Khảo sát đặc tính và điều kiện nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus casei

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHAN THỊ HƯỜNG

KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH VÀ ĐIỀU KIỆN
NUÔI CẤY VI KHUẨN
Lactobacillus casei

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHAN THỊ HƯỜNG
MÃ SINH VIÊN : 1401315

KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH VÀ ĐIỀU KIỆN
NUÔI CẤY VI KHUẨN
Lactobacillus casei
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
ThS. Kiều Thị Hồng
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công Nghiệp Dược

HÀ NỘI - 2019

LỜI CẢM ƠN
Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn đến cô
giáo ThS. Kiều Thị Hồng và PGS. TS Đàm Thanh Xuân, những người thầy đã
tận tình hướng dẫn và chỉ bảo em trong suốt thời gian làm khóa luận.
Đồng thời, em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật
viên trong bộ môn Công Nghiệp Dược đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong thời
gian nghiên cứu để hoàn thành khóa luận.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô
giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho
em trong suốt thời gian em học tập tại trường.
Cuối cùng, em xin dành lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè thân
thiết đã luôn luôn động viên, khích lệ em trong học tập, trong cuộc sống và hết
lòng giúp đỡ em thực hiện khóa luận.

Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019
Sinh viên
Phan Thị Hường


MỤC LỤC
Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………….............. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ………………………………………2
1.1. Đại cương về probiotic ……………………………………………………2
1.1.1. Định nghĩa probiotic ……………………………………………………2
1.1.2. Vai trò của probiotic ……………………………………………………2
1.2. Lactobacillus casei …………………………………………………………6
1.2.1. Giới thiệu về Lactobacillus casei ……………………………………6

1.2.2. Đặc điểm sinh lý của L. casei và nơi phân bố ………………………….6
1.2.3. Vai trò của L. casei đối với hệ tiêu hóa ………………………………...7
1.2.4. Phương pháp định lượng vi khuẩn ……………………………………..9
1.2.5. Ứng dụng của L. casei ………………………………………………10
1.2.6. Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn L. casei trong và ngoài nước……...12
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ………………………………………………………………...14
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ………………………………………………….14
2.1.1. Chủng vi khuẩn ………………………………………………………..14
2.1.2. Hóa chất ……………………………………………………………….14
2.1.3. Môi trường …………………………………………………………….14


2.1.4. Thiết bị, dụng cụ ………………………………………………………15
2.2. Nội dung nghiên cứu ……………………………………………………16
2.2.1. Lựa chọn điều kiện cấp khí và thời gian nuôi cấy vi khuẩn L. casei để thu
sinh khối tạo chế phẩm probiotic. ……………………………………….16
2.2.2. Khảo sát một số đặc tính probiotic của vi khuẩn L. casei …………….16
2.3. Phương pháp nghiên cứu ………………………………………………..16
2.3.1. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật ……………………………...16
2.3.2. Phương pháp nhân giống L. casei …………………………………….18
2.3.3. Phương pháp thử hoạt tính bacteriocin của vi khuẩn L. casei ………...18
2.3.4. Phương pháp định tính acid lactic và một số acid khác trong dịch nuôi
cấy vi khuẩn L. casei …………………………………………………….19
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN …………………21
3.1. Lựa chọn điều kiện cấp khí và thời gian nuôi cấy vi khuẩn L. casei để thu
sinh khối tạo chế phẩm probiotic. ……………………………………………21
3.1.1. Lựa chọn điều kiện cấp khí để thu sinh khối vi khuẩn L. casei ………21
3.1.2. Lựa chọn thời gian nuôi cấy để thu sinh khối vi khuẩn L. casei ……...23
3.2. Khảo sát một số đặc tính probiotic của vi khuẩn L. casei ……………..27

3.2.1 Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của vi khuẩn L. casei trong dịch nuôi
cấy và dịch phá tế bào. …………………………………………………..27
3.2.2. Khảo sát khả năng sinh acid lactic và một số acid khác của vi khuẩn L.
casei ……………………………………………………………………..31
4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

35


Tài liệu tham khảo


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ATCC

: Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ
(American Type Culture Collection)

B. subtilis

: Bacillus subtilis

BV

: Bacterial Vaginosis

CFU

: Số đơn vị khuẩn lạc (Colony - Forming Units)

E.coli

: Escherichia coli

L. acidophilus

: Lactobacillus acidophilus

L. casei

: Lactobacillus casei

L.casei shirota

: Lactobacillus casei shirota

L. gasseri

: Lactobacillus gasseri

L. johsonnii

: Lactobacillus johsonii

L. reuteri

: Lactobacillus reuteri

L. rhamnosus

: Lactobacillus rhamnosus

L. salivarius

: Lactobacillus salivarius

LAB

: Vi khuẩn lactic (Lactic acid bacterium)

MRS

: Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (de Man, Rogosa, Sharpe)

UV (Ultraviolet)

: Tia cực tím

VK

: Vi khuẩn

VSV

: Vi sinh vật


DANH MỤC CÁC BẢNG
STT

Tên bảng

2.1

Các hóa chất sử dụng trong đề tài

14

2.2

Các thiết bị sử dụng trong đề tài

15

3.1

Sinh khối thu được theo thời gian nuôi cấy

24

3.2

Kết quả xác định bacteriocin trong dịch nuôi cấy và dịch phá

28

tế bào L. casei

Trang

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

STT

Tên hình

Trang

1.1

L. casei

6

1.2

Sữa uống lên men chứa L. casei

11

1.3

Một số chế phẩm viên uống điều trị viêm âm đạo chứa L. casei

12

3.1

Đồ thị tương quan giữa sinh khối thu được trong 2 điều kiện

22

nuôi cấy khác nhau
3.2

Đường cong sinh trưởng phát triển của vi khuẩn L. casei nuôi

25

cấy trong môi trường MRS lỏng, tủ ấm 37℃, CO2 5%
3.3

Vòng ức chế tạo bởi dịch nuôi cấy L. casei trên vi khuẩn kiểm

30

định B. subtilis
3.4

Vòng ức chế tạo bởi dịch nuôi cấy L. casei trên vi khuẩn kiểm

30

định E. coli
3.5

Định tính acid lactic

32

3.6

Định tính acid acetic

33

3.7

Định tính acid citric

33


ĐẶT VẤN ĐỀ
Hàng nghìn năm về trước, con người đã biết tiêu thụ các sản phẩm sữa lên
men chứa vi sinh vật sống có lợi. Năm 1930, nhà khoa học Nhật Minoru Shirota
phân lập được các vi khuẩn lactic, cùng năm đó các nhà nghiên cứu Hoa Kỳ đã
chứng minh Lactobacillus acidophilus có khả năng làm giảm bệnh táo bón. Các
nhà khoa học đại học Havard phát hiện ra các vi khuẩn đường ruột đóng vai trò
quyết định trong quá trình tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung cấp một số vitamin
và các chất dinh dưỡng khác nhau mà cơ thể vật chủ không tự sản xuất được. Các
sản phẩm probiotic mang tính thương mại xuất hiện từ 1935 và tăng mạnh từ thập
niên 80 của thế kỷ trước. Hiện nay Tổ chức Thực phẩm và Nông nghiệp Liên hợp
quốc (FAO), Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và các tổ chức chuyên ngành đã ghi
nhận bổ sung probiotic có hiệu quả tích cực trong điều trị tiêu chảy liên quan đến
việc sử dụng kháng sinh, trong điều trị các bệnh lý dị ứng, viêm ruột hoại tử, cải
thiện tình trạng dinh dưỡng và tăng cường khả năng miễn dịch. Cho tới nay hiệu
quả của probiotic lên sức khỏe con người ngày càng nhận được sự quan tâm đặc
biệt của các nhà khoa học và các chuyên gia về sức khỏe trên thế giới.

Với mong muốn góp phần nhỏ vào nghiên cứu các chủng vi sinh vật sử
dụng làm chế phẩm probiotic ở Việt Nam, đề tài “Khảo sát đặc tính và điều kiện
nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus casei” được thực hiện với các mục tiêu cụ thể
như sau:
1. Lựa chọn điều kiện cấp khí và thời gian nuôi cấy để thu sinh khối vi khuẩn L.
casei tạo chế phẩm probiotic
2. Khảo sát một số đặc tính probiotic có lợi của vi khuẩn L. casei

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đại cương về probiotic
1.1.1. Định nghĩa probiotic
Lịch sử nghiên cứu probiotic được manh nha từ những năm cuối thế kỉ 19,
khi các nhà vi sinh vật học phát hiện ra sự khác biệt về hệ VSV trong đường tiêu
hóa của người khỏe mạnh và người bệnh. Thuật ngữ “probiotic” có nguồn gốc từ
tiếng Hy Lạp, trong đó “biotic” có nghĩa là “sự sống” và “probiotic” có nghĩa là
“dành cho sự sống”. Lilly và Stillwell (1965) đã sử dụng thuật ngữ này để mô tả
“các chất được tiết ra bởi một VSV nhằm kích thích sự phát triển của một VSV
khác”. Sau đó, thuật ngữ này đã được phát triển rộng rãi. Theo đó, Parker (1974),
đã đề xuất rằng probiotic là “sinh vật và các chất góp phần vào sự cân bằng vi
sinh vật đường ruột” [15]. Đến năm 2002, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và tổ
chức Nông lương thế giới (FAO) đã đưa ra định nghĩa ngắn gọn và hoàn chỉnh
nhất về probiotic như sau: “Probiotic là những vi sinh vật sống mà khi đưa vào cơ
thể với một lượng đủ lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ” [24].
Định nghĩa về probiotic này cũng được Hiệp hội khoa học quốc tế về Probiotics
và Prebiotics (ISAPP) áp dụng và được sử dụng trong hầu hết các ấn phẩm khoa
học.
Đối với chế phẩm probiotic, hiệu quả điều trị phụ thuộc vào liều lượng và

khả năng tồn tại của vi sinh vật trong quá trình di chuyển qua các điều kiện có
tính acid của dạ dày, không bị tác động bởi enzym và muối mật trong ruột non
[23], [35]. Mặt khác, trong quá trình chế biến, bảo quản và sử dụng, probiotic bị
ảnh hưởng bởi nhiều điều kiện bất lợi của quá trình sản xuất, của môi trường bên
ngoài cũng như môi trường trong đường tiêu hóa [21]. Vì vậy, để mang lại hiệu
quả, vi sinh vật phải ổn định trong chế phẩm trong suốt quá trình bảo quản, duy
trì số lượng sống sót ở mức tối thiểu là 107-109 CFU/g [14].
1.1.2. Vai trò của probiotic
Đã có rất nhiều nghiên cứu tìm hiểu về những lợi ích của các thực phẩm
2


lên men và probiotic. Những hiệu ứng liên quan đến sức khỏe có thể đúc kết như
sau:
1.1.2.1. Không dung nạp Lactose
Những người bị khiếm khuyết enzyme β-galactosidase bẩm sinh không có
khả năng tiêu hóa và hấp thụ lactose. Ở các bệnh nhân này, các vi khuẩn hoạt động
chuyển hóa lactose và có thể tạo ra các chất gây buồn nôn, tiêu chảy. Lactobacillus
bulgaricus (L. bulgaricus) và các Lactobacilli khác thường được dùng trong các
sản phẩm sữa lên men có tác dụng làm giảm lactose trong sản phẩm. Báo cáo của
Kilara và c.s., (1975) cho rằng sữa chua chứa L. bulgaricus và Streptococcus
thermophilus (S. thermophilus) có lợi cho những người không có khả năng dung
nạp lactose. Khám phá này sau đó được củng cố bởi các nghiên cứu của Gilliland
và c.s, (1984), Marteau và c.s. (1990) [42], [47].
Những tác dụng có lợi của các sản phẩm lên men vi sinh lên việc dung nạp
lactose được giải thích bởi ba cách. Thứ nhất, nồng độ lactose thấp trong các thực
phẩm lên men do hoạt động của lactase cao ở các chế phẩm lên men. Thứ hai, các
sản phẩm lên men kích thích hệ enzyme lactase trong ruột non hoạt động. Thứ ba,
bản thân vi sinh vật cũng có hoạt tính lactase cao. Ở sản phẩm sữa chua, vi khuẩn
sinh ra các enzym β-galactosidase và lactose được chuyển thành acid lactic, do

đó, nó giúp cải thiện quá trình không dung nạp lactose rất hiệu quả. Theo Salminen
và c.s., (2004), β- galactosidase có thể phát hiện trong tá tràng và hồi tràng sau
khi tiêu thụ sữa chua [48].
1.1.2.2. Chống nhiễm trùng đường tiết niệu
E. coli từ ruột thường là tác nhân gây ra bệnh đường tiết niệu ở phụ nữ.
Những nghiên cứu sử dụng các viên thuốc chứa các chủng Lactobacillus GR-1, B54 và RC- 14 đã thu được kết quả khả quan trong việc phục hồi hệ sinh vật đường
tiết niệu. Bằng cách gia tăng hàng rào Lactobacillus ở âm đạo, người ta cho rằng
tác nhân gây bệnh sẽ khó xâm nhập vào bàng quang, vì vậy ngăn chặn được hiện
tượng nhiễm trùng gây ra bởi tác nhân này [57].
1.1.2.3. Bệnh viêm ruột
3


Viêm loét ruột kết và bệnh Crohn’s là những bệnh viêm ruột thường gặp ở
Mỹ và Tây Âu. Một vài loại thuốc được chỉ định cho việc chữa trị những căn bệnh
này, tuy nhiên bệnh thường tái phát sau một thời gian chữa trị. Nguyên nhân của
các bệnh viêm ruột này không rõ ràng, có thể liên quan đến việc gây tổn thương
của niêm mạc do vi sinh vật, các yếu tố tâm lý và thói quen ăn uống. Các nghiên
cứu cho thấy sử dụng probiotic có thể làm giảm viêm và triệu chứng của bệnh
viêm ruột kết. Hơn nữa, những kết quả sơ bộ ở mô hình động vật cũng chứng tỏ
probiotic tạo ảnh hưởng tích cực trên bệnh viêm ruột kết ở chuột (Madsen, 1999;
Steidler và c.s, 2000). Một vài kết quả khác cũng được mô tả ở người như: việc sử
dụng L. rhamnosus GG ở những bệnh nhân bị bệnh Crohn’s đẩy nhanh phản ứng
miễn dịch IgA đường ruột (Malin và c.s., 1996). Mặt khác, một cuộc nghiên cứu
sơ bộ trên 4 trẻ em bị bệnh Crohn’s nhẹ cho thấy L. rhamnosus GG có thể cải
thiện chức năng hàng rào của ruột và tình trạng bệnh lý [29].
1.1.2.4. Ung thư ruột kết
Vai trò của probiotic trong việc ngăn chặn ung thư ruột kết gần đây đang
được xem xét. Người ta thấy rằng hiện tượng đột biến xảy ra trong các tế bào ruột
kết có thể gây ra ung thư và các amin thơm dị vòng hình thành trong quá trình chế

biến thức ăn có thể là tác nhân tiềm tàng gây ung thư ruột kết. Các nghiên cứu
in vitro đã chứng minh rằng vách tế bào của vi khuẩn lactic có thể gắn kết các
amin dị vòng. Các vi khuẩn lactic hoặc các sản phẩm sữa lên men đều thể hiện tác
dụng kháng các chất gây đột biến trong các thử nghiệm đột biến Salmonella
typhimurium hoặc trên mô hình động vật [29], [42].
Ngoài ra, theo nghiên cứu của Abrahmase và cs., 1999 cho thấy các vi
sinh vật đường ruột có thể tạo ra butyrate, một acid hữu cơ tạo ra ở ruột kết có tác
dụng ức chế hoạt tính gây độc của nhiều hợp chất trong tế bào ruột kết ở người.
Hoạt động của các chất gây ung thư có thể bị ảnh hưởng bởi hoạt tính của các
enzyme vi khuẩn như: NADPH dehydrogenase, nitroreductase, β-glucosidase, βglucuronidase và 7-α-dehydroxylase; các enzyme này biểu hiện nhiều ở các
Enterobacteria, Bacteroides và Clostridia, nhưng biểu hiện thấp ở
4

các


Lactobacillus và Bifidobacterium. Các enzyme này có hại đối với màng nhày ruột
kết vì chúng tham gia vào sự tái sinh của các chất gây độc (Hawksworth và cs.,
1971). Những nghiên cứu khá triển vọng về probiotic đối với bệnh ung thư ở động
vật và người trong điều kiện in vitro và in vivo đã được thực hiện, nhưng chưa thu
được những kết quả đáng mong đợi. Một số nghiên cứu công bố việc sử dụng sữa
chua làm giảm tác động của ung thư ruột kết ở vài cá nhân (Young và cs., 1988),
nhưng các nghiên cứu khác lại không đạt được những hiệu quả như vậy (Kampman
và cs., 1994). Do đó, cần thêm nhiều nghiên cứu nữa về vấn đề này trước khi có thể
xác định chắc chắn những ảnh hưởng có lợi của probiotic trong việc ngăn chặn
bệnh ung thư ruột kết ở người [29], [42].
1.1.2.5. Ngăn ngừa và điều trị bệnh do nhiễm Helicobacter pylori
Helicobacter pylori (H. pylori) là một trong số ít vi khuẩn có thể tồn tại ở
niêm mạc dạ dày. Trong một số trường hợp, chúng có thể gây viêm dạ dày, loét
hệ thống tiêu hóa và ung thư dạ dày. Việc sử dụng probiotic để chống lại H. pylori

là một ứng dụng khá mới mẻ. Các nhà khoa học nhận thấy rằng chủng L.
acidophilus LB có thể tiết ra một chất kháng khuẩn chống lại H. pylori trong điều
kiện in vitro, làm giảm khả năng kết bám và phát triển của H. pylori vào các tế
bào ruột HT29-MTX ở người được nuôi cấy (Coconnier, 1997). Ngoài ra, L.
salivarius cũng cho thấy khả năng ngăn chặn yếu tố nhiễm H. pylori ở người
(Sakamoto, 2001). Trong một cuộc nghiên cứu trên những người bị nhiễm H.
pylori tình nguyện, sữa chua LC1 chứa L. johsonnii La1 đã làm giảm mật độ H.
pylori và làm giảm chứng viêm trong xoang (Felley, 2001). L. gasseri cũng làm
giảm nhiễm H. pylori và chứng viêm niêm mạc ở người (Sakamoto, 2001) [29].
1.1.2.6. Giảm cholesterol
Rất nhiều nhà nghiên cứu đề xuất các chế phẩm probiotic có tác dụng giảm
cholesterol hiệu quả. Tuy nhiên, cơ chế của hiệu ứng này vẫn chưa giải thích chắc
chắn. Có hai giả thuyết để giải thích cơ chế: một là vi khuẩn có thể gắn hoặc kết
hợp cholesterol trực tiếp vào màng tế bào; thứ hai, enzyme thủy phân muối mật
kết hợp với muối mật mà có nhiều khả năng kết hợp phân hủy cholesterol [46].
5


Khi nghiên cứu về việc giảm cholesterol đã cho thấy rằng L. reuteri CRL
1098 giảm cholesterol toàn phần 38% khi nó được đưa vào cơ thể chuột trong 7
ngày với tỷ lệ 104 tế bào/ngày. Cũng với liều lượng L. reuteri này, triglyceride
giảm 40%, không có sự di chuyển hệ vi sinh vào lá lách và gan [53].
1.2. Lactobacillus casei
1.2.1. Giới thiệu về Lactobacillus casei
Lactobacillus casei (L. casei) là vi khuẩn Gram dương, kỵ khí không hoàn
toàn, không di động và không sinh bào tử, có dạng hình que (kích thước tế bào
khoảng 0,7-1,1 x 2,0-4,0 mm). Được phân loại như sau:
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli

Bộ: Lactobacillales
Họ: Lactobacillaceae
Giống: Lactobacillus
Loài: Lactobacillus casei

Hình 1.1: L. casei [59]

1.2.2. Đặc điểm sinh lý của L. casei và nơi phân bố
Giống với những vi khuẩn acid lactic, L. casei có khả năng chịu đựng được
điều kiện acid cực đoan và acid lactic là sản phẩm cuối cùng của quá trình lên
men trao đổi chất. Trong giống Lactobacillus, L. casei là nhóm lên men theo con
đường dị hình, sản xuất acid lactic từ đường hexose theo lộ trình EmbdenMeyerhof và từ pentose đến con đường 6-phosphogluconate/ phosphoketolase
[17]. Phương trình tóm tắt của quá trình lên men dị hình như sau:
C6H12O6  CH3CHOHCOOH + CH3CH2OH + CO2 + xKcal
Glucose

Acid lactic

Ethanol

Nhiệt độ phát triển của L. casei từ 150C – 450C. Riboflavin, acid folic,
calcium pantothenate và niacin là những nhân tố cần thiết cho quá trình phát triển
của L. casei và pH tối ưu của vi khuẩn này từ 5,5 – 5,8 [36].
L. casei là vi sinh vật kỵ khí tùy ý, tạo năng lượng thông qua quá trình lên
6


men. Hầu hết các chủng L. casei có thể lên men galactose, glucose, fructose,
mannose, mannitol, N-acetylglucosamine và tagatose. Khả năng lên men lactose
ở các chủng phân lập từ ruột của người và pho mát phổ biến hơn các chủng phân

lập từ các nguyên liệu thực vật [19]. Các điều kiện lên men như pH, nhiệt độ, các
loại môi trường phát triển, oxy, … cũng đóng một vai trò quan trọng trong hoạt
động phát triển của L. casei [26].
Hợp chất quan trọng nhất mà L. casei sản xuất là acid lactic. Nó thu được
từ quá trình lên men glucose và hình thành lactate. Acid lactic có thể được sản
xuất hóa học từ acetaldehyd và hydrogen cyanide hoặc lên men từ vi khuẩn. Acid
lactic được sử dụng rất nhiều cho quá trình công nghiệp như sản xuất các acid hữu
cơ theo phương pháp hóa học và sinh học, sử dụng như một hương liệu trong thực
phẩm, sản xuất mỹ phẩm và sản xuất các chất dẻo phân hủy sinh học [20].
L. casei có thể được tìm thấy trong các môi trường khác nhau như sản
phẩm sữa nguyên liệu và lên men, các sản phẩm thực vật tươi và lên men, trong
đường ruột và hệ sinh dục của người và động vật [19]. Acid lactic được sản xuất
bởi L. casei thông qua quá trình lên men rất quan trọng vì nó có thể được sử dụng
để làm pho mát và sữa chua; có chức năng giảm cholesterol, tăng cường đáp ứng
miễn dịch, chống bệnh tiêu chảy, tăng khả năng dung nạp lactose, ức chế tác nhân
gây bệnh đường ruột và được sử dụng như các chế phẩm sinh học [41], hữu hiệu
trong việc thúc đẩy hoặc hỗ trợ sự cân bằng các vi khuẩn sống có trong đường
tiêu hóa [31].
L. casei có khả năng thích ứng với nhiều hệ sinh thái. Khu trú trong đường
ruột, L. casei có chức năng như một probiotic (các vi sinh vật thúc đẩy sự phát
triển của vi sinh vật khác) [30]. Những đặc tính thuộc về probiotic là khả năng
chịu đựng được acid và mật, kháng lại các vi sinh vật gây bệnh [41].
1.2.3. Vai trò của L. casei đối với hệ tiêu hóa
L. casei rất quan trọng trong việc điều hòa hệ miễn dịch của đường tiêu
hóa. Vi khuẩn L. casei liên kết với bề mặt khoang ruột và kích thích đường ruột
liên kết với mô bạch huyết [39]. Điều này giúp tăng cường phản ứng miễn dịch
7


bẩm sinh và cung cấp khả năng miễn dịch của đường ruột và cơ thể. Nghiên cứu

của Perigon và c.s., (1988) thấy rằng khi cho chuột dùng sữa lên men trong 11
ngày với liều dùng 100 µg/ngày sẽ kích thích hoạt động của bạch cầu và đại thực
bào; hoạt động miễn dịch này xuất hiện vào ngày thứ 3, đáp ứng duy trì trong
vòng 5 ngày và giảm nhẹ vào ngày thứ 8 [45].
Ngoài ra, L. casei giúp điều hòa hệ miễn dịch, tránh tình trạng đáp ứng
quá mức dẫn đến hiện tượng viêm ở ruột. Theo kết quả nghiên cứu của nhóm tác
giả Hacini-Rachinel và c.s., (2009) cho thấy, sau 14 ngày cho chuột bị viêm ruột
kết uống sữa lên men có bổ sung L. casei DN-114 001, chuột có hiện tượng giảm
viêm đáng kể. Nguyên nhân được giải thích là L. casei có thể ngăn chặn chức năng
của tế bào T điều hòa nhân tố Foxp3+ CD4+ của biểu mô ruột (nhân tố kích thích
viêm ruột kết) [27].
Để chống lại tác nhân gây bệnh có thể xâm nhập vào hệ thống miễn dịch,
L. casei có thể cạnh tranh chất dinh dưỡng hoặc bám dính vào vùng bị tổn thương
nhằm chống lại tác nhân gây bệnh. Kết quả nghiên cứu in vivo cho thấy, L. casei
DN-114 001 có thể ngăn chặn hiệu quả sự bám dính của E. coli (gây ra bệnh
Crohn’s ở người) với tỷ lệ từ 75-84% khi cho xâm lấn đồng thời L. casei với E.
coli lên dòng tế bào ruột 407 hay từ 43-62% khi xâm lấn lần lượt L. casei tiếp theo
là E. coli [34]. Kết quả cũng xảy ra tương tự, dòng L. casei Shirota có thể giảm
khả năng xâm lấn của 4 tác nhân gây bệnh tiêu chảy cấp là enterotoxigenic E. coli
(ETEC), Salmonella enteritidis, Shigella dysenteriae và Vibrio cholera một cách
hiệu quả khi nghiên cứu ở cấp độ in vitro [25].
L. casei cũng có thể ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh bằng cách
giảm độ pH thông qua việc sản xuất các acid hữu cơ như acid propionic, acid
lactic hoặc bằng cách sản xuất hydrogen peroxide. Hơn nữa, L. casei có thể tiết
bacteriocin (lacticin 705, caseicin A) là các peptide kháng khuẩn mang điện tích
dương, các phân tử amphiphilic, để thoát khỏi các tác nhân gây bệnh trong cơ thể
[40].
Từ những dữ liệu nghiên cứu ở trên cho thấy L. casei có vai trò quan trọng,
8

góp phần cân bằng hệ tiêu hóa, giữ cho cơ thể được khỏe mạnh bởi việc kháng lại
nhiều tác nhân gây bệnh
1.2.4. Phương pháp định lượng vi khuẩn
Vi khuẩn có thể được định lượng một cách trực tiếp hoặc gián tiếp theo 3
cách chủ yếu đó là định lượng trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu, định lượng
gián tiếp vi khuẩn bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc trên môi trường đặc và
phương pháp đo độ đục [4], [54].
Với phương pháp định lượng trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu, số tế
bào trong 1 ml môi trường được tính theo công thức sau đây [4] :
x=

𝑎×4000×𝑏
𝑐

× 1000

Trong đó:
x: Lượng tế bào trong 1 ml
a: số tế bào trong 5 ô lớn
b: tỉ lệ pha loãng môi trường
c: số ô nhỏ trong 5 ô lớn.
Ưu điểm của phương pháp này cho biết được số lượng VSV. Tuy nhiên nhược
điểm của phương pháp: dễ nhầm lẫn, độ chính xác không cao, không thích hợp
cho huyền phù VSV có mật độ thấp.
Với phương pháp định lượng gián tiếp vi khuẩn bằng cách đếm số lượng
khuẩn lạc trên môi trường đặc, nguyên tắc như sau: một tế bào ở pha tăng trưởng
hay ở giai đoạn sớm của pha ổn định đều có thể phân chia theo cấp số nhân cho
đến khi hình thành một khuẩn lạc có thể trông thấy được. Số lượng khuẩn lạc sinh
ra từ một thể tích giống vi sinh vật nhất định chính là số lượng tế bào sống trong

thể tích đó. Do vậy cần pha loãng sao cho mỗi khuẩn lạc chỉ được hình thành từ
một tế bào sống duy nhất [4]. Số lượng khuẩn lạc trong 1 ml mẫu được tính bằng
công thức sau:
n

X= × D
v

Trong đó:
9


n: số khuẩn lạc trung bình trong đĩa petri ở mỗi độ pha loãng nhất định
v: thể tích dịch mẫu đem cấy (1 ml)
D: hệ số pha loãng.
Người ta cũng có thể dùng phương pháp đo độ đục để xác định nồng độ
vi khuẩn dựa trên nguyên tắc sinh khối tế bào có thể biểu diễn bằng giá trị mật độ
quang (OD) đo được [5]. Nguyên tắc dựa trên sự cản ánh sáng bởi các phần tử
không tan lơ lửng trong pha lỏng hình thành một hệ huyền phù và có độ đục do
sự hiện diện của chúng làm phân tán chùm ánh sáng tới. Độ đục của huyền phù tỉ
lệ với mật độ tế bào. Trong giới hạn nhất định của độ đục và mật độ tế bào có thể
xác lập quan hệ tuyến tính giữ chúng, thông qua máy so màu ở bước sóng 600
nm.
1.2.5. Ứng dụng của L. casei
Lactobacillus casei tạo ra acid lactic được ứng dụng trong công nghệ sinh
học vì nó có nhiều tác dụng có lợi. Hầu hết các ứng dụng công nghệ sinh học đều
có liên quan đến ngành công nghiệp thực phẩm. Có thể kể đến là việc nghiên cứu
tạo Sô cô la đen có bổ sung các chủng Lactobacillus như chủng vi khuẩn L. casei.
Thanh sô cô la đen mới và được cải tiến này có ít calo hơn và không gây sâu răng
phù hợp để bệnh nhân tiểu đường có thể tiêu thụ. Vi khuẩn lactic có thể được tích

hợp vào thanh sô cô la mà không làm thay đổi hương vị của sô cô la [43]. Trên
thị trường hiện nay, L. casei được ứng dụng trong rất nhiều chế phẩm, có thể kể
đến một số chế phẩm chứa L. casei tiêu biểu sau:
+ Sữa uống lên men chứa hàng tỉ lợi khuẩn L. casei có thể giúp cân bằng
hệ vi khuẩn trong ruột, ức chế các vi khuẩn gây hại, nâng cao hiệu quả tiêu hóa
và chuyển hóa năng lượng, tăng cường sức khỏe lẫn sức đề kháng của hệ tiêu hóa
và ngăn ngừa các bệnh về đường tiêu hóa như đau dạ dày, viêm loét dạ dày, đầy
hơi, chướng bụng, tiêu chảy, táo bón, rối loạn tiêu hóa… Điển hình là chế phẩm
sữa uống lên men Yakult, mỗi chai Yakult có chứa hơn 6,5 tỉ lợi khuẩn L. casei
Shirota hay sữa chua uống men sống Probi mỗi chai chứa khoảng 15 tỉ lợi khuẩn
probiotic L. casei 431.
10


Hình 1.2: Sữa uống lên men chứa L. casei [61], [62]
+ Men vi sinh Lactobacillus casei có tác dụng phục hồi khu hệ vi sinh vật
(microflore) trong đường ruột sau khi đã bị hủy hoại do dùng thuốc kháng sinh.
Ngoài ra, men vi sinh chứa Lactobacillus casei còn có khả năng thúc đẩy nhu
động của ruột, ức chế sự phát triển các vi sinh vật gây hại trong đường ruột, giúp
nhuận tràng, ngăn chặn sự hình thành và tích lũy các chất gây thối rữa đường ruột,
ví dụ chế phẩm men vi sinh Lactobacillus casei của công ty cổ phần Dược phẩm
Novaco [60].
+ Viên đặt/uống phụ khoa điều trị viêm âm đạo
Viêm âm đạo do vi khuẩn (BV) được đặc trưng bởi sự thay thế của hệ vi
khuẩn âm đạo khỏe mạnh bởi một loạt các loài có khả năng gây bệnh:
Gardnerellavagis, Prevotella, Bacteroides, Peptostreptococcus và Mobil
[22], [50]. Các loại vi khuẩn được sản xuất bởi lactobacilli âm đạo gần đây đã thu
hút sự chú ý của cộng đồng khoa học như là một phương thuốc có thể chống lại
BV [16], [18], [49]. Lactobacilli thực hiện vai trò của mình thông qua ít nhất 3 cơ
chế: Thứ nhất, chúng tạo ra acid lactic và các acid khác, thúc đẩy môi trường acid

âm đạo bình thường 3,5 – 4,5. Nhiều vi khuẩn gây bệnh không thể tồn tại hoặc
phát triển ở mức độ pH này. Thứ hai, nhiều loài Lactobacilli sản xuất hydro
peroxide, cũng ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Thứ ba, Lactobacilli có khả
năng cạnh tranh với các vi sinh vật gây bệnh của các tế bào biểu mô âm đạo.
Khoảng 7 loài có dữ liệu đáng kể được công bố về tính chất khả năng chống nhiễm
trùng của chúng là: L. rhamnosus, L. acidophilus, L. casei Shirota, L. reuteri, L.
11


casei, L. plantarum và L. salivarius. Trên thị trường hiện nay có rất nhiều chế
phẩm bào chế dưới dạng viên uống điều trị bệnh viêm âm đạo như: viên Now
Probiotic 10 cũng bổ sung 10 chủng lợi khuẩn trong đó bao gồm chủng
Lactobacillus casei giúp hệ tiêu hóa, niệu đạo và âm đạo khỏe mạnh hơn (Hình
1.3)

Hình 1.3: Một số chế phẩm viên uống điều trị viêm âm đạo chứa L. casei
[63].
1.2.6. Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn L. casei trong và ngoài nước
1.2.6.1. Các nghiên cứu trong nước
Đào Thị Minh Châu (Trường ĐH KHTN-ĐH Quốc gia TP. HCM) đã tiến
hành phương pháp bao gói vi khuẩn L. casei VTCC 186 bằng Natri alginate 3%
trong quá trình tạo bột sữa chua. Kết quả cho thấy kỹ thuật bao gói này đã bảo vệ
sự sống của vi khuẩn L. casei VTCC 186 trong những điều kiện cực đoan của hệ
tiêu hóa (pH acid thấp) và điều kiện kỹ thuật cực đoan trong quá trình sấy phun
tạo sản phẩm bột sữa chua probiotic. Đặc tính probiotic của L. casei VTCC 186
vẫn được bảo toàn sau quá trình sấy phun và trong suốt giai đoạn bảo quản bao
gồm: khả năng chịu muối mật, khả năng kháng khuẩn và khả năng khử cholesterol
[2]. Ngoài ra, nhóm tác giả Đào Thị Mỹ Linh-Nguyễn Hải Nam-Nguyễn Thị
Quỳnh Mai (Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM) đã tiến hành
nghiên cứu tối ưu quá trình nuôi cấy thu sinh khối Lactobacillus casei trên môi

trường MRS cải biên. Thành phần glucose trong môi trường MRS được thay thế
bằng dịch chiết dứa như một nguồn cung cấp cacbon cùng với một số vitamin và
12


khoáng chất cần thiết cho vi khuẩn để giảm giá thành sản phẩm [3].
1.2.6.2. Các nghiên cứu ngoài nước
Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về Lactobacillus casei. Có thể kể
đến một số nghiên cứu sau: Tiptiri-Kourpeti và cs đã sử dụng chủng L. casei
ATCC 393 trong một mô hình thí nghiệm nghiên cứu về ung thư ruột kết sử dụng
cả dòng tế bào biểu mô ung thư ở người và chuột. Các mô hình invivo cho thấy
giảm khoảng 80% khối lượng khối u ở những con chuột sử dụng L. casei trong 13
ngày, giảm số lượng các vi khuẩn gắn vào các tế bào ung thư và khả năng sống
sót của tế bào ung thư và gây chết tế bào ung thư [55]. Ngoài ra, Karimi và cs đã
tiến hành nghiên cứu việc sử dụng L. casei Shirota trên chuột béo phì đã được thu
được hiệu quả về khả năng cải thiện, kiểm soát cân nặng so với nhóm sử dụng
Orlistat, một loại thuốc dùng để điều trị béo phì. Kết quả của nghiên cứu này cho
thấy sự hứa hẹn trong việc sử dụng các chủng vi khuẩn có lợi như một phương
pháp thay thế để kiểm soát cân nặng [37]. Bên cạnh đó đã có nhiều nghiên cứu sử
dụng các chủng vi khuẩn có lợi L. casei Shirota kết hợp với chất xơ trong chế độ
ăn uống có khả năng làm giảm sự tái phát của khối u trong ung thư đại trực tràng,
với các nghiên cứu ban đầu cho thấy kết quả đầy hứa hẹn [33].

13


CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Chủng vi khuẩn

a. Vi khuẩn thử nghiệm
- Chủng vi khuẩn Lactobacillus casei (Bộ môn CND-Trường ĐH Dược HN)
b. Vi khuẩn kiểm định (chỉ thị)
- Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis
- Chủng vi khuẩn Escherichia coli
2.1.2. Hóa chất
Bảng 2.1: Các hóa chất sử dụng trong đề tài
Tên hóa chất

Nguồn gốc

Tên hóa chất

Nguồn gốc

Acid lactic

Trung Quốc

MgSO4.7H2O

Trung Quốc

Amoni citrat

Trung Quốc

MnSO4.H2O

Trung Quốc

Cao nấm men

Đức

NaCl

Trung Quốc

Cao thịt

Đức

Natri acetat

Trung Quốc

Chỉ thị màu

Trung Quốc

Pepton

Ấn Độ

FeCl3

Trung Quốc

Thạch

Việt Nam

Glucose

Trung Quốc

Phenol

Trung Quốc

K2HPO4

Trung Quốc

Triton X100

Trung Quốc

CaCO3

Trung Quốc

NaOH

Trung Quốc

Natri citrat

Trung Quốc

CaCl2

Trung Quốc

2.1.3. Môi trường
a. Công thức môi trường MRS lỏng

14


Glucose

: 2,0 g

Natri acetat

: 0,5 g

Pepton

: 1,0 g

K2HPO4

: 0,2 g

Cao thịt

: 1,0 g

MgSO4.7H2O

: 0,02 g

Cao nấm men

: 0,5 g

MnSO4.H2O

: 0,004 g

Amoni citrate

: 0,2 g

Nước máy vừa đủ

: 100 ml

Tween

: 0,1 ml

pH 6,8-7,0

b. Công thức môi trường MRS đặc
Cứ 100 ml môi trường MRS lỏng được bổ sung thêm 2,0 g thạch.
c. Công thức môi trường thạch thường

Pepton

:1g

Cao thịt

: 0,5 g

NaCl

: 0,5 g

Thạch

: 2,3 g

Nước máy vừa đủ : 100 ml
2.1.4. Thiết bị, dụng cụ
a. Thiết bị
Bảng 2.2: Các thiết bị sử dụng trong đề tài
Tên thiết bị

Nguồn gốc

Tên thiết bị

Nguồn gốc

Bếp cách thủy

Trung Quốc

Tủ ấm

Đức (Memmert)

Cân kĩ thuật

Đức (Sartorius)

Tủ ấm CO2

Nhật (Sanyo)

Lò vi sóng

Nhật (Sharp)

Tủ cấy vô trùng

Nhật (Sanyo)

Máy lắc Vortex

Đức (ISK)

Tủ lạnh

Hàn Quốc (LG)

Máy ly tâm

Đức (Rotofix)

Tủ sấy

Đức (Memmert)

Máy đo quang

Nhật (Hitachi)

Máy lắc ổn
nhiệt

Nồi hấp tiệt trùng Nhật (ALP)
b. Dụng cụ

15

Trung Quốc (KWF)


Bình nón

Ống nghiệm

Cốc có mỏ

Pipet chia vạch

Đèn cồn

Pipet Pasteur

Đĩa petri đường kính 9 cm

Pipet tip (đầu côn)

Ống đong

Pipet man (Pipet Eppendorf)

Ống ly tâm

Que cấy đầu tròn

Cuvet

Tuýp Eppendorf 1,5 ml

2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Lựa chọn điều kiện cấp khí và thời gian nuôi cấy vi khuẩn L. casei để thu
sinh khối tạo chế phẩm probiotic.
- Lựa chọn điều kiện cấp khí để thu sinh khối vi khuẩn L. casei
- Lựa chọn thời gian nuôi cấy để thu sinh khối vi khuẩn L. casei
2.2.2. Khảo sát một số đặc tính probiotic có lợi của vi khuẩn L. casei
- Khảo sát khả năng sinh bacteriocin trong dịch nuôi cấy và trong dịch phá
tế bào của vi khuẩn L. casei
- Khảo sát khả năng sinh acid lactic và một số acid khác của vi khuẩn L.

casei
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật
Các chủng vi khuẩn sử dụng trong đề tài, bao gồm chủng vi khuẩn thử
nghiệm L. casei, các chủng vi khuẩn kiểm định B. subtilis và E. coli được bảo
quản bằng phương pháp cấy truyền định kì lên môi trường mới. Các thao tác cấy
truyền được thực hiện trong tủ cấy vi sinh vật. Tủ cấy được tiệt trùng trước khi sử
dụng bằng cách lau sạch bằng cồn 96⁰ và bật đèn UV trong 20 phút.
a. Phương pháp giữ giống vi khuẩn L. casei
* Nguyên tắc: Điều kiện lạnh sẽ làm giảm quá trình hô hấp và trao đổi chất ở
VSV, đồng thời ngăn cản sự sinh trưởng của chúng để đảm bảo không làm thay
đổi phẩm chất ban đầu của giống.
* Cách tiến hành:
- Phương pháp giữ giống L. casei trong môi trường lỏng
16