ung thư ĐTT. Họ quan sát thấy các đột biến
mất đoạn trong các chuỗi [CA] n (gọi là "CA lặp") ở những vùng này và đặt ra
thuật ngữ sự mất ổn định vi vệ tinh (mà họ gọi là MIN). Họ phát hiện MSI ở


7

28% ung thư ĐTT, và nhận thấy rằng những đột biến này không đồng nhất
giữa các khối u khác nhau. Họ gọi sự xóa hoặc mở rộng gen trong con đường
CA như là đột biến kiểu I, và sự lặp cặp 2 base đơn là đột biến loại II. Vai trò
của các đột biến loại I với II chưa rõ, nhưng chúng có thể phản ánh sự tích lũy
của các đột biến ở trình tự lặp dinucleotide khi chúng xảy ra theo thời gian.
Điều quan trọng là họ nhận thấy rằng 89% khối u có MSI ở ĐTT gần và bệnh
nhân ung thư ĐTT MSI có tiên lượng tốt hơn. Một số tác giả nhận thấy rằng
đây là một con đường duy nhất cho sự phát triển của khối u mà "không liên
quan đến mất dị hợp tử."
Altonen và cs tìm thấy mối liên quan có ý nghĩa tại nhiễm sắc thể 2p sử
dụng dấu ấn D2S123 ở 2 dòng họ lớn bị hội chứng Lynch. Các tác giả sử
dụng D2S123 để tìm LOH tại locus đó trong DNA ung thư ĐTT, đây là vị trí
của gen ức chế khối u gây ra ung thư ĐTT di truyền. Họ tìm thấy MSI trong
13% các trường hợp ung thư ĐTT đơn lẻ và lý giải chính xác rằng các khối u

di truyền và u đơn lẻ có chung một con đường phát triển khối u duy nhất.
MSI là dấu ấn DNA đầu tiên sẵn có để xác định ung thư ĐTT di truyền.
Một loạt các nghiên cứu đã nhận ra rằng MSI phát sinh từ các khiếm khuyết
trong hệ thống sửa chữa bắt cặp sai DNA (MMR) và xác định 4 gen gây ra hội
chứng Lynch .
1.3.1. MLH1, PMS2, PMS1 và MSH6
Sự liên quan giữa MSH2 và hội chứng Lynch chỉ ra rằng các gen khác có
thể mã hóa MMR có thể nằm trên 3p, điều này sẽ biểu hiện một locus ung thư
ĐTT di truyền thứ hai. Hai nhóm nghiên cứu tìm thấy MLH1 trên 3p21.
Bronner và cs xác định MLH1 và tìm thấy sự đột biến gen ở nhiều thành viên
của một gia đình ung thư ĐTT với mối liên hệ có ý nghĩa với locus 3p.
Vào cùng thời gian, Vogelstein và de la Chapelle đã quét một cơ sở dữ
liệu DNA cho các trình tự MLH1, đã vẽ bản đồ nhiễm sắc thể 3p và nhân bản


8

gen. Sử dụng cùng một chiến lược tìm kiếm cơ sở dữ liệu cho các gen PMS1
và PMS2 liên quan đến ung thư ĐTT di truyền ngay sau đó. Sự liên kết giữa
PMS2 và ung thư ĐTT đã được thiết lập, nhưng vai trò của PMS1 trong ung
thư ĐTT đơn lẻ hoặc di truyền vẫn chưa rõ ràng. Trong giai đoạn từ tháng 12
năm 1993 đến tháng 9 năm 1994, có thêm 3 gen gắn liền với ung thư ĐTT di
truyền; phải mất một vài năm nữa để xác định mối quan hệ giữa gen MSH6 và
hội chứng Lynch .
1.3.2. MSI-H và MSI-L
Được sự đồng thuận quốc tế vào năm 1997, định nghĩa của MSI đã được
tiêu chuẩn hóa. Khi > 30% của bộ dấu ấn MSI bị đột biến, theo quy định
trong hướng dẫn của Bethesda được gọi là MSI-H. Xác định MSI -H biểu
hiện đặc tính của một nhóm các ung thư ĐTT với đặc điểm lâm sàng và GPB
tương tự nhau. Một tỷ lệ lớn hơn của ung thư ĐTT sẽ được tìm thấy có ít nhất

1 đột biến vi vệ tinh. Ung thư ĐTT có <30% các dấu ấn MSI bị đột biến được
gọi là MSI-L và có đặc điểm lâm sàng của các khối u MSS . Các loại ung thư
ĐTT MSI-L dường như không có sự khác biệt về mặt lâm sàng hay GPB so
với các bệnh ung thư MSS về chất lượng (tức là các bất thường chung),
nhưng chúng khác nhau về số lượng (tức là mức độ MSI). Sự nhầm lẫn xung
quanh các ung thư ĐTT MSI-L và vì mục đích lâm sàng, nên điều chỉnh phân
loại ung thư ĐTT MSI-L, khối u MSI-L nên được đưa vào nhóm khối u MSS.
Cần nghiên cứu để xác định trình tự vi vệ tinh thể hiện tốc độ đột biến nhanh
hoặc cao trong khối u và xác định một bộ dấu ấn có độ tin cậy cao để phát
hiện các khối u MSI-L hoặc kiểu hình không ổn định được tìm thấy trong các
khối u phát triển. Người ta tin rằng các khối u MSI-L tồn tại như một nhóm
khác biệt với các khối u MSS. Tuy nhiên, có bằng chứng cho thấy tất cả các
bệnh ung thư ĐTT đều có tính không ổn định vốn có, và nếu có đủ các dấu
hiệu, gần như tất cả các loại ung thư ĐTT sẽ có một mức MSI nào đó .


9

Một loại MSI khác đã được nhận ra mà không phù hợp với định nghĩa
của MSI-H. Tín hiệu này đã được gọi là “thay đổi vi vệ tinh cao ở sự lặp lại
bốn nucleotide được lựa chọn” (EMAST). EMAST được tìm thấy thường
xuyên nhất trong các khối u không phải ĐTT và gắn liền với đột biến p53.
Không có bằng chứng cho thấy nó được gây ra bởi sự bất hoạt đột biến của hệ
thống MMR.
Có bằng chứng cho thấy EMAST trong ~ 60% ung thư ĐTT đơn lẻ và
trong tất cả các khối u đó là MSI-H hay MSI-L. EMAST cũng được tìm thấy
trong 42,6% của ung thư ĐTT MSS .
1.4. Chẩn đoán MSI
1.4.1. Bộc lộ protein của MMR: Hoá mô miễn dịch
Vai trò chính của xét nghiệm MSI trong lâm sàng là để xác định bệnh

nhân bị hội chứng Lynch. Khoảng 15% tất cả các khối u ĐTT có MSI, và
75% - 80% nhóm này có MLH1 methyl hóa mắc phải; chỉ có khoảng 2% -3%
của tất cả các ung thư ĐTT có đột biến dòng mầm tại một trong những gen
MMR. Mặc dù xét nghiệm MSI là phương pháp đầu tiên để xác định bệnh
nhân bị hội chứng Lynch, song có thể xác định MSI bằng nhuộm HMMD với
độ nhạy và độ đặc hiệu tương đương và có thể thực hiện ở hầu hết các phòng
xét nghiệm GPB. Xác định các protein bộc lộ bất thường có thể được sử dụng
để xác định gen cần được giải trình tự. MSI xác định khối u ĐTT thiếu hụt
MMR với độ nhạy khoảng 93%; khả năng không nhạy nhất là do đột biến ở
MSH6. Báo cáo ban đầu ước tính rằng nhuộm HMMD MLH1 và MSH2 xác
định mẫu khối u bị thiếu hụt MMR với độ nhạy 92,3% và độ đặc hiệu 100%.
Một đánh giá toàn diện về 16 nghiên cứu so sánh MSI với HMMD xác định
protein MLH1 và MSH2, cho rằng HMMD về tổng thể kém nhạy hơn, chủ
yếu là do hoạt động kém với MLH1. Tuy nhiên, khi bổ sung thêm MSH6 và
PMS2, hiệu suất của HMMD được cải thiện, giải quyết các vấn đề gặp phải
với các mẫu từ bệnh nhân bị hội chứng Lynch do MSH6 và PMS2 .


10

Trong thực hành, tất cả các u mang các đột biến MSH2/MLH1 được xem
là MSI-H. Tuy nhiên, đột biến gen MSH6 có thể gặp ở các khối u MSI-H,
MSI-L hoặc MSS .
- Xác định sự bộc lộ protein MSI bằng HMMD là một xét nghiệm thay
thế với lợi thế có sẵn, phổ biến ở các phòng xét nghiệm trong bệnh viện và
không cần thiết có một phòng xét nghiệm phân tử và khả năng xác định được
gen bị ảnh hưởng bằng cách phát hiện ra sản phẩm protein đột biến của nó .
- Một ưu điểm khác của xét nghiệm HMMD là phát hiện sự mất một sản
phẩm của gen cụ thể (MLH1, MSH2, MSH6 và PMS2) có thể gián tiếp phát
hiện gen đó và giúp xác định bệnh nhân có hội chứng Lynch . Khả năng gián

tiếp xác định gen đột biến của HMMD cũng được khuyến khích sử dụng để
thay thế trong trường hợp các phương pháp chuẩn thất bại .
- Xác định sự mất biểu hiện protein MSI bằng HMMD đã được chứng
minh là phù hợp với các xét nghiệm MSI bằng PCR với độ nhạy cao (> 90%)
và độ đặc hiệu tuyệt đối (100%) .
- Sự mất bộc lộ protein MLH1 một mình trong ung thư ĐTT đơn lẻ. Các
protein MLH1 và PMS2 thường bị mất đi cùng nhau, nó biểu hiện mất chức
năng MLH1 thường do sự im lặng của gen hoặc đột biến dòng tế bào. Sự mất
bộc lộ protein PMS2 riêng biệt thường chỉ ra một đột biến PMS2 ở dòng mầm
tiềm tàng.
- Protein MSH2 và MSH6 thường bị mất đồng thời. Sự mất riêng biệt
của MSH2 hoặc MSH6 bằng xét nghiệm HMMD có tính đặc hiệu cao đối với
đột biến gen của những gen này dẫn đến sự chẩn đoán hội chứng Lynch.
Ngoài ra, sự mất bộc lộ protein MSH2 có thể là do sự biến đổi dòng tế bào
mầm ở gen EPCAM chứ không phải là gen MSH2.
- Các khối u có biểu hiện mất bộc lộ một protein MMR có thể được gọi
chung là dMMR và được coi là MSI-H, trong khi đó những người có các
protein MMR nguyên vẹn có thể được phân loại là pMMR được cho là ổn
định vi vệ tính (MSS) hoặc MSI -L.


11

- Trong các ung thư với sự mất đi biểu hiện protein MLH1, việc kiểm tra
đột biến ở gen ung thư BRAF là cách tiếp cận hiệu quả nhất để xác nhận một
trường hợp lẻ tẻ và thường không bao gồm hội chứng Lynch để hỗ trợ sử
dụng chiến lược này để sàng lọc hội chứng Lynch .
- HMMD nói chung được coi là một kỹ thuật không tốn kém: chi phí xét
nghiệm HMMD ít tốn kém hơn xét nghiệm MSI. Gần đây, các nghiên cứu đã
đề xuất một bộ hai kháng thể (PMS2 và MSH6) để thay thế cho bảng bốn

kháng thể hiện tại để sử dụng HMMD làm công cụ sàng lọc hàng đầu. PMS2
và MSH6 có khả năng dự đoán sự đột biến trên tất cả 4 gen MMR. Theo đề
xuất này, trong trường hợp có biểu hiện bất thường được phát hiện bởi bộ hai
kháng thể, nhuộm HMMD bước 2 sử dụng các kháng thể bổ sung (MLH1
trong trường hợp bất thường PMS2 và MSH2 trong trường hợp MSH6 bất
thường) có thể được thực hiện để xác định thêm để xét nghiệm đột biến gen.
Trong trường hợp không phát hiện bất thường PMS2 hoặc MSH6, không cần
xét nghiệm HMMD thêm nữa .
- HMMD có thể phát hiện các trường hợp thiếu hụt MMR mà xét
nghiệm MSI có thể bị bỏ sót
Đột biến ở MSH6 có xu hướng gây ra MSI yếu hơn hoặc không có MSI
ở các khối u, một hiện tượng cũng được chứng minh rõ ràng qua cả ở nghiên
cứu tế bào và ở nghiên cứu với chuột đột biến MSH6. Các trường hợp MSH6
như vậy có thể bị bỏ qua bởi xét nghiệm MSI nhưng có thể phát hiện được
MSH6 bởi nhuộm HMMD. Bằng cách áp dụng phương pháp khuyếch đại đầu
dò phụ thuộc ligation-multiplex đối với các khối u có bất thường PMS2 ở
HMMD, Halvarsson và cs đã xác định một sự mất các exon 14 đến 19 của
MLH1 đã bị bỏ qua bởi phương pháp giải trình tự thông thường .


12

1.4.2. Hạn chế của HMMD trong chẩn đoán MSI
- HMMD với kháng thể MLH1đơn thuần có độ nhạy thấp để phát hiện
đột biến MLH1: Các công trình của HMMD trước đây ghi nhận độ nhạy của
HMMD MLH1 thấp và điều này được coi là một trở ngại lớn của HMMD.
Tuy nhiên, như đã được chứng minh trong các nghiên cứu gần đây, nhược
điểm này phần lớn được khắc phục bằng cách bổ sung PMS2 vào bộ kháng
thể HMMD.
- Phương pháp HMMD khác nhau, dẫn đến sự không chắc chắn trong

đánh giá kết quả: Một hạn chế đáng chú ý là chất lượng nhuộm HMMD. Ba
kiểu nhuộm chính là: i) nhuộm âm tính (có hoặc không có cường độ yếu); ii)
thiếu chứng dương nội sinh, chủ yếu ở các khối u âm tính; Và iii) nhuộm bào tương.
Nhuộm ổ, thường có cường độ yếu, có hoặc không có chứng dương nội
sinh ở các vùng âm tính, là một kiểu thường gặp nhất với MLH1. Kiểu này có
thể phản ánh một số loại đột biến gen. Tuy nhiên, các phân tích kỹ lưỡng
không cho thấy sự kết hợp như thế và cũng có thể được nhìn thấy trong các
trường hợp không đột biến. Thiếu oxy vùng trong một khối u có thể là lý do
về sự âm tính hoặc dương tính yếu. Bảo quản mô tốt hơn có thể làm giảm các
ảnh hưởng như vậy của vi môi trường mô và cải thiện chất lượng của
HMMD. Nhuộm ổ có cường độ nguyên vẹn thường gặp hơn với MSH6.
Trong những trường hợp như vậy, các vùng tế bào u nhuộm ổ, đôi khi chỉ
chiếm dưới 10% u. Chứng dương nội sinh thường có ở khắp u. Cơ chế của
hiện tượng này là không rõ ràng.
Kiểu nhuộm thiếu chứng dương nội sinh gặp ở trong trường hợp nhuộm
HMMD âm tính khác (protein bị mất), không rõ cơ chế. Các trường hợp này
được coi là "nhuộm không thể giải thích được" và do đó bị loại. Cần kiểm tra
cẩn thận hoặc nhuộm lại để phát hiện ít nhất các tế bào lành dương tính trong
khi tế bào u vẫn âm tính.


13

Kiểu nhuộm thứ ba, nhuộm bào tương, không có ý nghĩa quan trọng. Chưa
có dữ liệu nào cho thấy sự hiện diện của nó phản ánh sự thiếu hụt protein.
Mặc dù tồn tại các kiểu nhuộm khác nhau, bằng kinh nghiệm, vẫn có thể
giải thích chính xác về kết quả HMMD, đặc biệt là trong mẫu khối u ĐTT.
Nói chung, sự có nhuộm nhân trong các tế bào u, ngay cả khi nó là ổ và yếu,
là bằng chứng tốt cho thấy có protein MMR. Trong trường hợp gặp nếu thiếu
chứng dương nội sinh trong khi tế bào u âm tính, nên nhuộm lại để tìm chứng

dương nội sinh. Nếu vẫn không thấy chứng dương nội sinh mà tế bào khối u
vẫn còn âm tính, khối u này được xem là HMMD bất thường hoặc không kết
luận .
- HMMD có thể không đáng tin cậy trong các mẫu sinh thiết nhỏ: Bằng
HMMD sự bộc lộ các ổ sản phẩm protein MMR, có thể bị ảnh hưởng bởi việc
lấy mẫu mô. Đặc biệt, ở mẫu sinh thiết nhỏ kết quả âm tính có thể không đáng
tin cậy để xác định sự không có protein đột biến trong toàn bộ khối u.
- Độ nhạy của HMMD phụ thuộc vào bộ kháng thể: Trừ khi các kháng
thể mới trở nên có sẵn, HMMD sẽ không thể phát hiện những gen khác.
Ngược lại, xét nghiệm MSI có khả năng dự đoán các bất thường bệnh học ở
bất kỳ gen MMR nào (mặc dù đã có những ngoại lệ, như các trường hợp đột
biến MSH6).
Nói tóm lại, những hạn chế đối với HMMD vẫn tồn tại. Tuy nhiên, hầu
hết các hạn chế đều có thể được khắc phục bởi bộ kháng thể HMMD thích
hợp, các quy trình phòng thí nghiệm tối ưu, kiến thức và kinh nghiệm trong
việc đọc kết quả HMMD MMR. Khả năng của HMMD không thể phát hiện ra
bất thường MMR một cách tin cậy ở các mẫu sinh thiết, nên được chứng minh
hơn nữa, xem có thực sự là một nhược điểm, vì chẩn đoán ở sinh thiết có thể
tăng đáng kể việc ra quyết định xử lý (cắt đoạn với cắt ĐTT gần toàn bộ). Tuy
nhiên, trong trường hợp này, xét nghiệm MSI không vượt trội so với HMMD,


14

xét nghiệm MSI trên mẫu sinh thiết nhỏ sẽ tương đương hoặc thậm chí không
đáng tin cậy hơn. Ngoài ra, HMMD còn khả năng xác định gen cụ thể và do
đó nó có thể được hiểu như là một "xét nghiệm di truyền". Mặt khác, khả
năng của HMMD phụ thuộc vào bộ kháng thể, và nó có thể bỏ sót các trường
hợp trong đó các khiếm khuyết cơ bản nằm trong các gen không được khảo
sát khác .

1.4.3. Nguyên lý cơ bản của hoá mô miễn dịch
HMMD là một phương pháp nhuộm đặc biệt, sử dụng các kháng thể để
xác định kháng nguyên trong mô, là một phương pháp hỗ trợ rất quan trọng
cho chẩn đoán mô học, tuỳ thuộc vào các chẩn đoán phân biệt và các dấu ấn
được dùng mà HMMD có thể giúp các nhà GPB đưa ra các chẩn đoán quyết
định. Mục đích chính của HMMD là xác định chính xác hơn bản chất của tế
bào, các đại phân tử có mặt trong tổ chức so với kỹ thuật nhuộm hoá mô.
- Dựa trên nguyên tắc một số ung thư có những protein đánh dấu có thể
được sử dụng để định typ mô học, vì vậy đã có một số phương pháp phát hiện
các kháng nguyên này trong các lát cắt mô bằng các kỹ thuật đặc hiệu.
- Kỹ thuật HMMD trên các lát cắt lạnh của bệnh phẩm bảo tồn được
kháng nguyên song ít nhạy cảm và khó áp dụng rộng rãi cho các cơ sở GPB.
- Phương pháp miễn dịch men như PAP (Peroxidase Anti- Peroxidase),
ABC (Biotin- Avidin Complex) áp dụng trên các lát cắt từ bệnh phẩm chuyển
đúc trong paraffin là phương pháp phổ biến. Phương pháp này vừa nhạy vừa dễ
thực hiện, dễ phát hiện bằng KHVQH, đồng thời được sử dụng cho cả các
nghiên cứu hồi cứu. Tuy nhiên, nó đòi hỏi phương pháp cố định không làm phá
huỷ kháng nguyên. Người ta khuyên trong nhuộm HMMD nên có cả vùng mô
bình thường coi như một chứng âm tính hoặc dương tính với kháng nguyên.


15

Kỹ thuật HMMD là dựa trên phản ứng miễn dịch của sự kết hợp giữa
kháng nguyên và kháng thể và các hoá chất để làm hiện rõ phức hợp kháng
nguyên- kháng thể này dưới KHVQH. Các kháng nguyên có thể hiện diện ở
trong bào tương, màng tế bào, hoặc nhân.
- Kháng thể chủ yếu là IgG, kết hợp trực tiếp với kháng nguyên gọi là
kháng thể thứ nhất gồm hai loại:
+ Kháng thể đa dòng chứa nhiều kháng thể khác nhau và chúng phản

ứng với nhiều quyết định kháng nguyên (epitop).
+ Kháng thể đơn dòng chỉ chứa một loại quyết định kháng nguyên,
nhược điểm là có phản ứng chéo với các quyết định kháng nguyên tương tự
trên một kháng nguyên không liên quan.
- Vì phức hợp kháng nguyên- kháng thể không thể thấy được dưới
KHVQH nên cần một hệ thống để hiển thị vị trí có phản ứng kháng nguyênkháng thể, gồm 2 phần:
+ Kháng thể thứ hai là cầu nối kháng thể thứ nhất với hệ thống phóng
đại dấu hiệu nhận biết là kháng thể kháng kháng thể thứ nhất, kháng thể thứ
hai được gắn với Biotin trong phương pháp ABC.
+ Hệ thống phóng đại dấu hiệu nhận biết gồm một men, cơ chất và
chất màu trong phương pháp ABC men được gắn với kháng thể bằng một
phần cầu nối hoá học (Avidin và Biotin). Với một chất nền thích hợp với men
và chất màu được gắn lên để cho phép xác định được sự hiện diện của kháng
nguyên trong mô dưới KHVQH. Có nhiều phương pháp để hiển thị phản ứng
kháng nguyên- kháng thể, song phương pháp ABC ở trên được sử dụng nhiều
vì có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Vì Avidin có ái lực mạnh với Biotin và men
peroxidase, làm cầu nối cho men gắn vào Biotin (trên kháng thể thứ hai). Một
phân tử Avidin có 4 vị trí gắn men peroxidase nên hệ thống nhận biết được
phóng đại lên gấp 4 lần.


16

4

5

1- Kháng nguyên

6

2- Kháng thể thứ nhất
3

3- Kháng thể thứ hai
4- Men peroxidase
5- Avidine
6- Biotine

2

1

Sơ đồ 1.1. Nguyên lý cơ bản của kỹ thuật HMMD
1.5. Vai trò dự báo sự đáp ứng với hóa trị của MSI
Gần đây, hóa trị dựa vào fluorouracil có lợi đối với các khối u ĐTT giai
đoạn II hoặc III có MSI-L hoặc MSS nhưng không có lợi ở u ĐTT giai đoạn
II hoặc III với MSI-H . Các xét nghiệm MSI có thể được sử dụng để dự đoán
sự đáp ứng với hóa trị bổ trợ, mặc dù thực tế, vấn đề này còn gây tranh cãi.
Gen MMR đã được xác định trong vi khuẩn; bất hoạt đột biến tạo ra một kiểu
hình đột biến và cho phép dung nạp các tác nhân gây tổn hại DNA. Một kiểu
hình tương tự cũng được tìm thấy trong các dòng tế bào động vật có vú. Sự
sửa đổi ổn định hoạt động MMR trong dòng tế bào đã khôi phục các đáp ứng
độc tế bào với các tác nhân alkyl hóa, 6-thio-guanine, 5-FU, hợp chất bạch
kim và tác nhân khác. Điều này cho thấy rằng khối u có MSI có thể kháng lại
một số phác đồ hóa trị. Nhìn chung, thời gian sống thêm là tốt hơn đáng kể ở
nhóm MSI, bất kể sự điều trị.
Fallik et al, các kết luận phác đồ hóa trị có chất ức chế topoisomerase-I,
irinotecan làm tăng thời gian sống thêm ở những bệnh nhân với ung thư ĐTT
với MSI, kết quả này đã được Bertagnolli et al ủng hộ. Có thể kết hợp các

loại thuốc không có độc tế bào quá mức sẽ tốt nhất cho những bệnh nhân ung


17

thư ĐTT với MSI. Không có bằng chứng về hiệu quả của hóa trị bổ trợ truyền
thống bằng 5 FU ở những bệnh nhân với ung thư ĐTT với MSI, nhưng có thể
có phác đồ điều trị sẽ có lợi cho những bệnh nhân này. Bệnh nhân có ung thư
ĐTT với MSI cần được đưa vào thử nghiệm lâm sàng cho đến khi xác định
được phác đồ điều trị thích hợp .
1.6. Vai trò dự báo sự tiên lượng của MSI
Bệnh nhân bị ung thư ĐTT với MSI có thời gian sống lâu hơn những
bệnh nhân bị u không có MSI. Một nghiên cứu 175 bệnh nhân bị hội chứng
Lynch (120 người trong số họ có hội chứng Lynch - loại MLH1), được so
sánh với hơn 14.000 bệnh nhân ung thư ĐTT dựa vào quần thể, cho thấy thời
gian sống cộng dồn 5 năm đối với những bệnh nhân bị hội chứng Lynch là
65%, so với 44% bệnh nhân ung thư ĐTT đơn lẻ, trên 65 tuổi. Bệnh nhân có
hội chứng Lynch mắc bệnh ở giai đoạn thấp hơn so với bệnh nhân với các loại
ung thư ĐTT khác, và ít biểu hiện di căn. Gryfe et al báo cáo rằng 17% bệnh
nhân ung thư ĐTT có MSI trẻ hơn 50 tuổi; tỷ suất chênh đối với bệnh nhân có
khối u liên quan MSI là 0,42, so với bệnh nhân trong cùng nhóm với khối u
không MSI. Bệnh nhân có khối u với MSI có tỷ lệ tử vong thấp hơn, gồm cả
các bệnh nhân bị ung thư giai đoạn IV .
Khối u với MSI có số lượng lớn tế bào lympho xâm nhập khối u được
kích hoạt và gây độc tế bào; phản ứng lympho bào có liên quan một cách độc
lập với thời gian sống thêm kéo dài hơn. Nghiên cứu báo cáo rằng các khối u
ĐTT có xâm nhập lympho bào có liên quan với thời gian sống thêm lâu hơn;
trên thực tế, xâm nhập lympho có thể là một yếu tố tiên lượng tốt hơn so với
giai đoạn GPB. Kết quả HMMD MSH2 và MLH1 bất thường dự đoán độc lập
kết quả tốt hơn ở những bệnh nhân với khối u ĐTT giai đoạn II-T3. Do đó,

phát hiện của MSI ở một bệnh nhân với ung thư ĐTT là một yếu tố tiên lượng
tốt, đặc biệt là ở những bệnh nhân trẻ tuổi .