Đánh giá khả năng sống sót trong dịch tiêu hóa mô phỏng của Lactobacillus acidophilus trong vi nang đông tụ alginattinh bột bao đa lớp

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

MAI HỒNG XUÂN

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SỐNG SÓT
TRONG DỊCH TIÊU HÓA MÔ PHỎNG
CỦA Lactobacillus acidophilus TRONG VI
NANG ĐÔNG TỤ ALGINAT- TINH BỘT
BAO ĐA LỚP
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

MAI HỒNG XUÂN
MÃ SINH VIÊN : 1401694

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SỐNG SÓT
TRONG DỊCH TIÊU HÓA MÔ PHỎNG
CỦA Lactobacillus acidophilus TRONG VI
NANG ĐÔNG TỤ ALGINAT- TINH BỘT
BAO ĐA LỚP

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. PGS. TS Đàm Thanh Xuân
2. DS. Võ Thị Thúy Ngân

Nơi thực hiện:
Bộ môn Công Nghiệp Dược

HÀ NỘI - 2019


Lời cảm ơn
Trong thời gian thực hiện khóa luận tại tổ Vi sinh Kháng sinh- Bộ môn
Công nghiệp Dược, tôi đã nhận được nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô,
bạn bè và gia đình.
Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn, tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS.
Đàm Thanh Xuân và DS. Võ Thị Thúy Ngân đã luôn tận tình giúp đỡ, hướng
dẫn tôi từ những ngày đầu tiên thực hiện khóa luận.
Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo và các anh chị kĩ thuật viên
của Bộ môn Công Nghiệp Dược và Viện Công nghệ Dược phẩm quốc gia đã giúp
đỡ và tạo điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu cùng toàn thể
các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền đạt những kiến thức quý
báu trong suốt những năm học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn động viên, ủng hộ tôi
trong suốt quá trình học tập và trong cuộc sống.
Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019
Sinh viên
Mai Hồng Xuân


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
TỔNG QUAN ........................................................................... 2
1.1. Đại cương về probiotic ................................................................................ 2

1.1.1. Định nghĩa .......................................................................................... 2
1.1.2. Các chủng probiotic phổ biến ............................................................. 2
1.1.3. Các thế hệ bào chế của chế phẩm probiotic ........................................ 3
1.2. Loài Lactobacillus acidophilus .................................................................... 4
1.2.1. Đặc điểm hình thái và điều kiện nuôi cấy ........................................... 4
1.2.2. Một số chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus trên thị trường ....... 4
1.3. Vi nang hóa ................................................................................................. 5
1.3.1. Định nghĩa .......................................................................................... 5
1.3.2. Ưu điểm của vi nang .......................................................................... 6
1.3.3. Các phương pháp tạo vi nang ............................................................. 6
1.3.4. Kĩ thuật bao vi nang ........................................................................... 9
1.3.5. Một số nguyên liệu sử dụng trong tạo vi nang bao............................ 10
1.4. Một số nghiên cứu sử dụng alginat, chitosan làm vật liệu để cải thiện khả
năng sống sót của VSV trong dịch tiêu hóa mô phỏng...................................... 13
NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................... 15
2.1. Nguyên liệu và thiết bị .............................................................................. 15
2.1.1. Chủng vi sinh vật ............................................................................. 15
2.1.2. Hóa chất ........................................................................................... 15
2.1.3. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu .............................................. 16
2.1.4. Thiết bị, dụng cụ .............................................................................. 16


2.1.5. Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu .......................................... 17
2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 18
2.2.1. Khảo sát một số thông số trong quá trình bao vi nang ...................... 18
2.2.2. Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng VSV của các vi nang bao trong
dịch tiêu hóa mô phỏng .............................................................................. 18
2.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 18
2.3.1. Phương pháp tiệt khuẩn .................................................................... 18

2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào ....................................... 18
2.3.3. Phương pháp tạo vi nang nhân alginat .............................................. 19
2.3.4. Phương pháp bao vi nang ................................................................. 19
2.3.5. Phương pháp đông khô ..................................................................... 20
2.3.6. Phương pháp pha loãng liên tục xác định số lượng VSV .................. 20
2.3.7. Phương pháp phá hạt vi nang xác định số lượng vi sinh vật.............. 21
2.3.8. Phương pháp xác định hình ảnh của vi nang ..................................... 21
THỰC NGHIỆM- KẾT QUẢ- BÀN LUẬN.......................... 22
3.1. Khảo sát một số yếu tố công thức trong quá trình bao vi nang ................... 22
3.1.1. Tạo vi nang nhân alginat chứa Lactobacillus acidophilus (vi nang A)
................................................................................................................... 22
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của khuấy trộn lên quá trình bao ...................... 22
3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột lên chất lượng màng bao
alginat ........................................................................................................ 25
3.2. Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng VSV trong dịch tiêu hóa mô phỏng
của vi nang alginat- tinh bột bao alginat và bao alginat-chitosan ...................... 28
3.2.1. Tiến hành bao nhân vi nang A sử dụng alginat và chitosan .............. 28
3.2.2. Đánh giá khả năng bảo vệ VSV trong dịch dạ dày mô phỏng SGF (pH
1,2)............................................................................................................. 29


3.2.3. Đánh giá khả năng giải phóng VSV trong dịch tiêu hóa mô phỏng ... 32
KẾT LUẬN, ĐỀ XUẤT .......................................................... 36
4.1. Kết luận ..................................................................................................... 36
4.2. Đề xuất ...................................................................................................... 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ATCC

: Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ
(American Type Culture Collection)

B. bifidum

: Bifidobacterium bifidum

B. longum

: Bifidobacterium longum

CFU

: Số đơn vị khuẩn lạc (Colony - Forming Units)

FAO

: Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc
(Food and Agriculture Organization of the United Nations)

kl/tt

: Khối lượng/thể tích

L. casei

: Lactobacillus casei

L. gasseri

: Lactobacillus gasseri

L. rhamnosus

: Lactobacillus rhamnosus

L.acidophilus

: Lactobacillus acidophilus

LAB

: Vi khuẩn lactic (Lactic acid bacterium)

LbL

: Kĩ thuật bao từng lớp (Layer by Layer)

MRS

: Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (de Man, Rogosa, Sharpe)

MT

: Môi trường

SGF

: Dịch dạ dày mô phỏng (Simulated Gastric Fluid)

SIF

: Dịch ruột mô phỏng (Simulated Intestinal Fluid)

TB

: Tinh bột

VK

: Vi khuẩn

VSV

: Vi sinh vật

WHO

: Tổ chức y tế thế giới (World Health Organization)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Nguyên liệu và hóa chất sử dụng ...................................................... 15
Bảng 2.2: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu .............................................. 16
Bảng 3.1: Số lượng VSV trong các vi nang trước và sau khi ủ SGF ................. 30
Bảng 3.2: Số lượng VSV sống sót ở đường tiêu hóa tại các thời điểm .............. 33


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1: Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus [50] ............................................ 4
Hình 1.2: Mô tả quá trình tạo vi nang probiotic bằng phương pháp phun sấy [43]
........................................................................................................................... 6
Hình 1.3: Mô tả quá trình tạo vi nang probiotic bằng phương pháp đông tụ [43] 7
Hình 1.4: Mô tả quá trình tạo vi nang probiotic bằng phương pháp nhũ tương hóa
[43] .................................................................................................................... 8
Hình 1.5: Sơ đồ sử dụng kĩ thuật LbL tạo vi nang bao hai lớp [26] .................. 10
Hình 1.6: Cấu trúc của alginat [49]................................................................... 11
Hình 1.7: Sự hình thành và cấu trúc của calci alginat [37] ................................ 11
Hình 1.8: Cấu trúc phân tử chitin và chitosan [51] ........................................... 13
Hình 3.1: Sơ đồ khảo sát tác động khuấy trộn trong quá trình bao alginat ........ 23
Hình 3.2: Ảnh hưởng của việc khuấy trộn lên thể chất màng bao alginat bên ngoài
vi nang nhân alginat ......................................................................................... 24
Hình 3.3: Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến chất lượng màng
bao alginat ........................................................................................................ 26
Hình 3.4: Hình ảnh vi nang nhân alginat sau khi bao hỗn hợp alginat và tinh bột
......................................................................................................................... 26
Hình 3.5: Hình ảnh vi nang alginat có nồng độ tinh bột 1% - 10% trong màng bao
alginat dưới kính lúp soi nổi có độ phóng đại 10X ........................................... 27
Hình 3.6: Sơ đồ quá trình bao vi nang nhân alginat .......................................... 29
Hình 3.7: Số lượng VSV trong các vi nang trước và sau khi ủ SGF ................. 31
Hình 3.8: Biểu đồ biểu diễn số lượng VSV sống sót trong dịch tiêu hóa mô phỏng
......................................................................................................................... 34


ĐẶT VẤN ĐỀ
Lactobacillus acidophilus là vi khuẩn có lợi, đã được nghiên cứu rộng rãi
và sử dụng nhiều làm nguyên liệu trong các chế phẩm probiotic [28]. Để phát huy
tác dụng, L. acidophilus phải đạt được số lượng đầy đủ sau khi uống. Phương
pháp tạo vi nang calci alginat – tinh bột đông khô là phương pháp đơn giản, được

sử dụng phổ biến hiện nay, có khả năng bao gói được lượng lớn VK, bảo vệ VK
trong thời gian bảo quản và khi đi qua môi trường khắc nghiệt của đường tiêu hóa
[27]. Để gia tăng hơn nữa khả năng bảo vệ VSV của các vi nang alginat- tinh bột,
một trong những giải pháp là tạo một lớp phủ trên bề mặt vi nang bằng các vật
liệu khác nhau hoặc có thể là cùng một vật liệu được sử dụng trong quá trình sản
xuất vi nang [30]. Những lớp phủ này sẽ tương tác với bề mặt vi nang, tạo ra một
màng (lớp) bổ sung trên bề mặt [26] và sẽ làm tăng khả năng bảo vệ VSV. Nguyên
liệu được sử dụng phổ biến và có tính tiềm năng nhất là alginat và chitosan. Các
đề tài nghiên cứu trong nước gần đây về vi nang probiotic sử dụng nguyên liệu
natri alginat, chitosan đều cho kết quả khả quan về khả năng bảo vệ VSV trong
môi trường dịch dạ dày mô phỏng, đồng thời giải phóng tốt VSV tại môi trường
dịch ruột mô phỏng [7], [5], [3].
Xuất phát từ những lí do trên, đề tài “Đánh giá khả năng sống sót trong
dịch tiêu hóa mô phỏng của Lactobacillus acidophilus trong vi nang đông tụ
alginat- tinh bột bao đa lớp” tiếp tục nghiên cứu sử dụng hai nguyên liệu natri
alginat và chitosan để phát triển lớp bao bên ngoài với các mục tiêu sau:
1. Khảo sát một số yếu tố công thức trong quá trình bao vi nang
2. Tạo được vi nang bao với yếu tố đã khảo sát và đánh giá khả năng bảo vệ,
giải phóng VSV trong dịch tiêu hóa mô phỏng của vi nang bao.

1


TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về probiotic
1.1.1. Định nghĩa
Thuật ngữ probiotic có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp, trong đó “biotic” có
nghĩa là “sự sống” và “pro” có nghĩa là “thân thiện” nên probiotic có thể được
hiểu là “sự sống thân thiện”. Thuật ngữ này ban đầu được sử dụng để mô tả các
chất được sản xuất bởi một VSV kích thích sự phát triển của VSV khác. Sau đó

được sử dụng để mô tả các chiết xuất mô kích thích sự phát triển của VSV và bổ
sung trong thức ăn chăn nuôi góp phần vào sự cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột
của động vật [19]. Năm 2002, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và tổ chức Nông
lương thế giới (FAO) đã đưa ra định nghĩa ngắn gọn và hoàn chỉnh nhất về
probiotic như sau: “Probiotic là những vi sinh vật sống mà khi đưa vào cơ thể với
một lượng đủ lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ” [17]. Định
nghĩa về probiotic này cũng được Hiệp hội khoa học quốc tế về Probiotics và
Prebiotics (ISAPP) áp dụng và được sử dụng trong hầu hết các ấn phẩm khoa học.
1.1.2. Các chủng probiotic phổ biến
Các tính chất quan trọng nhất của chủng giống để sử dụng sản xuất
probiotic bao gồm: đề kháng với acid dạ dày (pH 1-4), kháng acid mật, bám dính
chất nhầy và/hoặc tế bào biểu mô ở người, có hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi
khuẩn hoặc nấm gây bệnh bám dính vào bề mặt, có hoạt tính hydrolase muối mật,
tăng cường khả năng tồn tại trong các chế phẩm sinh học [40].
Hiện nay, chiếm thành phần đông đảo nhất trong số các probiotic là các VK
thuộc hai chi Lactobacillus và Bifidobacterium. Những VK này thường cư trú
trong ruột. Trong đó, một số loài tiêu biểu bao gồm L. acidophilus, L. gasseri, L.
rhamnosus, B. longum, B. bifidum [28].

2


1.1.3. Các thế hệ bào chế của chế phẩm probiotic
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, số lượng VSV còn sống có khả năng vận
chuyển đến cơ quan đích để gây ra tác dụng có lợi là rất thấp. Nhiều yếu tố bất lợi
như acid, nồng độ oxy,… đã ảnh hưởng đến sự tồn tại của VSV trước khi chúng
đến được vị trí tác dụng [5]. Vì vậy, để bảo vệ VSV, các nhà sản xuất đã nghiên
cứu và đưa ra thị trường các chế phẩm probiotic ngày càng cải thiện. Trong đó:
Thế hệ 1: Không bao, dạng bào chế gồm bột và cốm, đơn loài. Nhược điểm
của dạng bào chế này là phần lớn vi khuẩn bị chết khi đi qua dạ dày.

Thế hệ 2: Không bao, dạng bào chế nang cứng, đơn và đa loài. Vi khuẩn
được đưa vào dưới dạng bột đóng trong nang cứng, vẫn chịu ảnh hưởng của các
yếu tố môi trường bên ngoài tác động khiến suy giảm số lượng VSV.
Thế hệ 3: Bao tan trong ruột. Vi khuẩn chứa trong nang có lớp bảo vệ chỉ
tan trong ruột, hầu hết probiotic được xử lý với một polyme. Tác nhân bảo vệ này
chỉ được cho phép sử dụng trong dược phẩm, không thích hợp cho thực phẩm bổ
sung probiotic vì có thể gây tác dụng phụ.
Thế hệ 4: Vi nang hóa, tan trong ruột. Phương pháp này sử dụng chất tạo
màng là các polyme có nguồn gốc tự nhiên để giúp bảo vệ vi khuẩn khỏi môi
trường xung quanh như acid cao, pH thấp, muối mật hoặc sốc nhiệt.
Thế hệ 5: Bao kép, giải phóng VSV ở ruột. Lớp bao thứ nhất – lớp trong
cùng là hệ thống peptid/protein, phóng thích vi khuẩn căn cứ vào độ pH của môi
trường. Nó bảo vệ vi khuẩn trong suốt quá trình tiêu hóa, giúp vi khuẩn vẫn còn
sống khi đến ruột và trong điều kiện tốt vi khuẩn sẽ định cư và tăng sinh. Lớp bao
thứ hai, với hệ thống polysaccharid và hydrocolloid, giúp bảo vệ vi khuẩn chống
lại tác động của độ ẩm, nhiệt độ, áp suất… Lớp này làm tăng độ ổn định của vi
khuẩn trong suốt quá trình sản xuất và thời hạn sử dụng của sản phẩm.

3


1.2. Loài Lactobacillus acidophilus
1.2.1. Đặc điểm hình thái và điều kiện nuôi cấy
Lactobacillus acidophilus là một trực khuẩn hình que, Gram dương, kích
thước thường là 0,6-0,9 × 1,5-6,0 𝜇𝑚, tồn tại đơn lẻ hoặc xếp đôi hay chuỗi ngắn,
không sinh bào tử, không di động, kị khí không bắt buộc, phản ứng catalase âm
tính. Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển là 37ºC, tối đa trong khoảng 43-48ºC, không
phát triển trong khoảng 20-22ºC, có khả năng chịu được điều kiện pH khoảng 5,0
đến 6,0 trong 24-36 giờ, có khả năng chuyển hóa đường lactose tạo ra sản phẩm
L (+) lactic [18].

Hình 1.1: Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus [50]
Khả năng sống sót của L. acidophilus phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt
độ, pH, nồng độ acid lactic và acid acetic, nồng độ oxy hòa tan (khuếch tán từ bao
bì, trong môi trường nuôi cấy, bảo quản). Trong đó, nồng độ oxy hòa tan có vai
trò đáng kể trong việc hạn chế khả năng sống sót của L. acidophilus. Nhược điểm
này khiến số lượng L. acidophilus sống sót bị giảm đáng kể sau một thời gian bảo
quản [32], [34].
1.2.2. Một số chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus trên thị trường
Hiện nay, L. acidophilus được sử dụng rộng rãi làm chế phẩm probiotic
đơn lẻ hoặc phối hợp, giúp điều trị các trường hợp rối loạn tiêu hóa, hỗ trợ tiêu
hóa cho các đối tượng kém ăn, chậm phát triển như:
Chế phẩm men vi sinh Antibio Pro (Han Wha, Hàn Quốc) bào chế dưới
dạng bột pha hỗn dịch uống. Mỗi gói chứa 75 mg L. acidophilus tương đương với
4


108 CFU/g (theo thông tin ghi trên nhãn), hỗ trợ điều trị viêm ruột non, tiêu chảy
do nhiễm khuẩn, rối loạn tiêu hóa do ngộ độc thức ăn, do dùng kháng sinh và hóa
trị liệu dài ngày, dự phòng các biến chứng đường tiêu hóa.
Chế phẩm Bifina của Nhật Bản với công thức 3 trong 1, có chứa
Bifidobacterium, Lactobaccillus và chất xơ hòa tan (đường oligosaccharid). Dạng
bào chế của chế phẩm là viên nang liền mạch, không vết nối, có màng kép kháng
được acid dạ dày và lớp màng siêu bảo vệ giúp đưa lợi khuẩn sống đi qua được
môi trường acid dạ dày khắc nghiệt, xuống đến ruột non và đại tràng.
Nhìn chung, các chế phẩm trên thị trường hiện nay rất đa dạng. Trong đó,
các chế phẩm được bào chế dưới dạng thuốc bột, cốm pha hỗn dịch, viên nang
cứng có nhược điểm là dễ bị các yếu tố môi trường bên ngoài cũng như môi trường
đường tiêu hóa tác động khiến số lượng bị suy giảm. Để khắc phục nhược điểm
đó, phương pháp vi nang hóa, bao thêm các lớp bảo vệ đã và đang được nghiên

cứu sâu rộng hơn, mang đến hiệu quả bảo vệ và tăng cường khả năng tồn tại của
VSV trong chế phẩm.
1.3. Vi nang hóa
1.3.1. Định nghĩa
Vi nang (microcapsule) là những tiểu phân hình cầu hoặc không xác định,
kích thước từ 0,1 µm tới 5 mm (thông thường từ 100 đến 500 µm). Dược chất
(hoặc dược chất và tá dược) được bao bởi các hợp chất cao phân tử có nguồn gốc
thiên nhiên hoặc tổng hợp [3].
Phương pháp vi nang hóa có thể được định nghĩa là một quá trình bẫy một
chất (hoạt chất) trong một chất khác (vật liệu tường), tạo ra các hạt có đường kính
từ vài nm đến vài mm [48]. Vi nang hóa probiotic là một trong những phương
pháp cố định tế bào được sử dụng rộng rãi hiện nay. Trong đó, chất được bẫy là
các tế bào, cơ thể VSV sống; vật liệu tạo màng (tạo gel) là các polyme có nguồn
gốc tự nhiên như gelatin, alginat, chitosan, cellulose,… hoặc có nguồn gốc nhân
tạo như polyamid, polystyren, polyacrylat, polyacrylamid, polyester, polyvinyl

5


pyrrolidon, polyethylen glycon,… để bẫy, nhốt và bao gói các tế bào, cơ thể VSV
sống [3].
1.3.2. Ưu điểm của vi nang
Vi nang có cấu tạo như một màng bán thấm hình cầu giúp tế bào được cách
ly với môi trường xung quanh, bảo vệ và làm giảm sự tổn thất số lượng tế bào
VSV, bằng cách này chúng sẽ được bảo vệ tốt hơn trong các điều kiện bất lợi như
acid cao, pH thấp, muối mật,... và chỉ giải phóng VSV tại nơi mong muốn [27].
Vi nang hóa cho phép cố định một lượng lớn tế bào VSV. Độ bền cơ học
của lớp màng bao vi nang đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ và giải phóng
VSV khi cần thiết. Lớp màng phải có độ bền cơ học tương đối để có thể bảo vệ
được các VSV sống bên trong, tuy nhiên lại không nên quá vững chắc gây ảnh

hưởng đến sự giải phóng VSV khi cần thiết [4], [27].
1.3.3. Các phương pháp tạo vi nang
1.3.3.1. Phun sấy
Phun sấy là một công nghệ ứng dụng sản xuất vi nang có kích thước lớn.
Một chất lỏng được phân tán trong một thùng chứa sử dụng vòi hoặc đĩa, chất
lỏng hoà tan bay hơi sau khi tiếp xúc với khí nóng. Công nghệ này được cân nhắc
ứng dụng với vi nang chứa Lactobacillus spp [42] và Bifidobacterium [36].

Hình 1.2: Mô tả quá trình tạo vi nang probiotic bằng phương pháp phun
sấy [43]
6


1.3.3.2. Tách pha đông tụ
Tách pha đông tụ là phương pháp lâu đời nhất và phổ biến nhất để sản xuất
vi nang với hydrocolloids (ví dụ: alginat và carrageenan) bao gồm bước chuẩn bị
dung dịch hydrocolloid, thêm sinh khối tế bào, nhỏ giọt vào dung dịch làm cứng
(canxi clorid) tạo thành các vi nang.
Kích thước và hình dạng vi nang phụ thuộc vào đường kính của dụng cụ
nhỏ (pipet pasteur, kim tiêm,…) và khoảng cách giữa dụng cụ nhỏ với dung dịch
làm cứng (CaCl2). Ưu điểm của phương pháp này đơn giản và rẻ tiền, không gây
tổn thương tế bào dẫn đến tỷ lệ sống sót của VSV cao [30], không sử dụng các
dung môi độc hại và có thể được thực hiện trong cả hai điều kiện hiếu khí và kỵ
khí. Tuy nhiên phương pháp này có nhược điểm là khó mở rộng ra quy mô công
nghiệp do sự hình thành chậm của các vi nang.

Hình 1.3: Mô tả quá trình tạo vi nang probiotic bằng phương pháp đông tụ
[43]
1.3.3.3. Nhũ tương hoá
Trong phương pháp này, pha không liên tục gồm sinh khối tế bào phân tán

trong dung dịch hydrocolloid và pha liên tục là dầu thực vật. Sử dụng chất nhũ
hoá, tạo nhũ tương nước trong dầu. Sau khi nhũ tương được hình thành, các hạt
vi nang xuất hiện trong pha dầu do không được hoà tan.
Nhược điểm chính của phương pháp này chính là khoảng kích thước vi
7


nang khá rộng (25μm – 2mm) và hình dạng không đồng đều [13]. Hình dạng và
kích thước vi nang phụ thuộc vào chất diện hoạt, tốc độ khuấy trộn. Bên cạnh đó,
việc sử dụng dầu thực vật dẫn đến tăng chi phí. Kỹ thuật nhũ tương này là tương
đối mới trong ngành công nghiệp thực phẩm và dễ dàng mở rộng quy mô [30].

Hình 1.4: Mô tả quá trình tạo vi nang probiotic bằng phương pháp nhũ
tương hóa [43]
1.3.3.4. Phương pháp phun đông- sấy
Phương pháp phun đông – sấy là phương pháp kết hợp giữa đông khô và
phun sấy giúp kiểm soát được kích thước và hình dạng của vi nang. Tuy nhiên,
nhược điểm của phương pháp này là yêu cầu năng lượng cao, thời gian quá trình
kéo dài, chi phí cao (gấp 30-50 lần so với phương pháp phun sấy) [13].

8


Bảng 1.1: So sánh các phương pháp tạo vi nang [43]
Phương pháp tạo
vi nang

Chi phí

Dễ dàng

Loại tiểu phân

thực hiện

Kích thước
(µm)

Phun sấy

Thấp

Có

Xấp xỉ bột hình cầu

Đông tụ

Thấp

Có

Vi nang hình cầu

1600 - 5000

Nhũ tương hoá

Thấp

Có

Vi nang hình cầu

25 - 2000

Phun đông – khô

Cao

Không

Xấp xỉ bột hình cầu

3 - 100

400 - 1400

1.3.4. Kĩ thuật bao vi nang
Một trong những giải pháp để cải thiện khả năng bảo vệ VSV của vi nang
là ứng dụng lớp phủ trên bề mặt bằng cách sử dụng các vật liệu khác nhau, trong
một số trường hợp có thể là cùng một vật liệu được sử dụng để sản xuất vi nang
[30]. Các lớp phủ này sẽ tương tác với bề mặt vi nang tạo ra một lớp màng bổ
sung trên bề mặt [26] và tăng hiệu quả bảo vệ VSV. Lớp phủ này làm giảm tính
thấm của vi nang, giảm sự tiếp xúc của VSV với oxy trong quá trình bảo quản và
làm tăng sự ổn định của vi nang ở pH thấp và nhiệt độ cao [16], [26], [34]. Trong
các trường hợp khác, các lớp phủ này cũng được sử dụng để cung cấp một chức
năng mới cho vi nang, như các đặc tính bám dính hoặc để đảm bảo sự giải phóng
có kiểm soát của vi chất dinh dưỡng [11], [45].
Nhiều kỹ thuật khác nhau đã được sử dụng để tạo các lớp phủ này trên bề

mặt vi nang, cụ thể là kĩ thuật bao từng lớp (Layer by Layer), được thực hiện bằng
cách ngâm vi nang trong dung dịch polymer sẽ dẫn đến sự hình thành lớp phủ và
đồng trùng hợp được tạo ra giữa bề mặt của vi nang và lớp phủ polyme. Kỹ thuật
bao từng lớp được sử dụng đầu tiên vào cuối thế kỷ XX, nguyên tắc của kỹ thuật
này dựa trên lực hút tĩnh điện hóa học của vật liệu tích điện dương và âm [45].
Champagne và đồng nghiệp đã áp dụng kỹ thuật này trong các vi nang có chứa
VSV để tạo ra một lớp phủ trên bề mặt vi nang bằng cách ngâm vi nang vào dung
dịch biopolyme [14]. Hình 1.5 cho thấy cụ thể hơn quá trình này, trong đó vi nang
được sản xuất bởi một vật liệu cation (ví dụ, alginat) được phủ bởi một vật liệu
anion (ví dụ, poly-L-lysine) và sau đó phủ bởi một vật liệu cation khác. Các tương
9


tác tĩnh điện của các vật liệu tích điện trái dấu đã tạo những lớp phủ trên bề mặt
vi nang.
LbL là một phương pháp đơn giản, hiệu quả và có thể tái tạo để sửa đổi các
bề mặt của các cấu trúc khác nhau. Quá trình này tương đối rẻ, đòi hỏi điều kiện
đơn giản, sử dụng các dung dịch lỏng trong quá trình bao, làm việc chủ yếu với
các vật liệu tích điện tự nhiên. Nhược điểm chính của phương pháp này liên quan
đến thời gian bám dính của từng lớp, đó là không tức thời [11]. Do đó, trong quá
trình bám dính của các lớp liên tiếp, có thể xảy ra sự kết tụ toàn bộ hoặc một phần
của các vi nang, làm giảm diện tích bề mặt có sẵn cho các lớp dính tiếp theo, làm
giảm hiệu quả của quá trình.

Hình 1.5: Sơ đồ sử dụng kĩ thuật LbL tạo vi nang bao hai lớp [26]
1.3.5. Một số nguyên liệu sử dụng trong tạo vi nang bao
Nhiều polysaccharid tự nhiên được tạo thành từ các monome mang các
nhóm tích điện như amin, sunfat hoặc acid cacboxylic, nhưng các hợp chất đó
phải chứa tối thiểu một lượng các nhóm tích điện. Việc kiểm soát pH, nồng độ và
cường độ ion của dung dịch polyme là những điều kiện cơ bản để làm tăng cường

độ tương tác giữa các vật liệu.
Alginat
Alginat là tên gọi chung cho các muối của acid alginic, tồn tại dưới dạng
anion. Acid alginic là một polysaccharid mạch thẳng ưa nước, cấu tạo từ hai gốc
acid uronic là acid β-D-mannuronic (M) và acid α-L-guluronic (G) nối với nhau
10


bằng liên kết 1-4-glycosid. Cả hai gốc đều chứa các nhóm carboxyl do đó làm
phân tử alginat tích điện âm.

Hình 1.6: Cấu trúc của alginat [49]
Dung dịch alginat có khả năng tạo gel khi phản ứng với các ion kim loại
hóa trị II như Ca2+, Ba2+, Sr2+… Bình thường trong dung dịch alginat tồn tại khối
M là các dải hẹp và khối G là các dải gấp khúc. Khi có mặt ion kim loại đa hóa trị
ở nồng độ thích hợp, các phân tử alginat sắp xếp lại song song nhau, các phần gấp
khúc tạo thành khoảng không gian trống, tạo nên cấu trúc “hộp trứng” [24]. Các
ion Ca2+ khớp vào các khoảng trống này tạo nên mạng lưới không gian 3 chiều,
xảy ra hiện tượng đông rắn [10], [22]. Quá trình gel hóa này giúp cho tế bào được
nhốt trong các mạng lưới alginat mà vẫn duy trì chức năng sinh học [23]. Khi tạo
vi nang calci alginat bằng phương pháp nhỏ giọt đông tụ, nhỏ dung dịch natri
alginat vào dung dịch Ca2+, ban đầu calci alginat sẽ hình thành vào tạo nên sự hóa
rắn bề mặt. Tiếp theo, ion Ca2+ sẽ thấm dần vào lớp alginat, tạo gel và cứng dần
[9].

Hình 1.7: Sự hình thành và cấu trúc của calci alginat [37]
11


Ưu điểm của vi nang calci alginat: (1) calci alginat không độc khi sử dụng

theo đường uống và có tác dụng bảo vệ niêm mạc của đường tiêu hóa trên; (2) cấu
trúc của calci alginat là màng gel bán thẩm thấu, lớp màng có độ ổn định cao, giúp
làm lá chắn chống lại các tác nhân bất lợi bên ngoài môi trường và giải phóng
VSV một cách có kiểm soát; (3) sự trương nở của calci alginat phụ thuộc vào pH,
do đó có thể bảo vệ VSV khỏi tác động của acid dạ dày; (4) quá trình vi nang hóa
VK bằng alginat thực hiện dễ dàng, đơn giản, có thể thực hiện ở nhiệt độ thường
nên ít ảnh hưởng đến VK sống [12], [21]. Nhờ những ưu điểm trên, alginat là một
trong những nguyên liệu phù hợp trong việc bào chế vi nang.
Nhược điểm của việc sử dụng alginat là tính nhạy cảm với môi trường acid,
là mối quan tâm khi được sử dụng để bảo vệ vi khuẩn chống lại các điều kiện dạ
dày khắc nghiệt [13]. Trong một số trường hợp, alginat được trộn với các polyme
khác, ví dụ như tinh bột, để cải thiện khả năng chống lại môi trường acid và do
đó làm tăng khả năng bảo vệ men vi sinh [25], [30], [44].
Tinh bột
Tinh bột là một polysaccharid tự nhiên, có tính tương hợp sinh học. Tinh
bột không độc, không sinh đáp ứng miễn dịch, được sử dụng làm tá dược độn phổ
biến, giá rẻ và có thể được phân hủy bởi α-amylase [39].
Tinh bột là một tá dược bảo vệ trong quá trình đông khô theo cơ chế làm
giảm lượng tinh thể nước gắn với màng tế bào trong mẫu [35]. Khi tạo vi nang
calci alginat, tinh bột được phối hợp như tá dược độn rắn, góp phần cải thiện thể
chất của vi nang sau đông khô, giúp tế bào ổn định hơn, cải thiện khả năng sống
sót trong quá trình đông khô và bảo quản [5], [15], [47].
Chitosan
Chitosan là một polyaminosaccharid sinh học tự nhiên thu được từ phản
ứng deacetyl hóa của chitin, một polyme tự nhiên chuỗi dài của Nacetylglucosamin và dẫn xuất đường glucose [46]. Khi mức độ deacetyl hóa của
chitin đạt khoảng 50% (tùy thuộc vào nguồn gốc của polyme), nó có khả năng tan
được trong dung dịch có tính acid và được gọi là chitosan [38].
12

Hình 1.8: Cấu trúc phân tử chitin và chitosan [51]
Chitosan có tính nhớt. Độ nhớt của dung dịch chitosan tăng lên khi tăng
nồng độ chitosan, giảm nhiệt độ và phụ thuộc mức độ deacetyl hóa của chitosan.
Chitosan mang điện tích dương, có tính base yếu, thấm nước, tan trong hầu hết
các dung dịch acid hữu cơ ở pH ˂ 6,5 do trong môi trường acid, những nhóm amin
(các tiểu đơn vị glucosamin) của chitosan nhận proton tạo thành dạng
polysaccharid tích điện dương tan được. Chitosan không tan trong môi trường
trung tính và kiềm [46].
Với ưu điểm là độc tính thấp, tương hợp sinh học cao với tế bào vi khuẩn
và tự phân hủy được nên chitosan thường được dùng làm chất mang trong công
nghệ dược phẩm.
Trong quá trình tạo vi nang probiotic, chitosan có vai trò cung cấp một lớp
bao phủ hiệu quả, hạn chế các tác động bất lợi của acid dạ dày, đảm bảo VSV có
thể đi qua đường tiêu hóa đến ruột già mà vẫn đủ số lượng cần thiết phát huy tác
dụng [31].
1.4. Một số nghiên cứu sử dụng alginat, chitosan làm vật liệu để cải thiện khả
năng sống sót của VSV trong dịch tiêu hóa mô phỏng
Mokarram [34] với đối tượng nghiên cứu là Lactobacillus acidophilus
PTCC1643 và Lactobacillus rhamnosus PTCC167 được “bẫy” trong vi nang calci
alginat không bao, vi nang calci alginat bao một lớp alginat và vi nang calci alginat
bao hai lớp alginat nhằm tăng khả năng sống sót trong hệ dạ dày – ruột GIT. Ảnh
chụp bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) không nhận thấy sự khác biệt giữa 3
13


loại vi nang. Tuy nhiên, màng bao alginat ngăn chặn tác động của acid, gia tăng
tỷ lệ VSV sống sót trong môi trường dạ dày mô phỏng (pH 1,5 –120 phút) có ý
nghĩa thống kê (p<0,05). Sau khi ủ trong SGF 60 phút và SIF (pH 7,25 –120 phút),
số lượng L. acidphilus và L. rhamnosus trong vi nang calci alginat bao hai lớp
alginat lần lượt là 6,5 log CFU/g và 7,6 log CFU/g so với 2,3 log CFU/g và 2,0

CFU/g đối với tế bào tự do.
Một số nghiên cứu trong nước đã tiến hành nghiên cứu sử dụng vi nang
alginat-tinh bột bao chitosan để làm tăng khả năng bảo vệ của L. acidophilus
ATCC 4356 [5]. Vi nang alginat-tinh bột được bào chế theo phương pháp đông
tụ từ nhũ tương được bao chitosan bảo vệ vi khuẩn L. acidophilus ATCC 4356
trong môi trường acid pH 2,0 tốt hơn vi nang không bao chitosan, sau 90 phút số
lượng VSV sống sót còn 108 CFU/g. Bao chitosan không ảnh hưởng nhiều đến
khả năng giải phóng VSV trong môi trường kiềm: sau 2 giờ ủ trong đệm PBS pH
7,4 vi nang bao 0,4% chitosan giải phóng được 88% vi khuẩn, tương đương với
vi nang không bao; vi nang bao 1,0% chitosan giải phóng VSV chậm hơn.
Nghiên cứu đánh giá vai trò của tinh bột và sữa gầy đến quá trình tạo vi
nang probiotic chứa vi khuẩn L. acidophilus ATCC 4356 [3]. Các kết quả nghiên
cứu cho thấy việc bổ sung tinh bột tạo cho vi nang giữ được độ cầu và độ trơn
nhẵn sau sấy đông khô, đồng thời vi nang ít hút ẩm. Sữa gầy tuy giúp bảo vệ VSV
trong quá trình đông khô nhưng nồng độ cao sẽ làm tăng khả năng hút ẩm của vi
nang, việc phối hợp TB 5 % và SG 5 % tạo được vi nang sau sấy đông khô có
kích thước tương đối nhỏ (1,53 ± 0,16 mm), hàm ẩm thấp (1,95 %), giữ được số
lượng VSV sống sót cao trong điều kiện acid và không ảnh hưởng đến khả năng
giải phóng VSV khi xuống đến ruột non.

14


NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và thiết bị
2.1.1. Chủng vi sinh vật
Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 (Ấn Độ)
2.1.2. Hóa chất
Bảng 2.1: Nguyên liệu và hóa chất sử dụng

Tên nguyên liệu

Nguồn gốc

Tiêu chuẩn

Acid acetic băng

Trung Quốc

TKHH

Calci clorid

Trung Quốc

TCNSX

Cao nấm men

Merk – Đức

TCNSX

Cao thịt

Merk – Đức

TCNSX

CH3COONa.3H2O

Trung Quốc

TKHH

Chitosan

Trung Quốc

TCNSX

Glucose

Trung Quốc

TKHH

HCl

Trung Quốc

TKHH

K2HPO4

Trung Quốc

TKHH

MgSO4.7H2O

Trung Quốc

TKHH

MnSO4.4H2O

Trung Quốc

TKHH

NaOH

Trung Quốc

TKHH

Natri alginat

Ấn Độ

TCNSX

Natri citrat- Na3C6H5O7

Trung Quốc

TKHH

Natri clorid

Trung Quốc

TCKH

Pepton

Merk – Đức

TCNSX

Thạch agar

Việt Nam

TCCS

Tinh bột sắn

Việt Nam

TCNSX

Triamoni citrat

Trung Quốc

TKHH

15


2.1.3. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu
a. Môi trường MRS lỏng (MT1)
Glucose

20 g

Natri acetat

5g

Pepton

10 g

KH2PO4

2g

Cao thịt

10 g

MgSO4.7H2O

0.2 g

Cao nấm men

5g

MnSO4.4H2O

0.05 g

Triamoni citrat

2g

Nước máy vừa đủ

1000 ml

pH

6.8-7.0

b. Môi trường MRS thạch (MT2)
MT2 = MT1 + thạch 2% ( 20 g/1000ml môi trường)
2.1.4. Thiết bị, dụng cụ
 Thiết bị
Bảng 2.2: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Tên thiết bị
Cân kỹ thuật
Cân xác định
hàm ẩm nhanh

Nguồn gốc

Đức (Satorious)
Mỹ (Ohaus)

Tên thiết bị

Nguồn gốc

Nồi hấp tiệt trùng Nhật (ALP)
Tủ cấy vô trùng
(LAF)

Nhật (Sanyo)

Kính lúp soi nổi

Nhật (Nikon)

Tủ ấm CO2

Nhật (Sanyo)

Máy khuấy từ

Hàn Quốc (Wisd)

Tủ lạnh bảo quản

Hàn Quốc (LG)

Máy lắc ổn nhiệt

Trung Quốc (KWF) Tủ sấy

Máy ly tâm

Đức (Satorious)

Hàn Quốc (Daihan)

Thiết bị đông khô Đức (Christ Alpha)

 Dụng cụ

16