NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH VIRUS CỦA CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana tabacum L.) CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC RNAi

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH VIRUS CỦA CÂY THUỐC LÁ
(Nicotiana tabacum L.) CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC RNAi


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

AGO
ATP
bp
CP

Protein Argonaute
Adenosin triphosphat
Base pair
Coat protein (protein
vỏ)

CMV

Cucumber mosaic
virus

DNA
Kb
kDa
RNA
RNas

Deoxyribonucleic acid
Kilobase
Kilodalton

Ribonucleic acid
Ribonuclease

TMV
TSW

Tobacco mosaic virus
Tomato spotted wilt

e

V

virus
TYL

CV

Tomato yellow leaf
curl virus


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN.................................................................................................1
LỜI CAM ĐOAN...........................................................................................2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................7
1.1...........................................................Cây thuốc lá và bệnh virus gây hại
7
1.1.1.Giới thiệu về cây thuốc lá....................................................................7
1.1.1.1. Nguồn gốc, phân loại........................................................................7

1.1.1.2. Đặc điểm sinh học............................................................................9
1.1.1.3. Ý nghĩa khoa học và tình hình sản xuất thuốc lá nguyên liệu.....11
1.1.2.Bệnh virus hại thuốc lá......................................................................12
1.1.2.1. Giới thiệu chung về bệnh hại trên cây thuốc lá............................12
1.1.2.2. Virus gây bệnh trên cây thuốc lá...................................................13
1.1.2.3. Biện pháp phòng trừ bệnh virus trên cây thuốc lá......................20
1.2.......................................................................Giới thiệu công nghệ RNAi
27
1.2.1.Lược sử nghiên cứu...........................................................................27

1


1.2.2.Cơ chế hoạt động của RNAi ở thực vật............................................29
1.2.2.1. Cơ chế hoạt động của RNAi..........................................................30
1.2.3. Đặc điểm và vai trò của cơ chế RNAi...........................................34
1.3.........................Ứng dụng RNAi trong tạo cây chuyển gen kháng virus
35
1.3.1.Ứng dụng RNAi tạo cây trồng kháng một loại virrus.....................35
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng cắt..........................................................49
TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................................................................145

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 3.1. Hình ảnh mẫu bệnh biểu hiện triệu chứng bệnh khảm lá thuốc lá...........3
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR khuếch đại đoạn gen MP-CP
(A) và một phần RdRp (B) của TMV trên gel agarose 1%.................................................4
Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR chọn dòng khuẩn lạc
dương tính.......................................................................................................................... 5
Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm tách chiết plasmid tái tổ hợp (A) và sản
phẩm cắt bằng enzyme cắt giới hạn Bam HI (B) của 5 dòng khuẩn lạc mang

pBT/RdRp-TMV................................................................................................................ 6

2


Hình 3.5. Hình ảnh tổng hợp một số trình tự của gene CP của TMV của một
số dòng thu thập ở các vùng khác nhau trong cả nước.....................................................10
Hình 3.6. Hình ảnh so sánh trình tự amino acid của các đoạn gen CP phân
lập được của các mẫu TMV Việt Nam.............................................................................10
Hình 3.7. Cây phát sinh chủng loại dựa vào trình tự nucleotide của gen CP
TMV Việt Nam................................................................................................................. 11
Hình 3.8. Hình ảnh so sánh trình tự amino acid của các đoạn gen MP phân
lập được của các mẫu TMV Việt Nam.............................................................................12
Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại dựa vào trình tự nucleotide của gen MP
TMV Việt Nam................................................................................................................13
Hình 3.10. Hình ảnh so sánh trình tự amino acid của các đoạn gen RdRp
TMV Việt Nam................................................................................................................14
Hình 3.11. Hình ảnh so sánh trình tự amino acid của các đoạn gen RdRp
TMV Việt Nam................................................................................................................16
Hình 3.12. Hình ảnh khuẩn lạc E. coli DB3.1 trên môi trường chọn lọc...............17
Hình 3.13. Kết quả điện di sản phẩm tách chiết plasmid pK7GWIWG2(II).........17
Hình 3.14. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid pK7GWIWG2(II) bởi
enzyme Sph I.................................................................................................................... 18
Hình 3.15. Kết quả điện di sản phẩm tách chiết plasmid pNOV-gusplus..............19
Hình 3.16. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid pNOV-gusplus bởi Pme I
và Hind III........................................................................................................................ 19
Hình 3.17. Bản đồ cấu trúc vector pK7M..............................................................21
Hình 3.18. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen CP của TMV..............23
Hình 3.19. Ảnh điện di sản phẩm ghép nối tạo đoạn gen đa đoạn TCYS..............24
Hình 3.20. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR chọn dòng khuẩn lạc mang

pENTR-TMV................................................................................................................... 25
Hình 3.21. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp pK7M-TMV (A),
pK7M-TCYS (B) bằng enzyme Xba I và Hind III...........................................................27

3


Hình 3.22. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR chọn dòng khuẩn lạc
mang pK7M-TMV...........................................................................................................28
Hình 3.23. Ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid tách chiết từ A.tumefacien bởi
enzyme giới hạn Xba I và Hind III...................................................................................30

MỞ ĐẦU
1.

Tính cấp thiết của đề tài

Thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) là cây công nghiệp ngắn ngày, có giá trị
kinh tế cao và đem lại nguồn thu ngân sách đáng kể cho nhiều quốc gia trên thế
giới. Việc trồng và sản xuất thuốc lá cũng thu hút nhiều nhân công, góp phần tạo
công ăn việc làm và thu nhập cho nhiều đối tượng lao động. Không chỉ để sản xuất
thuốc lá, nó còn được sử dụng làm nguyên liệu sản xuất nicotin, axit hữu cơ, dùng
làm thuốc trừ sâu hay chiết xuất dầu thực vật từ hạt. Ngoài ra, thuốc lá còn được
xem là cây mô hình cho nhiều nghiên cứu sinh học cơ bản như nghiên cứu quá trình
trao đổi chất ở thực vật, hay vai trò, chức năng của gen và protein,… Với khả năng
dễ tái sinh và chấp nhận gen ngoại lai, thuốc lá còn là mô hình cho những nghiên
cứu mang tính ứng dụng như sản xuất vacine thực vật hay dược liệu, làm nguồn
nhiên liệu sinh học thay thế.
Tuy nhiên, với những đặc điểm sinh học của mình, thuốc lá là cây trồng mẫn
cảm với nhiều bệnh hại, đặc biệt là các bệnh do virus gây nên, ảnh hưởng nghiêm

trọng đến năng suất và chất lượng cây thuốc lá. Trong đó, một số loại virus gây hại
phổ biến có thể kể đến là: TMV (Tobacco mosaic virus) TSWV (Tomato spotted
wilt virus), Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), Cucumber mosaic virus
(CMV). Khi cây nhiễm virus, thiệt hại về năng suất có thể lên tới 95-100%. Cho
đến nay chưa có một loại thuốc bảo vệ thực vật nào có khả năng chống lại bệnh do
virus gây ra trên cây trồng. Con người chỉ có thể hạn chế tác hại của virus và kiểm
soát nó ở mức độ nhất định thông qua một số biện pháp thông dụng như sử dụng
giống kháng bệnh, giống sạch bệnh, các biện pháp canh tác,… Song những biện

4


pháp này chỉ mang tính chất phòng trừ, đòi hỏi nhiều thời gian và công sức, hiệu
quả kinh tế thấp.
Hiện nay, với những tiến bộ trong lĩnh vực sinh học, người ta đã tạo ra được
một số loại cây trồng kháng được bệnh do virus gây ra thông qua biện pháp tạo cây
trồng chuyển gen mang các gen hoặc đoạn gen có nguồn gốc từ chính virus gây
bệnh (Reddy el al., 2009). Cho tới những năm cuối thế kỷ 20, cấu trúc dạng kẹp tóc
(ihpRNA) hay kỹ thuật RNAi được xem là một kỹ thuật hiện đại và hữu hiệu nhất
trong việc chống lại các bệnh do virus gây ra ở thực vật.
Bên cạnh đó, việc thay thế các gen chọn lọc gây nên những lo lắng về độ an
toàn với sức khỏe con người và môi trường như các gen kháng lại kháng sinh
hygromycin (hpt) và kanamycin (nptII) hoặc kháng lại các chất diệt cỏ như
phosphinothricin (bar) và chlorosulfuron (als) bằng thế hệ các gen chọn lọc tích
cực, thân thiện với môi trường cũng đang là vấn đề được quan tâm trong các nghiên
cứu chuyển gen vào thực vật.
Ở Việt Nam, cây thuốc lá đang được trồng phổ biến ở các tỉnh miền núi và
trung du phía Bắc, các tỉnh Nam Trung Bộ, Tây Nguyên và miền Đông Nam Bộ và
được đánh giá là một trong những cây công nghiệp ngắn ngày, đem lại hiệu quả
kinh tế cao cho nông dân và thu nhập quốc gia. Song bệnh hại (đặc biệt là bệnh do

virus) cũng đang đe dọa nghiêm trọng đến năng suất và phẩm chất cây thuốc lá. Và
những nghiên cứu về việc tạo cây trồng chuyển gen kháng bệnh và trồng cây
chuyển gen đang là vấn đề được quan tâm và thử nghiệm ở nước ta.
Xuất phát từ những cơ sở trên chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu khả
năng kháng bệnh virus của cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) chuyển gen
mang cấu trúc RNAi”.
2.

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

1)

Phân lập, đánh giá được đa dạng di truyền của TMV, xác định được

trình tự bảo thủ của gen CP (coat protein) mã hóa cho protein vỏ của TMV phục vụ
cho thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi.

5


2)

Thiết kế được vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi mang gen đơn

đoạn của TMV và gen đa đoạn chứa trình tự gen của đồng thời 4 virus TMV, CMV,
TYLCV và TSWV.
3)

Tạo được các dòng thuốc lá chuyển gen kháng đơn virus và kháng

virus phổ rộng
4)

Đánh giá được khả năng kháng virus, mức độ an toàn sinh học, khả

năng sinh trưởng của các dòng thuốc lá chuyển gen.
3.

Nội dung nghiên cứu

1)

Khảo sát, thu thập mẫu thuốc lá nghi nhiễm TMV trên các vùng trồng

thuốc lá nguyên liệu của Việt Nam
2)

Tách dòng, xác định trình tự gen, phân tích đa dạng di truyền của

TMV phân lập được.
3)

Thiết kế vector mang cấu trúc RNAi chứa đơn gen của TMV và chứa

gen đa đoạn của 4 virus TMV, CMV, TYLCV, TSWV sử dụng gen chọn lọc manA.
4)

Xác định ngưỡng chọn lọc mannose thích hợp và hoàn thiện quy trình

chuyển gen vào 2 giống thuốc lá K326 và C9-1 sử dụng chất chọn lọc mannose.

5)

Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang các cấu trúc RNAi đã thiết kế bằng

phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens.
6)

Đánh giá khả năng kháng virus, mức độ an toàn sinh học và các chỉ

tiêu liên quan đến năng suất, chất lượng các dòng thuốc lá chuyển gen.
4.

Đóng góp mới của luận án

-

Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam có sự đánh giá đa dạng di

truyền virus khảm thuốc lá một cách toàn diện ở cả 3 đoạn gen trong genome TMV.
-

Luận án đã sử dụng gen chọn lọc thân thiện với môi trường trong thiết

kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi. Tạo được cây thuốc lá kháng virus phổ
rộng, với việc kháng đồng thời 4 virus gây hại phổ biến trên cây thuốc lá. Khả năng
kháng của các dòng chuyển gen đã được di truyền ổn định đến T2.

6

-

Là công trình đầu thực hiện việc đánh giá an toàn sinh học cũng như

ảnh hưởng của gen chuyển đến các chỉ tiêu liên quan đến năng suất và chất lượng
các dòng thuốc lá chuyển gen

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cây thuốc lá và bệnh virus gây hại
1.1.1. Giới thiệu về cây thuốc lá
1.1.1.1. Nguồn gốc, phân loại
Thuốc lá là cây công nghiệp ngắn ngày có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới và
cận nhiệt đới. Trong lịch sử, cây thuốc lá được trồng đầu tiên ở châu Mỹ từ hơn
6.000 năm trước công nguyên, được sử dụng trong các nghi lễ tôn giáo và làm thuốc
chữa bệnh (Daryl et al., 2000). Christopher Columbus, người đã tìm ra châu Mỹ vào
cuối thế kỉ XV (năm 1492) chính là người châu Âu đầu tiên biết đến cây thuốc lá.
Tuy nhiên, người mang thuốc lá từ châu Mỹ tới và trồng ở châu Âu vào khoảng năm
1496-1498 lại là Pano, một nhà truyền đạo người Tây Ban Nha. Sau hơn nửa thập kỉ
được biết đến, cây thuốc lá đã có mặt ở rất nhiều nước châu Âu như: Bồ Đào Nha,
Tây Ban Nha, Pháp, Anh, Nga,… Sau đó, vào khoảng cuối thế kỉ XVI, thuốc lá bắt
đầu được trồng ở châu Á và châu Phi (Daryl et al., 2000). Ngày nay, với đặc điểm
di truyền phong phú, dễ trồng, dễ chăm sóc và thích ứng với nhiều vùng khí hậu
khác nhau, thuốc lá được trồng phổ biến ở 120 quốc gia trên thế giới với diện tích

7


hơn 4,5 triệu ha, trải dài từ 40 0 vĩ Nam đến 600 vĩ Bắc, trong đó tập trung nhiều ở vĩ
độ Bắc.
Ở Việt Nam, thuốc lá được du nhập vào từ khá sớm, khoảng giữa thế kỉ thứ

17 từ thời vua Lê Thần Tông. Tuy nhiên, ngành công nghiệp thuốc lá chỉ mới được
hình thành và phát triển từ sau Cách mạng tháng Tám (Vũ Triệu Mân và Lê Lương
Tề, 1998). Hiện nay, thuốc lá đang được trồng phổ biến ở các tỉnh miền núi và trung
du phía Bắc, các tỉnh Nam Trung Bộ, Tây Nguyên và miền Đông Nam Bộ. Virginia
Bland Cash là giống thuốc lá trồng đầu tiên ở nước ta. Sau đó, qua quá trình chọn
tạo giống, ngày nay đã có rất nhiều giống khác nhau được đưa vào sản xuất. Các
giống trồng phổ biến tại các tỉnh phía Bắc như Cao Bằng, Lạng Sơn, Bắc Giang,…
là C.176, K.326 (giống nhập nội) và giống chọn tạo trong nước gồm C7-1, C9-1,
VTL5H. C-83, K 51E, Coker 176, Burley và Flue-Cured Virginia là các giống trồng
phổ biến ở Nam Trung Bộ (Đỗ Đình Dũng et al., 2013).
Theo phân loại của Wilson và Loomis (1967), cây thuốc lá thuộc họ cà
(Solanaceae), bộ hoa mõm sói (Scrophulariales). Thuốc lá thương mại (Nicotiana
tabacum L.) là loài thuộc chi Nicotiana, chi này được chia thành 3 chi phụ, 14 phân
chi và 65 loài. Trong đó loài Nicotiana tabacum L. được xếp vào chị phụ Tabacum,
phân chi Geneuinae, là loài được gieo trồng phổ biến nhất, chiếm 90% diện tích
trồng thuốc lá trên thế giới. Loài N. tabacum L (hoa đỏ) được lai từ loài N.
sylvertris Speg & Comes và N. tomentosiformis Goodspeed hoặc N. octophora.
Nicotiana tabacum L. được chia thành 5 loài phụ là:
- Loài phụ Oriental: là nhóm có hàm lượng chất thơm và đường cao, chất
lượng tốt, được dùng để sản xuất nên các loại thuốc lá thơm hảo hạng trên thế giới.
- Loài phụ American: lá có màu vàng sáng, chất lượng cao và là loại được
trồng phổ biến nhất trên thế giới, chiếm 50% sản lượng với các loại thuốc chủ yếu
là Virginia và Burley.
- Loài phụ Southern: lá có màu sậm, chất lượng và sản lượng thấp.
- Loài phụ Island: lá có hàm lượng nicotin tương đối cao, khoảng 3%, dùng
để sản xuất xì gà.

8

- Loài phụ Asian: hàm lượng nicotin rất cao, từ 3-5%, dùng chủ yếu cho việc
sản xuất thuốc nhai.
1.1.1.2. Đặc điểm sinh học
Cây thuốc lá là cây thân thảo, mọc thẳng, đường kính thân từ 2-4 cm, cao từ
1-3 m. Chiều cao thân phụ thuộc vào giống, điều kiện canh tác và kỹ thuật gieo
trồng, chăm sóc. Trên thân có nhiều lóng và ngăn cách bởi các đốt, mỗi đốt mang
một lá và một chồi nách.Bên ngoài thân được bao phủ một lớp lông dính, mật độ
lông phụ thuộc vào các giai đoạn phát triển của cây, cây càng già mật độ lông càng
giảm.
Lá thuốc lá thường có hình trứng, ô van, e líp, thuôn bầu, thuôn dài,… Phiến
lá to có thể dài 60-70 cm, rộng 30-50 cm, không có cuống, một phần lá phía dưới
ôm vào thân. Số lá trên cây thay đổi theo giống, các giống được trồng ở nước ta có
số lá trung bình từ 20-35 lá. Bề mặt lá thuốc lá khi non có lông tơ màu trắng, dày và
dính bao phủ.Khi già lớp lông tơ thưa dần, ít dính và rụng đi. Các lông tơ này tạo
nên mùi thơm tự nhiên cho lá. Lá là phần thu hoạch chủ yếu, quyết định đến năng
suất kinh tế của cây thuốc lá. Vị trí của lá được xem là một tiêu chí dùng để phân
cấp, làm tiêu chuẩn cho quá trình thu mua nguyên liệu. Theo đó nó được chia thành
lá gốc, lá giữa và lá ngọn. Lá giữa có diện tích và chất lượng tốt hơn lá gốc và lá
ngọn, là phần thu hoạch chủ yếu trên cây thuốc lá. Thành phần chính trong lá thuốc
lá là: nicotin chiếm từ 1-6%, tinh dầu 1,5%, chất nhựa 4-7%, cacbonhydrat 25-50%,
protein 11-14%, tro 15%.
Hoa thuốc lá là loại hoa hữu hạn. Khi chùy sinh trưởng ở đỉnh không phân
hóa lá nữa thì chuyển sang phân hóa hoa. Đầu tiên, hoa trung tâm xuất hiện trước và
từ gốc sẽ phát sinh ra ba cành chạc và tiếp tục nở hoa trên các cành chạc này. Cánh
hoa dính lại với nhau thành dạng hình phễu hay hình chuông dài khoảng 5 cm, phía
đầu cánh xẻ thành 5 thùy sâu. Hoa thuốc lá là loại hoa đơn hay lưỡng tính, có năm
cánh, 5 nhị đực (4 nhị dài và một nhị ngắn) và một nhị cái, chủ yếu là tự thụ phấn,
hiện tượng giao phấn chỉ chiếm 3-5%. Trong quá trình sản xuất thuốc lá nguyên
liệu, khi cây bắt đầu xuất hiện nụ hoa đầu tiên người ta thường tiến hành ngắt ngọn

9


sau đó là diệt chồi nách để dinh dưỡng tập trung cho phát triển lá (Bùi Thanh Tùng
et al., 2013).
Quả thuốc lá là dạng quả nang có 2 ô, có đài tồn tại bọc ngoài, chín chuyển
thành màu nâu. Tỉ lệ hoa đậu quả rất cao (>90%). Trên một cây có từ 100-200 quả.
Trong một quả có rất nhiều hạt (2000-4000 hạt/quả).
Hạt thuốc lá có hình trứng, vỏ cứng màu vàng hoặc nâu, phía trong vỏ là nội
nhũ. Hạt có kích thước bé, 1ml có thể chứa tới 6000 hạt, khối lượng 1000 hạt chỉ
khoảng 0,05-0,09 g. Trong hạt chứa nhiều chất béo chiếm từ 40-43%, protein 1820%, có thể được dùng trong công nghiệp chiết xuất axit béo và protein.
Rễ thuốc lá có khả năng tái sinh mạnh, hình thành các rễ bất định ở phần cổ
rễ khi ta vun xới. Nicotin được hình thành ở rễ sau đó được vận chuyển đưa lên các
bộ phận khác ở trên cây nhất là phần lá. Rễ phân bố chủ yếu ở lớp đất mặt sâu
khoảng 50 cm. Bộ rễ thuốc lá thích hợp với pH từ 6-7. Rễ thuốc lá ưa ẩm nhưng rất
sợ úng. Trong điều kiện ngập úng, bộ rễ thuốc lá không phát triển được.
Thuốc lá là cây có nguồn gốc nhiệt đới, nhạy cảm với nhiệt độ, độ ẩm và loại
đất trồng. Điều kiện thích hợp cho cây sinh trưởng là 20 đến 30°C, độ ẩm không khí
từ 80 đến 85%, đất không chứa quá nhiều nitơ. Trong điều kiện khí hậu ở nước ta,
thời gian sinh trưởng phát triển của các giống thuốc lá khoảng 130-150 ngày, trong
đó thời gian ươm tạo cây con kéo dài 30-40 ngày. Có thể chia quá trình sinh trưởng
phát triển của cây thuốc lá thành các giai đoạn chính là: giai đoạn cây con; giai đoạn
sinh trưởng; giai đoạn ra hoa, già và chín (Nguyễn Mạnh Chinh và Nguyễn Đăng
Nghĩa, 2007; Trần Đình Kiên, 2011)
1.1.1.3. Ý nghĩa khoa học và tình hình sản xuất thuốc lá nguyên liệu
Ý nghĩa khoa học của cây thuốc lá
Với khả năng dễ tái sinh và chấp nhận các gen ngoại lai, thuốc lá là cây mô
hình quan trọng được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu sinh lý thực vật, sinh
học phân tử như phân tích chức năng gen, lập bản đồ di truyền, tạo giống… hay
trong các nghiên cứu ứng dụng như biểu hiện các protein tái tổ hợp có giá trị như

10


các vaccine hoặc dược liệu, làm nguồn nhiên liệu sinh học thay thế,…(Xiao et al.,
2015).
Trong sinh lý thực vật, thuốc lá là đối tượng để thực hiện các nghiên cứu
chuyên sâu về ảnh hưởng của các nhân tố sinh thái hay vai trò của các chất đối với
các quá trình sinh trưởng, phát triển của cây trồng. Như cơ chế tổng hợp, con đường
vận chuyển của hoocmon thực vật (Chen et al., 2010), vai trò của các chất hóa học
trong phản ứng kháng virus (Nagorskaya et al., 2014), ảnh hưởng của chu kì chiếu
sáng đến phản ứng sinh lý trong cây (Darwish et al., 2015) hay cơ chế tác động của
các enzyme tham gia vào quá trình quang hợp (Sharwood et al., 2008).
Trong lĩnh vực sinh học phân tử, thuốc lá trở thành mô hình hiệu quả trong
đánh giá biểu hiện của các gen, các nghiên cứu tiền đề trong việc ứng dụng kỹ thuật
di truyền trong cải tiến giống cây trồng. Thuốc lá là mô hình trong các nghiên cứu
về chức năng của các gen, protein liên quan đến khả năng chống chịu với các yếu tố
bất lợi của môi trường (stress phi sinh học) ở thực vật như: biểu hiện của gen
CaCIPK25 (phân lập từ cây họ đậu liên quan đến cảm ứng tín hiệu canxi) trong
chống chịu hạn và mặn (Meena et al., 2015), vai trò của gen OsPGK2-P phân lập
từ giống lúa chịu mặn (mã hóa cho enzyme phosphoglycerate kinase có vai trò
quan trọng đối với sản xuất ATP trong quá trình đường phân và sản xuất 1, 3bisphosphoglycerate để tham gia vào chu trình Calvin cố định cacbon ở thực vật)
với khả năng chịu mặn trong thuốc lá chuyển gen (Joshi et al., 2015), biểu hiện và
cơ chế tác động của protein EcbHLH57 trong tăng cường biểu hiện các gen đáp
ứng với stress phi sinh học giúp cải thiện và nâng cao khả năng chống chịu với các
tác nhân bất lợi của môi trường như hạn, mặn, oxi hóa (Babitha et al., 2015),…
trong nghiên cứu tìm phương pháp mới để giải trình tự gen và lập bản đồ di truyền
(Xiao et al., 2015), trong phân tích chức năng gen, promoter của các con đường
tổng hợp các chất ở thực vật như các hợp chất terpenoid (Zhang et al., 2015),
đường (Zheng et al., 2015; Wang et al., 2015) hay trong phản ứng ra hoa của thực

vật (Li et al., 2015).

11


Đặc biệt, thuốc lá là cây trồng mẫn cảm với bệnh hại và là cây kí chủ của
hơn 20 loại virus phổ biến khác nhau. Vì vậy, trong các nghiên cứu chuyển gen tạo
cây trồng kháng virus, thuốc lá chính là mô hình đầu tiên cho các thử nghiệm về vai
trò của các vector chuyển gen kháng bệnh virus. Trong đó có thể kể đến những
nghiên cứu điển hình như thuốc lá kháng TMV (Beachy et al., 1990; Trifonova et
al., 2015 ), thuốc lá kháng TMV và CMV (Hu et al., 2011), thuốc lá kháng virus
khảm vàng lá đậu xanh (Shanmugapriya et al., 2015), thuốc lá kháng PVY và TEVSD1 (Song et al., 2014), thuốc lá kháng virus khoai tây X (Khan et al., 2015).
1.1.2. Bệnh virus hại thuốc lá
1.1.2.1. Giới thiệu chung về bệnh hại trên cây thuốc lá
Bệnh hại, đặc biệt là các loại bệnh truyền nhiễm do các kí sinh vật gây ra
như: nấm, vi khuẩn, virus,… là nguyên nhân chính dẫn đến những thiệt hại về năng
suất và chất lượng cây trồng. Tại các vùng trồng thuốc lá, bệnh hại xuất hiện ở tất cả
các giai đoạn từ cây con trong vườn ươm cho đến khi thu hoạch (Vũ Triệu Mân,
2007). Trong đó có thể kể đến một số loại bệnh thường gặp như:
- Bệnh đốm mắt cua (bệnh đốm trắng tròn) do nấm Cercospora nicotianae
Ell and Ev gây ra. Bệnh gây hại mạnh trên lá, vết bệnh là những đốm tròn màu nâu,
giữa có màu xám bạc hoặc trắng, xung quanh có viền nâu thẫm, trên vết bệnh có thể
xuất hiện các ổ bào tử nấm màu nâu. Bệnh phát triển mạnh trong điều kiện nóng ẩm
và mưa nhiều.
- Bệnh đốm nâu do nấm Peronospora tabacina gây nên. Bệnh hại trên thân
cây con tạo các sọc màu nâu ngắn. Ở giai đoạn trưởng thành, bệnh hại trên các lá
già phía dưới, vết bệnh có hình tròn, màu nâu, xung quanh có quầng vàng.
- Bệnh đen thân có nguyên nhân từ nấm Phytophthora parasitica. Giai đoạn
cây con, thân cây và rễ cây bị thối đen, làm cây chết hàng loạt. Giai đoạn cây lớn, lá
đột nhiên chuyển vàng và héo rũ, vùng gốc cây xuất hiện phần mô bệnh có màu

đen, cắt ngang thân thấy mạch dẫn có màu nâu đen. Bệnh nặng, bộ rễ thối đen toàn
bộ làm cây chết nhanh chóng.
- Bệnh héo xanh do vi khuẩn Pseudomonas solanacearum gây ra. Triệu
chứng là lá ngọn đang xanh bị héo rũ đột ngột, sau vài ngày toàn bộ lá trên thân đều
12


héo, vàng úa, cây chết. Thân cây có các vết màu nâu ướt, bổ dọc thân thấy mạch
dẫn có màu nâu. Bệnh gây hại mạnh trong điều kiện nóng và đất quá ẩm.
- Bệnh đốm lá vi khuẩn do Pseudomonas angulate. Bệnh gây hại cả trên cây
non trong vườn ươm và cây trưởng thành trên đồng ruộng. Trên lá, vết bệnh có màu
nâu đen, lớn dần, đường kính lên đến 5-10 mm, vết bệnh có vẻ ướt. Vết bệnh phát
triển trong vùng phiến lá giữa các gân, các vết bệnh liên kết với nhau làm chết một
phần lớn diện tích lá (Nguyễn Văn Biếu et al., 2001).
Ngoài một số bệnh do nấm và vi khuẩn kể trên gây ra thì bệnh virus được
xem là nhóm bệnh phổ biến và ảnh hưởng nghiệm trọng hơn đến năng suất và chất
lượng thuốc lá, với hơn 20 loại bệnh hại đã được phát hiện trên thế giới (Vũ Triệu
Mân, 2007). Trong số đó, TMV, CMV, TYLCV, TSWV, PVX, PVY,… là những
virus xuất hiện với tỷ lệ cao trên nhiều vùng trồng thuốc lá ở nước ta với các triệu
chứng xoăn lá, khảm lá, héo và cuốn lá, cây lùn thấp,… Khác với các loại bệnh
truyền nhiễm có nguyên nhân từ nấm hay vi khuẩn, bệnh virus hại thực vật không
có thuốc phòng trừ hiệu quả dẫn đến những thiệt hại lớn về kinh tế.
1.1.2.2. Virus gây bệnh trên cây thuốc lá
Virus khảm thuốc lá (Tobacco mosaic virus, TMV)
Bệnh khảm lá thuốc lá do TMV gây nên được phát hiện từ khá sớm ở Việt
Nam và hiện tại là loại bệnh phổ biến và gây hại nặng nhất trên nhiều vùng trồng
thuốc lá nguyên liệu. Bệnh xuất hiện ở tất cả các tuổi cây, từ giai đoạn cây non
trong vườn ươm cho đến lúc cây trưởng thành. Triệu chứng bệnh xuất hiện sau
khoảng 5-7 ngày nhiễm virus, biểu hiện chủ yếu và rõ nhất trên lá, đặc biệt là các lá
non. Lá bị bệnh xuất hiện các đốm màu xanh nhạt hoặc xanh vàng ở khoảng giữa

của gân lá, tạo thành những mảng xanh đậm nhạt xen kẽ loang lổ trên phiến lá, lá co
nhỏ lại làm giảm khả năng quang hợp của cây. Bệnh có thể mất triệu chứng khi
nhiệt độ thấp dưới 110 C và cao trên 360C. Cây bệnh thường không chết nhưng sinh
trưởng kém, cây thấp lùn, năng suất có thể giảm từ 35% đến 70%, phẩm chất giảm
mạnh. Mức độ biểu hiện và thiệt hại của bệnh phụ thuộc vào giống thuốc lá, thời vụ
gieo trồng (Nguyễn Văn Biếu, 2002).

13


TMV thuộc loại Tobamovirus là một trong những virus gây hại trên thực vật
được mô tả sớm nhất bởi Mayer (1886), Iwanowski (1892), Allard (1914) và
Stanley (1935). Virus có dạng hình gậy, kích thước 300x18 nm.Trong một số trường
hợp, virus có thể tồn tại dưới dạng tinh thể 6 cạnh trong suốt. Các tinh thể này có
thể liên kết với nhau hoặc nằm rời rạc trong mô lá, mạch dẫn, lông hút, khi đó có
thể quan sát thấy virus dưới kính hiển vi thường với độ phóng đại 80 lần. TMV có
genome là một sợi RNA đơn dương, có chiều dài khoảng 6,4 Kb (Goelet et al.,
1982), mã hoá cho các protein gồm: protein vỏ virus (trọng lượng 17,6 kDa),
protein vận chuyển (trọng lượng phân tử 30kDa) giữ vai trò trong sự chuyển dịch
của virus giữa các tế bào và các protein mã hóa cho các enzyme tham gia vào quá
trình phiên mã như replicase (trọng lượng phân tử 183kDa) và quá trình tháo xoắn
bắt đầu phiên mã như helicase (126 kDa) (Collmer et al., 1983) (Hình 1.1).

Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc genome của TMV
(Collmer et al., 1983)
Virus khảm lá thuốc lá là loài đa thực, có phạm vi kí chủ rộng, gây hại trên
230 loại thực vật thuộc 32 họ khác nhau. TMV có khả năng chống chịu tốt, có sức
tồn tại mạnh mẽ trong tự nhiên, với ngưỡng pha loãng là 10 -6, nhiệt độ làm mất hoạt
tính là 93-960C tùy theo chủng và có thời gian tồn tại trong dịch bệnh cây lên tới 8
năm nếu dịch này được xử lý bằng di-ethylether. Bệnh lan truyền mạnh qua tiếp xúc

cơ học giữa cây bệnh và cây lành (tại các vết thương cơ giới thông qua dụng cụ lao
động, chân tay người chăm sóc,…) và không truyền qua côn trùng. Thời kì tiềm dục
khoảng 5 ngày trong điều kiện nhiệt độ là 300C, trung bình là 8-14 ngày. Ở điều
14


kiện nhiệt độ thấp, thời gian ủ bệnh có thể kéo dài đến 2 tháng. Virus có thể tồn tại
lâu dài trên tàn dư cây bệnh, trên vỏ hạt giống, trên cây kí chủ trung gian,… và là
nguồn bệnh cho vụ tiếp theo (Vũ Triệu Mân, 2007).
Virus khảm dưa chuột (Cucumber mosaic virus, CMV)
Virus khảm dưa chuột (CMV) được Price phát hiện lần đầu tiên vào năm
1934 ở Mỹ. Đây là virus thực vật có phổ gây bệnh rộng nhất với trên 1000 loài cây
thuộc hơn 100 họ thực vật khác nhau (Gallitelli, 2000) trong đó có nhiều cây trồng
có giá trị kinh tế cao như cây họ cà, họ bầu bí, họ đậu,… (Phạm Thị Vân et al.,
2009b). Virus được lan truyền qua tiếp xúc cơ học, qua vật chủ trung gian chủ yếu
là qua rệp muội theo kiểu không bền vững như các loại rệp bông (Aphis gossypii
Glover), rệp đào (Myzus persicae Sulz). Virus không bền trong dịch cây bệnh sau
một vài ngày ở nhiệt độ phòng, chịu được nhiệt độ 700C trong thời gian 10 phút.
Bệnh phát triển mạnh trong điều kiện 20-220C, ánh sáng yếu, bón nhiều đạm. Giai
đoạn cây non là giai đoạn mẫn cảm nhất với virus (Vũ Triệu Mân, 2007).
Trên cây thuốc lá nhiễm CMV, biểu hiện đầu tiên của bệnh là các lá non ngả
màu vàng nhạt, lá nhỏ lại, các ngọn bị chùn lại, không phát triển được.Trên các mặt
lá có biểu hiện các vết khảm loang lổ, màu sắc chỗ đậm, chỗ nhạt. Ngoài ra còn có
những biểu hiện khác như: phiến lá nhăn nheo, lồi lõm, do các gân lá bị kìm hãm
sinh trưởng trong khi thịt lá vẫn phát triển, kích thước lá bị thu nhỏ lại. Bệnh nặng
thì cây cằn cỗi, chết dần từ ngọn xuống (Nguyễn Văn Biếu, 2002).
CMV thuộc loại Cucumovirus, họ Bromoviridae.Virus có dạng hình cầu kích
thước 28-30 nm. Genome của CMV bao gồm 3 sợi RNA đơn dương (RNA1, RNA2
và RNA3) chứa 5 khung đọc mở (ORF), chiếm 18% khối lượng virus. ORF 1a và
2a nằm trên RNA 1 và 2, tách biệt và là những thành phần của enzyme sao chép

replicase; ORF 2b là một gen gối lên ORF 2a, nằm trên dưới genome RNA4A (Ding
et al., 1994) và mã hóa một suppressor của quá trình câm gen sau phiên mã
(Brigneti et al., 1998). ORF 3a và CP nằm trên RNA3, trong đó ORF 3a mã hóa cho
protein 3a-protein di chuyển của virus (MP) còn ORF CP mã hóa cho protein vỏ
(CP); CP được biểu hiện từ dưới genome RNA4 (Roossinck, 2001).

15


Các chủng CMV đã được phân chia thành hai phân nhóm I và II dựa vào
huyết thanh học (Ilardi et al., 1995), lai acid nucleic (Owens và Palukaitis, 1998),
trình tự gen và RFLP (Sialer et al., 1999). Phân nhóm I và II có mối quan hệ khá
xa nhau và genome của chúng có 75% nucleotide tương đồng. Phân nhóm I lại
được chia thành IA và IB, với độ tương đồng khá cao lên tới 92%-95% (Palukaitis
và Zaitlin, 1997; Roossinck, 2002). Các chủng CMV IA và II xuất hiện gần như
trên khắp thế giới, trong khi các chủng CMV IB chủ yếu có mặt ở Châu Á
(Roossinck, 2002).
Trong ba sợi RNA của CMV, RNA3 xảy ra sự tái tổ hợp thường xuyên hơn
RNA1 và RNA2 (Roossinck, 2002; Bonnet et al., 2005). Vì vậy có rất nhiều nghiên
cứu dựa vào RNA3 để đánh giá đa dạng di truyền và xây dựng cây phát sinh chủng
loại của CMV (Roossinck et al., 1999; Deyong et al., 2005); trong đó, gen CP được
ưu tiên nhất bởi CP của CMV đóng một vai trò cần thiết trong sự di chuyển virus,
vector truyền bệnh và sự phân hóa triệu chứng (Callaway et al., 2001). Vai trò này
của gen CP cũng cho phép sử dụng gen CP làm nguyên liệu cho tạo cây trồng
chuyển gen kháng virus CMV bằng cơ chế bất hoạt RNA (RNA interference).
Virus héo đốm cà chua (Tomato spotted wilt virus, TSWV)
Virus héo đốm cà chua thuộc loại Tospovirus, họ Bunyaviridae. Tospovirus
gây hai trên nhiều cây lương thực và rau quả, tác động lớn đến nền nông nghiệp ở
các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Thiệt hại về kinh tế do nhóm virus này gây ra
trên toàn cầu ước tính lên đến hơn 1 tỉ đô la mỗi năm. Trong số hơn 25 loài được

biết đến của chi Tospovirus, TSWV là loài gây hại phổ biến và nghiêm trọng nhất
với phổ kí chủ là hơn 1000 loài thực vật. Một số cây kí chủ chính của TSWV là
khoai tây, cà chua, thuốc lá, đậu tương, bắp cải,…(Pappu et al., 2009; Mitter et al.,
2013).
Ở Việt Nam, TSWV được phát hiện lần đầu tiên trên cây thuốc lá trồng tại
Tây Ninh vào năm 1998 (Nguyễn Ngọc Bích và Bùi Cách Tuyến, 2005). Những
năm sau đó (2002-2003), TSWV trở thành loại virus gây thiệt hại nghiêm trọng nhất
tại đây. Thuốc lá nhiễm TSWV biểu hiện triệu chứng bệnh trên toàn cây, lá bị úa

16


vàng và xuất hiện các vết hoại tử , phiến lá biến dạng, thân cây còi cọc xuất hiện các
vệt đen kéo dài từ lá bệnh xuống gốc, bệnh nặng, ngọn cây sinh trưởng bất thường,
chùn lại, cây chết (Vũ Triệu Mân, 2007).
TSWV có dạng hình cầu, đường kính khoảng 85 nm. Genome của TSWV
gồm ba sợi RNA đơn âm (negative) hoặc lưỡng tính (ambisense) là sợi L (8,9 kb),
sợi M (4,9 kb) và sợi S (2,9 kb). Sợi L mã hóa cho các replicase liên quan tới quá
trình phiên mã của virus trong khi sợi M mã hóa cho protein vận chuyển (NSm) và
protein vỏ (GN và GC), còn sợi S mã hóa cho nucleprotein (N) và protein ức chế
quá trình bất hoạt gen (NSs) (Kormelink et al., 1992; Takeda et al., 2002) (Hình
1.4). Tổ chức bộ gen của TSWV cho phép nó dễ dàng kết hợp với những virus họ
hàng để tạo nên những chủng mới, đây là một trong những lí do khiến việc kiểm
soát virus này trở nên khó khăn (Mitter et al., 2013). Hiện nay, những nghiên cứu
giải trình tự bộ gen của TSWV vẫn tiếp tục được tiến hành nhằm đánh giá mối quan
hệ di truyền giữa các chủng virus tại các vùng khác nhau với những virus đã được
phát hiện nhằm tìm ra biện pháp phòng trừ hiệu quả nhất (Margaria và Rosa, 2015;
Hu et al., 2011).

Hình 1.2. Sơ đồ cấu trúc genome TSWV

(Takeda et al., 2002)
Chiều mũi tên chỉ chiều dịch mã Virus được lan truyền chủ yếu thông qua bọ
trĩ (với ít nhất khoảng 7 loài bọ trĩ khác nhau có thể truyền bệnh) như các loài:
Thrips tabaci, Thrips setosus, Thrips parmi,… theo kiểu truyền bền vững. Ấu trùng
17


tuổi 2 và bọ trĩ trưởng thành chỉ có khả năng truyền bệnh khi TSWV được hấp thụ
trước đó, tức là ở giai đoạn ấu trùng bọ trĩ tuổi 1. Tế bào biểu mô ruột giữa là vị trí
virus định cư và nhân lên, sau đó TSWV sẽ di chuyển đến tuyến nước bọt. Bệnh
thường phát triển mạnh trong điều kiện thời tiết ấm và khô – khoảng 25 0C, ít mưa
(đây là điều kiện thuận lợi cho bọ trĩ sinh sản).Virus sẽ ngừng hoạt động khi ở nhiệt
độ khoảng 40-460C. TSWV có thể qua đông trên nhiều loài cây trồng khác nhau.Khi
nhiệt độ xuống thấp, bọ trĩ mang virus qua đông dưới dạng côn trùng nằm trong đất.
Khi xuân đến, thời tiết ấm áp, bọ trĩ sẽ truyền bệnh một cách dễ dàng.(Vũ Triệu
Mân, 2007).
Virus xoăn vàng lá cà chua (Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)
Virus xoăn vàng lá cà chua là nguyên nhân gây bệnh xoăn vàng lá trên nhiều
đối tượng cây trồng họ cà như cà chua, thuốc lá, khoai tây,…Khi cây bị nhiễm
TYLCV, năng suất thiệt hại trung bình từ 55-90% (Reynaud et al., 2003; Nguyễn
Thị Hải Yến, 2012).
TYLCV thuộc chi Begomovirus, họ Geminiviridae, được phát hiện lần đầu
tiên ở Israel vào năm 1939 và đến năm 1988, chủng virus này mới được phân lập.
Begomovirus là một trong bốn chi lớn nhất trong họ Geminiviridae với trên 200 loài
khác nhau (Fauquet et al., 2008).Virion có dạng hình chùy gồm hai khối cầu 20 mặt,
kích thước khoảng 38x22 nm. Các virus trong chi Begomovirus được chia làm 3
nhóm chính dựa vào cấu trúc genome của chúng bao gồm loại hai vòng gen (DNAA và DNA-B) kích thước khoảng 2,6-2,8 kb (thể bipartite), loại một vòng gen
nhưng dịch mã thành hai khung đọc riêng biệt (giống DNA-A) kích thước khoảng
2,8 kb (thể monopartite) và loại một vòng gen kèm DNA vệ tinh (Reddy et al.,
2005; Idris và Brown, 2005; Ha et al., 2008). Dựa vào phân tích phân tử, ngưỡng

phân biệt loài virus trong chi Begomovirus là 89% tương đồng chuỗi nucleotide cho
vòng DNA-A. Tên của TYLCV thường được đặt tên dựa trên triệu chứng là xoăn lá
và biến vàng kèm theo tên địa phương nơi bệnh xuất hiện như TYLCV-Is (Isarel),
TYLCV-Th (Thái Lan), TYLCV-Au (Autralia), TYLCCNV (Trung Quốc),….Theo

18


cách phân loại này, hiện nay trên thế giới có 40 loài đã được công bố với triệu
chứng bệnh không thể phân biệt được (Đỗ Tấn Dũng et al., 2012).
Genome Begomovirus có 6 khung đọc mở, gồm gen CP (V1) và preCP (V2)
có chiều dịch mã ngược chiều với bốn gen C1, C2, C3 và C4. Các gen này có thể
nằm trên cùng một vòng DNA-A hoặc hai vòng DNA-A và DNA-B riêng biệt được
ngăn cách với nhau bởi một vùng liên gen (IR-intergeneic region) có độ dài khoảng
200 nucleotide. Trên đó chứa điểm khởi đầu sao chép và vùng điều khiển cho sự tái
bản vòng gen virus theo cả hai hướng. Dạng trình tự điển hình nhất trong vùng IR là
hai trình tự bảo thủ lặp lại đảo ngược của TAATATTAC được định vị trên một cấu
trúc vòng (stem-loop) có liên quan tới việc tái bản sợi DNA mới và một trình tự lặp
cần thiết cho việc nhận biết và bám vào của protein Rep trong quá trình phiên mã
(Rojas et al., 2005; Seal et al., 2006). Trong hệ gen của Begomovirus, gen CP mã
hóa cho protein vỏ tham gia vào các quá trình tạo vỏ ngoài virus, vận chuyển và
nhận ra vector truyền nhiễm. Gen C1 mã hóa protein tái bản, là protein đa chức
năng vừa khởi đầu vừa kết thúc tổng hợp DNA virus. CP và C1 được xem là 2 gen
có vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên của virus, đồng thời còn là những
vùng gen có độ bảo thủ cao nên thường được lựa chọn làm nguyên liệu trong thiết
kế vector chuyển gen (Kamachi et al., 2007; Nguyễn Thị Hải Yến, 2011).
TYLCV không truyền qua hạt phấn, không truyền qua tiếp xúc cơ học. Virus
xâm nhập vào cây và lan truyền trên đồng ruộng nhờ môi giới là bọ phấn Bemissia
tabaci (họ Aleyrodidae) theo kiểu truyền bền vững. Thông thường, thời gian chích
nạp và chích truyền virus của bọ phấn là khoảng 15-20 phút, thời kì tiềm ẩn khoảng

8 giờ. Virus có thể truyền từ bọ phấn đực sang bọ phấn cái và ngược lại thông qua
giao phối. Một bọ phấn có thể truyền bệnh sau khi chích nạp 24 giờ mặc dù tỉ lệ
truyền bệnh là không cao (Gafni Y, 2003; Vũ Triệu Mân, 2007).
1.1.2.3. Biện pháp phòng trừ bệnh virus trên cây thuốc lá
Thuốc lá là một trong những cây trồng chịu thiệt hại bởi nhiều loại sâu và
bệnh khác nhau, đặc biệt là bệnh do virus gây nên. Do đó, việc nghiên cứu các biện

19


pháp phòng trừ sâu bệnh hại có ý nghĩa quan trọng để đảm bảo vấn đề kinh tế cho
các vùng trồng thuốc lá nguyên liệu.
Ở Việt Nam, Viện Kinh tế Kỹ thuật Thuốc lá là nơi tập trung nhiều nghiên
cứu, điều tra về thành phần các loại sâu bệnh hại thuốc lá, làm tiền đề cho việc đề
xuất các biện pháp phòng trừ sâu bệnh hại hiệu quả nhất (Nguyễn Văn Biếu et al.,
2001; Nguyễn Ngọc Bích và Bùi Cách Tuyến, 2005). Hiện nay, con người sử dụng
nhiều biện pháp khác nhau để phòng trừ các bệnh virus, trong đó có sự kết hợp giữa
các biện pháp truyền thống lẫn các biện pháp hiện đại, ứng dụng những tiến bộ
trong lĩnh vực công nghệ sinh học nhằm giảm thiểu tối đa những thiệt hại do virus
gây ra. Căn cứ vào đặc tính của cây trồng, đặc điểm của từng loại virus, khả năng
truyền lan và sự tồn tại của nguồn bệnh có thể kể đến một số các biện pháp phòng
trừ bệnh virus tiêu biểu, điển hình như sau:
Biện pháp truyền thống
- Sử dụng giống kháng bệnh: Đối với thuốc lá, nguồn giống có gen kháng
bệnh rất hạn chế và thường chỉ được tìm thấy trong một số loài thuốc lá dại. Vì vậy,
lai xa giữa các loài thuốc lá trồng với thuốc lá dại là biện pháp hữu hiệu để tạo cây
thuốc lá kháng bệnh. Trở ngại lớn của phương pháp này là nguồn gen kháng thường
được tìm thấy trong các loài thuốc lá có họ hàng xa với thuốc lá trồng. Với sự trợ
giúp của kỹ thuật cứu phôi và dung hợp tế bào trần các nhà khoa học đã thực hiện
thành công việc lai xa để thu được các dòng thuốc lá chống chịu bệnh. Alard là

người đầu tiên công bố rằng Nicotiana glutinosa là loài miễn dịch với TMV. Khi lây
nhiễm nhân tạo TMV trên cây sẽ xuất hiện các đốm mô chết hoại có ranh rới rõ
ràng. Sau đó tính kháng TMV theo cơ chế này còn được tìm thấy ở nhiều loài thuốc
lá hoang dại khác như N. benthamiana, N. gossei, N. velutina, N. accuminata, N.
maritime. Tuy nhiên với ưu điểm tính kháng TMV chỉ do một gen trội kiểm soát
nên Nicotiana glutinosa được các nhà chọn giống sử dụng để tạo các giống thuốc lá
kháng TMV (Zhang et al., 2010).
Bên cạnh đó, những nghiên cứu sâu hơn về gen kháng và theo thuyết gen đối
gen của Flor năm 1971, đối với TMV, gen Rep (mã hóa cho enzyme phiên mã tham

20


gia vào quá trình nhân lên của virus trong cây kí chủ) được xem là gen không độc,
tương ứng với gen kháng N trong cây thuốc lá. Khi có sự tồn tại song song của cả
gen N và Rep thì cây thuốc lá có khả năng kháng cao với TMV (do vai trò giới hạn
khả năng nhân lên và di chuyển của virus). Việc phân lập thành công gen N trong
cây thuốc lá là cơ hội để tạo giống kháng TMV không chỉ với thuốc lá mà còn trên
các đối tượng cây trồng khác (Erickson et al., 1999; Đỗ Tấn Dũng, 2012).
Ở Việt Nam, trước đây, các nghiên cứu trên cây thuốc lá chủ yếu tập trung
vào chọn tạo và phát triển các giống cho năng suất cao, chất lượng tốt, thích nghi
với điều kiện khí hậu. Thành công theo hướng này có thể kể đến một số giống như:
C.176 và K.326 được công nhận là giống quốc gia vào năm 1996 (Nguyễn Thị Loan
et al., 2001); C9-1 và C7-1 công nhận là giống quốc gia năm 2004 (Vũ Thị Bản và
Tào Ngọc Tuấn, 2005). Gần đây là hai giống thuốc lá lai đang được sản xuất thử
nghiệm là VTL6H và VTL81 (Hoàng Tự Lập et al., 2013) cùng với dòng thuốc lá
TL16 cho năng suất cao và ổn định, chất lượng tốt, phục vụ sản xuất trong nước và
làm nguyên liệu xuất khẩu (Đào Thị Xuân et al., 2012). Hiện nay, tại các vùng trồng
thuốc lá, bệnh virus đã và đang gây ra những thiệt hại lớn về kinh tế đặt ra yêu cầu
cần có nguồn giống kháng bệnh tốt hơn phục vụ cho sản xuất. Trong đó, TMV là

virus gây hại chính ở nước ta, do đó các hướng nghiên cứu chủ yếu tập trung vào
chọn tạo các giống thuốc lá kháng bệnh khảm lá do TMV. Kết quả đã thu được một
số dòng, giống thuốc lá mới như: BS2, BS3, VTL.5H (công nhận giống quốc gia
năm 2009), GL2 (công nhận giống quốc gia năm 2013), … có khả năng kháng bệnh
cao với virus khảm thuốc lá, trồng được trên vùng đất có tiền sử bệnh TMV (Đào
Đình Dũng et al., 2013, Trần Đăng Kiên et al., 2013)
Qua quá trình chọn lọc nhân tạo lâu dài theo hướng tạo các giống cây trồng
có năng suất cao, phẩm chất tốt mà ít quan tâm đến khả năng kháng bệnh khiến cho
ngày nay số lượng các giống cây trồng có khả năng kháng virus tự nhiên là rất ít.
Đây cũng là hạn chế của phương pháp này trong việc tìm kiếm nguồn vật liệu di
truyền kháng virus phục vụ cho công tác lai tạo giống truyền thống

21


- Sử dụng giống sạch bệnh: Nguồn giống được lựa chọn từ các cây giống
khỏe mạnh, sạch bệnh hoặc được xử lý nhiệt, hóa chất để loại bỏ mầm bệnh trước
khi gieo trồng.
Đối với cây thuốc lá, gieo cây con trên khay thay vì trên luống đất được xem
là biện pháp đơn giản giúp ngăn chặn nguồn bệnh phát sinh từ đất, tạo cây con đồng
đều, khỏe mạnh và sạch bệnh. Hiện nay, 1/3 diện tích trồng thuốc lá ở Trung Quốc
sử dụng cây con trong khay làm nguồn cây giống ban đầu. Ở Việt Nam, gần đây,
quy trình sản xuất cây con thuốc lá theo phương pháp khay lỗ cũng được hoàn thiện
và áp dụng hiệu quả trong sản xuất (Đinh Văn Năng et al., 2013). Bên cạnh đó việc
khử trùng bằng rượu ethanol hay xử lý bằng potassium bromide cũng giúp làm tăng
sức sống và loại bỏ mầm bệnh đối với hạt giống thuốc lá trước khi gieo trồng
(Nguyễn Mạnh Chinh và Nguyễn Đăng Nghĩa, 2007).
Hạn chế của biện pháp này là cây trồng vẫn có thể nhiễm virus khi canh tác
trên đồng ruộng.
- Biện pháp canh tác: Luân canh, xen canh, thời vụ, chăm sóc,… là những

biện pháp canh tác được áp dụng thường xuyên trong quá trình trồng trọt. Đây là
biện pháp không gây ảnh hưởng đến môi trường, đem lại hiệu quả phòng trừ tốt nếu
áp dụng đúng cách. Đối với bệnh virus, biện pháp này giúp thay đổi cây kí chủ, loại
bỏ mầm bệnh cho vụ sau do đó thường hạn chế với những bệnh có nguyên nhân từ
nhóm virus có phổ kí chủ rộng, khả năng chống chịu cao (Vũ Triệu Mân, 2007).
Ở vùng trồng thuốc lá nguyên liệu thuộc các tỉnh phía Bắc Việt Nam thường
có công thức luân canh là: thuốc lá xuân-lúa mùa sớm-cây vụ đông hoặc lúa xuânlúa mùa sớm-thuốc lá thu. Tại các tỉnh phía Nam, thuốc lá được trồng vào mùa khô
khoảng tháng 10 đến tháng 1 là thời điểm không phù hợp cho sự phát triển của môi
giới truyền bệnh. Không trồng thuốc lá trên đất canh tác cây họ cà ở vụ trước để
tránh nguồn bệnh đặc biệt là bệnh xoăn lá do TYLCV (Nguyễn Mạnh Chinh và
Nguyễn Đăng Nghĩa, 2007).
- Biện pháp cơ học và lý học: Đối với các virus lan truyền qua môi giới như
TYLCV, TSWV, CMV có thể phòng bệnh bằng cách sử dụng tấm phủ phản quang

22


có tính chất phản xạ ánh sáng khả kiến và tia cực tím, làm mất phương hướng và
giảm đáng kể sự xâm nhập của bọ phấn, bọ trĩ và các loại rệp trên đồng ruộng. Biện
pháp này đã được ứng dụng thành công trên cây cà chua (Zaks, 1997). Ngoài ra,
lưới chống côn trùng hay tấm nhựa che hấp thụ tia cực tím cũng giúp ngăn chặn
hiệu quả các loại môi giới truyền bệnh virus (Berlinger et al., 2002).
Bên cạnh đó, có thể sử dụng các biện pháp cơ học khác như dùng tay, bẫy để
loại bỏ cỏ dại và tiêu diệt các loại rệp muội, bọ phấn, bọ trĩ trên đồng ruộng. Đối
với các ruộng thuốc lá sau khi thu hoạch, cần tiêu hủy hết tàn dư cây trồng nhằm
loại bỏ mầm bệnh cho vụ sau (Nguyễn Mạnh Chinh và Nguyễn Đăng Nghĩa, 2007).
Biện pháp cơ học và lý học được xem là biện pháp đơn giản, dễ tiến hành
giúp hạn chế sự lây lan dịch bệnh trên đồng ruộng.
- Biện pháp sinh học: Với bệnh virus, việc sử dụng một số chủng virus nhược
độc để lây nhiễm nhân tạo có thể giúp cây trồng tăng sức kháng bệnh đối với virus

đó hoặc những virus có quan hệ gần gũi. Nhật Bản đã phân lập được 3 chủng TMV
có tính độc yếu là TMV-L11, TMV-L11A và TMV-L11A237 để phòng chống bệnh
khảm thuốc lá. Hà Lan gây đột biến và cũng tạo được chủng virus khảm thuốc lá
MR-11-16 nhược độc, được sử dụng rộng rãi trong các nhà kính ở Hà Lan và Anh
để phòng chống bệnh virus trên cây thuốc lá và cà chua (Phạm Văn Lầm, 2005).
Liên quan đến việc sử dụng các chất kháng sinh, một số nghiên cứu gần đây
chỉ ra rằng, lentinan và lentinan sulfat có khả năng chống lại virus khảm thuốc lá,
giảm nhẹ các triệu chứng bệnh và sự nhân lên của TMV trong các cây thuốc lá
nhiễm bệnh. Lentinan (β-1,3/1,6 glucan) là hợp chất tự nhiên (cấu tạo từ các đơn
phân là D-glucose gắn với nhau qua liên kết β-glycoside) có hoạt tính sinh học cao
với hàm lượng lớn được tìm thấy trong nấm hương (Trần Thị Hồng Hà et al., 2013).
Lentinan và lentinan sulfat có khả năng bảo vệ cây thuốc lá lâu dài đối với sự xâm
nhiễm của TMV. Các hợp chất này bám vào protein vỏ của virus và kích hoạt bền
vững hoạt động của một nhóm các gen mã hóa cho các enzyme bảo vệ trong cây
thuốc lá như enzymes phenylalanine ammonia lyase (PAL), phenylalanine
ammonia-lyase

và

5-epi-aristolochene

23

synthase

hay

một

vài

hợp

chất