Tổng hợp vật liệu nano bạc chấm lượng tử graphen (AgNPs GQDs) và ứng dụng

BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Nguyễn Thị Ngọc Lan

TỔNG HỢP VẬT LIỆU NANO BẠC/CHẤM LƢỢNG TỬ
GRAPHEN (AgNPs/GQDs) VÀ ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ: HÓA VÔ CƠ

Hà Nội - 2019


BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Nguyễn Thị Ngọc Lan

TỔNG HỢP VẬT LIỆU NANO BẠC/ CHẤM LƢỢNG TỬ
GRAPHEN (AgNPs/GQDs) VÀ ỨNG DỤNG
Chuyên ngành: Hóa vô cơ
Mã số: 8440113

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
Hƣớng dẫn 1: TS. Trần Vĩnh Hoàng
Hƣớng dẫn 2: GS.TS. Trần Đại Lâm
Hà Nội - 2019


Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan những gì viết trong luận văn là do sự tìm tòi, học hỏi
của bản thân và sự hƣớng dẫn tận tình của các thầy TS. Trần Vĩnh Hoàng và
GS.TS Trần Đại Lâm. Mọi kết quả nghiên cứu cũng nhƣ ý tƣởng của tác giả
khác, nếu có đều đƣợc trích dẫn cụ thể. Đề tài luận văn này cho đến nay chƣa
đƣợc bảo vệ tại bất kỳ một hội đồng bảo vệ luận văn thạc sĩ nào và cũng chƣa
hề đƣợc công bố trên bất kỳ một phƣơng tiện nào. Tôi xin chịu trách nhiệm về
những lời cam đoan trên.

Hà Nội, ngày 11 tháng 4 năm 2019
Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Ngọc Lan


Lời cảm ơn

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới ngƣời
thầy đã tận tình hƣớng dẫn tôi là TS. Trần Vĩnh Hoàng và GS.TS. Trần Đại
Lâm.
Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ môn Hóa Vô cơ Đại cƣơng, Viện Kỹ thuật
Hóa học, Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi
điều kiện cho tôi làm thực nghiệm, đo mẫu trong thời gian qua.
Trong quá trình nghiên cứu, tôi còn nhận đƣợc sự động viên, giúp đỡ của
các các thầy cô- Viện Hàn lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, bạn bè đã
luôn ủng hộ và cho tôi những lời khuyên bổ ích.
Cuối cùng, tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới gia đình, đồng nghiệp và
những ngƣời thân đã luôn sát cánh bên tôi để tôi có thể hoàn thiện khóa học.


Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt
Ký hiệu

Tên Tiếng Anh

Tên Tiếng Việt

GQDs

Graphene quantum dots

Chấm graphen lƣợng tử

AgNPs

Silver Nanoparticles

Hạt nano bạc

TEM

Transmission Electron
Microscope

Ảnh hiển vi điện tử truyền
qua

SEM

Scanning Electron Microscope

Ảnh hiển vi điện tử quét

EDX

Energy-dispersive X-ray
spectroscopy

Phổ tán xạ năng lƣợng

PL

Photoluminescence

Huỳnh quang

XRD

X-rays diffraction

Nhiễu xạ tia X

FT-IR

Fouier Tranfomation IifraRed
spectrum

Phổ hồng ngoại

DLS

Dynamic Light Scattering

Phƣơng pháp đo phân bố
kích thƣớc hạt bằng phƣơng
pháp tán xạ

UV-Vis

Ultraviolet–visible spectroscopy Quang phổ hấp thụ phân tử

WHO

World Health Organization

Tổ chức Y tế thế giới

IUPAC

International Union of Pure and
Applied Chemistry

Liên minh Quốc tế về Hóa
học Tinh khiết và Hóa học
ứng dụng

ChOx

Cholesterol Oxidase

Enzyme oxi hóa Cholesterol


HRP

Horseradish peroxidase

Enzyme Horseradish
peroxidase

Danh mục các bảng
Bảng 3. 1. So sánh các cảm biến cholesterol trên cơ sở phương pháp so màu
........................................................................... Error! Bookmark not defined.


Danh mục các hình vẽ, đồ thị
Hình 1.1. Nguyên lý cấu tạo của cảm biến sinh học[2] ................................... 6

Hình 1. 2. Các kiểu đầu thu sinh học phổ biến trong cảm biến sinh học. ........ 8
Hình 1.3. Phân loại cảm biến trên cơ sở bộ phận chuyển đổi (transducer)[34]
........................................................................................................................... 9
Hình 1.4. Cảm biến so màu phổ dụng: (a) giấy đo độ pH; (b) Hộp que thử 10
thông số của nước tiểu và (c) các màu sắc ứng với nồng độ trong 10 thông số
của que thử nước tiểu; (d) giấy thử hàn the trong thực phẩm; (e) bộ kit xác
định hàm lượng methanol trong rượu và (f) que thử thai. .............................. 10
Hình 1.5. (a) Cấu trúc của enyzme Cholesterol Oxidase; (b) Sơ đồ cấu trúc
của cholesterol và (c) cấu trúc của cholest-4-en-3-one.................................. 14
Hình 1.6. Mô hình mô tả tác hịa làm tắc mạch máu, xơ vữa động mạch của
cholesterol. ...................................................................................................... 15
Hình 1.7. Sơ đồ phản ứng enzyme dùng để xét nghiệm cholesterol theo
phương pháp so màu. ...................................................................................... 17
Hình 1.8. (A) Bộ dụng cụ đo nồng độ cholesterol trong máu: (1) hộp đựng
que thử; (2) than máy đo; (3) kim chích máu; (4) que đo và (5) bút chích máu.
(B) Cấu trúc của que thử. ................................................................................ 17
Hình 1.9. Cảm biến màu cholesterol sử dụng hạt nano vàng (lõi)/bạc (vỏ)
thay thế enzyme POD [43]. ............................................................................. 19
Hình 1.10. Nguyên lý phát hiện cholesterol bằng phương pháp so màu sử
dụng hạt graphen nano (GQDs) thay thế enzyme HRP[54] ........................... 20
Hình 1.12. Hai nguyên lý trong tổng hợp GQDs ............................................ 22
Hình 1. 13. (a) Dung dịch nano bạc (nano Ag); (b) Phổ UV-Vis của dung dịch
nano Ag và (c) ảnh TEM của hạt nano Ag chế tạo được trong luận văn. ...... 23
Hình 2.1 Sơ đồ chùm tia tới và chùm tia nhiễu xạ trên tinh thể ..................... 30
Hình 2.2 Độ tù của pic phản xạ gây ra do kích thước hạt .............................. 31
Hình 2.3 Thiết bị đo nhiễu xạ tia X ................................................................. 31


Hình 2.4 Kính hiển vi điện tử truyền qua hiện đại.......................................... 32
Hình 2.5 Máy đo phổ hồng ngoại (FTIR) ....................................................... 33

Hình 2.6 Bước chuyển của các electron trong phân tử ................................. 34
Hình 2.7. Hệ đo UV–Vis Agilent 8453 ............................................................ 35
Hình 3.1. Sơ đồ mô tả sự hình thành hạt GQDs dots theo phương pháp từ
dưới lên (bottom-up) ....................................................................................... 37
Hình 3. 2.(A) Phổ UV-Vis của GQDs và (B) phổ FL của GQDs với các bước
sóng kích thích khác nhau; (D) Ảnh TEM of GQDs;(E) Màu sắc dung dịch
GQDs và mẫu nước ở dưới ánh sáng thường (trái) và dưới tia UV (phải) .... 38
Hình 3.3. Sơ đồ mô tả sự tạo thành vật liệu AgNPs/GQDs ............................ 39
Hình 3.4. (A) Phổ UV-Vis của (a) GQDs, và (b) AgNPs/GQDs; (B) Phổ XRD
của (a) GQDs và (b) AgNPs/GQDs. ............................................................... 40
Hình 3. 5. (a,b) Ảnh TEM của AgNPs/GQDs; (c) ảnh SEM của sản phẩm
AgNPs/GQDs;(d) Phân bố kích thước hạt phân tích theo phương pháp tán xạ
laser (DLS) của mẫu AgNPs/GQDs) .............................................................. 41
Hình 3.6. (A) Phổ FT-IR của: (a) chấm lượng tử graphen (GQDs) và (b)
AgNPs/GQDs và (B) Phổ tán xạ năng lượng (EDX) ...................................... 43
Hình 3. 7. (A) phổ hấp thụ UV-vis của AgNPs/GQDs (a) trước và (b) sau khi
thêm 100 μM dung dịch H2O2; (B) Biến đổi A/A (%) theo thời gian. .......... 44
Hình 3. 8. Phổ UV-vis của dung dịch AgNPs/CQDs trước (đường i) và sau
khi phản ứng với 100 µM H2O2 ở các pH khác nhau: (a) pH =3; (b) pH = 4;
(c) pH = 7; (d) pH = 9; (e) pH = 11; và (f) Biến đổi tín hiệu A/A0 (%)và
biến đổi tín hiệu max của cảm biến khi có mặt 100 µM H2O2 tại các pH
khác nhau. ....................................................................................................... 46
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả hiệu quả làm việc của cảm biến
phát hiện H2O2. Nồng độ H2O2 sử dụng là 20, 40, 60, 80 và 100 µM. pH =7.
......................................................................................................................... 47
Hình 3.10.Cơ chế phản ứng của cảm biến phát hiện H2O2 ............................ 48


Hình 3.11. Ảnh TEM của dung dịch AgNPs/GQDs (a,b) khi không có mặt
H2O2 và (c,d) khi có mặt H2O2 với nồng độ 0,8 mM. ...................................... 49

Hình 3.12. (A) Phổ UV-Vis của cảm biến H2O2 với các nồng đô H2O2 khác
nhau từ 0, 0.5; 1; 5; 10; 20; 30; 40; 50 và 100 μM H2O2;(B) Đường chuẩn
của cảm biến để xác định nồng độ H2O2 (hình chèn: màu sắc của các cảm
biến tương ứng với các nồng độ H2O2) ........................................................... 50
Hình 3.13. (A) Phổ UV-Vis của cảm biến H2O2 với các nồng đô H2O2 khác
nhau từ 0, 0.5; 1; 5; 10; 20; 30; 40; 50 và 100 μM H2O2;(B) Đường chuẩn
của cảm biến để xác định nồng độ H2O2 (hình chèn: màu sắc của các cảm
biến tương ứng với các nồng độ H2O2) ........................................................... 51
Hình 3.14. Phổ UV-Vis của dung dịch cảm biến khi có mặt: (1) mẫu trắng;
(2) có 0,5 mM glucose; (3) 1 mM glucose; (4) 0,5 mM axit ascorbic; (5) 1mM
axit ascorbic; (6) 1 mM galactose; (7) 0,02 mM H2O2................................... 52
Hình 3.15. Thành phần của bộ kit xét nghiệm H2O2 ....................................... 53
Hình 3.16. Bảng màu chuẩn để đọc kết quả nồng độ H2O2 trong mẫu .......... 53
Hình 3.17. Cơ chế hoạt động của cảm biến Cholesterol trên cơ sở
AgNPs/CQDs ................................................................................................... 54
Hình 3.18. Độ chọn lọc của cảm biến cholesterol: A) Phổ UV-Vis của cảm
biến với sự có mặt của các sacarit khác nhau ở nồng độ 4 mM và (B) Độ thay
đổi tín hiệu cường độ pic A/A0 of ứng với các sacarit ở hình A. Hình chèn:
màu sắc của các dung dịch cảm biến tương ứng. ........................................... 55
Hình 3.19.(A) Phổ UV-vis của cảm biến với nồng độ cholesterol khác nhau
(hình chèn: màu sắc của các dung dịch cảm biến tương tứng); (B) Đường
chuẩn xác định nồng độ cholesterol của cảm biến. ........................................ 56
Hình 3.20. Ảnh TEM mẫu AgNPs/GQDs sau khi phản ứng với hỗn hợp ChOx
và 1 mM cholesterol ở thang đo (a) 100nm và (b) thang đo 20 nm. .............. 58


1

MỤC LỤC
Trang

MỤC LỤC ......................................................................................................... 1
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................. 6
1.1. CẢM BIẾN SINH HỌC, CẤU TRÚC, CÁC TÍNH CHẤT ĐẶC
TRƢNG VÀ PHÂN LOẠI. ........................................................................... 6
1.1.1.Định nghĩa cảm biến sinh học. .......................................................... 6
1.1.2. Cấu trúc và thành phần của cảm biến sinh học................................. 7
1.1.2.1. Đầu thu sinh học (capture probe) ............................................... 7
1.1.2.2. Bộ phận chuyển đổi .................................................................... 9
1.1.3. Cảm biến so màu............................................................................... 9
1.1.4. Các đặc trƣng của cảm biến sinh học ............................................. 11
1.1.4.1. Độ nhạy..................................................................................... 11
1.1.4.2. Độ chọn lọc (độ đặc hiệu) ........................................................ 12
1.1.4.3. Giới hạn phát hiện (LOD) ........................................................ 12
1.2. ENZYME VÀ CẢM BIẾN ENZYME CHOLESTEROL ................... 13
1.2.1. Enzyme ........................................................................................... 13
1.2.2. Cấu trúc phân tử và đặc tính xúc tác ƣu việt của enzyme .............. 13
1.2.5. Enzyme Cholesterol oxidase........................................................... 13
1.3. CHOLESTEROL VÀ BỆNH RỐI LOẠN MỠ MÁU. ........................ 15
1.3.1. Cholesterol và bệnh rối loạn mỡ máu ............................................ 15
1.3.2. Các phƣơng pháp xét nghiệm nồng độ cholesterol ........................ 16
1.3.2.1. Phƣơng pháp so màu trên cơ sở sử dụng enzyme đặc chủng nhƣ
cholesterol oxidase (ChOx) ................................................................... 16


2

1.3.2.2. Xét nghiệm bằng máy đo sử dụng cảm biến sinh học điện hóa
sử dụng các enzym đặc chủng ............................................................... 17
1.3.3. Các xu hƣớng phát triển cảm biến cholesterol ............................... 18

1.3.3.1. Tổng hợp và ứng dụng các vật liệu thay thế enzyme cholesterol
oxidase (ChOx) trong chế tạo cảm biến. ............................................... 18
1.3.3.2. Tổng hợp và sử dụng các vật liệu có hoạt tính xúc tác thay thế
enzyme peroxidase (POD). .................................................................... 18
1.4. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU TRONG LUẬN VĂN ............................. 21
1.4.1. Vật liệu chấm graphen lƣợng tử (Graphene quantum dots-GQDs) 21
1.4.2. Vật liệu nano bạc (silver nanoparticles- AgNPs) ........................... 23
1.5. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI. ................................................................... 24
CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM ...................................................................... 26
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ.......................... 26
2.1.1. Hóa chất, vật liệu ............................................................................ 26
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị .......................................................................... 26
2.2. CHẾ TẠO VẬT LIỆU CQDs VÀ AgNPs/GQDs ................................ 27
2.2.1. Chế tạo cacbon dots bằng phƣơng pháp từ dƣới lên (bottom-up) . 27
2.2.2. Chế tạo vật liệu nano Ag/Cacbon dots (AgNPs/GQDs) ................. 27
2.3. CHẾ TẠO CẢM BIẾN H2O2 VÀ CHOLESTEROL ........................... 27
2.3.1. Chế tạo cảm biến phát hydrogen peroxide ..................................... 27
2.3.2. Chế tạo cảm biến cholesterol .......................................................... 28
2.4. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VẬT LIỆU VÀ CẢM BIẾN .... 29
2.4.1. Phƣơng pháp nhiễu xạ tia X (X-ray diffraction-XRD ).................. 29
2.4.2. Phƣơng pháp kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) .................... 31
2.4.3. Phƣơng pháp phổ hồng ngoại (FT-IR) ........................................... 32
2.4.4. Phổ hấp thụ electron (UV-Vis) ....................................................... 33


3

2.4.5. Phổ tán sắc năng lƣợng tia X (EDX) .............................................. 35
2.5. CÁC PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ........................................... 36
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 37

3.1. ĐẶC TRƢNG CỦA VẬT LIỆU .......................................................... 37
3.1.1. Đặc trƣng chấm graphen lƣợng tử (Graphene quantum dots- GQDs)
................................................................................................................... 37
3.1.2. Đặc trƣng vật liệu AgNPs/GQDs .................................................. 38
3.2. CHẾ TẠO CẢM BIẾN HYDROGEN PEROXIDE TRÊN CƠ SỞ VẬT
LIỆU AgNPs/GQDs..................................................................................... 43
3.2.1. Khảo sát thời gian phản ứng và tìm hiểu cơ chế phản ứng ............ 43
3.2.2. Đƣờng chuẩn xác định nồng độ hydrogen peroxide (H2O2)........... 50
3.2.3. Bộ kit xét nghiệm xác nồng độ hydrogen peroxide (H2O2)............ 52
3.3. CHẾ TẠO CẢM BIẾN CHOLESTEROL TRÊN CƠ SỞ VẬT LIỆU
AgNPs/GQDs ............................................................................................... 53
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN .............................................................................. 59
HƢỚNG NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN .............................................. 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 61
PHỤ LỤC – BÀI BÁO KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ


4

MỞ ĐẦU
Hiện nay việc phát hiện nhanh các thông số an toàn thực phẩm; chỉ số
môi trƣờng; các chỉ dấu sức khỏe bằng các bộ kit, que thử theo phƣơng pháp
so màu, bằng cách thay đổi màu của chỉ thị để biết các thông tin về môi
trƣờng, phát hiện các độc tố, các chất độc hại….đang đƣợc ứng dụng rộng rãi
trong nhiều lĩnh vực khác nhau nhƣ: hóa học, thực phẩm, môi trƣờng, dƣợc
phẩm, sinh học…Thực tế cho thấy thấy tính tiện dụng và các ứng dụng rộng
rãi trong đời sống của cảm biến so màu. Đơn giản và phổ biến nhất, dễ sử
dụng nhất là giấy pH dùng để xác định độ axit- bazơ của dung dịch; cao cấp
hơn một chút là que thử 10 chỉ tiêu trong nƣớc tiểu (để kiểm tra pH, tỷ trọng,
glucose, protein, nitrit…trong nƣớc tiểu). Cảm biến so màu còn ứng dụng

trong kiểm tra an toàn thực phẩm nhƣ que thử hàn the trong thực phẩm nhƣ
giò, bún, phở; hay bộ kit xét nghiệm sự có mặt của methanol trong rƣợu. Cao
cấp nhất là các cảm biến so màu ứng dụng trong y tế nhƣ: que thử thai, kit
kiểm tra sự có mặt của độc tố Alfatoxin trong thực phẩm; hay bộ kit thử kiểm
tra HIV…Với việc chỉ quan sát màu sắc bằng mắt thƣờng mà không cần máy
đo và cho kết quả nhanh nên cảm biến so màu đã và đang có vai trò rất quan
trọng và phổ biến trong thời đại mới vì tính tiện dụng, nhanh chóng và sử
dụng đơn giản. Vì vậy, nhu cầu về các cảm biến đặc biệt là cảm biến so màu
rất đa dạng để áp dụng trong thực phẩm, môi trƣờng, dƣợc phẩm, xét nghiệm
bệnh tật. Tuy nhiên cảm biến so màu hóa học có tính chọn lọc không cao vì
vậy để phát triển cảm biến có độ chọn lọc cao cần có các đầu thu sinh học, khi
đó ta có cảm biến so màu sinh học.
Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ và vật liệu nano đã cho ra đời
các kết cấu vật liệu mới, với tính chất lý hóa, sinh học rất mới và có tiềm năng
ứng dụng rất lớn. Các ứng dụng vật liệu nano bạc (nano Ag) có những tính
chất hóa lý rất đáng quan tâm nhƣ: thay thế đƣợc enzym horseradish
peroxidase (enzym HRP) cho phản ứng phân hủy H2O2; có pic hấp thụ đặc
trƣng tại 420 nm đặc trƣng của nano Ag; có tính dẫn điện tốt và có hoạt tính
điện hóa…Do đó việc phát triển các ứng dụng sâu hơn của chúng sẽ mở ra
nhiều ứng dụng mới nhƣ thay thế các enzym nhƣ HRP; loại enzym có giá


5

thành cao nhƣng có thời gian sống ngắn, điều kiện hoạt động nghiêm ngặt về
nhiệt độ, pH, ánh sáng…) để sử dụng trong các bộ cảm biến sinh học nhằm
chế tạo ra các cảm biến sinh học phát hiện các chỉ dấu sinh học (nhƣ
hydrogen peroxide, cholesterol, glucozơ…) một cách nhanh, nhạy và rất chọn
lọc với chi phí thấp và thời gian bảo quản dài hơn
Các hạt nano kim loại quý, đặc biệt là hạt nano bạc(AgNP), đã thu hút

đƣợc sự chú ý đáng kể do đặc tính quang học độc đáo và đặc trƣng của phổ
plasmon bề mặt. Phổ này sẽ bị thay đổi khi có các tác nhân tấn công sự tồn
tại hoặc làm biến dạng hình học các hạt AgNPs và bằng mắt thƣờng cũng có
thể quan sát đƣợc sự biến đổi này.Vì vậy thời gian gần đây có nhiều nghiên
cứu ứng dụng các tính chất này để chế tạo cảm biến hóa học, sinh học. Tuy
nhiên để đáp ứng cho các ứng dụng này thì AgNPs yêu cầu có độ sạch cao
trong mẫu không có dƣ lƣợng sản phẩm phụ hoặc các sản phẩm phụ không
ảnh hƣởng/ tƣơng tác với các chất trong hệ ứng dụng của AgNPs. Do đó các
phƣơng pháp truyền thống tổng hợp AgNPs tỏ ra bị hạn chế khi sản xuất
nano bạc cho các ứng dụng này. Để khắc phục hạn chế đó, tôi chọn đề tài:
“Tổng hợp vật liệu nano bạc/chấm lượng tử graphen (AgNPs/GQDs) và
ứng dụng”. Trong công trình này, chúng tôi trình bày phƣơng pháp “xanh”
để tổng hợp các hạt nano bạc (silver nanoparticles- AgNPs), trong đó điểm
mới là sử dụng các hạt nano cacbon (hay chấm lƣợng tử graphen -GQDs) làm
chất khử và đồng thời làm chất ổn định. Tiếp đó chúng tôi dùng AgNPs tổng
hợp đƣợc để làm đầu dò đa chức năng để chế tạo cảm biến hydrogen peroxit
(H2O2), tiếp đó, chúng tôi kết hợp cảm biến H2O2 và enzyme cholesterol
oxidase (ChOx) để chế tạo cảm biến cholesterol theo phƣơng pháp so màu.
Đây đều là các nội dung nghiên cứu mới và có ý nghĩa thực tiễn.


6

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. CẢM BIẾN SINH HỌC, CẤU TRÚC, CÁC TÍNH CHẤT ĐẶC TRƢNG
VÀ PHÂN LOẠI.
1.1.1.Định nghĩa cảm biến sinh học.
Hiệp hội quốc tế về hóa học ứng dụng – IUPAC (International Union of
Pure and Applied Chemistry) năm 1992[1] đã định nghĩa: “Cảm biến sinh học
(biosensor) là một thiết bị tích hợp có khả năng cung cấp thông tin phân tích

định lượng hoặc bán định lượng đặc trưng, bao gồm một phần tử nhận biết
sinh học (bioreceptor) kết hợp trực tiếp với một phần tử chuyển đổi tín hiệu
(transducer)”. Chất đƣợc gắn trên bộ phận chuyển đổi đƣợc gọi là “phần tử
dò/phần tử nhận biết sinh học”, chất cần phân tích trong mẫu đƣợc gọi là
“phần tử đích”. Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học là dựa trên các
phản ứng đặc hiệu: kháng nguyên/kháng thể (cảm biến miễn dịch), lai hóa
DNA-DNA(cảm biến DNA) hoặc enzym/cơ chất (cảm biến enzym)… Trên
cơ sở các phản ứng đặc hiệu này, phần tử nhận biết sinh học giữ vai trò dò tìm
đối tƣợng đích trong mẫu phân tích và phần tử chuyển đổi giữ vai trò chuyển
đổi tƣơng tác sinh học thành tín hiệu điện hóa, quang, nhiệt… sau đó đƣa qua
bộ phận xử lý tín hiệu và hiển thị kết quả đo (hình 1.1).

Hình 1.1. Nguyên lý cấu tạo của cảm biến sinh học[2]
Có nhiều dạng chuyển đổi tín hiệu nhƣ chuyển đổi điện hóa, chuyển đổi
quang, chuyển đổi nhiệt, chuyển đổi bằng tinh thể áp điện hoặc chuyển đổi
bằng các hệ vi cơ… Trong đó, cảm biến sinh học trên cơ sở chuyển đổi theo


7

nguyên lý điện hóa có nhiều khả năng ứng dụng trong phân tích các đối tƣợng
y sinh vì độ nhạy tốt và có thể vi cấu trúc hóa để chuyển đổi thành các thiết bị
cầm tay. Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học điện hóa là chuyển các
tín hiệu của phản ứng sinh hóa giữa phần tử nhận biết sinh học và phần tử
đích trong dung dịch điện ly thành các tín hiệu đƣợc nhận biết bởi kỹ thuật
điện hóa. Các kỹ thuật điện hóa có thể đƣợc sử dụng để đánh giá một cách
định lƣợng (theo nồng độ) hoặc định tính (âm tính/dƣơng tính) sự có mặt của
các thành phần sinh học (DNA hoặc kháng nguyên/kháng thể…) trong dung
dịch. Có nhiều phƣơng pháp để đo tín hiệu điện hóa khi có sự tƣơng tác giữa
đầu thu sinh học và chất cần phân tích nhƣ đo dòng, đo thế, đo độ dẫn và đo

phổ tổng trở…[54]. Tuy nhiên, bên cạnh đó cảm biến sinh học điện hóa cũng
có nhiều nhƣợc điểm nhƣ (i) cần thiết bị nghiên cứu đắt tiền (máy đo), và (ii)
các điện cực để nghiên cứu cũng có chi phí cao, gia công phức tạp.
1.1.2. Cấu trúc và thành phần của cảm biến sinh học
1.1.2.1. Đầu thu sinh học (capture probe)
Cảm biến sinh học là khái niệm chỉ cảm biến mà có đầu thu là các phần
tử sinh học (bio-receptors) nhƣ là enzyme, kháng thể (antibody), các chuỗi
DNA hoặc RNA hoặc các chuỗi peptit hoặc protein dùng để phát hiện các
chất cần phân tích. Quan hệ giữa đầu dò (probe) và đối tƣợng cần phát hiện
(còn gọi là đích- target) chủ yếu gồm các nhóm chính nhƣ sau (hình 1.2):
(i) Với đầu dò là enzyme ta có cảm biến enzyme dùng để phát hiện các phân
tử đích (target) đặc trƣng của chúng (hay còn gọi là cơ chất của enzyme). Một
số cảm biến enzyme đã đƣợc phát triển và ứng dụng[3-9]. Ví dụ với đầu dò
enzyme glucose oxidase (GOx) dùng để phát hiện glucose ; enzyme
cholesterol oxidase (ChOx) dùng để phát hiện cholesterol….Do cảm biến
enzym rất nhạy, phản ứng nhanh và chọn lọc nên cảm biến enzyme còn đƣợc
dùng trong việc khuếch đại tín hiệu để nâng cao giới hạn phát hiện cho các
loại cảm biến khác; chẳng hạn phép phân tích sàng lọc ELISA dùng trong
bệnh viện để xét nghiệm ung thƣ, bệnh tật hoặc các ca nhiễm độc bởi các chất
độc hại nhƣ clozapine[10], phenolthiazines[11], rifampicin[12], thuốc trừ sâu,
diệt cỏ[13]. Với ứng dụng này thì enzym thƣờng đƣợc dùng là loại enzym


8

oxidase (chủ yếu là enzym horseradish peroxidase-HRP).
(ii) Với đầu dò là kháng thể (antibody) thì sẽ dùng để phát hiện kháng nguyên
(antigen) tạo ra cảm biến miễn dịch (immunosensor). Một kháng thể
(antibody) sẽ liên kết một cách đặc hiệu với một đối tƣợng kháng nguyên
(antigen) [14-19], tạo ra độ chọn lọc cao (tính đặc hiệu tốt) cho phép phân

tích. Cảm biến kiểu này dùng rất phổ biến với nhiều bộ kit đƣợc phát triển để
phân tích các mẫu thực phẩm, nƣớc uống, bệnh phẩm…với tên gọi chung là
bộ kit ELISA. Ví dụ bộ kit xét nghiệm là các chất độc hại nhƣ 2,4-D (chất độc
màu da cam); các phụ gia trong sản xuất giấy gói có ảnh hƣởng đến sức khỏe
nhƣ bisphenol A; các loại thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu nhƣ atrazine hoặc các
loại protein bệnh nhƣ virus cúm, bệnh ung thƣ…

(a) Enzyme

(b) Khángthể (Antibody)

(c) DNA

Hình 1. 2. Các kiểu đầu thu sinh học phổ biến trong cảm biến sinh học.
(iii) Nếu đầu dò là các đoạn DNA hay RNA hoặc axit nucleic peptide sẽ ứng
dụng trong chế tạo các bộ cảm biến DNA hay RNA nhằm phát hiện ra các
đoạn DNA hoặc RNA dùng trong các nghiên cứu sinh học xét nghiệm huyết
thống bệnh tật, trong chuyển đổi gen. Nguyên tắc hoạt động là các chuỗi này
có quan hệ bổ sung (ghép cặp) rất nhạy và rất chọn lọc nên cảm biến loại này
có độ nhạy cao và tính chọn lọc [16, 20-33]. Ngày nay, chủ yếu là
oligodeoxyribonucleotides tổng hợp (ODNs) đƣợc sử dụng làm đầu dò trong
cảm biến DNA. Các phần ghép thêm vào nhƣ đuôi thiol (-SH), amin (-NH2)
hoặc biotin đƣợc kết hợp để cố định ODN trên bề mặt của cảm biến.


9

1.1.2.2. Bộ phận chuyển đổi

Hình 1.3. Phân loại cảm biến trên cơ sở bộ phận chuyển đổi (transducer)[34]

Bộ phận chuyển đổi trong các cảm biến sinh học là bộ phận chuyển đổi tín
hiệu của việc bắt cặp nhau giữa đầu dò và đích thành các tín hiệu có thể đo
đƣợc [1, 35, 36]. Tùy vào tín hiệu đầu ra (out put signal) mà chúng ta có thể
gọi tên là cảm biến điện hóa hay cảm biến quang…Nhƣ tóm tắt ở hình 1.3,
cảm biến sinh học có thể xây dựng trên một trong 5 loại bộ phận chuyển đổi
tín sau đây: điện hóa (electrochemical), điện (electrical), quang (optical),
cơ/áp điện (piezoelectric) hoặc nhiệt (thermal). Mặc dù có rất nhiều loại bộ
phận chuyển đổi nhƣ trên, nhƣng trong thực tế bộ phận chuyển đôi điện hóa
và quang là đƣợc dùng phổ biến nhất trong cảm biến sinh học.
Trong luận văn này chúng tôi sử dụng bộ phận chuyển đổi quang học hay
còn gọi là cảm biến quang với sự đổi màu của chất chỉ thị nên còn có thể gọi
là cảm biến so màu. So với cảm biến điện hóa thì cảm biến so màu có một số
lợi thế nhƣ có thể quan sát bằng mắt thƣờng nhờ sự chuyển màu của các chất
chỉ thị, dụng cụ tiến hành đơn giản, gia công dễ dàng…Do đó cảm biến sinh
học so màu đang đƣợc dùng nhiều trong thực tế và đã khẳng định đƣợc sự tin
cậy nhƣ phép xét nghiệm ELISA trong xét nghiệm bệnh ung thƣ, cảm cúm,
các bệnh do virus, ở bệnh viện.
1.1.3. Cảm biến so màu
Từ khi ngành hóa học phát triển đã sử dụng các chất chỉ thị, chất chỉ thị
màu để phát hiện môi trƣờng các chất một cách nhanh chóng và đến nay các
chất chỉ thị vẫn đƣợc sử dụng rộng dãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Để


10

nâng cao độ tiện dụng cũng nhƣ để ứng dụng rộng rãi trong đời sống ngƣời ta
đã chế tạo ra các bộ kit so màu để xác định nồng độ một số chất thậm chí để
xác định tình trạng bệnh tật. Chẳng hạn, bộ so màu đơn giản và hay dùng nhất
là giấy pH (hình 1.4a), sau đó là các que thử nhƣ thử 10 chỉ tiêu trong nƣớc
tiểu (gồm pH, tỷ trọng) (hình 1.4b và hình I.4c), giấy thử hàn the trong thực

phẩm nhƣ chả, bún, phở (hình 1.4d); bộ kit xét nghiệm sự có mặt của
methanol trong rƣợu (hình 1.4e) và cao cấp là que thử thai (hình 1.4f).
(a)

(d)

(b)

(c
)

(e)

(f)

Hình 1.4. Cảm biến so màu phổ dụng: (a) giấy đo độ pH; (b) Hộp que thử 10
thông số của nước tiểu và (c) các màu sắc ứng với nồng độ trong 10 thông số
của que thử nước tiểu; (d) giấy thử hàn the trong thực phẩm; (e) bộ kit xác
định hàm lượng methanol trong rượu và (f) que thử thai.
Nguyên tắc hoạt động của cảm biến so màu ở dạng giấy chỉ thị khá đơn
giản, đó là trên cơ sở giấy có độ tro thấp, ngƣời ta sẽ tẩm các hóa chất đóng
vai trò là chất chỉ thị lên. Khi thử, gặp các tác nhân cần kiểm tra ở trong mẫu
thì chỉ thị sẽ biến đổi màu, tùy thuộc vào màu sắc và cƣờng độ để xác định sự
có mặt của tác nhân cần kiểm tra cao hay thấp. Đại đa số cảm biến so màu là
cảm biến hóa học, chỉ một số ít là cảm biến sinh học, nhƣ que thử thai là cảm
biến sinh học dựa theo phản ứng kháng nguyên - kháng thể để xét nghiệm
hormone HCG (Human Chorionic Gonadotrophin). Theo đó, ở vùng phản
ứng, các sợi thấm đã đƣợc ngâm tẩm với một loại protein kháng thể đặc biệt

11

có hình chữ Y (Ab1) đƣợc đánh dấu bằng các hạt vàng hoặc hạt huỳnh
quang,...Các kháng thể này sẽ bắt cặp với HCG (ở đây đƣợc xem là các kháng
nguyên) có trong mẫu nƣớc tiểu. Hiện nay ngày càng có nhiều cảm biến sinh
học dựa trên phƣơng pháp so màu đang đƣợc phát triển vì tính tiện lợi và đơn
giản của quy trình xét nghiệm. Cảm biến so màu không chỉ đƣợc phát triển để
xét nghiệm các hóa chất hay các phần tử sinh học, loại cảm biến này đang
đƣợc phát triển cho xét nghiệm quản lý môi trƣờng, kiểm tra chất lƣợng nƣớc.
1.1.4. Các đặc trƣng của cảm biến sinh học
Một cảm biến sinh học dù theo phƣơng pháp đo nào cũng cần có các
chỉ số để đánh giá chất lƣợng của chúng, bao gồm các đặc tính sau:
1.1.4.1. Độ nhạy
Đối với cảm biến tuyến tính, giữa biến thiên đầu ra Δs và biến thiên
đầu vào Δm có sự liên hệ tuyến tính:
Δs = S.Δm

(I.1)

Trong đó: Đại lƣợng S xác định bởi biểu thức, đƣợc gọi là độ nhạy của
cảm biến.Trƣờng hợp tổng quát, biểu thức xác định độ nhạy S của cảm biến
xung quanh giá trị của đại lƣợng đo xác định bởi tỷ số giữa biến thiên Δs của
đại lƣợng đầu ra và biến thiên Δm tƣơng ứng của đại lƣợng đo ở đầu vào
quanh giá trị đó. Để phép đo đạt độ chính xác cao, khi thiết kế và sử dụng
cảm biến cần làm sao cho độ nhạy S của nó không đổi, nghĩa là ít phụ thuộc
nhất vào các yếu tố sau:
- Giá trị của đại lƣợng cần đo m và tần số thay đổi của nó,
- Thời gian sử dụng,
- Ảnh hƣởng của các đại lƣợng vật lý khác (không phải là đại lƣợng đo)
của môi trƣờng xung quanh. Thông thƣờng nhà sản xuất cung cấp giá trị của

độ nhạy S tƣơng ứng với những điều kiện làm việc nhất định của cảm biến.


12

1.1.4.2. Độ chọn lọc (độ đặc hiệu)
Độ đặc hiệu của một xét nghiệm là tỷ lệ những trƣờng hợp thực sự
không có bệnh và có kết quả xét nghiệm âm tính trong toàn bộ các trƣờng hợp
không bị bệnh. Độ đặc hiệu đƣợc tính theo công thức sau:
Độ đặc hiệu = Số trƣờng hợp âm tính thật/ (số trƣờng hợp âm tính
thật + số trƣờng hợp dƣơng tính giả)
(I.2)
Đối với một xét nghiệm để xác định xem ai mắc bệnh nào đó, độ đặc
hiệu 100% có nghĩa là toàn bộ những ngƣời khỏe mạnh (không mắc bệnh)
đƣợc xác định là khỏe mạnh. Một mình độ đặc hiệu không cho chúng ta biết
toàn bộ về xét nghiệm bởi vì 100% độ đặc hiệu có thể có đƣợc một cách
thông thƣờng bằng việc gán cho toàn bộ các trƣờng hợp kết quả xét nghiệm
âm tính. Chính vì vậy, chúng ta cần phải biết thêm về độ nhạy của xét
nghiệm.
1.1.4.3. Giới hạn phát hiện (LOD)
Giới hạn phát hiện (hay còn gọi là limit of detection – LOD) là giới hạn
dƣới về nồng độ mà cảm biến có thể nhận biết đƣợc sự có mặt của chất cần
phân tích với mẫu trắng (mẫu không có mặt chất cần phân tích hoặc chất cạnh
tranh). Thông thƣờng LOD đƣợc tính theo công thức[34]:
ALOD = ̅

+ 3.ϭblank

(I.3)

Trong đó :ALOD – tín hiệu mẫu ứng với nồng độ thấp nhất mà cảm biến
có thể phát hiện (LOD);
̅

: tín hiệu trung bình của mấu trắng; và:

ϭBlank : sai số tuyệt đối của mẫu trắng. Sai số này đƣợc tính theo công
thức:
√

∑

̅

(I.4)

Với : N- số thí nghiệm với mẫu trắng, để có ý nghĩa thống kê tốt thì N
phải lớn (thƣờng N>5) ;

– là tín hiệu mẫu trắng thứ i. Với giá trị


13

ALOD tính toán đƣợc, nội suy hoặc ngoại suy từ đƣờng chuẩn ta tính toán đƣợc
giá trị LOD.
Ngoài ra cảm biến sinh học cần có thêm các tính chất khác nhƣ: Độ
bền, độc lập, tính lặp lại, dễ sử dụng và vận chuyển…
1.2. ENZYME VÀ CẢM BIẾN ENZYME CHOLESTEROL
1.2.1. Enzyme

Enzyme (hay còn gọi là men) là chất xúc tác sinh học có thành phần cơ
bản là protein. Trong cuộc sống sinh vật xảy ra rất nhiều phản ứng hóa học,
với một hiệu suất rất cao, mặc dù ở điều kiện bình thƣờng về nhiệt độ, áp suất,
pH. Sở dĩ nhƣ vậy vì nó có sự hiện diện của chất xúc tác sinh học đƣợc gọi
chung là enzyme; nhƣ vậy, enzyme là các protein xúc tác các phản ứng hóa
học. Trong các phản ứng này, các phân tử lúc bắt đầu của quá trình đƣợc gọi là
cơ chất, enzyme sẽ biến đổi chúng thành các phân tử khác nhau. Enzyme có
tính chọn lọc rất cao đối với cơ chất của nó. Hầu hết phản ứng đƣợc xúc tác
bởi enzyme đều có tốc độ cao hơn nhiều so với khi không đƣợc xúc tác. Có
trên 4 000 phản ứng sinh hóa đƣợc xúc tác bởi enzyme. Tuy vậy, hoạt tính của
enzyme chịu tác động bởi nhiều yếu tố (nhiệt độ, áp suất, pH, môi trƣờng, chất
ức chế, ngộ độc…).
1.2.2. Cấu trúc phân tử và đặc tính xúc tác ƣu việt của enzyme
Bản chất enzyme là những protein đặc hiệu có cấu tạo phân tử rất phức
tạp, do vậy nó có tất cả các thuộc tính hóa học của protein. Enzyme có khả
năng và hiệu lực xúc tác rất lớn, có tính đặc hiệu rất cao. Để đảm bảo cho
chức năng của enzyme là chất xúc tác sinh học, cấu trúc của enzyme phải rất
tinh vi và phức tạp. Enzyme là những loại phân tử lớn, phần nhiều những
enzyme đã đƣợc nghiên cứu có trọng lƣợng phân tử từ 10.000 đến 1.000.000
dalton.
1.2.5. Enzyme Cholesterol oxidase
Cholesterol oxidase còn có các tên gọi khác nhƣ Cholesterol-O2
oxidoreductase; beta- hydroxy steroid oxidoreductase; beta- hydroxysteroid:
oxygen oxidoreductase. Cholesterol oxidase (hình 1.10a) thuộc nhóm 1


14

(Oxydoreductase) (EC 1.1.3.6) có tác dụng xúc tác cho phản ứng oxy hóakhử. Cholesterol oxidase thƣờng đƣợc thu từ Streptomyces, Pseudomonas,
Brevibacterium… Enzyme này có tính đặc hiệu cao đối với cholesterol trong

khoảng pH thích hợp từ 4,0 đến 7,0 (tính đặc hiệu cao nhất tại pH=7,0). Đặc
tính của enzyme ChOx là chất đặc hiệu để phát hiện và định lƣợng
cholesterol.Phản ứng với xúc tác ChOx. Phản ứng oxy hóa cholesterol (hình
1.10b) dƣới tác dụng của ChOx tạo ra H2O2 và cholest-4-en-3-one (hình
1.10c):
→

(1.4)

Hình 1.5. (a) Cấu trúc của enyzme Cholesterol Oxidase; (b) Sơ đồ cấu trúc
của cholesterol và (c) cấu trúc của cholest-4-en-3-one
Ngày nay, enzyme ChOx đƣợc sử dụng rộng rãi trong chế tạo các bộ kit
xét nghiệm cholesterol theo kiểu cấu trúc điện hóa phục vụ nhu cầu tự kiểm
tra theo dõi nồng độ cholesterol trong máu; còn trong xét nghiệm ở các bệnh
viện chủ yếu cảm biến cholesterol hoạt động theo cơ chế cảm biến so màu.


15

1.3. CHOLESTEROL VÀ BỆNH RỐI LOẠN MỠ MÁU.
1.3.1. Cholesterol và bệnh rối loạn mỡ máu

Hình 1.66. Mô hình mô tả tác hịa làm tắc mạch máu, xơ vữa động mạch của
cholesterol.
Cholesterol có danh pháp theo IUPAC là (3β)-cholest-5-en-3-ol, có
công thức phân tử là C27H46O (Mw = 386,654 g/mol) công thức cấu tạo mô tả
ở hình 1.10b. Cholesterol là một chất béo steroid, mềm, có màu vàng nhạt, có
ở màng tế bào của tất cả các mô trong cơ thể, và đƣợc vận chuyển trong huyết
tƣơng của mọi động vật. Cholesterol có mặt trong cơ thể do 2 cách là nội sinh
(do cơ thể tự sản xuất) và ngoại sinh (do ăn uống các chất mỡ động vật).

Lƣợng cholesterol nội sinh đƣợc sản xuất hàng ngày trong gan mỗi ngày từ
1,5g – 2g. Cholesterol đóng vai trò trung tâm trong nhiều quá trình sinh hoá,
nhƣng lại đƣợc biết đến nhiều nhất do liên hệ đến bệnh tim mạch gây ra bởi
nồng độ cholesterol trong máu tăng. Khi cholesterol trong máu quá dƣ thừa
thì chúng sẽ đóng thành mảng mỡ trong mạch máu và các mảng này gây trở
ngại cho dòng máu chảy trong các động mạch (hình 1.11). Khi đó, máu mang
oxy sẽ không chảy đủ tới tim và nhƣ vậy nguy cơ bị lên cơn đau tim sẽ tăng;
nếu máu chạy lên não mà thiếu thì sẽ gây ra đột quỵ (stroke). Chứng bệnh dƣ
cholesterol huyết (hypercholesterolemia) không có triệu chứng gì đặc biệt, chỉ
có thử máu mới phát hiện đƣợc vì vậy xét nghiệm cholesterol trong máu là chỉ
số quan trọng trong kiểm tra sức khỏe. Việc xét nghiệm, kiểm tra thƣờng
xuyên nồng độ cholesterol trong cơ thể sẽ góp phần kiểm soát, phát hiện sớm
bệnh rối loạn mỡ máu để kịp thời điều trị, qua đó sẽ góp phần giảm chi phí


16

điều trị. Hiện nay, việc xét nghiệm cholesterol chủ yếu là tiến hành trên mẫu
máu và thực hiện ở bệnh viện, thƣờng là lấy máu để xét nghiệm khi đói, nếu
giá trị vƣợt ngƣỡng thì mới thực hiện các xét nghiệm khác để sàng lọc, theo
dõi. Cảm biến xét nghiệm cholesterol hiện đang áp dụng trong các cơ sở y tế
chủ yếu là theo phƣơng pháp so màu. Theo quy định, nồng độ cholesterol
toàn phần đối với ngƣời bình thƣờng tùy thuộc vào độ tuổi, chẳng hạn trẻ
dƣới 10 tuổi là 100-180 mg/dL máu hay 2,6-4,7 mM; từ 10 -20 tuổi thì giá trị
này là 120 -180 mg/dL (3,1 – 4,7 mmol/L); lứa tuổi trên 20 tuổi thì giá trị
bình thƣờng là 120 – 200 mg/dL (3,1 – 5,2 mmol/L).
1.3.2. Các phƣơng pháp xét nghiệm nồng độ cholesterol
Hiện nay có 2 cách chính để xác định nồng độ cholesterol trong máu đó
là xét nghiệm ở bệnh viện hoặc tự đo ở nhà. Cả hai cách này đều có điểm
chung là sử dụng hệ 2 enzym giống nhau là enzyme cholesterol oxidase

(ChOx) và enzyme peroxidase (POD); cơ chế hoạt động của chúng cũng
giống nhau, chỉ khác về nguyên lý đo và tính chất của bộ phận chuyển đổi tín
hiệu (transducder): với cảm biến so màu là tín hiệu quang, còn với cảm biến
điện hóa là tín hiệu điện.
1.3.2.1. Phương pháp so màu trên cơ sở sử dụng enzyme đặc chủng
như cholesterol oxidase (ChOx)
Đây là phƣơng pháp kinh điển và chuẩn mực để xét nghiệm cholesterol
trong các bệnh viện từ trƣớc đến hiện nay. Nguyên tắc của phƣơng pháp, lấy
xét nghiệm cholesterol làm ví dụ, là sử dụng enzyme cholesterol oxidase
(thƣờng đƣợc ký hiệu là ChOx) để oxy hoá cholesterol trong mẫu thành
cholest-4-en-3-onevà giải phóng peroxide hydrogen (H2O2). Sau đó hydrogen
peroxid đƣợc tạo thành bị enzyme peroxidase (hiệu là POD) (thông thƣờng
enzyme POD hay đƣợc sử dụng nhất là horseradish peroxidase -HRP) phân
huỷ H2O2 và giải phóng oxy. Oxy giải phóng oxy hoá chất chỉ thị, phổ biến là
hệ 4 – aminophenzon (4-AAP)/phenol hay hệ 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine
(TMB) để tạo ra sản phẩm có màu đặc trƣng (cơ chế đƣợc minh họa trên hình
1.12), TBM tạo ra dạng TMB dạng oxi hóa có màu xanh lá cây. Cƣờng độ