NGHIÊN cứu hệ THỐNG tái SINH IN VITRO PHỤC vụ CHUYỂN GEN ở cây đậu NHO NHE (VIGNA UMBELLATA)

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Đậu Nho nhe có tên khoa học Vigna umbellata (Thunb.) Ohwi & Ohashi
thuộc họ Đậu (Fabaceae) hay thường được gọi là đậu gạo, đậu nâu. Loài đậu
này được phát hiện lần đầu tiên ở Ấn Độ, sau đó được Ohwi và Ohashi miêu
tả khoa học đầu tiên vào năm 2010. Đậu Nho nhe phân bố khá rộng từ miền
Nam Trung Quốc sau đó lan rộng ra miền Bắc Việt Nam, Lào, Thái Lan,...Ở
nước ta, đậu Nho nhe được trồng chủ yếu ở các tỉnh miền núi phía Bắc như
Cao Bằng, Lào Cai, Yên Bái...
Đậu đỗ nói chung và đậu Nho nhe nói riêng là nhóm cây có giá trị dinh
dưỡng cao, đóng vai trò thiết yếu để nâng cao tiêu chuẩn thực phẩm cho con
người đặc biệt ở những nước đang phát triển trong tình trạng thiết hụt protein.
Đậu Nho nhe thường được sử dụng làm thức ăn cho người và vật nuôi, là cây
một năm, hệ rễ phát triển mạnh, có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn cố định đạm
nên thường được trồng luân canh với lúa và ngô để tăng vụ và cải tạo đất bạc
màu chống xói mòn. Đậu Nho nhe là cây sinh trưởng rất nhanh, sau 3 tháng
có thể phủ kín đất, đặc biệt hàm lượng dinh dưỡng trong thân và lá cao, làm
phân bón rất tốt. Một số những nghiên cứu gần đây, còn cho thấy đậu Nho
nhe ngoài là cây lương thực thiết yếu còn có tác dụng trong việc chữa bệnh. Ở
Trung Quốc, đậu Nho nhe được dùng như một loại dược liệu để chữa các
bệnh liên quan đến đau nhức xương khớp, hay sắc uống để giải độc, giảm phù
nề [41].
Tuy nhiên, các cây trồng thuộc họ Đậu có khả năng chống chịu kém đối
với các tác nhân bất lợi từ ngoại cảnh và khả năng này ngày càng bị suy giảm
nghiêm trọng do biến đổi khí hậu. Do vậy nghiên cứu tìm biện pháp cải thiện

1


khả năng chống chịu của cây họ Đậu nói chung và cây đậu Nho nhe nói riêng
được quan tâm và mang tính thời sự.

Có nhiều cách tiếp cận nghiên cứu nâng cao khả năng chống chịu của
cây họ Đậu bằng lai hữu tính, đột biến thực nghiệm và công nghệ gen. Trong
đó ứng dụng kỹ thuật chuyển gen để làm tăng khả năng chống chịu các stress
phi sinh học là một hướng tiếp cận có triển vọng. Việc xây dựng hệ thống tái
sinh là một trong những giai đoạn có ý nghĩa quan trọng và quyết định rất lớn
đến sự thành công của kỹ thuật chuyển gen. Đối với các cây họ Đậu như đậu
tương, đậu xanh, đậu cove việc xây dựng hệ thống tái sinh in vitro đã được
nghiên cứu và khẳng định. Còn đối với đậu Nho nhe, một loài cây hai lá mầm
có thể tái sinh trong ống nghiệm hay không, tái sinh từ bộ phận nào của cây,
công thức môi trường thích hợp cho tái sinh đa chồi. Đây là những câu hỏi đặt
ra cho nghiên cứu này.
Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi xây dựng đề tài cho luận văn
thạc sĩ là: “Nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro phục vụ chuyển gen ở cây
đậu Nho nhe (Vigna umbellata)”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định được hệ thống tái sinh đa chồi in vitro phục vụ chuyển gen ở
cây đậu Nho nhe.
3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu điều kiện khử trùng hạt để tạo mẫu sạch trong ống nghiệm.
- Nghiên cứu tái sinh đa chồi in vitro qua mô sẹo, nách lá mầm, chồi ngọn.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng BAP, kinetin đến sự
tạo đa chồi ở cây đậu Nho nhe.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của chồi in vitro.
- Nghiên cứu điều kiện chuyển cây đậu Nho nhe in vitro ra ngoài môi trường tự
nhiên.
2


Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÂY ĐẬU NHO NHE

1.1.1. Nguồn gốc, phân loại, đặc điểm sinh học của đậu Nho nhe
Đậu Nho nhe có những tên khác như: đậu gạo, đậu nâu, đậu Cao Bằng,
đậu đà, thua dài.... Tên khoa học của đậu Nho nhe là Vigna
umbellata (Thunb.) Ohwi & Ohashi. Đậu Nho nhe thuộc chi Đậu (Vigna), họ
Đậu (Fabaceae), bộ Đậu (Fabales), lớp Hai lá mầm (Magnoliopsida).
Chi Vigna là một trong những chi lớn của họ Đậu, bao gồm 7 chi phụ là
Vigna, Haydonia, Plectropic, Macrohynchus, Ceratotrophic, Lasionspron,
Sigmoidotrotopis. Đậu Nho nhe theo quan điểm lấy hạt bao gồm các loại
thuộc hai chi phụ là Vigna và Ceratotrophic. Chi phụ Ceratotrophic còn được
gọi là nhóm đậu Châu Á mang những mức độ điển hình thể hiện ở mức độ
cao nhất cho Vigna. Năm 1970, Vercourt đã công bố 5 trong 16 loài của
Ceratotrophic đã được thuần hóa là: Đậu xanh ( Vigna radiata (L.) Wilczel),
đậu gạo (Vigna umbellata (Thunb.)), đậu adzukia (Vigna anguilaris (Willd),
đậu ván (Vigna aconiti (Jacp)), Vigna trilobala (L.) Wilczel.
Đậu Nho nhe là dạng cây thân thảo, có thể mọc thẳng đứng, bán thẳng
hoặc xoắn có dây leo, thường có chiều dài từ 30-100 cm, một số loài có thể
cao đến 200 cm. Thân cây có rãnh, phân nhánh. Khi cây còn non có lông
ngắn, mịn, trắng phát triển bao phủ, lông này sẽ rụng dần khi cây lớn lên.
Lá của đậu Nho nhe phần lớn là mọc cách, thường là lá kép ba lá chét, lá
kèm hình ngọn giáo, chiều dài của lá từ 6-9 cm, cuống lá dài từ 5-10 cm. Hệ
thống rễ của đậu Nho nhe phát triển mạnh mẽ, rễ cái có thể cắm sâu xuống đất
100-150 cm có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn cố định đạm.

3


Hoa thường có màu vàng tươi hoặc vàng nhạt. Cụm hoa hình chùm mọc
ra từ nách lá. Hoa lưỡng tính, đều hoặc không đều, mẫu 5. Hoa thường có 10
nhị, màng hạt phấn có 3 rãnh - lỗ. Bộ nhụy gồm có 1 noãn với nhiều noãn đảo

hay cong.
Quả của đậu Nho nhe dài hình dải cong, mọc đứng dài từ 7,5-12,5 cm,
rộng 4- 6 mm, chứa khoảng 6-10 hạt. Hạt đậu dài 6-8 mm, rốn hạt lõm. Hạt
đậu Nho nhe có màu sắc đa dạng: vàng lục, vàng nâu, nâu, đen, đốm hoặc
màu rơm. Các hạt màu vàng lục thường trở thành màu nâu vàng trong quá
trình lưu trữ. Hạt màu vàng nâu được cho là có giá trị dinh dưỡng cao hơn cả.
Đậu Nho nhe phát triển nhanh vào mùa hè. Ở Ấn Độ và Nepal, đậu Nho
nhe được gieo vào tháng 2, tháng 3 để thu hoạch vào mùa hè và tháng 7,
tháng 8 để thu hoạch vào tháng 12. Thời kỳ sinh trưởng của cây thay đổi tùy
theo giống và vùng địa lý. Khi được trồng ở Ăng-gô-la (vĩ độ 6°-17°S), theo
báo cáo, cây trưởng thành sau 60 ngày kể từ khi gieo hạt, nhưng ở Tây Bengal
ở bán cầu bắc, cây trồng cần khoảng 130 ngày để tạo ra năng suất hạt giống
kinh tế [40].
Đậu Nho nhe là một cây họ đậu linh hoạt có thể phát triển ở vùng cận
nhiệt đới ẩm đến khí hậu ôn đới ấm áp và mát mẻ. Cây không chịu được
sương giá nhưng chịu được nhiệt độ cao, thường được tìm thấy mọc ở những
khu vực có nhiệt độ trung bình từ 18-30°C. Phạm vi nhiệt độ cho sự tăng
trưởng là 10-40°C với mức tối ưu trong khoảng từ 18-30°C. Đậu Nho nhe
phát triển tốt ở vùng khí hậu ẩm ướt và mặc dù có khả năng chịu hạn tốt,
nhưng để có năng suất tốt, nó đòi hỏi lượng mưa hàng năm là 1000-1500
mm. Phạm vi lượng mưa hàng năm được báo cáo cho cây tăng trưởng là 3002000 mm với mức tối ưu trong khoảng 700-1500 mm. Đậu Nho nhe phát triển

4


mạnh trong điều kiện ánh sáng đầy đủ, sự tăng trưởng của nó có thể bị cản trở
nếu trồng xen canh với cây trồng khác chẳng hạn như ngô, lúa [40].
Loài đậu này có thể được trồng trên nhiều loại đất, cả những loại đất
thoái hóa, khô cằn, nghèo dinh dưỡng nhưng để có năng suất tối ưu, nó đòi
hỏi phải có đất màu mỡ. Tuy nhiên, độ phì nhiêu của đất cao có thể cản trở sự

hình thành quả và làm giảm năng suất hạt. Phạm vi pH đất cho sự tăng trưởng
là 5,5-8 với mức tối ưu trong khoảng 6-7,5.
Đậu Nho nhe là một loại cây khỏe mạnh, có khả năng chống lại nhiều
loại sâu bệnh, nó không cần phân bón hoặc chăm sóc đặc biệt trong quá trình
tăng trưởng. Nó có nguồn gốc từ châu Á, được tìm thấy đầu tiên ở Ấn Độ và
miền trung Trung Quốc sau đó lan sang Malaysia. Loài đậu này được người Ả
Rập đưa vào Ai Cập, dọc theo bờ biển phía Đông châu Phi và các đảo Ấn Độ
Dương. Ngày nay, đậu Nho nhe được trồng rộng rãi ở các nước nhiệt đới châu
Á, ít được trồng ở Hoa Kỳ, Úc, Tây Nam châu Á, vùng nhiệt đới châu Phi và
châu Mỹ. Ở các cùng nhiệt đới châu Phi, nó được trồng ở Tây Phi, Đông Phi
và các đảo Ấn Độ Dương, và ít gặp hơn ở Trung và Nam Phi. Ở nước ta, đậu
Nho nhe được trồng chủ yếu ở các tỉnh miền núi phía Bắc như Cao Bằng, Lào
Cai, Yên Bái,...
Hiện nay, chưa có số liệu cụ thể về tình hình sản xuất đậu Nho nhe, tuy
nhiên loài đậu này được sản xuất chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á, Nhật Bản
là nước nhập khẩu chính, các nhà xuất khẩu chính là Thái Lan, Myanmar và
Trung Quốc. Madagascar cũng là một trong những nước xuất khẩu chính đậu
Nho nhe. Xuất khẩu trung bình hàng năm từ năm 1998-2000 ước tính là 1100
triệu tấn [40].

5


Hình 1.1. Cây đậu Nho nhe (ảnh chụp của tác giả tại vườn thí nghiệm Khoa
Sinh học, 6/2018)
1.1.2. Giá trị dinh dưỡng và giá trị sử dụng của đậu Nho nhe
Đậu Nho nhe là một loại đậu ít được biết đến và chưa được sử dụng
đúng cách. Tuy nhiên, gần đây loại đậu này đã gây được sự chú ý nhờ giá trị
tiềm năng về mặt dinh dưỡng của nó. Chất lượng dinh dưỡng của hạt đậu Nho
nhe cao hơn so với nhiều loại đậu khác thuộc họ Vigna. Trong nghiên cứu

hiện tại, 16 kiểu gen khác nhau của hạt đậu Nho nhe đã đánh giá được các
thành phần dinh dưỡng chính là: hàm lượng protein, chất béo tổng hợp, chất
xơ, carbohydrate, vitamin, khoáng chất, axit amin và axit béo [28]. Hạt đậu
Nho nhe khô chứa nước 13,3%, protid 20,9%, lipid 0,9%, glucid 64,9%, xơ
4,8%, tro 4,2%, 100g cung cấp năng lượng là 1373KJ. Ðậu gạo còn chứa
nhiều Ca, Fe, P và các loại vitamin của nhóm B như thiamin, niacin,
riboflavin. Nghiên cứu gần đây cho thấy đậu Nho nhe có hàm lượng Ca cao

6


so với các loại cây trồng họ Đậu khác tốt cho các bà mẹ đang cho con bú.
Protein cô đặc được điều chế từ hạt đậu đã cho thấy tác dụng chống tăng
huyết áp ở chuột đồng Botrytiscinerea, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia
solani và Mycosphaerella arachidicola [16]. Hơn nữa, nó đã cho thấy giảm
thiểu và chống lại hoạt động sao mã ngược của HIV-1 [18]. Ở Ấn Độ lá đậu
Nho nhe cùng với bột gạo được dùng làm thuốc đắp vào bụng để trị đau dạ
dày.Tuy nhiên, các yếu tố chống dinh dưỡng cũng tìm thấy trong hạt đậu Nho
nhe bao gồm các yếu tố ức chế trypsin, phytates, tannin và oligosacarit. Việc
ngâm, tách vỏ, nảy mầm và nấu chín có thể làm giảm đáng kể các yếu tố
chống dinh dưỡng này [33], [34].
Đậu Nho nhe là một cây họ đậu đa năng, không phổ biến như các loại
đậu khác: đậu đũa (Vigna unguiculata), đậu adzuki (Vigna angulari) và đậu
xanh (Vigna radiata), đậu Nho nhe lại là một loại thực phẩm quan trọng và
thiết yếu trong dinh dưỡng của con người ở các nước đang phát triển, thiếu
hụt nguồn dinh dưỡng trong thức ăn như: Ấn Độ, Nepal, Thái Lan…trong đó
có Việt Nam đặc biệt là các tỉnh miền núi phía Bắc (Lào Cai, Yên Bái, Cao
Bằng…).
Tất cả các bộ phận của cây đậu đều có thể ăn được và sử dụng trong các
chế phẩm thức ăn. Hạt khô có thể luộc, ăn với cơm hoặc chúng có thể thay

gạo khi hầm hoặc nấu soup. Ở một số nước, hạt này được xay ra để tạo thành
loại bột dinh dưỡng có trong thức ăn dành cho trẻ em. Quả non, lá, rau mầm
được luộc và ăn như rau. Quả non đôi khi còn để ăn sống. Đậu Nho nhe rất
hữu ích cho chăn nuôi. Những thứ còn lại sau thu hoạch như thân cây, lá,
hạt… có thể để tươi hoặc phơi khô sử dụng làm thức ăn cho ra súc.
Đậu Nho nhe được dùng để làm phân xanh, nó mọc rất nhanh và che phủ
kín mặt đất như một hàng rào sống hay hàng rào sinh học. Ở những ngọn đồi

7


ở vùng biên giới Nepal, người nông dân dùng cây đậu với hai mục đích chính
là làm thức ăn cho gia súc, cải tạo các loại đất.
1.2. NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

1.2.1. Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
Tính toàn năng của tế bào
Tất cả các tế bào của một cơ thể đều mang thông tin di truyền giống
nhau. Do đó chúng có tiềm năng tổng hợp nên các protein giống nhau. Các tế
bào được lấy từ bất kỳ mô sống nào của cơ thể thực vật (bao phấn, đỉnh sinh
trưởng, lá mầm, đoạn thân, rễ…) đều có thể được kích thích để tái sinh thành
cây hoàn chỉnh đặc trưng cho loài, phát triển và ra hoa kết quả bình thường.
Quá trình này có thể thông qua phát sinh cơ quan hoặc hình thành phôi vô
tính và được nuôi cấy trong điều kiện dinh dưỡng thích hợp có bổ sung các
chất kích thích sinh trưởng cần thiết. Các loại mô đã phân hoá tách từ cơ thể
thực vật có khả năng tái sinh trực tiếp thành cây hoàn chỉnh, hoặc là phát triển
thành tế bào mô sẹo. Đó là loại tế bào không phân hoá, phân chia liên tục và
có khả năng phân hoá thành phôi, chồi để tạo cây hoàn chỉnh. Khả năng đó
gọi là tính toàn năng của tế bào [9], [14].
Phản biệt hóa và tái biệt hóa

Quá trình tái sinh được chia làm hai giai đoạn: phản biệt hóa và tái biệt hóa.
Phản biệt hóa là giai đoạn đưa tế bào từ trạng thái đã biệt hóa trở lại
trạng thái chưa biệt hóa. Các tế bào đã biệt hóa là những tế bào có chức năng
nhất định và có cấu trúc phù hợp để hoàn thành chức năng ấy. Quá trình phản
biệt hóa biến tế bào đã biệt hóa thành những tế bào có hình thức giống như
những tế bào ở đỉnh sinh trưởng (tế bào mầm phôi), chúng có đặc điểm: tế
bào đậm đăc, không bào nhỏ li ti hoặc không có, nhân to, kích thước tế bào

8


lớn. Những tế bào như vậy coi như đã được phản biệt hóa xong và trong
những điều kiện nuôi cấy nhất định chúng sẽ phát triển thành cơ thể mới. Các
mô phản biệt hóa cần nuôi trên môi trường chứa các chất kích thích sinh
trưởng thuộc nhóm Auxin gồm: 2,4-D, α-NAA, IAA, IBA [7].
Tái biệt hóa là giai đoạn tế bào đã phản biệt hóa phát triển thành cây
hoàn chỉnh và chỉ có các tế bào phôi mới có thể hình thành cơ thể mới [7].
Trong cùng một cơ thể, mỗi tế bào đều có khả năng biệt hóa, phản biệt
hóa và vì thế triển vọng nuôi cấy thành công cũng khác nhau. Những tế bào
càng chuyên hóa về một chức năng nào đó (đã biệt hóa sâu) thì càng khó xảy
ra quá trình biệt hóa và ngược lại, như các tế bào mạch dẫn ở thực vật, tế bào
thần kinh ở động vật. Người ta đã chứng minh rằng: những tế bào càng gần
trạng thái của phôi bao nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy
nhiêu [1].
1.2.2. Môi trường nuôi cấy tế bào thực vật
Cơ sở cho việc xây dựng các môi trường nuôi cấy là việc xem xét các
thành phần cần cho sự sinh trưởng và phát triển của cây. Đầu những năm 20
đã có một số công trình sử dụng môi trường dinh dưỡng tổng hợp, ngoài muối
khoáng và nguồn cacbon còn bổ sung thêm vitamin và một số chất khác [7].
Trong những năm 60, nhiều môi trường nuôi cấy đã được xây dựng và được

sử dụng cho đến nay chỉ cần cải tiến chút ít. Đó là các môi trường White,
Knop (1953), Môi trường giàu chất dinh dưỡng Murashige - Skoog (1963)
[23]; Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình Gamborg (1968).
Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật thay đổi tùy theo loài và bộ
phận nuôi cấy. Tùy theo mục đích nuôi cấy muốn duy trì mô ở trạng thái mô
sẹo, muốn tạo rễ, tạo mầm hay muốn tái sinh cây hoàn chỉnh, môi trường nuôi
cấy phải thay đổi nhiều hay ít. Tuy vậy, tất cả các môi trường nuôi cấy bao
9


giờ cũng có các thành phần chính gồm: muối khoáng, cacbon, vitamin, các
chất điều khiển sinh trưởng, các nhóm chất bổ sung, chất độn [7].
Các nguyên tố khoáng đa lượng:
Là những nguyên tố muối khoáng được sử dụng ở nồng độ trên 30ppm,
tức là trên 30mg/l, bao gồm các nguyên tố sau: N, P, S, K, Mg, Ca. Các
nguyên tố này có chức năng tham gia vào quá trình trao đổi chất của tế bào và
xây dựng lên thành tế bào.
Các nguyên tố vi lượng
Các nguyên tố vi lượng được coi là cơ sở của sự sống bởi vì hầu hết các
quá trình tổng hợp chuyển hóa các chất đều được thực hiện nhờ các enzyme
mà trong thành phần của enzyme đều có các nguyên tố vi lượng. Ngoài ra, các
nguyên tố vi lượng còn có tác động sâu sắc đến quá trình quang hợp, hô hấp,
hấp thụ nước…Tuy nhiên, nhu cầu muối khoáng vi lượng trong nuôi cấy mô
thực vật là lĩnh vực còn ít được nghiên cứu, rất ít các nguyên tố vi lượng được
chứng minh là không thể thiếu được đối với sự phát triển của mô và tế bào. Vì
vậy, sự cung cấp các nguyên tố vi lượng và nồng độ của chúng trong các môi
trường nuôi cấy hầu hết là dựa vào kinh nghiệm, trong các trường hợp cụ thể
là không cần thiết.
Trong nuôi cấy mô thực vật, những nguyên tố vi lượng được sử dụng ở
nồng độ thấp hơn 30 ppm. Bao gồm: Fe, B, Mn, I Mo, Cu, Zn, Ni, Co.

Nguồn cacbon
Hầu hết các mẫu mô nuôi cấy là dị dưỡng, không có khả năng tổng hợp
cacbon. Vì vậy việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là
điều kiện bắt buộc. Trong phần lớn các môi trường nguồn cacbon và năng
lượng chủ yếu là sucrose và glucose, nhưng hiện nay sucrose được sử dụng

10


nhiều hơn cả. Các loại đường khác như fructose, lactose, galactose… cũng đã
được thử nghiệm, nhưng tỏ ra kém hiệu quả và chỉ được sử dụng trong những
trường hợp đặc biệt.
Vitamin
Mặc dù các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro có khả năng tự
tổng hợp được hầu hết các loại vitamin, nhưng thường không đủ về lượng, do
đó phải bổ sung thêm từ bên ngoài, đặc biệt các vitamin thuộc nhóm B như:
Vitamin B1, Vitamin B2, Vitamin B6. Myo-inositol cũng hay được sử dụng vì
nó có vai trò quan trọng trong việc sinh tổng hợp thành tế bào.
Các chất kích thích sinh trưởng
Các chất kích thích sinh trưởng có vai trò hết sức quan trọng đến kết quả
cũng như sự thành công của toàn bộ quá trình nuôi cấy in vitro. Nó ảnh hưởng
trực tiếp tới sự phản biệt hóa, tái biệt hóa và sinh trưởng của tế bào, đặc biệt
là sự biệt hóa các cơ quan như chồi và rễ. Nhu cầu về chất kích thích sinh
trưởng đối với từng loài cây qua từng giai đoạn nuôi cấy là khác nhau. Vì vậy,
để nuôi cấy in vitro thành công cần phải tiến hành các nghiên cứu cụ thể để
tìm ra nồng độ cũng như tỷ lệ các chất kích thích sinh trưởng phù hợp.
Người ta đã phát hiện thấy 5 nhóm chất điều tiết sinh trưởng ở thực vật
đó là auxin, cytokinin, ethylen, giberelin, axit absixic. Những chất này được
phân thành các nhóm vào tính tương đồng về cấu trúc và chức năng sinh lý,
tuy nhiên tùy thuộc vào đối tượng nghiên cứu mà chúng có những tác động

chồng chéo và hỗ trợ nhau. Còn một số nhóm khác điều khiển từng giai đoạn
sinh trưởng nhất định. Trong nuôi cấy mô tế bào người ta thường sử dụng ba
nhóm chất điều tiết sinh trưởng là dẫn xuất của auxin, cytokinin, giberelin.
[11], [13].
Nhóm auxin là nhóm kích thích sinh trưởng chính được các nhà sinh lí
11


học thực vật phát hiện và quan tâm sớm nhất. Auxin là những hoocmon thực
vật có tác dụng kích thích sinh trưởng, kéo dài tế bào và phân hóa cơ quan,
kiểu tác động của nó liên quan đến làm chuyển đổi và mềm hóa màng tế bào.
Nhóm auxin bao gồm các chất sau: 2,4 Diclorophenoxy axetic axit (2,4D), αnaphtylaxetic axit (NAA), Indotaxetic axit (IAA), trong đó 2,4D dễ gây độc
nhưng có tác dụng kích thích quá trình phânchia tế bào và thường được sử
dụng nhiều nhất, NAA có tác dụng tạo rễ cho cây non [11], [13].
Nhóm cytokinin là nhóm chất hóa học có ảnh hưởng quyết định đến kích
thích phân chia tế bào. Đại diện cho nhóm cytokinin gồm: Kinetin; 6 – Benzyl
amino purine (BAP); 6-Dimethylalylamnino purine(2iP); Zeatin. Hiện nay
một thế hệ mới của chất điều hòa sinh trưởng, chẳng hạn như thidiazuron
(TDZ) – một cytokinin thuộc các phenylureas, đang nổi lên như là một thay
thế thành công cho tái sinh trực tiếp với tần số cao của phôi vô tính [17], [26].
Nhóm giberelin là nhóm được phát hiện qua quá trình nghiên cứu bệnh
nấm lúa von. Nó tác động làm tế bào dãn ra và phân chia, làm cây lùn có thể
cao lên được, như ngô lùn thành ngô cao, đậu dạng bụi thành dạng đứng. Đại
diện cho nhóm này là axit giberilic (GA3), được sử dụng rộng rãi trong nông
nghiệp [11], [13].
Ethylen là nhóm có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển của
cây nhưng gần đây nó mới được coi là hoocmon thực vật. Ethylen thường
được sử dụng để làm chín quả ở chuối, ra hoa đồng loạt ở dứa, nó cũng ảnh
hưởng đến quá trình phân bào. Đối với cà chua trong điều kiện ethylen nồng
độ cao sẽ kéo dài khả năng ra rễ của thân [11], [13]

Axit absixic là hợp chất ức chế sinh trưởng thực vật tự nhiên ảnh hưởng
đến tính ngủ nghỉ của hạt, mầm và rụng lá, tăng cường ra hoa cho một số cây
ngắn ngày thông qua việc tổng hợp ARN và protein [11], [13].

12


Chất phụ gia
Nước dừa chứa hàm lượng dinh dưỡng cao, được sử dụng để cung cấp
dinh dưỡng cho mẫu nuôi cấy mô tế bào thực vật. Các chất có hoạt tính trong
nước dừa hiện đã được chứng minh là myo-insitol và một số amino acid khác.
Nước dừa được sử dụng để kích thích sự phân hóa và nhân nhanh chồi ở
nhiều loài cây. Nước dừa thường được lấy từ quả để sử dụng tươi hoặc sau
bảo quản.
Ngoài nước dừa, chuối xanh, khoai tây và cà chua cũng là những chất tự
nhiên giàu dinh dưỡng được sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô thực vật.
Than hoạt tính cũng là một chất phụ gia có nhiều tác dụng tích cực trong
nuôi cấy mô tế bào thực vật chủ yếu là tạo điều kiện tối cho môi trường nuôi
cấy, có tác dụng hấp thụ các chất độc và các chất ức chế sinh trưởng thực vật
như các hợp chất phenolic, dịch rỉ nâu sinh ra từ môi trường nuôi cấy. Những
chất này gây ức chế sinh trưởng của mẫu nghiên cứu. Than hoạt tính làm thay
đổi môi trường ánh sáng, do môi trường trở nên sẫm khi có nó vì thế có sự
kích thích sự hình thành và sinh trưởng của rễ. Ngoài ra, than hoạt tính cũng
có thể hấp thụ các vitamin, cytokinin và auxin, làm thay đổi tỉ lệ thành phần
các chất có trong môi trường nuôi cấy cũng như pH môi trường.
1.2.3. Các yếu tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
Vật liệu nuôi cấy
Tất cả các mô chưa hóa gỗ đang sinh trưởng mạnh như: Mô phân sinh
ngọn, tượng tầng, đầu rễ, phôi đang phát triển, thịt quả non,… khi đặt vào môi
trường có chứa một lượng hoocmon thích hợp đều có khả năng tạo mô sẹo. Tuy

nhiên, mỗi tế bào ở mỗi mô khác nhau có khả năng tạo mô sẹo, phân hóa thành
rễ, thân, cành, lá,… rất khác nhau. Do đó việc chọn mẫu thực vật để sử dụng
trong quá trình nuôi cấy có vai trò quyết định. Các kết quả nghiên cứu cho thấy,

13


để bắt đầu nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhất định, người ta chú trọng
đến các chồi bên và mô phân sinh đỉnh [3].
Vô trùng trong nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy có chứa đường, muối khoáng và vitamin, thích hợp
cho các loài nấm, vi khuẩn phát triển. Để đảm bảo điều kiện vô trùng trong
quá trình nuôi cấy đòi hỏi các yêu cầu sau: Vô trùng mô cấy, vô trùng dụng cụ
thủy tinh, môi trường và nút đậy. Trong thao tác cấy cần phải tránh làm rơi
nấm, khuẩn lên bề mặt môi trường nuôi cấy. Mô cấy có thể là các bộ phận
khác nhau của thực vật, tùy theo sự tiếp xúc với môi trường bên ngoài mà các
bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn, nấm. Phương pháp vô trùng mẫu cấy
phổ biến hiện nay là dùng các chất hóa học có hoạt tính diệt nấm, khuẩn. Hiệu
lực diệt nấm, khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ
và khả năng xâm nhập của chúng trên bề mặt mô cấy. Ngoài ra, còn sử dụng
các chất làm giảm sức căng bề mặt như: Tween 80, fotoflo, teepol vào dung
dịch diệt nấm, khuẩn [5], [14].
Ánh sáng và nhiệt độ
Ánh sáng là nhân tố quan trọng trong quang hợp, ảnh hưởng đến khả
năng nuôi cấy in vitro ở những cây có diệp lục tố. Cường độ ánh sáng trên dàn
nuôi cấy phải là ánh sáng có phổ gần như ánh sáng tự nhiên (230 -780 nm).
Nhiệt độ của phòng nuôi cấy được duy trì từ 25 -28oC [5].
Môi trường nuôi cấy
Tất cả các môi trường nuôi cấy đều gồm năm thành phần chính sau: các
muối khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin, nguồn cacbon, các chất điều hòa

sinh trưởng, chất độn. Ngoài ra, người ta còn bổ sung thêm một số chất hữu
cơ có thành phần xác định như acid amin, hoặc không xác định như: nước
dừa, dịch chiết nấm men,…vào trong môi trường tùy theo nhu cầu riêng của
14


từng đối tượng nuôi cấy. Trong những năm 60 nhiều môi trường nuôi cấy đã
được xây dựng và được sử dụng cho đến ngày nay, đó là các môi trường: Môi
trường nghèo chất dinh dưỡng White, Knop (1953); Môi trường giàu chất dinh
dưỡng Murashige - Skoog (1963) [23]; Môi trường có hàm lượng chất dinh
dưỡng trung bình Gamborg (1968) [8].
1.3. HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO PHỤC VỤ CHUYỂN GEN Ở CÂY
HỌ ĐẬU

Trong thực tế thì các cây họ Đậu nói chung và cây đậu Nho nhe nói riêng
đều được sản xuất dễ dàng và hoàn toàn không có nhu cầu cần nhân giống vô
tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô. Tuy nhiên, việc nghiên cứu chuyển gen ở các
cây họ Đậu sẽ khó thực hiện và thành công nếu trước hết không tiến hành việc
tái sinh cây. Rudrabhatla Sairam và cs (2005) đã tổng hợp các kết quả nghiên
cứu phát triển kỹ thuật tái sinh ở cây một lá mầm và cây hai lá mầm; sự tái
sinh cây được thực hiện bằng nuôi cấy in vitro từ phôi soma hoặc từ một bộ
phận khác độc lập trên cây và điều đó còn phụ thuộc vào kiểu gen của giống
[32].
Các cây trồng họ Đậu đều thuộc lớp 2 lá mầm,việc xây dựng hệ thống
tái sinh in vitro đã được nghiên cứu và khẳng định. Một số nghiên cứu hệ
thống tái sinh ở một loài cây thuộc chi Vigna đã thu được kết quả khả quan.
Kết quả tạo phôi soma từ tế bào nuôi cấy huyền phù ở cây đậu đũa (Vigna
unguiculata) được thực hiện bởi Ramakrishnan và cs (2005) [29] và cũng
bằng phương pháp này Prem và cs (2001) đã thu tần số tái sinh in vitro cao
[27]. Nghiên cứu khả năng tái sinh của 27 giống Đậu thuộc chi Vigna có

nguồn gốc từ Phillipine, Madagascar, Pakistan, India, Australia, China, Japan
Renato và cs (2001) đã cho thấy kỹ thuật tái sinh cây từ nách lá mầm của hạt
nảy mầm 4 ngày tuổi đạt hiệu quả tái sinh 80% - 100% và tái sinh chồi trực

15


tiếp từ mắt lá mầm như là chỉ thị cho hệ gen của loài đậu Vigna châu Á
(subgenus Ceratotropis) [30], [31]. Tái sinh từ nách lá mầm của cây (Vigna
unguiculata (L.) Walp.) có tỷ lệ tái sinh là 100%. Jayanti Sen và Spra Guha
Mukherjee (1998) đã công bố kết quả nghiên cứu tái sinh cây ở đậu xanh từ
phôi soma và từ nách lá mầm phục vụ chuyển gen [21], Ignacimuthu và
Franklin (1999) [19], Renato và cs (1999, 2001) [30], [31], Mai Trường và cs
(2001) [12], Sita và cs (2006) [37], Kaviraj và cs (2006) [22]. Năm 2007,
Sonia và cs đã thu được kết quả chuyển gen mã hóa protein ức chế enzyme αamylase vào cây đậu xanh thông qua lây nhiễm bằng Agrobacterium được
thực hiện nhờ tái sinh đa chồi từ nách lá mầm [38]. Đánh giá hiệu quả chuyển
gen ở cây Vigna mungo khi sử dụng kỹ thuật cấy in vitro từ nách lá mầm của
Muruganantham và của Amutha và cs (2006) cũng đã khẳng định hiệu quả
của phương pháp này [24]. Bhadra và cs (1991) đã nghiên cứu tái sinh đa chồi
thành công trên cây đậu Nho nhe. Các chồi được tạo ra từ nách lá mầm của
hạt đậu Nho nhe nảy mầm trên môi trường MS cơ bản, bổ sung muối B5,
NAA (0,1-0,5mg/l), BAP (0,5mg/l), kinetine (0,5mg/l) và zeatin (0,5-1mg/l),
môi trường kéo dài chồi được bổ sung IBA (0,005mg/l) và BAP (0,2mg/l),
Cây ra rễ trên môi trường MS cơ bản [15]. Tuy nhiên cho đến nay có rất ít
công trình nghiên cứu tối ưu tái sinh đa chồi ở đậu Nho nhe.
Sự tái sinh in vitro ở cây đậu tương được tạo đa chồi từ nách lá mầm đã
được nghiên cứu, tuy nhiên đậu tương là đối tượng thực vật rất khó thực
hiện nuôi cấy in vitro từ khâu khử trùng, tạo mô sẹo, tái sinh cây, tạo rễ và ra
cây [3]. Những năm gần đây, kết quả tái sinh đa chồi từ nách lá mầm của
đậu tương được công bố bởi Nguyễn Thị Thúy Hường (2011), Nguyễn Thu

Hiền (2014), Lò Thị Mai Thu (2014), Lò Thành Sơn (2015) [2], [4], [6],
[10]. Các tác giả đã làm nghiên cứu được các chồi được tạo ra từ nách lá
mầm hạt đậu tương nảy mầm đã gây tổn thương trên môi trường MS cơ bản,
16


bổ sung BAP 2mg/l, các chồi được kéo dài trong môi trường có bổ sung GA 3
0,5mg/l + IAA 0,1mg/l, ra rễ trên môi trường bổ sung IBA 0,1mg/l và ra cây
trong bầu ở điều kiện nhà lưới.
Việc chuyển gen để tạo nên những dòng cây chuyển gen có đặc tính
sinh học ưu việt hơn giống gốc là cần thiết; tuy nhiên tỷ lệ thành công của
chuyển gen vào cây trồng phụ thuộc rất nhiều vào hệ thống nuôi cấy và tái
sinh in vitro sau chuyển gen. Tái sinh cây in vitro với hiệu suất cao được xem
là mấu chốt quyết định đến sự thành công trong quy trình tạo cây chuyển gen
[36].

17


Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
2.1.1. Vật liệu thực vật
Hạt đậu Nho nhe thu tại huyện Lục Yên, Tỉnh Yên Bái có hạt nhỏ, nhiều
màu khác nhau như xanh, vàng nâu, nâu đen. Hạt đậu Nho nhe không bị mọt,
nấm mốc... được khử trùng, cho nảy mầm trong ống nghiệm để thu nguyên
liệu phục vụ nghiên cứu tái sinh in vitro.
2.1.2. Hóa chất, thiết bị
Hóa chất
Hóa chất dùng trong khử trùng mẫu là cồn 70 độ, javen 50-70%, nước

cất vô trùng.
Hóa chất dùng trong nuôi cấy mô: Các thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào
được tiến hành trên nền môi trường cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962)
[23]. Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết và thông dụng có nguồn gốc từ
Đức, Trung Quốc như các chất kích thích sinh trưởng BAP, IBA, NAA,
đường sucrose, thạch, ethanol,…Nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ 25-27 oC,
chế độ chiếu sáng 12 giờ/ ngày với cường độ chiếu sáng là 2000lux.
Thiết bị
Thiết bị dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật: Bình tam giác 250ml,
pipet, cốc thủy tinh định mức, đũa thủy tinh, bông, giấy làm nút, giấy thấm.
Bộ đồ cấy: dao cấy, que cấy, đĩa cấy, buồng cấy vô trùng (Biological Safety
Cabinets) của hãng Nuarie (Mĩ), nồi khử trùng (Auto Clave) của hãng Tomy
(Nhật), tủ sấy (Carbolite, Anh), máy đo pH, cân kĩ thuật, cân phân tích (Thụy
Sĩ), bếp điện...
18


2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật,
khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên. Thời gian
nghiên cứu từ tháng 5/2018 đến tháng 4/2019.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Các bước nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ thí nghiệm tổng quát
trình bày ở hình 2.1.

Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát
2.2.1. Phương pháp khử trùng hạt, tạo cây con nuôi cấy in vitro
Mẫu nuôi cấy là hạt đậu Nho nhe trưởng thành có thể nhiễm nấm mốc và
vi khuẩn vì vậy cần phải khử trùng để loại bỏ.

19


Chọn khoảng 100-150 hạt đậu Nho nhe: hạt mẩy, vỏ bóng mịn, rốn hạt
rõ, hạt có màu vàng nâu. Tiến hành khử trùng trong box cấy. Hạt đậu Nho nhe
được chọn tráng qua nước cất vô trùng 2-3 lần sau đó khử trùng bề mặt bằng
cách lắc nhẹ trong cồn 70 độ với thời gian 1 phút, sau đó tráng lại bằng nước
cất khử trùng 3 lần. Thêm dung dịch Javen, lắc đều trong 20-25 phút, sau đó
rửa bằng nước cất khử trùng 3 đến 4 lần. Thí nghiệm với các nồng độ Javen
và thời gian khác nhau như sau để tìm kết quả tốt nhất:
Javen 50%, trong thời gian 15 phút, 20 phút, 25 phút;
Javen 60%, trong thời gian 15 phút, 20 phút, 25 phút;
Javen 70%, trong thời gian 15 phút, 20 phút, 25 phút;
Môi trường hạt nảy mầm: Hạt sau khi khử trùng được thấm khô bằng
giấy thấm khử trùng và cấy vào bình tam giác chứa môi trường nảy mầm GM
bảng 2.1 có bổ sung agar 9g/l, sucrose 30g/l. Nuôi bình hạt trong phòng nuôi
cấy có ánh sáng 2000 lux, nhiệt độ 25 ± 2 oC, thời gian chiếu sáng 12 giờ/
ngày. Ngày tuổi của hạt nảy mầm được tính kể từ khi gieo hạt. Khảo sát khả
năng nảy mầm hạt sau 7 ngày, theo dõi tỷ lệ nảy mầm của hạt.
2.2.2. Tái sinh chồi đậu Nho nhe thông qua mô sẹo
Hạt đậu Nho nhe sau khi gieo nảy mầm (6-7 ngày tuổi), lựa chọn các cây
con có lá thật, kích thước 3-4 cm, tiến hành dùng kéo thu lá, cắt bỏ viền lá và
gân chính. Sau đó cắt thành những mảnh lá có kích thước khoảng 0,5 x 1cm
đặt vào môi trường cảm ứng mô sẹo gồm: MS, sucrose 30g/l, agar 9g/l,
pH=5,8, 2,4-D (0-4mg/l). Cấy mật độ 6 mẫu/ bình môi trường loại 250ml.
Mẫu được chia thành hai lô, ở lô thứ nhất, mẫu nuôi cấy dưới ánh sáng
đèn neon với cường độ chiếu sáng 2000 lux, nhiệt độ 25 ± 2 oC, thời gian
chiếu sáng 12 giờ/ ngày. Ở lô thứ hai, mẫu được nuôi cấy 7 ngày trong tối, sau
đó được đưa ra nuôi cấy 2 tuần dưới điều kiện phòng nuôi cấy (ánh sáng 2000
lux, nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ ngày ). Xác định tỷ lệ mẫu

20


tạo mô sẹo, đánh giá chất lượng mô sẹo trên các công thức thí nghiệm. Công
thức đối chứng sử dụng môi trường MS, sucrose 30g/l, agar 9g/l, không bổ
sung các chất kích thích sinh trưởng.
Đánh giá tỷ lệ tạo mô sẹo thu được sau 3 tuần nuôi cấy theo công thức:
Ci (%) = x 100%
Trong đó:
Ncp: Số lá tạo mô sẹo
Nt: Tổng số lá nuôi cấy
Ci: Tỷ lệ tạo mô sẹo
Sau 3 tuần nuôi cấy, các mô sẹo tốt nhất tạo ra từ lá trên môi trường cảm
ứng mô sẹo được cấy chuyển sang môi trường cảm ứng chồi SIM bảng 2.1.
Mỗi công thức thí nghiệm tiến hành trên 30 mẫu. Đánh giá tái sinh chồi
theo công thức:
Rc = (%)
Trong đó
Rc: Tỷ lệ tái sinh chồi (%);
Nr: Tổng số mô tái sinh chồi;
Nsv: Tổng số mô nuôi cấy;
2.2.3. Tái sinh đa chồi đậu Nho nhe thông qua nách lá mầm và chồi ngọn
(1) Nách lá mầm:
Hạt đậu Nho nhe sau khi gieo nảy mầm (3-4 ngày tuổi) thì tiến hành
dùng dao cắt bỏ phần thân và rễ mầm, vết cắt dưới mắt lá mầm khoảng 23mm. Tách đôi 2 lá mầm thành 2 mẫu cấy riêng biệt sao cho phần thân mầm
còn lại được chia đều cho 2 lá mầm. Cắt ngang bỏ phần đuôi lá mầm, tiếp đến
hủy bỏ chồi chính và gây tổn thương nách lá mầm bằng cách dùng mũi dao
nhọn chích nhẹ 5-7 lần vào cùng nách lá mầm. Như vậy, từ một hạt giống nảy

21


mầm cho ra 2 mẫu cấy. Sau đó các mẫu cấy được cấy úp nghiêng 45 độ trên
môi trường cảm ứng chồi SIM bảng 2.1. Cấy với mật độ 6 mẫu/ bình môi
trường loại 250ml, nuôi cấy trong 8 tuần.
(2) Chồi ngọn:
Hạt đâu Nho nhe sau khi gieo nảy mầm (5-6 ngày tuổi), tiến hành dùng
kéo cắt lấy đoạn ngọn (3-4cm) ra khỏi bình, tiếp đó cắt lấy phần chồi ngọn
(0,5-1cm), cắt bỏ lá giữ lại phần cuống lá và chồi ngọn. Sau đó các mẫu cấy
được cấy vào môi trường cảm ứng chồi SIM bảng 2.1. Cấy với mật độ 6 mẫu/
bình môi trường loại 250ml, nuôi cấy trong 8 tuần.
Đánh giá tỷ lệ tạo đa chồi trên từng vật liệu nghiên cứu (nách lá mầm,
chồi ngọn) sau 8 tuần theo công thức:
Ci (%) = x 100%
Trong đó:
Ci: Tỷ lệ tái sinh chồi ;
Ncp: Tổng số mẫu tái sinh chồi ;
Nt: Tổng số mẫu nuôi cấy ;
2.2.4. Môi trường ra rễ
Khi chồi đạt chiều cao từ 4-5cm, chuyển sang môi trường ra rễ RM bảng
2.2. để tạo cây hoàn chỉnh. Mỗi bình cấy từ 3-4 mẫu. Đánh giá khả năng hình
thành và phát triển rễ của cây tái sinh sau 8 tuần.

22


Bảng 2.1. Thành phần các loại môi trường nuôi cấy dùng cho hệ thống tái
sinh cây đậu Nho nhe
Loại môi trường

Ký

Cảm ứng nảy mầm

hiệu
GM

Cảm ứng tạo đa chồi

SIM

Cảm ứng ra rễ

RM

Thành phần cơ bản
MS*; sucrose 30g/l; agar 9g/l; pH = 5,8
MS*; BAP (0,5, 1, 1,5, 2mg/l); sucrose
30g/l; agar 9g/l; nước dừa 10%; pH = 5,8
MS*; Kinetine (0,5, 1, 1,5, 2mg/l); sucrose
30g/l; agar 9g/l; pH = 5,8
MS*; IBA (0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5mg/l);
sucrose 30g/l; agar 9g/l; pH = 5,8

Chú thích: MS*: Môi trường cơ bản của Murashige và Skoog, 1962 [23].
Các khâu nuôi cấy từ tạo cảm ứng đa chồi đến khi ra rễ được tiến hành ở
nhiệt độ dao động trong khoảng 25oC ± 2oC, dưới ánh sáng đèn của phòng cây
với cường độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ ngày.
2.2.5. Ra cây và chế độ chăm sóc

Các bình nuôi cấy chứa cây tái sinh hoàn chỉnh được chuyển ra khỏi
phòng nuôi cấy để trong phòng có ánh sáng và nhiệt độ bình thường 2-3 ngày
để cây thích nghi. Sau đó mở nút bông, cho nước vào ngâm, lắc nhẹ cho thạch
rời khỏi rễ cây. Dùng panh kẹp nhẹ kéo cây ra khỏi bình tam giác, rửa hết
thạch bám quanh rễ bằng nước sạch sau đó trồng trên các loại giá thể khác
nhau bảng 2.2. Pha loãng dung dịch MS cơ bản 10 lần tưới nhẹ vào gốc, cứ 5
tiếng tưới 1 lần. Sử dụng mái che chắn cho cây khỏi các tác động trực tiếp từ
môi trường tự nhiên (nắng, mưa, gió…). Sau khi cây sống ra rễ và lá mới, có
thể đưa ra ngoài vườn ươm.

Bảng 2.2. Giá thể nuôi cây
23


Công thức
CT1
CT2
CT3
CT4

Giá thể
Đất thịt
Đất : Trấu
Đất : Cát
Cát : Trấu

Tỷ lệ
100%
2:1
2:1

1:1

2.2.6. Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu
Sử dụng bộ phần mềm SPSS để phân tích các trị số thống kê như trung
bình mẫu, sai số và so sánh sự khác nhau giữa các trị số trung bình ở mức ý
nghĩa α =0,05.

24


Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ KHỬ TRÙNG HẠT ĐẬU NHO NHE

Vô trùng mẫu cấy là bước đầu tiên đóng vai trò quyết định sự thành công
của việc xây dựng hệ thống tái sinh in vitro. Vì vậy, cần lựa chọn phương
pháp khử trùng và loại hóa chất thích hợp để loại bỏ hoàn toàn các nguồn vi
khuẩn, nấm mốc, virus khỏi mẫu trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy. Có
rất nhiều loại hóa chất được sử dụng để khử trùng. Tuy nhiên, nồng độ khử
trùng thích hợp cho các đối tượng khác nhau là hoàn toàn khác nhau.
Hạt đậu Nho nhe là loại hạt nhỏ, giàu chất dinh dưỡng điều kiện lý tưởng
cho các loại vi sinh vật, nấm mốc phát triển. Vì vậy, việc nghiên cứu đưa ra
công thức khử trùng tối ưu là rất cần thiết để chuẩn bị mẫu cho quá trình nuôi
cấy in vitro tiếp theo. Phương pháp khử trùng thích hợp phải đảm bảo được
các yêu cầu, tỷ lệ hạt bị nhiễm thấp, thân mầm to, mập và chồi sinh trưởng
phát triển tốt.
Chúng tôi đã tiến hành vô trùng sơ bộ hạt đậu Nho nhe bằng cách lắc nhẹ
hạt trong cồn 700 1 phút và javen ở các nồng độ 50%, 60%, 70% với ngưỡng
thời gian khác nhau 15, 20, 25 phút. Sau khi khử trùng, hạt được cấy vào môi
trường MS có bổ sung sucrose 30 g/l và agar 9 g/l. Đánh giá khả năng thu
được mẫu sạch và khả năng nảy mầm của hạt là bước tiếp theo để tìm ra công

thức khử trùng tốt nhất.
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, đối với công thức khử trùng 1, sử dụng
dung dịch Javen pha loãng 50% cho thấy tỷ lệ mẫu nhiễm rất cao, tỷ lệ nảy
mầm thấp. Cụ thể với thời gian khử trùng là 15, 20, 25 phút tỷ lệ mẫu nhiễm
lần lượt là 30%, 23%, 17%, tỷ lệ nảy mầm lần lượt 70%, 77%, 82%. Nếu tăng
thời gian khử trùng tỷ lệ mẫu nhiễm có thể sẽ giảm nhưng tỷ lệ mẫu nhiễm

25