Báo cáo các phương pháp phổ ứng dụng trong nghiên cứu Dược liệu

ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA DƢỢC

BÁO CÁO MÔN PHƢƠNG PHÁP PHỔ ỨNG DỤNG TRONG
NGHIÊN CỨU DƢỢC LIỆU
Lớp cao học khóa 2016 - 2018

ỨNG DỤNG PHỔ KHỐI TRONG PHÂN TÍCH CÁC
CHẤT TRONG HỖN HỢP, CÁC CHẤT CAO PHÂN TỬ

TRÌ KIM NGỌC

Chuyên ngành: Dƣợc liệu – Dƣợc học cổ truyền
Mã số:60720406
Khóa 2016-2018

TP HCM, 05/2018


ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA DƢỢC

BÁO CÁO MÔN PHƢƠNG PHÁP PHỔ ỨNG DỤNG TRONG
NGHIÊN CỨU DƢỢC LIỆU
Lớp cao học khóa 2016 - 2018

ỨNG DỤNG PHỔ KHỐI TRONG PHÂN TÍCH CÁC
CHẤT TRONG HỖN HỢP, CÁC CHẤT CAO PHÂN TỬ

Chuyên ngành: Dƣợc liệu – Dƣợc học cổ truyền
Mã số:60720406

Khóa 2016-2018
Thầy hƣớng dẫn: PGS.Ts. Trần Hùng
Học viên : Trì Kim Ngọc

TP HCM, 05/2018


MỤC LỤC

MỤC LỤC ........................................................................................................................... 3
I. ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................................. 5
II. GIỚI THIỆU PHỔ KHỐI ............................................................................................... 6
2.1. Giới thiệu .................................................................................................................. 6
2.2. Nguyên tắc ................................................................................................................ 6
2.3. Sự cải tiến của phổ khối ............................................................................................ 7
III. CÁC CHẤT CAO PHÂN TỬ ....................................................................................... 8
3.1. Khái niệm chất cao phân tử ...................................................................................... 8
3.2. Các hợp chất cao phân tử điển hình .......................................................................... 8
3.2.1. Axid amin........................................................................................................... 8
3.2.2. Carbohydrat........................................................................................................ 9
3.2.3. Lipid ................................................................................................................... 9
3.2.4. Nucleotid ............................................................................................................ 9
IV. ỨNG DỤNG PHỔ KHỐI TRONG PHÂN TÍCH CÁC CHẤT TRONG HỖN HỢP,
CÁC CHẤT CAO PHÂN TỬ ............................................................................................. 9
4.1. Protein và Peptid ....................................................................................................... 9
4.1.1. Phân tích protein và peptid bằng phương pháp ion hóa ESI và MALDI ........ 10
4.1.2. Cấu trúc và xác định chuỗi thông qua sự phân mảnh ..................................... 12
4.1.3. Ứng dụng ......................................................................................................... 15
4.2. Oligonucleotid......................................................................................................... 17
4.2.1. Khối phổ của Oligonucleotid ........................................................................... 17

4.2.2. Sự phân mảnh của Oligonucleotid................................................................... 18
4.2.3. Đặc trưng của sự biến đổi Oligonucleotid ...................................................... 20
4.2.4. Các ứng dụng của phổ khối trên Oligonucleotid ............................................. 21
4.3. Oligosaccharid ........................................................................................................ 21
4.3.1. Khối phổ của Oligosaccharid .......................................................................... 22


4.3.2. Phân mảnh Oligosaccharid ............................................................................. 22
4.4. Lipid ........................................................................................................................ 23
4.4.1. Acid béo ........................................................................................................... 24
4.4.2. Acylglycerol ..................................................................................................... 26
4.4.3. Axid mật ........................................................................................................... 27
4.5. Metabolomic ........................................................................................................... 28
4.5.1. Phổ khối trong Metabolomic ........................................................................... 28
4.5.2. Ứng dụng ......................................................................................................... 28
III. KẾT LUẬN .................................................................................................................. 29
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 29


I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Phương pháp phổ khối hay phổ khối lượng viết tắt là MS (Mass Spectrometry), là một một
phương pháp phân tích công cụ quan trọng để phân tích thành phần và cấu trúc của các hợp chất
vô cơ và hữu cơ. Phổ khối ngày nay khác biệt rất nhiều so với các phương pháp phân tích cổ điển
và so với năm mươi năm trước khi nó lần đầu tiên được sử dụng như một công cụ phân tích
chung. Nguyên tắc cơ bản của nó vẫn không thay đổi nhưng các thiết bị hỗ trợ liên tục được cải
tiến. Từ đó các ứng dụng của phổ khối trong sinh học đã mở rộng với một tốc độ phi thường và
các cải tiến mới để giải thích thông tin phổ khối đang được phát triển để giải quyết các câu hỏi
mới [5].
Đại phân tử sinh học là các phân tử hữu cơ phức tạp. Những phân tử này hình thànhthành phần
cấu trúc cơ bản của một tế bào sống. Các hợp chất hữu cơ nnhư axit amin, nucleotid và

monosaccharid đóng vai trò như các khối xây dựng các phân tử sinh học phức tạp. Các phân tử
sinh học quan trọng là protein, carbohydrat và chất béo, enzym, vitamin, kích thích tố và axit
nucleic.Hầu hết các phân tử sinh học đều rất lớn và cực kỳ phức tạp. Phản ứng của chúng liên
quan đến các cơ chế phức tạp [1].
Ngày nay, khối phổ đã trở thành một trong những kỹ thuật phân tích được sử dụng rộng rãi nhất
trong khoa học đời sống. Do đó trong phạn vi bài báo cáo này sẽ trình bày ứng dụng của phổ khối
trong phân tích các đại phân tử sinh học như: peptide, protein, axit nucleic, oligosaccharides và
chất béo.


II. GIỚI THIỆU PHỔ KHỐI
2.1. Giới thiệu
Trong phổ khối, người ta tạo ra các ion từ một mẫu để phân tích. Những ion này sau đó được tách
biệt và phát hiện để định lượng. Việc tách các ion được thực hiện trên cơ sở sự khác nhau về quỹ
đạo chuyển động của các ion với các tỷ lệ (m/z) khác nhau trong điện và/hoặc từ trường. Khối
phổ đã phát triển từ các thí nghiệm và nghiên cứu vào đầu thế kỷ 20 đã giải thích trạng thái của
các hạt tích điện trong các trường lực từ trường và tĩnh điện. Những cái tên nổi tiếng từ những
ngày đầu này là J. J. Thompson điều tra htrạng thái ion trong điện trường và từ trường (1912), A.
J. Dempster hướng tập trung (1918) và F. W. Aston tập trung năng lượng (1919). Các ứng dụng
phân tích đầu tiên sau đó tiếp tục khi phổ khối thương mại đáng tin cậy đầu tiên được sản xuất.
Chủ yếu cho định lượng xác định một số thành phần trong hỗn hợp phức tạp của dầu thô. Vào
đầu những năm sáu mươi, bắt đầu việc áp dụng phổ khối để xác định và làm sáng tỏ cấu trúc các
hợp chất hữu cơ phức tạp hơn, bao gồm cả polyme và biomolecul. Kể từ đó, kỹ thuật này đã phát
triển thành một công cụ mạnh mẽ và linh hoạt cho mục đích này, cung cấp thông tin một phần bổ
sung và kết hợp với các kỹ thuật khác, chẳng hạn như NMR. Điều đáng ngạc nhiên là một kỹ
thuật mà ngay từ cái nhìn đầu tiên dường như không cung cấp thêm thông tin gì ngoài trọng
lượng của một hạt nhân. Nhưng kiểm soát sự phân mảnh của các ion phân tử ban đầu mang lại
những thông tin thú vị có thể đóng góp cho việc xác định cấu trúc [6].
2.2. Nguyên tắc
- Một lượng nhỏ hợp chất, thường là một micromol hoặc ít hơn được làm bốc hơi. Hơi được đưa

vào buồng ion hóa nơi áp suất được duy trì khoảng 10-7 mbar.
- Các phân tử hơi bây giờ bị ion hóa bởi một chùm electron được tạo ra bởi cathod nóng, dây tóc.
Bằng cách làm mất electron hóa trị, tạo ra các ion dương.
- Các ion dương được ép ra khỏi buồng ion hóa bằng một điện tích dương nhỏ (vài Volts. Sau khi
các ion đã rời khỏi buồng ion hóa, chúng được gia tốc bởi một trường tĩnh điện (A> B) vài trăm
đến hàng ngàn volts trước khi vào máy phân tích.
- Việc tách các ion diễn ra trong máy phân tích đặt trong từ trường, tại áp suất khoảng 10-8 mbar.
Từ trường mạnh được áp dụng vuông góc với hướng chuyển động của các ion. Các ion chuyển
động nhanh sau đó sẽ đi theo quỹ đạo hình tròn, do với gia tốc Lorentz, bán kính được xác định
bởi tỷ số khối lượng/điện tích của ion và sức mạnh của từ trường. Các ion với các tỷ lệ khối
lượng/điện tích khác nhau bị buộc thông qua lối thoát-khe bằng biến thể của điện áp tăng tốc (A>
B) hoặc bằng cách thay đổi lực từ trường.
- Sau khi các ion đã đi qua khe thoát, chúng va chạm vào một điện cực thu. Các kết quả hiện tại
được khuếch đại và ghi nhận như một hàm của lực từ trường hoặc điện áp tăng tốc [6].


Hình 2.1. Các bộ phận thiết yếu của máy đo phổ khối phân tích [6].

Hình 2.2. Sơ đồ buồng ion hóa[6].
2.3. Sự cải tiến của phổ khối
Tiến sỹ Guido Verbeck, Phó Giáo sư hóa học tại Đại học Bắc Texas kiêm Giám đốc Phòng thí
nghiệm Ghi ảnh Khối phổ, đã thiết kế các thiết bị quang học ion mới nhằm thu nhỏ, chuẩn bị và
phân tích khối phổ. Ông đã phát triển một khối phổ kế bẫy ion thu nhỏ tại Phòng thí nghiệm
Quốc gia Oak Ridge, ba khối phổ chuẩn bị mẫu để lọc vật liệu mới và chất xúc tác và một số ứng
dụng phân tích mới đối với tế bào đơn và phân tích pháp y. Tiến sỹ Verbeck đã nhận bằng Tiến


sỹ khi còn là một nghiên cứu sinh về hóa học của Proctor & Gamble tại trường Đại học Texas
A&M.Ông nhận định, Sự thay đổi lớn nhất trong lĩnh vực phổ khối là thay vì hầu hết các chuyên
gia MS đến từ các nhóm hóa hữu cơ như trước đây, hiện nay MS xuất hiện ở mọi lĩnh vực và có

nhiều hơn các chuyên gia MS trong từng lĩnh vực. Về mặt thiết bị, sự thay đổi lớn nhất là ở độ
nhạy. Dường như tuân theo Quy luật Moore (một thuật ngữ máy tính cho thấy sức mạnh xử lý
của máy tính cứ hai năm sẽ tăng gấp đôi), độ nhạy hiện nay đã đạt tới dưới mức 10-12 và 1015
mol/l. Sự tiến bộ này thật tuyệt vời, nó cho phép chúng ta ghi hình và làm việc với khối lượng
mẫu thấp và vẫn nhận được dữ liệu tốt. Một sự thay đổi nữa là tiểu hình hóa đang giúp khối phổ
kế dần nhỏ hơn với độ nhạy cao hơn [4].
Về mặt kỹ thuật ghép nối, dịch chuyển ion đã được cộng đồng chấp nhận như là một kỹ thuật
tách cho MS thông lượng cao (IMS-MS). Với kỹ thuật ghi phổ MRM (multiple reaction
monitoring) và dịch chuyển ion, có thể nhận được số lượng lớn các dữ liệu có cấu trúc rất nhanh
chóng, trong cùng khoảng thời gian mà trước đó chỉ có thể thu thập một quang phổ. Với dịch
chuyển ion có thể nhận được sự phân tách cực kỳ nhanh chóng, chỉ trong vài phần ngàn giây.
Trước đây khi chỉ có các kỹ thuật tách ở trước điểm cuối của khối phổ, chỉ có một khoảng thời
gian nhất định để có được tất cả thông tin này trên một giải phân chất phân tích. Bây giờ, với sự
dịch chuyển ion và MRM, có thể nhận được hàng gigabyte dữ liệu từ cột được giải phân trong 10
hoặc 15 giây. Bước tiến lớn tiếp theo sẽ là khả năng thực hiện các phạm vi khối phổ lớn thông
lượng cao với độ phân giải cao trên toàn bộ phạm vi khối phổ. Một bước đột phá khác sẽ nằm
trong lĩnh vực tin học - nhận 12 gigabyte dữ liệu hình ảnh và xử lý chính xác. Chỉ mất 4 giờ để
thu thập 12 gigabyte dữ liệu và mất một tuần để xử lý. Những đổi mới về cơ sở dữ liệu và tin
học giúp con người sử dụng các thuật toán để đánh giá dữ liệu dựa trên những gì họ đang tìm
kiếm sẽ trở nên rất quan trọng [4].
III. CÁC CHẤT CAO PHÂN TỬ
3.1. Khái niệm chất cao phân tử
Cơ thể sống rất phức tạp của ngay cả những dạng sống đơn giản nhất. Tuy nhiên, từ góc độ hóa
học, các thành phần tế bào có thể được tách biệt thành các đại phân tử (DNA, RNA, protein, …),
tương đối đơn giản các phân tử (amino acid, monosaccharid, lipid) và tiền chất của chúng: CO2,
H2O và NH3. Nói chung, các đại phân tử có xu hướng là các polyme nhỏ, phân tử sinh học; tuy
nhiên, mỗi phân tử này, dù đơn giản hay phức tạp đều tham gia vào vô số các phản ứng trao đổi
chất phức tạp. Một trường hợp điển hình là đường monosaccharid được tổng hợp từ H2O và CO2.
Nó cung cấp năng lượng cho tế bào. Ngoài ra, glucose là nguyên liệu xây dựng cơ bản của đại
phân tử như tinh bột và cellulose [3].

3.2. Các hợp chất cao phân tử điển hình
3.2.1. Axid amin
Axit amin là các phân tử sinh học nhỏ đa năng nhất. Chúng có vai trò cực kỳ quan trọng trong
sinh học bao gồm: xây dựng các khối protein đó là các polyme của axit amin, tiền chất của kích
thích tố và tiền chất của các phân tử có chức năng sinh lý đặc biệt, ví dụ chất dẫn truyền thần


kinh dopamin và hormon thyroxin đều là dẫn xuất của tyrosin axit amin. Như tên gọi của nó, các
axit amin chứa các nhóm amino và cacboxyl. Có thể được chia thành các nhóm dựa trên tính axid
khi hòa tan trong nước, cũng được phân loại theo độ hòa tan, ví dụ, ưa nước và kỵ nước [3].
3.2.2. Carbohydrat
Carbohydrat còn được gọi là đường hoặc sacarit, được định nghĩa là polyhydroxy aldehyd và
ceton và/hoặc các dẫn xuất của chúng. Chúng là nhóm các phân tử được tìm thấy nhiều nhất
trong tự nhiên và tham gia vào cả vai trò vận động và cấu trúc,ví dụ: chúng là đầu mối trong
chuyển hóa năng lượng và là trung gian chính trong cấu trúc thực vật và sự trao đổi chất. Chúng
có thể tồn tại trong tự nhiên như carbohydrat, nhưng chúng cũng có thể được liên kết hóa học với
lipid và protein. Carbohydrat đơn giản được gọi là đường, trong khi carbohydrat phức tạp là được
gọi là glycoconjugat tức là glycolipid và glycoprotein [3].
3.2.3. Lipid
Lipid còn được gọi là chất béo, là các phân tử sinh học hòa tan trong dung môi hữu cơ nhưng
không hòa tan trong dung dịch nước. Chúng đóng vai trò thiết yếu trong màng sinh học. Tất cả
các bào quan từ ty thể đến hạt nhân được bao quanh bởi màng lipid. Chúng cũng đóng vai trò nổi
bật trong sự trao đổi năng lượng như các thành phần của mô mỡ. Cuối cùng, đóng vai trò như
kích thích tố, chúng rất cần thiết cho điều hòa sinh lý cho sự trao đổi chất của tế bào. Có nhiều
hợp chất lipid. Bao gồm các: axit béo, triacylglycerol, sphingolipid, phospholipid, glycolipid,
lipoprotein, steroid và sterol, prostaglandin [3].
3.2.4. Nucleotid
Giống như các axit amin là các đơn vị xây dựng của protein, nucleotid là đơn vị xây dựng các
khối axid nucleic, RNA và DNA. Ngoài những vai trò sinh học chính, nucleotid đóng vai trò
quan trọng trong chuyển hóa năng lượng, coenzym, và chuyển hóa trung gian. Nucleotid bao gồm

một base nitơ, đường và nhóm phosphoryl. Loại bỏ các nhóm phosphoryl trong một hợp chất
được gọi là một nucleosid. Có hai loại base được tìm thấy trong nucleotid là purin và pyrimidin.
Đường là D-ribose hoặc 2-deoxy-D-ribose [3].
IV. ỨNG DỤNG PHỔ KHỐI TRONG PHÂN TÍCH CÁC CHẤT TRONG HỖN HỢP,
CÁC CHẤT CAO PHÂN TỬ
4.1. Protein và Peptid
Protein và peptid là các polyme tuyến tính được tạo thành từ sự kết hợp của 20 loại axit amin phổ
biến nhất liên kết với nhau bằng liên kết peptit. Hơn nữa, protein được sản xuất bởi ribosom có
thể trải qua những sửa đổi cộng hóa trị, được gọi là sửa đổi sau phiên dịch, sau khi kết hợp các
axit amin. Hơn 200 sửa đổi như vậy đã được phát hiện, quan trọng nhất là glycosyl hóa, sự hình
thành cầu disulfid, phosphoryl hóa, sulfat, hydroxyl hóa, carboxyl hóa và axetyl hóa. Phổ khối
không chỉ cho phép xác định chính xác khối lượng phân tử peptid và protein mà còn xác định
trình tự của chúng, nhất là khi được sử dụng đồng thời với các kỹ thuật khối lượng. Thật vậy, sự
phân mảnh của peptid và protein cho thông tin chuỗi có thể được sử dụng để nhận dạng protein,


trình tự và xác định và bản chất hóa học của các sửa đổi sau phiên dịch hoặc các thay đổi cộng
hóa trị khác [2].

4.1.1. Phân tích protein và peptid bằng phương pháp ion hóa ESI và MALDI
Các phương pháp ion hóa được sử dụng thường xuyên nhất để nghiên cứu các peptid và protein
thông qua khối phổ là ESI và MALDI. Tất cả các kỹ thuật này được đặc trưng bởi hình thành các
ion ổn định (vì chúng chỉ có năng lượng thấp) và sự vắng mặt của mảnh vỡ. ESI tạo ra các ion
tích điện, cho phép phát hiện các phân tử lớn với phổ khối thông thường như tứ cực, bẫy ion và
dụng cụ từ tính. Các dòng electron phun với kích thước nano là một sự phát triển quan trọng của
phương pháp ion hóa này. Với dòng bơm trong khoảng 20 m /phút − 1, tín hiệu lâu dài có thể thu
được từng phút số lượng mẫu, cho phép thực hiện nhiều thí nghiệm MS/MS làm sáng tỏ cấu trúc.
Độ nhạy ESI không phụ thuộc vào tốc độ nano lít mỗi phút. MALDI là một nguồn xung, và rất
thích hợp để sử dụng với phổ khối lượng TOF, hoặc với quang phổ kế cho phép lưu trữ các ion
như bẫy ion và FTICR. Thường xuyên nhất được sử dụng là công cụ TOF. Trong thập kỷ qua,

những MALDI-TOF này là quang phổ kế đã có những tiến bộ quan trọng trong việc giới thiệu
việc khai thác ion. Kết quả là, hiệu suất của các máy phân tích TOF, về độ phân giải và độ chính
xác khối lượng, đã được cải thiện rất nhiều. Mặc dù không thể đạt được với các máy phân tích
FTICR hoặc orbitrap, độ phân giải hiện có thể đạt tới 20.000 FWHM và với một giao thức hiệu
chuẩn khối lượng tốt, khối lượng chính xác có thể thu được. Các công cụ FTICR phức tạp hơn
cũng đang được được sử dụng với sự thành công ngày càng tăng. Các công cụ này hiện đang sử
dụng tái thẩm định và các công cụ cải tiến khác. Sự phức tạp và chi phí cao của các công cụ này
có nghĩa là chúng chỉ có sẵn rất hạn chế trong một số phòng thí nghiệm. Một công cụ phát triển
khác là kết hợp trình phân tích trình tự khác nhau như các công cụ Q-TOF, LIT-ICR hoặc LITorbitrap, theo thứ tự để tăng hiệu suất và tính linh hoạt và cho phép nhiều thử nghiệm được thực
hiện. Giới hạn phát hiện của ESI và MALDI phụ thuộc vào một số yếu tố, chẳng hạn như bản
chất của mẫu và chuẩn bị và độ tinh khiết của nó, dụng cụ được sử dụng và kỹ năng của người
vận hành. Đối với peptid và protein, giới hạn phát hiện được thực hiện ở đâu đó giữa các
femtomol và picomol, ngay cả khi giới hạn attomol đã được báo cáo. Bởi vì độ phân giải cần
thiết để tách các đỉnh khác nhau trong cụm đồng vị của một peptid thấp hơn độ phân giải của hầu
hết các máy phân tích, khối lượng phân tử được đo tương ứng với tính toán bằng cách sử dụng
đồng vị chiếm ưu thế của mỗi phân tử. Vì vậy đây không phải trong trường hợp của protein. Vì
độ phân giải cần thiết để giải quyết cụm đồng vị tăng theo khối lượng hoặc với điện tích do ion
mang và vì độ phân giải của các máy phân tích bị giới hạn, các đỉnh khác nhau trong cụm đồng vị
kết hợp và tạo thành đỉnh đơn trải rộng trên nhiều khối lượng (15 Da tại 10 000 Da và 45 Da tại
100 000 Da) [2].


Hình 3.3. Phổ khối của cụm đẳng hƣớng của một peptit proton đơn (C101H145N34O44) [2].
Do đó khối lượng phân tử được xác định bởi các kỹ thuật này tương ứng với được tính bằng khối
lượng hóa học của mỗi nguyên tố có trong protein. Cả hai giá trị khác biệt đáng kể với nhau. Thật
vậy, sự khác biệt giữa đồng vị khối lượng và khối lượng hóa học của một peptid hoặc của một
protein là khoảng 1 Da mỗi 1500 Da. Vì thế, xác định khối lượng là quan trọng. Lựa chọn được
xác định bởi độ phân giải của máy phân tích và khối lượng của ion được phân tích. Các lỗi đo
khối lượng cũng phụ thuộc vào một số lượng lớn các yếu tố. Một điển hình sai số đo 0,01% có
thể thu được thường xuyên. Tuy nhiên, những lỗi này có thể cao hơn 0,1% trong trường hợp xấu

nhất (MALDI-LTOF) hoặc thấp hơn 0,0001% trong trường hợp tốt nhất (ESI-FTICR). Sự vắng
mặt đặc trưng của các ion phân mảnh cho phép phân tích các hỗn hợp phức tạp mà không có sự
tách biệt nào trước đó. Tuy nhiên, việc phân tích các hỗn hợp protein có khối lượng phân tử bị
giới hạn bởi độ phân giải của máy phân tích đang được sử dụng. Ví dụ, điều tra hỗn hợp protein
10.000 Da và sản phẩm oxy hóa tương ứng để bổ sung một nguyên tử oxy đòi hỏi độ phân giải ít
nhất là 1000, trong khi độ phân giải cần thiết để phân tích hỗn hợp là 10.000 nếu protein có khối
lượng 100.000 Da. Một yếu tố khác đóng vai trò trong khả năng phân tích loại hỗn hợp này là số
lượng tương đối của mỗi thành phần. Một hợp chất có sự phong phú là 10% của chính thành phần
đòi hỏi độ phân giải ít hơn so với hỗn hợp tương tự với cùng một hợp chất có chỉ có 1% sự phong
phú tương đối. Hơn nữa, việc phân tích các hỗn hợp rở nên phức tạp bởi hiện tượng ion hóa cạnh
tranh. Hiện tượng này, được quan sát thấy trong MALDI và ESI, được đặc trưng bằng cách cạnh
tranh các ion phân tử của một số peptid khi có mặt các peptid khác trong hỗn hợp. Tín hiệu tương
ứng với các peptid này có thể biến mất hoàn toàn và do đó các peptid này có thể không được phát
hiện mặc dù chúng dễ dàng phát hiện được tín hiệu khi phân tích riêng lẻ [2].
Có thể tránh ion hóa cạnh tranh bằng cách thay đổi điều kiện pH hoặc ma trận, thông qua dẫn
xuất hóa học của các peptid chứa trong hỗn hợp này, hoặc thông qua phân tách một phần hỗn hợp
bằng sắc ký lỏng pha đảo sao cho mỗi phần chứa peptid có tính kỵ nước tương tự nhau. Đối với
cả ESI và MALDI, nồng độ của mẫu và độ phức tạp của chất gây ô nhiễm đóng vai trò quan
trọng trong cả độ nhạy và độ chính xác khối lượng. Các giải pháp cho peptid hoặc protein là mẫu


sinh học có chứa một số lượng lớn chất gây ô nhiễm thường được pha loãng. Hai vấn đề, pha
loãng và chất gây ô nhiễm không dễ xử lý, đặc biệt là khi tổng số lượng mẫu thấp. Các chất ô
nhiễm có nguồn gốc khác nhau và bao gồm đệm, muối không bay hơi, chất tẩy rửa và nhiều hợp
chất không rõ nguồn gốc. ESI chỉ có thể chịu đựng được một lượng nhỏ các ion gây ô nhiễm.
Những ion này có thể làm giảm sự phong phú của các ion từ hợp chất quan tâm và thậm chí có
thể hoàn toàn đàn áp chúng. Chúng cũng rất thường dẫn đến sự hình thành ion cộng, làm giảm độ
nhạy. Hơn nữa, chúng có thể làm phức tạp việc xác định khối lượng phân tử, hoặc giảm độ chính
xác của khối lượng phân tử nếu một số chất phụ gia không được tách ra khỏi các ion của phân tử.
Nói chung, MALDI thích hợp hơn ESI với nhiều chất gây ô nhiễm. Điều này một phần có thể là

do một số sự phân tách xảy ra trong quá trình kết tinh của mẫu với ma trận. Dù phương pháp ion
hóa nào thì chất lượng của phổ khối sẽ cao hơn nếu giảm ô nhiễm mẫu [2].
Vấn đề thứ hai là các mẫu sinh học có nồng độ thấp của hợp chất quan tâm. Khối lượng cần thiết
cho việc phân tích rất thấp khoảng microlit cho cả MALDI và ESI, và chỉ một phần của nó thực
sự được sử dụng trong phân tích. Nhưng nồng độ có ảnh hưởng rõ rệt trên quang phổ quan sát
được. Phương pháp cổ điển cho peptid và protein là chuẩn bị sắc ký lỏng pha đảo, tiếp theo là cô
đặt lại (thường là đông khô). Trong các bước thực hiện với số lượng mẫu rất nhỏ, mất mẫu có thể
xảy ra. Việc sử dụng các phương pháp tách trực tuyến với phổ khối phổ thường được ưu tiên.
Micro- hoặc nano-HPLC và điện di mao quản, cả hai cùng chủ yếu là ion hóa electro spray / khối
phổ (ESI-MS), được sử dụng ngày càng nhiều [2].
4.1.2. Cấu trúc và xác định chuỗi thông qua sự phân mảnh
Phân mảnh các peptid
Mặc dù các kỹ thuật khác nhau cho phép truyền năng lượng, phương pháp phổ biến nhất vẫn là
sự phân ly do va chạm gây ra (CID). Do đó, phổ khối song song (MS / MS) đã trở thành một kỹ
thuật cần thiết cho phân tích cấu trúc của peptid và protein. Kỹ thuật này bao gồm việc chọn ion
được phân mảnh bằng phổ khối đầu tiên và đưa nó vào một ô va chạm, nơi nó va chạm với các
nguyên tử khí không tích điện. Vì vậy, động năng được biến đổi một phần thành năng lượng dao
động và các mảnh kết quả được phân tích bởi một máy phân tích thứ hai, do đó có tên là phổ khối
CID song song hoặc CID MS / MS. Nếu độ phân giải của thiết bị đủ, bộ phân tích đầu tiên chỉ có
thể chọn đỉnh đồng vị chứa các đồng vị chính, chẳng hạn như 12C và 16O, cho phép phổ phân
mảnh không thu được các cụm đẳng hướng phức tạp (đặc biệt là ở các khối lượng cao). Phổ khối
song song có thể thu được bằng cách sử dụng nhiều công cụ khác nhau, chẳng hạn như phản xạ
TOF, bẫy ion, tứ cực ba cực, ICR hoặc dụng cụ lai. Chính sự khác biệt là ở động năng của các
ion. Trong từ tính và dụng cụ TOF là động năng ion tiền thân là vài keV trong khi các loại máy
phân tích khác, chẳng hạn như tứ cực, bẫy ion hoặc ICR, động năng ion không bao giờ vượt quá
100 eV. Sự khác biệt này ảnh hưởng đến quá trình phân mảnh [2].
Sự phân mảnh của peptid cũng có thể được quan sát bằng kỹ thuật hậu nguồn phân rã (PSD) khi
các dụng cụ TOF phản xạ được sử dụng. Kỹ thuật này, không chỉ được sử dụng để phân tích
peptid, các ion của các phân tử được tạo ra bởi MALDI có đủ năng lượng để phân mảnh nhưng

phân mảnh siêu bền này xảy ra trong quá trình di chuyển giữa nguồn và đầu dò. Với một phổ kế
TOF tuyến tính các mảnh tiếp cận máy dò cùng với các ion tiền thân. Ngược lại, lần sau chúng sẽ
có quá trình di chuyển khác và do đó khối lượng của chúng có thể được xác định [2].
Sự phân mảnh của peptid cũng có thể thu được bằng các dụng cụ FTICR. Bên cạnh phương pháp
kích hoạt thường được sử dụng nhất, cụ thể là CID, việc kích hoạt khác có thể thực hiện mà
không có khí bằng cách phân chia multiphoton hồng ngoại (IRMPD) và chụp electron phân ly
(ECD). Những phương pháp này phân đoạn các ion peptid trong tế bào ICR bằng cách phát ra
một chùm tia laser hoặc chùm electron, tương ứng. Phân tích MS / MS của nhiều peptid với các
trình tự đã biết cho phép nhận diện các quá trình phân mảnh khác nhau. Phân mảnh năng lượng
cao và thấp. Từ quan điểm thực tế, có thể được phân loại theo một trong hai loại: những dẫn xuất
từ sự phân cắt một hoặc hai liên kết trong chuỗi peptid và phân cắt của chuỗi amino acid bên [2].

Hình 3.4. Phổ phân mảnh năng lƣợng cao và thấp của methionin-enkephalin
(chuỗi YGGFM) [2].
Danh pháp được đề xuất bởi Roepstorff và Fohlman và sau đó được sửa đổi bởi Biemann cho
phép ghi các mảnh khác nhau thu được. Các mảnh đầu tiên được xác định được tạo ra bởi sự
phân cắt của một liên kết trong chuỗi chính. Sự phân tách của một liên kết trong chuỗi peptid đó
có thể xảy ra ở một trong ba loại liên kết, Cα – C, C – N hoặc N – Cα, tạo ra sáu loại mảnh tương
ứng được gắn nhãn an, bn, cn khi điện tích dương được giữ bởi phía N đầu cuối và xn, yn, zn khi
điện tích dương được giữ bởi C phía đầu cuối. Các đoạn liên kết cn và yn chuyển đổi thêm hai
nguyên tử hydro, nguyên tử đầu tiên chịu trách nhiệm cho các proton và nguyên tử thứ hai có
nguồn gốc từ phía bên kia của peptid. Chỉ số n cho biết số lượng axit amin chứa trong phân đoạn.
Hình 3.5 cho thấy các loại khác nhau của các mảnh vỡ được tạo ra thông qua sự phân cắt của một
liên kết trong chuỗi peptit [2].


Hình 3.5. Đƣờng phân mảnh chính của peptid trong phổ khối lƣợng song song CID [2].
Sự khác biệt khối lượng giữa các ion liên tiếp trong một chuỗi cho phép nhận diện axit amin liên
tiếp được xác định và do đó biết được trình tự peptid.ác loại ion phân đoạn quan sát được trong

phổ MS / MS phụ thuộc vào nhiều yếu tố bao gồm thành phần axit amin, trình tự peptid, lượng
năng lượng được chuyển giao bên trong, phương pháp kích hoạt ion được sử dụng, v.v. Có sự
khác biệt rõ rệt giữa các mảnh vỡ được quan sát ở năng lượng cao và thấp. Ở năng lượng cao, tất
cả các mảnh vỡ được có thể được tạo ra theo nguyên tắc mô tả trong hình 3.5 [2].
Giải trình tự peptid và protein
Bởi vì phổ khối là hoàn toàn khác với các kỹ thuật giải trình tự khác, nó cung cấp một số ưu điểm
chẳng hạn như phân tích peptit trong hỗn hợp hoặc peptid bị chặn ở phía đầu N hoặc mang theo
sau phiên dịch sửa đổi,… Như vậy phổ khối bổ sung cho các phương pháp hiện có khác. Khối
phổ cũng nhạy hơn và nhanh hơn các phương pháp khác. Việc thu nhận phổ phân mảnh của
peptid chỉ cần vài phút. Mặt khác, việc giải thích phổ này là trong nhiều trường hợp đơn giản
hơn. Diễn giải của phổ phối được dựa trên cơ chế và các con đường phân mảnh được mô tả ở
trên, được minh họa trong ví dụ sau. Phổ phân đoạn MS / MS CID của một peptid có trình tự
Gly-Ile – Pro-Thr-Leu-Leu-Leu-Phe-Lys đo ở mức năng lượng cao được thể hiện
trong hình 8.13 [2].


Hình 3.6. Theo dõi MSB MS / MS năng lƣợng va chạm cao của 1001 peptid với trình tự
Gly – Ile – Pro – Thr – Leu-Leu-Leu-Phe-Lys [2].
Phổ này chứa một loạt các ion bn, do đó cho phép suy ra chuỗi peptit từ axit N-terminal đến đầu
cuối C axit, trong khi hàng loạt các ion yn cho phép nhận dạng chuỗi ngược hướng. Trong thực tế,
sự khác biệt khối lượng của 97 Da giữa đỉnh b2 và b3 chỉ ra rằng axit amin ở vị trí 3 tương ứng
với prolin. Tương tự, 147 Da sự khác biệt giữa các đỉnh y1 và y2 chỉ ra rằng, axit amin ở vị trí tiếp
theo đến vị trí cuối cùng là một phenylalanin. Các giá trị m/z của các ion w3, w4, w5 và w8 ngụ ý
rằng axit amin ở các vị trí 3, 4 và 5 bắt đầu từ phía đầu cuối C là leucin, trong khi đó axit amin ở
vị trí 8 là một isoleucin. Sự hiện diện của prolin gây ra sự hình thành nội bộ các mảnh có nhãn
PT, PTL và PTLL để xác minh trình tự suy luận. Các các đỉnh có nhãn P, F và X đại diện cho các
ion vô cơ và biểu thị sự hiện diện của prolin, phenylalanin và leucin và/hoặc isoleucin. Việc giải
thích quang phổ phân mảnh có thể khó khăn và tốn thời gian. Nó có thể đơn giản hóa nếu peptid
được sửa đổi theo cách mà một loại phân mảnh được ưu tiên. Điều này có thể đạt được bằng cách
tạo dẫn xuất nhóm đầu cuối amin với N-succinimidyl-2- (3- pyridyl) acetat, thúc đẩy các mảnh

bn. Sửa đổi peptid cũng có thể làm cho sự khác biệt giữa các mảnh C-và N đầu cuối dễ dàng hơn.
Dẫn xuất cũng cho phép phát hiện và xác định dư lượng cụ thể bằng cách so sánh quang phổ
trước và sau khi dẫn xuất. Các dẫn xuất thường được sử dụng cho mục đích này là: sự hình thành
các este etyl từ các axit cacboxylic Asp, Glu và C-terminal; sự axetyl hóa của nhóm amin Nterminal và Lys; và phản ứng Edman cho N-terminal amino axit [2].
4.1.3. Ứng dụng
Việc xác định một peptid hoặc một khối lượng phân tử protein với độ chính xác cao cho phép
nhiều vấn đề cần được giải quyết, chẳng hạn như nhận dạng protein, phát hiện đột biến bên trong
protein, nhận dạng và bản địa hóa các sửa đổi sau phiên dịch, xác minh cấu trúc và độ tinh khiết
của peptid tổng hợp và protein được sản xuất bởi kỹ thuật di truyền, và thậm chí trình tự gián
tiếp. Đối lập với trình tự trực tiếp dựa trên các phân đoạn pha khí, trình tự gián tiếp dựa trên việc
tạo ra các thông tin cụ thể theo trình tự từ phương pháp khác với phương pháp pha khí, ví dụ:


phản ứng pha dung dịch. Tuy nhiên, mặc dù những khả năng khác nhau này, MS / MS thường
được sử dụng. Thật vậy, MSn chỉ cho phép các kết quả dựa trên xác định khối lượng phân tử
được xác nhận và xác định [2].
Xác định Protein
Về mặt cổ điển, việc xác định protein đòi hỏi xác định toàn bộ hoặc một phần chuỗi của chúng
bằng phương pháp suy thoái của Edman. Trong một số trường hợp cụ thể, việc xác định protein
cũng có thể dựa trên sự công nhận của chúng bằng các kháng thể đặc hiệu. Kỹ thuật này đòi hỏi
một thời gian phân tích dài và một lượng lớn mẫu. Phương pháp dựa trên so sánh dữ liệu thu
được từ phổ khối với những dữ liệu được dự đoán cho tất cả các protein có trong cơ sở dữ liệu
một cách nhanh chóng và độ nhạy cao. Hơn nữa, sự phân mảnh trong khí giai đoạn để giải trình
tự bằng MS/MS dễ dàng hơn đối với peptid so với protein và thường cho độ bao phủ chuỗi tốt
hơn. Tuy nhiên, bởi vì các kỹ thuật được cải thiện, trình tự các protein nguyên vẹn của MS / MS
ngày càng trở nên mạnh hơn [2].
Phát hiện và mô tả các đột biến
Khối phổ cho phép phát hiện và mô tả các đột biến trong protein, cho dù chúng là tự nhiên hay
thu được thông qua đột biến trực tiếp. Cách tiếp cận thường bao gồm ba bước: xác định khối
lượng phân tử của protein nguyên vẹn để phát hiện đột biến, PMF của một enzyme tiêu hóa để

xác định đột biến peptid, và cuối cùng, MS / MS để xác định hoặc xác nhận vị trí và bản chất của
axit amin đã bị đột biến. Một đột biến điểm trong một protein dẫn đến sự biến đổi khối lượng
phân tử của protein này. Sự thay đổi này bằng với sự khác biệt về khối lượng giữa loại tự nhiên
và dư lượng đột biến. Thật vậy, 18 trong số 20 dư lượng axit amin tự nhiên có khối lượng phân tử
đặc biệt. Ngoại lệ với Leu và Ile, là đồng phân. Sự khác biệt hàng loạt trong số các axit amin thay
thế dao động từ 0,0364 Da cho Gln / Lys đến 129,0578 Da cho Gly / Trp. Do đó, tất cả các thay
thế giữa các axit amin này dẫn đến biến đổi khối lượng phân tử có thể được phát hiện về mặt lý
thuyết bằng phép đo khối phổ [2].
Thẩm định cấu trúc và độ tinh khiết của peptid và protein
Khối phổ cũng có thể đóng một vai trò quan trọng trong việc xác minh cấu trúc vàđộ tinh khiết
của peptide tổng hợp. Sự phát triển của bộ tổng hợp tự động làm cho việc sản xuất peptid tổng
hợp ngày càng dễ dàng hơn. Tuy nhiên một số lượng lớn các lỗi có thể xảy ra trong hoặc sau quá
trình tổng hợp phần lớn trong số đó có thể phát hiện được bằng phép đo khối phổ. Phổ khối lượng
song song cho phép một xác nhận bản chất của sự sửa đổi mà còn để xác định vị trí của nó trong
peptid. Khối phổ cũng đóng một vai trò quan trọng trong tổng hợp hóa học và đặc biệt hơn cho
phân tích cấu trúc của các thư viện peptid. Các thư viện này thường chứa một số lượng lớn các
mẫu trong nhiều trường hợp rất phức tạp. Thật vậy, các thư viện peptid dựa trên sự tổng hợp pha
rắn thường chứa hàng triệu hợp chất. Kiểm soát tổng hợp đòi hỏi kỹ thuật phân tích nhanh và
đáng tin cậy có thể cung cấp thông tin về các mẫu [2].


Trình tự Peptid Ladder
Khối phổ được sử dụng để đọc toàn bộ đoạn hoàn chỉnh trong một thao tác đơn lẻ. MALDI-TOF
là công cụ lựa chọn để xác định khối lượng phân tử của các peptid này vì sự đơn giản của quang
phổ và độ nhạy cao của nó. Phổ khối chứa các ion tương ứng với từng loài polypeptid. Sự khác
biệt khối lượng giữa các đỉnh liên tiếp tương ứng với dư lượng axit amin và thứ tự xuất hiện của
chúng trong tập dữ liệu xác định trình tự của các axit amin trong chuỗi peptid ban đầu. Độ nhạy
của trình tự peptid bậc thang, tổng số picomol của mẫu peptid, có thể so sánh với các phương
pháp Edman hiện có, với khả năng nhạy lớn hơn nhiều [2].
Thông tin cấu trúc phức hợp protein không cộng hóa trị và Tridimensional

Khối phổ và đặc biệt ESI có thể được sử dụng cho việc nghiên cứu tương tác không cộng hóa trị
của protein. Thật vậy, ESI là một phương pháp ion hóa thích hợp quan sát phức hợp không cộng
hóa trị của các protein được hình thành trong dung dịch và chuyển trong pha khí [2].
4.2. Oligonucleotid
Oligonucleotid cũng được đặt tên là axit nucleic (DNA hoặc RNA), là các polyme tuyến tính của
nucleotid. Các nucleotid bao gồm một cơ sở dị vòng, một đường và một nhóm phosphat. Có năm
nhóm khác nhau. Cytosine (C), thymine (T) và uracil (U) là các cơ sở pyrimidin và adenin (A) và
guanin là các cơ sở purin. Cả DNA và RNA không chỉ khác với thành phần cơ bản của chúng
(ACGT cho DNA và ACGU cho RNA) mà còn bởi bản chất của phần đường (2’ -deoxy-D-ribose
trong DNA và D-ribose trong RNA). Các nucleosid và deoxynucleosid được hình thành bằng
cách gắn kết vị trí N-9 của purin hoặc N-1 vị trí của pyrimidin với C-1’ của ribo hoặc deoxyribo
tương ứng. Khối phổ khối đóng một vai trò quan trọng trong việc làm nổi bật những sửa đổi và
xác định cấu trúc và vị trí của chúng trong oligonucleotid. Khối phổ không chỉ cho phép xác định
chính xác trọng lượng phân tử của oligonucleotid mà còn định trình tự của chúng theo cách trực
tiếp hoặc gián tiếp [2].
4.2.1. Khối phổ của Oligonucleotid
Trong nhiều năm, khối phổ có vai trò quan trọng trong phân tích axit nucleic.. Với sự ra đời của
FAB và PD, oligonucleotid nhỏ bao gồm lên đến khoảng 10 đơn vị đã được phân tích. Bởi vì các
axit nucleic là phức tạp nhất của các chất sinh học, chúng được hưởng lợi nhiều từ sự ra đời của
ESI và MALDI bởi vì các phương pháp này cho phép phân tích lượng oligonucleotid rất nhỏ, bắt
đầu từ vài chục femtomol. Tuy nhiên, các oligonucleotid không dễ phân tích như peptid và
protein. Do sự hình thành liên kết mạnh giữa nhóm phosphodiester và guyên tử kim loại kiềm,
chủ yếu là Na và K, dẫn đến sự hình thành các cấu trúc chứa nhiều của các nguyên tử này. Các
oligonucleotid được phát hiện tốt nhất ở chế độ ion âm, và ion quan sát có công thức chung (M [n + m] H + mNa / K) n−. Sự phân bố này các ion của các phân tử trên một vài giá trị khối lượng
dẫn đến giảm tỷ số tín hiệu nhiễu. Việc tách các ion riêng lẻ đòi hỏi độ phân giải cao. Nói chung
là, chúng không tách rời và tạo ra một đỉnh lớn. Điều này làm giảm độ chính xác của khối lượng.
Hơn nữa, hỗn hợp chứa các hợp chất có sự khác biệt khối lượng nhỏ sẽ không được tách ra. Khó
khăn này có thể được khắc phục bằng cách thêm ion amoni cho mẫu. Chúng sẽ thay thế các ion

kim loại kiềm bằng cách liên kết với nhóm phosphodiester, nhưng trong giai đoạn khí amoniac
được giải phóng, để lại oligonucleotid tự do. Khó khăn thứ hai trong phân tích oligonucleotid là
sự phân mảnh dễ dàng của chúng.Ccác oligonucleotid có xu hướng mất đi các đơn vị nucleic của
chúng bằng cơ chế loại bỏ 1,2. Sự phân mảnh của chuỗi hạt nhân ở cả 5’ hoặc 3’ có thể xảy ra.
Vấn đề ổn định này quan trọng hơn đối với MALDI hơn là phân tích ESI [2].
Oligonucleotide có thể được phân tích ở cả hai chế độ ion dương và âm. Tuy nhiên, chế độ ion
âm cho độ nhạy và độ phân giải tốt hơn, đặc biệt là trong ESI. Phổ MALDI bị chi phối bởi hoặc
các ion được phân giải (M + H) + hoặc deprotonated (M - H) - của các loài phân tử. Sự thành
công của phân tích oligonucleotid phụ thuộc nhiều vào sự lựa chọn ma trận và chuẩn bị mẫu. Một
cải tiến lớn đã dẫn đến việc giới thiệu các ma trận mới cụ thể cho các oligonucleotid. Một ví dụ là
3-hydroxypicolinic axit. Một số cách chuẩn bị mẫu đã được áp dụng, với mục tiêu chủ yếu loại
bỏ nhiễu từ các ion kim loại kiềm phổ biến: một sự kết hợp của việc sử dụng các cột trao đổi
cation để thay thế các ion kim loại kiềm bằng amoni và bổ sung một số muối amoni vào mẫu.
Phản ứng của nucleotid với MALDI cũng phụ thuộc vào bản chất, kích thước và thành phần tín
hiệu mạnh hơn so với tín hiệu của các cơ sở khác. Thymin khó tạo proton hơn so với các base
khác. Do đó, cũng khó loại bỏ hơn, điều này dẫn đến kết quả sự ổn định của chuỗi polyme tốt
hơn. RNA dễ phân tích hơn DNA. Điều này cũng xuất hiện kết quả từ thực tế là loại bỏ 1,2 cơ sở
chỉ xảy ra với deoxyribo; các sự hiện diện của nhóm 2 -hydroxyl trong RNA cản trở phản ứng
loại bỏ.Khi kích thước của nucleotid tăng, trở nên khó khăn hơn để ion hóa và phát hiện. Hơn
nữa, sự hình thành các adducts được tăng lên và phản ứng phân mảnh cũng tăng lên. Những sự
kiện này cùng nhau giải thích tại sao các oligonucleotid lớn hơn được phát hiện với tỷ số tín hiệu
trên nhiễu thấp hơn và độ phân giải thấp hơn, hoặc tín hiệu có thể bị triệt tiêu hoàn toàn. Sai số
khối lượng phân tử đo được bằng MALDI từ 0,01 đến 0,05% cho oligonucleotid nhỏ. Sai số này
tăng lên 0,5% hoặc thậm chí nhiều hơn cho nucleotid lớn. Thật vậy, ở khối lượng cao hơn các tín
hiệu từ adducts hoặc kết quả từ sự mất mát của một đơn vị cũng cao hơn và không thể được giải
quyết, gây ra sự mở rộngđỉnh. Sai số khi xác định trọng tâm tăng lên. Người ta có thể xem xét
rằng kích thước tối đa có thể được phân tích hợp lý bởi MALDI là khoảng 50 base cho DNA. Đối
với RNA hơn 100 đơn vị đã được phân tích thành công [2].
4.2.2. Sự phân mảnh của Oligonucleotid
Sự phân mảnh của oligonucleotid trong pha khí có thể là một vấn đề cần được khắc phục để phân

tích các phân tử này. Tuy nhiên, phân mảnh này có thể được sử dụng để xác định trình tự của
oligonucleotid. Sự phân ly của oligonucleotid có thể xảy ra là kết quả của sự dư thừa năng lượng
được truyền cho phân tử trong quá trình giải hấp/ion hóa. Đây là trường hợp phổ FAB của
oligonucleotid. Phổ khối FAB chế độ âm của oligonucleotid được đặc trưng bởi sự hiện diện của
hai chuỗi ion là đặc trưng của chuỗi: một chứa phosphat trên 5’ bên cạnh và bên kia có chứa
phosphat trên 3’. Thông thường cường độ của 5’ lớn hơn so với dòng 3’, và hàng loạt ion khác
của khối lượng 18 Đà thấp hơn (mất nước) hoặc 80 Da cao hơn (bổ sung HPO3) cũng có mặt. Phổ
đó là điển hình của một oligonucleotid nhỏ với trình tự UGUU, được đo bằng chế độ FAB/MS,
được thể hiện trong Hình 3.7 [2].


Hình 3.7. Phổ FAB chế độ âm của một oligonucleotid với chuỗi UGUU [2].
Sự phân mảnh của nucleotid cũng có thể được quan sát thấy trong phổ MALDI. Trong nguyên
tắc, những mảnh vỡ này có thể cho phép suy luận trình tự. Chỉ những mảnh vỡ xảy ra nhanh như
sự giải hấp có thể được quan sát thấy trong khối phổ ở các giá trị m/z bên phải của chúng trong
một công cụ TOF tuyến tính. Phân ly xảy ra sau có thể được quan sát chỉ khi khai thác từ nguồn
bị trì hoãn hoặc nếu sử dụng một máy phân tích phản xạ. Sự kết nối của MALDI với một máy
phân tích bẫy, hoặc bẫy ion hoặc FTICR, cho phép tất cả những mảnh vỡ đó sẽ được phát hiện.
Sự hình thành các mảnh vỡ này phụ thuộc vào ma trận, sức mạnh của chùm tia laser và trình tự
của oligonucleotid được gửi tới phân tích [2].
Sự ion hóa electrospray tạo ra các ion ổn định của các loài phân tử, trừ khi các điều kiện trong
nguồn được điều chỉnh để tạo ra sự phân ly bởi va chạm trong vòi phun–khu vực skimmer.Sự
phân ly của các nucleotid cũng có thể thu được bằng cách thêm năng lượng bên trong vào các ion
ổn định. Kết hợp sự phân ly này với MS/MS cho phép chỉ thu được các ion phân mảnh từ tiền
thân đã chọn. Điều này cho phép phân tích oligonucleotid từ một hỗn hợp và cũng ngăn chặn các
ion khối lượng thấp có nguồn gốc từ ma trận khi FAB hoặc MALDI được sử dụng. Với ESI,
quang phổ được đơn giản hóa vì chỉ có một trạng thái đã được chọn. Số phân tích phổ khối sử
dụng oligonucleotid ngày càng tăng MS/MS. Kết quả thu được bằng cách ghép nối nguồn ESI
hoặc MALDI với máy phân tích FTICR hoặc bằng cách ghép một nguồn ESI vào một dụng cụ
bốn cực [2].

Hình 3.8. Các sản phẩm phân ly từ oligonucleotid [2].
4.2.3. Đặc trưng của sự biến đổi Oligonucleotid
Oligonucleotid có thể trải qua những thay đổi cộng hóa trị. Đây có thể do tự nhiên trong tRNA và
rRNA nhưng chúng cũng có thể do phản ứng với các chất ngoại sinh và là các dấu hiệu cho thấy
sự suy giảm có thể có của các tế bào. Chúng cũng có thể sửa đổi hóa học để tạo ra các loại thuốc
mới. Hầu như tất cả những sửa đổi này đều đi kèm bởi các biến thể về khối lượng, và phổ khối
lượng là hữu ích để xác định bản chất của chúng và vị trí trong chuỗi. Một sơ đồ phân mảnh
chung được vẽ dựa trên MS và MS/MS của nhiều nucleosid được đo ở chế độ dương và âm bằng
các kỹ thuật ion hóa khác nhau (EI, CI, FAB, ESI), như trong Hình 3.9 [2].

Hình 3.9. Dấu vết phân ly FAB / MS / MS của N 6-isopentenyladenosin (25 ng) chứa trong
một hydrolyzat chƣa đƣợc lọc hóa của E.coli tRNATyr [2].


Kết quả phân mảnh phong phú nhất từ sự phân cắt của liên kết giữa nucleobase và đường. Biết sơ
đồ phân mảnh này và sử dụng MS/MS, có thể phát hiện và xác định cấu trúc của các nucleosid
biến đổi trực tiếp trong hỗn hợp nucleosid thu được bởi enzym tiêu hóa hoặc thủy phân, mà
không có bất kỳ sự phân tách trước đó [2].
4.2.4. Các ứng dụng của phổ khối trên Oligonucleotid
Ứng dụng phổ khối đơn giản nhất và phổ biến nhất là xác định chính xác trọng lượng phân tử để
xác minh sự có mặt của một oligonucleotid của một trình tự đã cho, dự đoán hoặc mong muốn.
Điều này đặc biệt áp dụng cho tổng hợp oligonucleotid hoặc oligonucleotid được sản xuất bởi các
kỹ thuật sinh học phân tử, chẳng hạn như phản ứng chuỗi polymerase (PCR). Việc sử dụng các
oligonucleotid được sản xuất với bộ tổng hợp tự động trở nên nhiều hơn và thường xuyên hơn.
Tuy nhiên, các oligonucleotid tổng hợp có thể bị lẫn tạp đáng kể hoặc, trình tự của chúng có thể
khác với mong đợi do phản ứng depurination, các nhóm bảo vệ không bị loại bỏ,… bộ tổng hợp
tự động đã tăng cường đáng kể mức độ tự tin cho các oligonucleotid được tạo ra. Thật vậy, xác
định chính xác trọng lượng phân tử của oligonucleotid được sản xuất không chỉ cho phép xác

nhận trình tự mong đợi mà, trong trường hợp khuyết tật, cho phép xác định các sửa đổi đã xảy ra
hoặc bản chất của các chất gây nhiễu. Một lợi thế quan trọng của phổ khối lượng so với các kỹ
thuật khác như điện di hoặc sắc ký là tốc độ cao của nó. Ví dụ, sự kết hợp của MALDI/TOF với
chuẩn bị tự động các mẫu, cùng với việc mua lại quang phổ tự động, cho phép phân tích hơn 100
oligonucleotide trong 90 phút [2].
Một ưu điểm quan trọng khác của phổ khối là khả năng xác định sự kết hợp của các nucleotid đã
được sửa đổi. Hiển thị phổ khối của oligonucleotid tổng hợp có khối lượng lý thuyết là 5838 Da.
Ngoài các nucleotid mong muốn, các hợp chất khác có mặt. Chênh lệch khối lượng giữa các đỉnh
(111–151 Da) tương ứng với khối lượng của các bazơ nucleic. Điều này cho thấy phản ứng
depurination có xảy ra trong quá trình tổng hợp. Xác định kích thước hoặc trọng lượng phân tử
của axit nucleic là rất quan trọng trong phân tử sinh học. Tầm quan trọng này được tăng lên nhờ
sự ra đời của PCR, cho phép tác nhân được xác định (ví dụ: vi khuẩn gây bệnh) hoặc liên kết di
truyền giữa các cá nhân và cho phép dự đoán hoặc chẩn đoán bệnh [2].
4.3. Oligosaccharid
Oligosaccharid là các phân tử được hình thành bởi sự kết hợp của một số monosaccharid liên kết
với nhau thông qua các liên kết glycosid. Việc xác định cấu trúc hoàn chỉnh của oligosaccharid là
khó khăn hơn so với protein hoặc oligonucleotid vì nó yêu cầu xác định các đặc tính bổ sung như
bản chất đồng phân của monosaccharid và khả năng tạo thành tuyến tính hoặc oligosaccharid
phân nhánh. Việc biết cấu trúc của một oligosaccharid không chỉ đòi hỏi xác định trình tự
monosaccharid của nó và mô hình phân nhánh của nó, mà còn vị trí đồng phân và cấu hình
anomeric của mỗi liên kết glycosidic của nó. Hơn thế nữa, các monosaccharid ở dạng cyclic của
chúng có thể có đồng phân pyran/furan. Việc xác định tất cả các thông tin cấu trúc này có thể thu
được bằng phép đo phổ khối, ngay cả khi nó đòi hỏi việc sử dụng các kỹ thuật khác nhau [2].


4.3.1. Khối phổ của Oligosaccharid
Việc sử dụng phổ khối để mô tả đặc tính của oligosaccharid không phải là mới. Thật vậy, GC/MS
đã được sử dụng trong nhiều thập kỷ để xác định monosaccharid hoặc oligosaccharid. Việc sử
dụng GC/MS cần tạo dẫn xuất trước của các phân tử này bằng cách methyl hóa, acetyl hóa hoặc
trimethylsilylation. Ngày nay, GC/MS vẫn là phương pháp lựa chọn để xác định thành phần

monosaccharid của oligosaccharid và được sử dụng rộng rãi. Phân tích bắt đầu với thủy phân
hoặc thẩm tách oligosaccharid thành monosaccharid, sau khi dẫn xuất (chủ yếu là bằng
trimethylsilylation) được phân tích bằng GC/MS. Monosaccharid nhận dạng dựa trên so sánh thời
gian lưu giữ và mẫu phân mảnh với tài liệu tham khảo. GC/MS cũng được sử dụng chủ yếu trong
phân tích methyl hóa, cho phép xác định được vị trí của các liên kết glycosidic trong một
oligosaccharid. Permethylation của oligosaccharid được thực hiện trước khi thủy phân. Sau đó,
monosaccharid được methyl hóa một phần và peracetyl hóa, tạo ra một phần methyl hóa alditol
acetates (PMAA). Phân tích các phân tử này bằng GC/MS, trên cơ sở giải thích đơn giản về sự
phân mảnh, vị trí của glycosidic trước đây được xác định. Phân tích khối phổ của oligosaccharid
không thủy phân đã bắt đầu với kỹ thuật ion hóa FAB và đã phát triển với ESI và MALDI. ESI
không hiệu quả đối với các oligosaccharid tự nhiên như MALDI. Thật vậy, các oligosaccharid tự
nhiên không chứa các nhóm có tính axit hoặc cơ bản, và do đó không dễ bị ion hóa trong ESI.
Phản ứng cho oligosaccharid yếu hơn so với peptid hoặc protein. Tuy nhiên, các oligosaccharid
có chứa phosphoryl hóa, sulfated hoặc sialicacid được ion hóa tốt bởi ESI ở chế độ ion âm. Nói
chung, các oligosaccharid được phân tích bởi ESI sau khi dẫn xuất, hoặc bằng cách methyl hóa
hoặc acetyl hóa. Sự khử amin của nhóm aldehyd hoặc ketone cũng được sử dụng. Permethyl hóa
được ưu tiên cho dẫn xuất bởi vì sự gia tăng khối lượng kết quả thấp hơn và do đó các
oligosaccharid lớn hơn có thể được phân tích. Dẫn xuất không chỉ cải thiện tín hiệu nhưng cũng
có thể mang lại nhiều thông tin cấu trúc hơn, đặc biệt là với MS/MS [2].
4.3.2. Phân mảnh Oligosaccharid
Bởi vì các phương pháp ion hóa được sử dụng cho oligosaccharid tạo ra vài mảnh, sự phân ly va
chạm gây ra (CID) hoặc phân rã sau nguồn (PSD) phải được sử dụng cho xác định cấu trúc. Hai
kỹ thuật này đã được áp dụng cho các ion phân tử bị hủy hoại, proton hoặc alkali hóa từ các
oligosaccharid có nguồn gốc hoặc dẫn xuất bằng FAB, ESI hoặc MALDI. Sự phân mảnh của
oligosaccharid bị ảnh hưởng mạnh bởi một số lượng lớn các yếu tố, chẳng hạn như phương pháp
ion hóa, máy phân tích, bản chất của đạo hàm, bản chất của các loài phân tử, … Tuy nhiên, có thể
quan sát được năm loại ion phân đoạn. Như được hiển thị trong phổ được trình bày trong Hình
3.10 hai dãy ion đầu tiên, thường phong phú, đến từ sự phân cắt của một liên kết glycosidic [2].

Hình 3.10. Dấu vết phân ly ESI/MS/MS thêm phụ gia natri của maltoheptulose methyl hóa
(m / z = 760,7) [2].
Vì vậy, chúng chứa sự giảm hoặc không giảm kết thúc. cả hai mảnh vỡ này, bằng cách trải qua sự
phân cắt liên kết của một glycosidic thứ hai, dẫn đến một loạt các ion thứ ba được gọi là các
mảnh bên trong. Chúng không chứa hai termini ban đầu nữa (phân cắt ở cả hai đầu). Hai dãy ion
cuối cùng, thường ít hơn, là do sự phân cắt kép trên vòng glycosidic. Các mảnh giữ lại điện tích
ở phía không giảm được gọi là A, B hoặc C, và những mảnh giữ lại điện tích ở phía giảm được
gọi là X, Y và Z, tùy thuộc vào việc họ cắt vòng hoặc liên kết glycosidic. Nói chung, MS/MS cho
phép xác định trình tự và mô hình phân nhánh của oligosaccharid. Vị trí đồng phân của mỗi liên
kết glycosidic của chúng cũng có thể xác định. Mặt khác, cấu hình anomeric của liên kết
glycosidic và phân biệt monosaccharid với diastereoisomeric hiếm khi có thể xác địnhbằng kỹ
thuật này [2].
4.4. Lipid
Lipid được tạo thành từ nhiều lớp phân tử rất khác nhau, tất cả đều thể hiện độ hòa tan tính chất
trong dung môi hữu cơ. Khối phổ khối đóng một vai trò quan trọng trong quá trình sinh hóa của
chất béo. Thật vậy, phổ khối không chỉ cho phép phát hiện và xác định cấu trúc của các phân tử


này mà còn định lượng của chúng. Thực tế, chỉ axit béo, acylglycerol và axit mật được nêu ở đây,
mặc dù các loại chất béo khác như phospholipid, steroid, prostaglandin, ceramid, sphingolipid và
leukotrien đã được phân tích thành công bởi khối phổ. Hơn nữa, các phương pháp mô tả sẽ được
giới hạn ở những phương pháp chỉ dựa trên phổ khối, ngay cả khi phần lớn các phương pháp này
thường được ghép đôi trực tiếp hoặc gián tiếp với các kỹ thuật tách như GC hoặc HPLC [2].
4.4.1. Acid béo
Axid béo là một nhóm các phân tử được tạo thành từ một chuỗi hydrocarbon dài, độ dài thay đổi
và mức độ không bão hòa khác nhau, được kết thúc bởi nhóm cacboxylic. Một số sinh vật như vi
khuẩn, bọt biển và một số loại thực vật có thể sản xuất axid béo biến đổi: nhánh; có vòng
cyclopropan, cyclopropen hoặc epoxy; hydroxyl hóa hoặc alkoxyl hóa; hoặc thậm chí không bão
hòa bất thường. Phương pháp phân tích cổ điển bao gồm chiết xuất các chất béo từ vật liệu sinh
học và sau đó mô tả các axid béo tinh khiết trước đó bằng cách so sánh chúng với các axid béo

tham chiếu, bằng phân tích và bằng cách sử dụng một loạt phương pháp quang phổ. Nhiều kỹ
thuật sắc ký, bao gồm sắc ký lớp mỏng (TLC), HPLC và GC, được sử dụng trong quá trình thanh
lọc. Bởi vì các axid béo có nguồn gốc từ các nguồn tự nhiên có mặt trong một hỗn hợp, một
phương pháp phân tích lý tưởng cho các phân tử này nên được áp dụng cho các hỗn hợp mà
không yêu cầu tách hoặc dẫn xuất. Khối phổ là một công cụ tuyệt vời để xác định cấu trúc của
các axid béo có trong hỗn hợp. Có thể xác định không chỉ trọng lượng phân tử và thành phần
nguyên tố mà còn bản chất và vị trí của nhánh và các nhóm thế khác trên chuỗi carbon trong hầu
hết các trường hợp. Hơn nữa, phân tích đòi hỏi khối lượng thấp từ 10 pg đến 100 ng lipid, tùy
thuộc vào mẫu phân tích, phương pháp ion hóa được sử dụng. Phương pháp phân tích chung cho
các axid béo dựa trên năng lượng quang phổ cao của anion carboxylat. Thật vậy, FAB, ion hóa
hóa học giải hấp (DCI), ESI hoặc quang phổ hóa học áp suất khí quyển (APCI) được đo bằng
chế độ âm được đặc trưng bởi sự hiện diện duy nhất của các loại ion phân tử và đồng vị của
chúng và sự vắng mặt của các mảnh. Đặc điểm này được sử dụng để tạo thuận lợi cho xác định
khối lượng phân tử của axid béo ngay cả khi chúng có mặt trong phức hợp hỗn hợp, nhưng nó
không cung cấp thông tin liên quan đến cấu trúc. Sự bất tiện này có thể được khắc phục bằng
cách chuyển năng lượng dư thừa cần thiết để phân mảnh thành các ion ổn định được sản xuất
trong quá trình ion hóa bằng cách sử dụng MS/MS. Những mảnh vỡ tương ứng đến sự mất alkan:
CH4, C2H6,. . . , CnH2n + 2. Chúng được tạo ra bởi cơ chế loại trừ cụ thể 1,4 của một phân tử
hydro,như trong Hình 3.11. [2].


Hình 3.11. Cơ chế loại trừ 1,4 của H2 xảy ra dọc theo chuỗi axid béo để số lƣợng mảnh
tƣơng ứng với sự mất một alken [2].
Sự mất CnH2n + 2 bắt đầu tại đầu cuối alkyl và tiến triển dọc theo chuỗi hydrocacbon. Trong
trường hợp axit béo bão hòa, sự phong phú của những mảnh này tạo ra phổ đặc trưng như trong
Hình 3.12.

Hình 3.12. Dấu vết phân ly FAB/MS/MS của axid octadecanoic thu đƣợc ở chế độ ion âm ở
năng lƣợng cao [2].
Sự hiện diện của phân nhánh trên chuỗi hydrocacbon được biểu thị bằng sự cạnh tranh phân

mảnh tại điểm phân nhánh và bằng cách nhấn mạnh sự phân mảnh của liên kết tiếp giáp với
nhánh ở phía alkyl. Vì vậy, phổ của một axid béo phân nhánh được đặc trưng bởi tín hiệu kép
hai-metylen, tức là bởi hai đỉnh trong dãy phân cách. Sự hiện diện của một sự không bão hòa
trong một axid béo được chỉ định và vị trí của nó được thiết lập bởi sự vắng mặt của các mảnh có
nguồn gốc từ sự phân tách của liên kết không bão hòa này và những yếu tố liền kề. Các biến đổi
khác của chuỗi hydrocarbon của các axit béo, chẳng hạn như hydroxyl hóa hoặc có thêm một
vòng cyclopropan, cyclopropen hoặc epoxy, có thể được xác định và định vị theo phương pháp
này. MS / MS năng lượng cao áp dụng cho (M + Li) + hoặc (M - H + 2Li) + tương ứng với các
axit béo được phân loại bởi Li + (được ưu tiên hơn các kim loại kiềm khác vì chúng liên kết chặt
chẽ hơn với các nhóm cacboxylic) cho kết quả có thể so sánh với các kết quả thu được trong chế
độ ion âm [2].