Nghiên cứu xác định hàm lượng một số độc tố pyrolizidin alkaloids trong thảo dược bằng sắc ký lỏng khối phổ

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

ĐẶNG THỊ PHƢƠNG THẢO

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG
MỘT SỐ ĐỘC TỐ PYROLIZIDIN
ALKALOIDS TRONG THẢO DƢỢC
BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỔI PHỔ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

ĐẶNG THỊ PHƢƠNG THẢO
Mã sinh viên: 1401558

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG
MỘT SỐ ĐỘC TỐ PYRROLIZIDIN
ALKALOIDS TRONG THẢO DƢỢC
BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỔI PHỔ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. ThS. Bùi Cao Tiến
2. TS. Đặng Thị Ngọc Lan
Nơi thực hiện:

1. Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực
phẩm Quốc gia
2. Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất

HÀ NỘI - 2019


LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến những người đã giúp đỡ tôi trong
quá trình thực hiện khóa luận này.
Xin chân thành cảm ơn TS. Đặng Thị Ngọc Lan, giảng viên bộ môn Hoá phân
tích và Độc chất, ĐH Dược Hà Nội. Cô là người luôn theo sát, hướng dẫn, động viên
tôi những ngày đầu làm khóa luận, truyền cho tôi tinh thần làm việc sôi nổi, sáng tạo,
miệt mài. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các thầy cô của trường ĐH Dược Hà Nội nói
chung và bộ môn Hoá phân tích và Độc chất nói riêng đã trang bị cho tôi những kiến
thức nền quý giá để chuẩn bị sẵn sàng cho việc làm khóa luận.
Xin chân thành cảm ơn TS. Trần Cao Sơn, trưởng khoa Độc học Dị nguyên,
Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia. Anh đã nhiệt tình giúp đỡ,
hướng dẫn, tận tình trao đổi nhiều vấn đề có liên quan. Đặc biệt, tôi muốn gửi lời cảm
ơn chân thành nhất đến ThS. Bùi Cao Tiến, kiểm nghiệm viên Viện kiểm nghiệm an
toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, người trực tiếp hướng dẫn, luôn cùng tôi thảo luận,
giải quyết vấn đề, cho tôi lời khuyên cũng như cùng tôi tháo gỡ những khó khăn trong
quá trình thực hiện khóa luận tại viện. Xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị kĩ thuật viên
của viện, đã tạo cho tôi một môi trường thân thiện, vui vẻ để có thể hoàn thành tốt
công việc của mình.
Cuối cùng, xin được tri ân gia đình và bạn bè, đã luôn đồng hành bên tôi những
lúc khó khăn, luôn tạo điều kiện và là nguồn động lực để tôi làm việc và phấn đấu
vươn lên.
Tôi xin chân thành cảm ơn tới tất cả mọi người!

Hà Nội, tháng 5 năm 2019
Đặng Thị Phương Thảo


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN ..........................................................................................2
1.1. Tổng quan về pyrrolizidin alkaloids .....................................................................2
1.1.1. Khái quát về pyrrolizidin alkaloids ......................................................................2
1.1.2. Nguồn thực vật chứa độc tố pyrrolizidin alkaloids .............................................4
1.1.3. Độc tính của PAs ..................................................................................................6
1.1.4. Quy định hiện hành đối với PAs ..........................................................................8
1.2. Phƣơng pháp xác định độc tố PAs ........................................................................8
1.2.1. Phương pháp chiết ...............................................................................................8
1.2.2. Phương pháp làm sạch .......................................................................................10
1.2.3. Phương pháp phân tích ......................................................................................11
CHƢƠNG II. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................13
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ...........................................................................................13
2.2. Nguyên vật liệu, thiết bị .......................................................................................13
2.2.1. Thiết bị, dụng cụ .................................................................................................13
2.2.2. Dung môi, hóa chất ............................................................................................14
2.2.3. Chất chuẩn ..........................................................................................................14
2.2.4. Chuẩn bị dung dịch chuẩn .................................................................................14
2.3. Nội dung nghiên cứu.............................................................................................15
2.3.1. Khảo sát các điều kiện phân tích .......................................................................15
2.3.2. Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu ......................................................................15

2.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích ...................................................................15
2.3.4. Đánh giá hàm lượng độc tố PAs trong thảo dược có trên thị trường ..............15
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .....................................................................................15
2.4.1. Phương pháp xử lý mẫu .....................................................................................15
2.4.2. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) ................................16
2.4.3. Phương pháp thẩm định. ...................................................................................16
2.4.4. Phương pháp lấy mẫu ........................................................................................17
2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................................17
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..............................................................18
3.1. Xây dựng phƣơng pháp xác định đồng thời một số PAs trong thảo dƣợc ......18
3.1.1. Khảo sát điều kiện LC-MS/MS ..........................................................................18
3.1.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu ...........................................................................22
3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng nền ....................................................................................29
3.2. Thẩm định phƣơng pháp .....................................................................................29
3.2.1 Độ đặc hiệu ..........................................................................................................30
3.2.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) ...............................31
3.2.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn các chất phân tích ...................................33
3.2.4. Độ lặp lại và độ thu hồi ......................................................................................35
3.3. Ứng dụng phƣơng pháp để phân tích một số thảo dƣợc trên thị trƣờng ........37
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................................................38
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

Association of Official Analytical

Hiệp hội các cộng đồng phân

Commodities

tích chính thức

Atmospheric pressure chemical

Ion hóa hóa học ở áp suất khí

ionization

quyển

Collisionally Activated Dissociation
Gas

Áp suất bắn phá

Collision energy

Năng lượng va chạm

CUR

Curtain Gas

Áp suất khí màng

DAD

Diod Array Detector

Detector mảng diod

d-SPE

Dispersive solid phase extraction

Chiết phân tán pha rắn

AOAC

APCI

CAD
CE

ELISA

Enzyme-linked Immune-sorbent
Assay

Kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch

ESI

Electrospray Ionization

Ion hóa phun điện tử

FLD

Fluorescence detector

Detector huỳnh quang

GC

Gas chromatography

Sắc ký khí

GS1

Ion Source Gas 1

Áp suất khí nguồn 1

GS2

Ion Source Gas 2

Áp suất khí nguồn 2

HLB

Hydrophylic lipophilic balance

Cân bằng thân nước, thân dầu

ISV

Ion Spray Voltage

Thế ion hóa

KPH
LC-MS/MS
LOD

-

Không phát hiện

Liquid chromatography tandem mass
Sắc ký lỏng khối phổ hai lần
spectrometry
Limit of Detection

Giới hạn phát hiện


Từ viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

Limit of Qualification

Giới hạn định lượng

MS

Mass spectrometry

Khối phổ

NPD

Nito phospho detector

Detector nitơ photpho

Recovery

Hiệu suất thu hồi

RSD

Relative Standard Deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

SCX

Strong cation exchange

Cột trao đổi cation mạnh

SPE

Solid phase extraction

Chiết pha rắn

LOQ

R

TCVN
TEM

Temparature

Tiêu chuẩn Việt Nam
Nhiệt độ nguồn


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Các loài thực vật chứa PAs gây độc trên ngƣời và động vật ....................5
Bảng 1.2. Một số phƣơng pháp chiết sử dụng acid loãng..........................................9
Bảng 1.3. Tổng quan một số nghiên cứu có sử dụng cột SPE SCX ........................10
Bảng 1.4. Một số nghiên cứu xác định PAs bằng LC-MS/MS.................................12

Bảng 2.1. Các độc tố PAs đƣợc sử dụng trong nghiên cứu......................................13
Bảng 2.2. Dung dịch chuẩn trung gian ......................................................................14
Bảng 2.3. Dung dịch chuẩn làm việc của PAs ...........................................................15
Bảng 3.1. Các điều kiện MS/MS phân tích PAs........................................................18
Bảng 3.2. Các thông số của MS để phân tích các PAs..............................................19
Bảng 3.3. Chƣơng trình gradient của pha động.......................................................21
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của nền mẫu ............................................................................29
Bảng 3.5. Tỷ lệ ion của các PAs ..................................................................................30
Bảng 3.6. Độ lặp lại và độ thu hồi của echimidin .....................................................35
Bảng 3.7. Độ lặp lại và độ thu hồi của intermidin ....................................................35
Bảng 3.8. Độ lặp lại và độ thu hồi của jacobin ..........................................................36
Bảng 3.9. Độ lặp lại và độ thu hồi của senecionin.....................................................36
Bảng 3.10. Kết quả phân tích mẫu thực tế ................................................................37


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Cấu trúc của PAs và các dạng khác nhau của nó ......................................2
Hình 1.2. Các nhóm PAs phân loại theo base necin ...................................................3
Hình 1.3. Cấu trúc của một số acid necic điển hình ...................................................3
Hình 1.4. Một số PAs phổ biến .....................................................................................4
Hình 2.1. Sắc đồ Ichimidin và Jacobin sử dụng cột C18 và cột TSK Gel ..............20
Hình 2.2. Sắc đồ tổng các PAs ....................................................................................21
Hình 2.3. Sắc đồ MRM của từng PAs ........................................................................22
Hình 2.4. Biểu đồ kết quả khảo sát dung môi chiết ..................................................24
Hình 2.5. Biểu đồ kết quả khảo sát nhiệt độ .............................................................25
Hình 2.6. Biểu đồ kết quả khảo sát nồng độ acid .....................................................26
Hình 2.7. Biểu đồ kết quả khảo sát cột SPE ..............................................................27
Hình 2.8. Sắc đồ khảo sát dung môi rửa giải với intermidin...................................28
Hình 2.9. Quy trình xử lí mẫu....................................................................................28

Hình 2.10. Đƣờng chuẩn trên nền dung môi và nền mẫu thực ...............................29
Hình 2.11. Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn PAs ............31
Hình 2.12. Sắc đồ mẫu trắng thêm chuẩn tại mức nồng độ 0,3 µg/kg ....................32
Hình 2.13. Đƣờng chuẩn phân tích Echimidin .........................................................33
Hình 2.14. Đƣờng chuẩn phân tích Intermedin ........................................................33
Hình 2.15. Đƣờng chuẩn phân tích Jacobin ..............................................................34
Hình 2.16. Đƣờng chuẩn phân tích Senecionin.........................................................34


ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, xu hướng trong việc sử dụng các loại thảo dược trong tự nhiên, chủ
yếu xuất phát từ các bài thuốc y học cổ truyền đang ngày càng phổ biến. Tuy nhiên đa
số các loại thảo dược đều có thành phần phức tạp, một số có dược tính khá mạnh, khó
kiểm soát về độc tính tiềm ẩn. Nhiều loại thảo dược có chứa các độc tố tự nhiên có thể
gây hại đến sức khỏe người sử dụng.
Một trong số các độc tố tự nhiên đang ngày càng thu hút sự quan tâm của các
nhà khoa học trên giới đó là các alkaloid nhân pyrrolizidin (Pyrrolizidin alkaloids PAs). PAs là một nhóm các hợp chất có độc tính, sinh ra bởi một số loài thực vật do đó
được xếp vào nhóm độc tố thực vật (phytotoxin). Khi sử dụng các loài thực vật có
chứa độc tố PAs như trà thảo dược, các sản phẩm ngũ cốc bị nhiễm độc tố, con người
có thể xuất hiện các triệu chứng ngộ độc cấp tính và mãn tính trên gan, độc tính trên
gen và nhiễm sắc thể, đôi khi có liên quan đến sự hình thành một số khối u phát triển
trên da, bàng quang, não, tủy sống, tụy và đường tiêu hóa.
Ngày nay, hơn 6.000 loài thực vật (chiếm khoảng 3% thực vật trên toàn thế
giới) được biết có khả năng sinh tổng hợp PAs, chủ yếu thuộc họ Mồ hôi
(Boraginaceae), họ Cúc (Asteraceae) và họ Đậu (Fabaceae). Trong đó, khoảng 600
loại PAs đã được xác định và mô tả có khả năng gây nhiễm độc.
Giới hạn tối đa cho phép của các PAs trong thực phẩm đã được thiết lập ở một
số nước trên thế giới. Tuy nhiên tại Việt Nam mới chỉ ban hành TCVN 12053:2017 về
quy phạm thực hành kiểm soát cỏ dại để ngăn ngừa và giảm thiểu nhiễm pyrrolizidin
alkaloid trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi [1]. Hiện nay, chưa có phương pháp

chính thức để kiểm nghiệm độc tố PAs trong thực phẩm nói chung và các thảo dược
nói riêng. Do đó, đề tài “Nghiên cứu xác định hàm lượng một số độc tố pyrrolizidin
alkaloids trong thảo dược bằng sắc ký lỏng khổi phổ” đã được thực hiện với hai mục
tiêu như sau:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định hàm lượng một số độc tố PAs
trong thảo dược bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ.
2. Ứng dụng phương pháp để sơ bộ đánh giá mức nhiễm độc tố PAs trong một
số loại thảo dược, trà thảo dược trên thị trường.

1


CHƢƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về pyrrolizidin alkaloids
1.1.1. Khái quát về pyrrolizidin alkaloids
Pyrrolizidin alkaloids (PAs) là nhóm hợp chất chuyển hóa thứ cấp có mặt trong
khoảng 3% thực vật trên toàn thế giới, chủ yếu từ thực vật thuộc họ Mồ hôi
(Boraginaceae), ví dụ Heliotropium spp., họ Cúc (Asteraceae), ví dụ Senecio spp. và
họ Đậu (Fabaceae), ví dụ Crotalaria spp.
Về mặt cấu tạo hóa học, PAs là một nhóm các alkaloid có nguồn gốc từ ornithin
được phân bố trong một số loài thực vật có hoa. Chúng ít khi ở dạng tự do như một
base pyrrolizidin, thay vào đó được tìm thấy nhiều ở dạng ester (monoester, diester
hoặc macrocyclic diesters) hoặc pyrrolizidin alkaloids N–oxids (PANOs) [18].

Hình 1.1. Cấu trúc của PAs và các dạng khác nhau của nó
Nhân pyrrolizidin, bao gồm hai vòng năm cạnh bão hòa với một nguyên tử nitơ
ở giữa, có thể có một liên kết đôi ở vị trí 1,2, thường dẫn đến độc tính tăng cường. Cấu
trúc có thể xuất hiện một nhóm alcol tại C-1, một nhóm alcol ở vị trí C-7 (dihydroxylated) và trong một số ít trường hợp nhóm alcol thứ ba xuất hiện ở vị trí C-2
hoặc C-6 (tri-hydroxylated) [18].
Theo cấu trúc của base necin, PAs có thể được phân loại thành bốn nhóm:

retronecin, heliotridin, otonecin và platynecin (Hình 1.2) trong đó, duy chỉ có
platynecin được bão hòa ở vị trí C-1,2. Ngoài ra, từ đặc điểm cấu trúc, có thể thấy
otonecin là khác biệt nhất, vì bị oxy hóa ở C-8 và có một vòng đơn. Retronecin và

2


heliotridin là các đồng phân quang học không đối quang, với định hướng khác biệt ở vị
trí C-7 [18].

Hình 1.2. Các nhóm PAs phân loại theo base necin
Các base necin có thể được ester hóa bởi các acid béo đơn giản (như acid
angelic, acid tiglic), các monocarboxylic ở C-7 (acid trachelantic và viridifloric) hoặc
acid dicarboxylic ở C-10 (acid senecic và acid isatinecic) (Hình 1.3).

Hình 1.3. Cấu trúc của một số acid necic điển hình
Sự kết hợp của các cấu trúc nêu trên dẫn đến các dạng mono-ester hoặc diester. Trong các acid monocarboxylic (đặc trưng của họ Boraginaceae), một số có
nhóm hydroxyl ở C-9 được ester hóa bằng acid hydroxyisopropylbutanoic, chẳng hạn
như intermedin (Hình 1.4C). Trong trường hợp có một acid necic thứ hai, nó thường

3


xảy ra trong nhóm hydroxyl của C-7, dưới dạng acid angelic hoặc acid tiglic, như
trong echimidin (Hình 1.4A). Các thụ thể macrocyclic, đặc trưng từ họ Asteraceae,
cũng đã được mô tả, tương ứng với C-7 và C-9 được ester hóa bằng acid dicarboxylic,
chẳng hạn như jacobin (Hình 1.4B) hay seneconin (Hình 1.4D) [18]. Đây là các PAs
được quan tâm nhất hiện nay.

A. Echimidin

B. Jacobin

C. Intermedin

D. Seneconin
Hình 1.4. Một số PAs phổ biến

Cấu trúc của một PA bất kì có thể dẫn đến độc tính là [31]:
-

Sự có mặt của liên kết đôi ở vị trí C1-2 trong base necin.

-

Sự có mặt của nhóm hydroxyl ở vị trí C-7 và C-9 trong base necin.

-

Ester hóa của ít nhất một trong các nhóm hydroxyl trong base necin.

-

Ester hóa của nhóm hydroxyl với acid mono hoặc dicarboxylic.

Trong nghiên cứu này, 4PAs được lựa chọn là Echimidin, Jacobin, Intermidine
và Senecionin do cấu trúc hóa học của chúng dẫn độc tính tăng cường, xuất hiện phổ
biến trên thực vật và có thể gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Bên cạnh đó, sự
có sẵn chất chuẩn của 4 chất là một yếu tố thuận lợi cho nghiên cứu.
1.1.2. Nguồn thực vật chứa độc tố pyrrolizidin alkaloids

4


Mặc dù hơn 6000 loài thực vật được báo cáo có chứa PAs, nhưng gây trực tiếp
ngộ độc ở người và động vật thường chỉ liên quan đến một số loài nhất định. Cụ thể,
các loài thực vật được báo cáo là có liên quan đến ngộ độc ở người thường gặp ở 3 họ
thực vật gồm họ Cúc, họ Mồ hôi và họ Đậu, được nêu chi tiết trong bảng 1.1 [2].
Bảng 1.1. Các loài thực vật chứa PAs gây độc trên người và động vật
Họ
Asteraceae

Loài
Adenostyles alliariae (Gouan)Kern; Ageratum conyzoides L.;
Bidens pilosa L.;
Cacalia hastata L.; Cacalia hupehensis Hand-Mazz.; Chromolaena
odorata (L.) R. M. King & H.Rob.; Crassocephalum crepidioides (Benth.) S.
Moore;
Emilia sonchifolia(L.) DC.; Eupatorium cannabinum L.;Eupatorium
chinense L.; Eupatorium fortunei Turcz.; Eupatorium japonicum Thunberg ex
Murray.;
Farfugium japonicum (L.) Kitam.;
Gynura bicolor (Roxb. ex Willd.) DC.; Gynura divaricata (L.) DC.; Gynura
japonica (Thunb.) Juel; Gynura pseudochina (L.) DC.; Gynura segetum;
Ligularia dentata (A.Gray) Hara;
Matricaria chamomilla L.;
Packera candidissima (Greene) W. A. Weber; Petasites hybridus (L.) PH
Gaertn., B. Mey & Scherb.; Petasites japonicus (Siebold & Zucc.) Maxim.;
Petasites spurius (Retz) RCHB;
Senecio argunensis Turcz.; Senecio integrifolius (L.) Clairv.; Senecio

jacobaea; Senecio longilobus Benth.; Senecio nemorensis L.; Senecio scandens
Buch.-Ham. Ex D. Don; Senecio vulgaris L.; Solanecio mannii(Hook.f.) C.
Jeffrey; Solanecio tuberosus (Sch. Bip. ex A. Rich.) C. Jeffrey var. tuber;
Syneilesis aconitifolia (Bunge) Maxim.;
Tussilago farfara;

Boraginaceae

Alkanna tinctoria (L.) Tausch; Anchusa officinalis L.; Arnebia
benthamii (Wall. ex G.Don.) Johnst.; Arnebia euchroma (Royle) I. M.
Johnst.;
Borago officinalis L.;
Cordia myxa L.; Cynoglossum amabile Stapf & J. R. Drumm; Cynoglossum
grande Dougl. ex Lehm.; Cynoglossum lanceolatum Forssk.; Cynoglossum
officinale L.; Cynoglossum virginianum L.; Cynoglossum zeylanicum (Vahl)
Brand;
Heliotropium arborescens L.; Heliotropium indicum;

5


Lappula intermedia (Ledeb.) Popov; Lithospermum erythrorhizon Siebold &
Zucc.; Lithospermum officinale L.;
Myosotis scorpioidesL.;
Symphytum asperum Lepech; Symphytum caucasicum Bieb.; Symphytum
officinale L.; Symphytum tuberosum L.; Symphytum × uplandicum Nyman;
Fabaceae

Crotalaria albida Roth; Crotalaria assamica Benth.; Crotalaria
pallida Aiton; Crotalaria sessiliflora L.; Crotalaria tetragona.

Trong số này, một số loài thực vật sinh sống phổ biến ở Việt Nam gồm:
- Borago officinalis: Lưu ly, họ Mồ hôi Boraginacea.
- Crotalaria albida : Lục lạc sợi/ Muồng sợi, họ Đậu Fabaceae.
- Crotalaria assamica : Lục lạc lá ổi dài/ Muồng 1 lá, họ Đậu Fabaceae.
- Crotalaria pallida: Lục lạc 3 lá tròn/ Muồng lá tròn, họ Đậu Fabaceae.
- Crotalaria sessiliflora: Lục lạc lá ổi tròn/ Muồng lá ổi, họ Đậu Fabaceae.
- Crotalaria tetragona : Lục lạc 4 cạnh, họ Đậu Fabaceae.
- Heliotropium indicum: Vòi voi, họ Mồ hôi Boraginacea.
- Lithospermum erythrorhizon: Tử thảo, họ Mồ hôi Boraginacea.
- Senecico jacobaea: Cỏ lưỡi chó (Cúc dại), họ Cúc Asteraceae.
- Senecio vulgaris: Cúc bạc, họ Cúc Asteraceae.
- Symphytum officinalis: Liên mộc/ Hoa chuông, họ Mồ hôi Boraginacea.
- Tussilago farfara: Khoản đông hoa, họ Cúc Asteraceae.
Hàm lượng PAs trong thực vật thường thay đổi từ 100 mg/kg đến 40.000 mg/kg
(tính theo chất khô). Hàm lượng PAs cao nhất được ghi nhận là 180.000 mg/kg ở loài
Senecio riddelli [14]. Cả thành phần và nồng độ của PAs có thể dao động tùy theo điều
kiện môi trường khí hậu, độ tuổi và sự đa dạng của cây. Hơn nữa, các bộ phận khác
nhau của thực vật có hàm lượng PAs khác nhau, có thể có mặt chủ yếu ở dạng N-oxid.
Ví dụ, trong loài Senecio vulgaris và Senecio jacaobaea, các bộ phận được sắp xếp
theo nồng độ giảm dần của PAs là: hoa và hạt > lá > thân cây > rễ. Các nhà nghiên cứu
khác báo cáo rằng rễ của Symphytum officinale tập trung nhiều PAs hơn (từ 1.400 đến
8.300 mg /kg) so với lá (từ 15 đến 55 mg/kg) [26].
1.1.3. Độc tính của PAs
1.1.3.1. Nhiễm độc gan

6


Gan là cơ quan chính bị ảnh hưởng bởi các độc tố PAs, do hoạt động sinh học

chủ yếu xảy ra trong cơ quan này. Dấu hiệu ngộ độc có thể bao gồm nôn mửa, tổn
thương gan và tiêu chảy kèm chảy máu [8].
Ngộ độc PAs trên gan có thể xảy ra cấp tính hoặc mãn tính, với các triệu chứng
khác nhau. Nhiễm độc cấp tính có thể gây ra hoại tử xuất huyết, gan to và cổ trướng;
tắc nghẽn tĩnh mạch gan, dẫn đến tổn thương gan và rối loạn chức năng tế bào nhu mô.
Nhiễm độc mãn tính có thể gây ra hoại tử tế bào gan, xơ gan và sự gia tăng của biểu
mô ống mật; suy gan và tử vong là mức độ độc tính cao nhất [28].
1.1.3.2. Độc tính gen và ung thư
Một số nghiên cứu đã chứng minh PAs có khả năng gây độc tính gen trên động
vật thí nghiệm, có thể dẫn đến sự hình thành và phát triển các khối u. Năm 1954,
Schoental và cộng sự phát hiện ra rằng retrorsin có khả năng gây ra các khối u trong
các nghiên cứu thực nghiệm trên động vật [9]. Các khối u phát triển ở gan, phổi, bàng
quang, da, não, tủy sống, tụy và đường tiêu hóa. Các PAs gây ra tác dụng này thuộc
nhóm heliotridin, retronecin và otonecin.
Hơn nữa, các PAs có thể liên quan đến ung thư da, vì chúng dẫn đến tăng nhạy
cảm ánh sáng ở động vật. Phylloerythrin, một porphyrin có nguồn gốc từ sự phá hủy
chất diệp lục do vi sinh vật có trong đường tiêu hóa, đi qua tuần hoàn và được bài tiết
qua gan vào mật. Tuy nhiên, gan bị hư hại do PAs không thể loại bỏ phylloerythrin,
dẫn đến sự tích tụ của nó trong máu và da. Phylloerythrin tiếp xúc với ánh sáng mặt
trời, các chất chuyển hóa của nó có thể gây ra oxy hóa và peroxid hóa lipid trong các
mô da và cuối cùng kích thích sự hình thành các khối u [14].
Hiện nay, chưa có bất kỳ báo cáo nào về trường hợp ung thư ở người do hậu quả
trực tiếp của việc tiêu thụ thực phẩm nhiễm PAs. Tuy nhiên, với các nghiên cứu trên
các loài gặm nhấm, như việc gây ra các khối u gan thông qua sự tác động trên DNA,
chương trình độc học quốc gia ở Hoa Kỳ đã tuyên bố một số PAs được “dự đoán là
chất gây ung thư trên người” [30].
1.1.3.3. Các loại độc tính khác
Các PAs có thể gây các tổn thương khác trên hệ tuần hoàn (như suy tim sung
huyết), hệ thần kinh (như chóng mặt, đau đầu, có thể dẫn đến mê sảng và mất ý thức).
Ngoài ra, PAs có thể vượt qua hàng rào nhau thai và gây độc cho gan ở trẻ sơ sinh của

7


một người phụ nữ tiêu thụ trà thảo dược được chế biến từ loài Tussilago farfara L.
[8],[31].
1.1.4. Quy định hiện hành đối với PAs
Với sự tiêu thụ ngày càng tăng của các loại thuốc thảo dược, ngộ độc PAs đã bắt
đầu được coi là một vấn đề sức khỏe nghiêm trọng. Do đó, một số nước đã thiết lập
các quy định về kiểm soát hàm lượng PAs trong thực phẩm. Tại Hoa Kỳ, FDA đã ra
lệnh cấm tất cả các chế phẩm từ cây Liên mộc (Symphytum officinale L. Boraginaceae)
[30].
Tại Liên minh châu Âu, Cơ quan an toàn thực phẩm châu Âu (EFSA) đã khuyến
nghị sử dụng tối đa 0,35 µg PAs /ngày đối với người có trọng lượng 50 kg [15]. Áo đã
loại trừ tất cả các sản phẩm có PAs từ thị trường và ở Hà Lan, tất cả thực phẩm, chế
phẩm thảo dược và chiết xuất thực vật chứa PAs được giới hạn ở 1 µg/L trong sản
phẩm [32].
Tại Việt Nam, mới chỉ ban hành Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 12053:2017
(CAC/RCP 74-2014) của Bộ Khoa học và Công nghệ về quy phạm thực hành kiểm
soát cỏ dại để ngăn ngừa và giảm thiểu nhiễm pyrrolizidin alkaloid trong thực phẩm và
thức ăn chăn nuôi, chưa có quy định cụ thể nào giới hạn nồng độ pyrrolizidin trong
thực phẩm [1].
1.2. Phƣơng pháp xác định độc tố PAs
Hiện nay, có nhiều phương pháp có thể được sử dụng để xác định PAs trong thảo
dược như các phương pháp sàng lọc (ELISA, sắc ký lớp mỏng) hay các phương pháp
phân tính khẳng định như sắc ký khí; phương pháp sắc ký lỏng với detector UV, DAD,
FLD và MS. Bất kể phương pháp nào được lựa chọn, việc phân tích độc tố PAs trong
mẫu thường gồm 3 giai đoạn: chiết, làm sạch và xác định độc tố (định tính, định
lượng) [12].
1.2.1. Phương pháp chiết

Mục đích của việc chiết là thu được càng nhiều các PAs từ nền mẫu càng tốt vào
dung môi phù hợp. Việc chiết dung môi là sự chuyển các chất từ pha rắn vào pha lỏng
do đó còn được gọi là chiết rắn lỏng.
PAs là các hợp chất hữu cơ có bản chất tương đối phân cực. Do đó chúng hòa tan
khá tốt trong dung môi hữu cơ phân cực như methanol, acetonitril. Cả dạng base tự do

8


và N-oxid đều hòa tan dễ dàng trong methanol và cả trong acid loãng. Đây là những
dung môi được sử dụng nhiều nhất.
1.2.1.1. Chiết bằng dung môi hữu cơ
Nguyên liệu thực vật thường được ngâm trong methanol, đun sôi hoặc trộn đồng
nhất bằng cách sử dụng máy siêu âm [12]. MeOH có thể được acid hóa (ví dụ với acid
tartaric) [24]. Đôi khi, MeOH được kết hợp với CHCl3 để chiết các base PAs tự do từ
nguyên liệu thực vật, nhưng hiện nay việc sử dụng dung môi clor hóa gây ra những lo
ngại về ô nhiễm môi trường cũng như khả năng xảy ra phản ứng của acid hydrocloric
dư với các nhóm PAs epoxid [10], [17].
Lebanda và cộng sự [22] so sánh một số dung môi hữu cơ để chiết xuất senkirkin
và senecionin từ loài Tussilago spp. Hiệu suất cao nhất thu được khi chiết nóng 15
phút với tỉ lệ methanol : acid citric (pH 2) = 50:50. Sau đó cần khuấy ở nhiệt độ phòng
trong nước ở pH 7 và chiết Soxhlet với methanol trong 48 giờ. Tuy nhiên quá trình
chiết Soxhlet có thể làm mất PAs gây giảm hiệu suất đồng thời tăng thời gian chiết.
Bên cạnh đó, việc chiết xuất bằng MeOH nóng (100°C) trong một thời gian ngắn
(2 giờ) cũng cho hiệu suất tốt. Hiệu suất cao nhất của các alkaloid thu được khi chiết
bằng methanol nóng chứa 1% acid tartaric, nhưng cần loại bỏ acid trước khi phân tích
bằng HPLC [24].
1.2.1.2. Chiết bằng acid loãng
Một số nghiên cứu cụ thể sử dụng dung môi chiết bằng acid loãng được tổng
hợp trong bảng 1.2

Bảng 1.2. Một số phương pháp chiết sử dụng acid loãng
Tác giả
Crew và cộng

Nền mẫu

Dung môi chiết

Nguyên liệu H2SO4 hoặc HCl

Kết quả và bàn luận
Hiệu suất cao

sự [12]

thực vật

loãng

Hösch và cộng

Senecio

HCl 2,5%

sự [19]

leucophyllus

MeOH

khi chiết nóng [19]

Schuzl và cộng

Trà dược

sự [29]

liệu

H2SO4 0,05M

Hiệu suất cao

Joosten và

Mẫu thực

HCOOH 2%

Không có sự khác biệt khi sử dụng

cộng sự [20]

vật

H2SO4 0,25M

hai loại dung môi chiết này

Chiết với HCl 2,5% cho độ thu hồi
cao hơn, hiệu suất tốt nhất thu được

9


Mathon và

Mẫu thực

cộng sự [23]

vật

Griffin và

Trà dược

cộng sự [16]

liệu

LOQ 1 ng/mL; khoảng tuyến tính từ
H2SO4 0,05M

1 – 100 ng/mL; độ thu hồi từ 91 –
114 %

H2SO4 0,05M

LOD 0,4 µg/kg, LOQ 1,3 µg/kg

1.2.2. Phương pháp làm sạch
Bước làm sạch thường áp dụng cho các kỹ thuật phân tích khẳng định nhằm loại
trừ các ảnh hưởng của nền mẫu. Hơn nữa, làm sạch thường kèm theo quá trình làm
giầu mẫu do đó giảm được giới hạn phát hiện của phương pháp.
Chiết pha rắn (SPE) là kỹ thuật phổ biến nhất được áp dụng để làm sạch mẫu sau
khi chiết PAs từ nguyên liệu thực vật. Dịch chiết mẫu được đưa qua cột SPE đã được
hoạt hóa, chất phân tích được giữ lại trên cột, các tạp chất được rửa qua cột, sau đó sử
dụng dung môi có ái lực mạnh hơn với chất phân tích để rửa giải ra khỏi cột. Dịch rửa
giải có thể được cô đến cạn sau đó hòa cặn lại trong một dung môi thích hợp nhằm làm
giầu mẫu. Do các PAs có tính phân cực và độ tan khác nhau, nên khó lựa chọn được
một loại cột đặc hiệu cho tất cả các PAs.
Cột SPE loại đa cực (Ví dụ: HLB) (vừa có nhóm thân nước và thân dầu) được
một số nghiên cứu sử dụng để làm sạch khi phân tích PAs. Dịch chiết nước của các
PAs (không hòa tan trong dung môi hữu cơ) có thể được cho qua cột sau đó các PAs
được rửa giải bằng dung môi hữu cơ có bổ sung thêm amoniac. Khi áp dụng cho nền
mẫu mật ong, phương pháp cho kết quả tốt, tuy nhiên kết quả không lặp lại đối với
một số PA dạng diester và đã được thay thế bằng các phương pháp trao đổi cation
[12], [16].
Cột C8 hoặc C18 là cột chứa các pha tĩnh không phân cực như octylsilan hoặc
octadecylsilan (C8 hoặc C18). Hosch và cộng sự đã chứng minh rằng pha tĩnh C18 có
độ thu hồi tốt hơn so với pha tĩnh C8 [19]. Mroczek và cộng sự chỉ ra rằng việc sử
dụng chất hấp thụ C18 có thể rửa giải các tạp chất do tính đặc hiệu thấp [24].
Cột SPE trao đổi cation mạnh (SCX) là phương pháp phổ biến nhất sử dụng
polymer mạnh để cô lập cả các base tự do và N-oxid. Bằng việc sử dụng cột này, các
PA tự do và N-oxid của chúng có thể được phân lập đồng thời với năng suất cao, khả

10

năng làm sạch và tập trung mẫu [7]. Một số nghiên cứu cụ thể sử dụng cột SCX được
tổng hợp trong bảng 1.3
Bảng 1.3. Tổng quan một số nghiên cứu có sử dụng cột SPE SCX
Tác giả

Nền mẫu

Dung môi chiết

LOQ

Griffin [16]

Trà

H2SO4 0,05M

1,3 µg/kg

Betteridge [4]

Mật ong

H2SO4 0,05M

-

Zhou [33]

Thực vật

HCl 0,05 M

3,9 µg/kg

Dubecke [13]

Mật ong; Phấn ong

H2SO4 0,05M

1 µg/kg

Kempf [21]

Mật ong

H2SO4 0,05M

10 µg/kg

1.2.3. Phương pháp phân tích
Một số phương pháp có thể được sử dụng để định tính và định lượng PAs trong
nguyên liệu thực vật hoặc các chế phẩm của nó bao gồm ELISA, GC hoặc LC.
1.2.3.1. ELISA
Thông qua albumin huyết thanh bò, kháng nguyên liên kết enzyme (AG-E) được
tổng hợp và sử dụng để sản xuất của kháng thể (đa dòng cũng như đơn dòng) ở chuột.
Phương pháp này rất nhạy và không cần phải làm sạch phức tạp. Nhược điểm là chỉ áp

dụng được cho một chất hoặc một nhóm PAs có cấu trúc tương đồng [5], [27].
1.2.3.2. Sắc ký khí
Sắc khí khí với detector khối phổ hoặc NPD đã được một số tác giả nghiên cứu
để phân tích các PAs. Tuy nhiên, một vấn đề của kỹ thuật này là các PAs N-oxid phải
được khử thành các base tự do và dẫn xuất trước khi được phân tích [12].
Michael Kempf và cộng sự sử dụng phương pháp GC-MS để phân tích PAs trong
mẫu mật ong. Mẫu được chiết với H2SO4 0,05M, làm sạch qua cột SPE SCX, rửa giải
bằng NH4OH 6%/MeOH, làm giàu bằng thổi khô N2, sau đó dẫn xuất bằng 100 µL
LiAlH4 1M/THF trong 3 giờ ở nhiệt độ 4oC. Thêm 500 µL CH2Cl2 và 5 giọt NaOH
10% để dừng phản ứng. Mẫu tiếp tục được thổi khô và hòa cặn lại bằng 50 µL
MSTFA và phân tích trên GC-MS. Phương pháp có giới hạn định lượng 10 µg/kg, độ
thu hồi 83 ± 3% đối với các PAs [21].
11


Joosten và cộng sự sử dụng GC-NPD để phân tích PAs trong mẫu thực vật. Mẫu
được chiết với 15 mL H2SO4 0,1M trong 1 giờ, sau đó lọc lấy phần dịch và kiềm hóa
với 5 mL NH4OH và làm sạch qua cột Extrelut. Các PAs được rửa giải bằng 120 mL
CH2Cl2, sau đó thổi khô và hòa cặn, phân tích trên sắc ký khí. Phương pháp có giới
hạn định lượng 0,03 mg/g [20].
1.2.3.3. Sắc ký lỏng khối phổ
Sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) đã được sử dụng rất phổ biến do khả
năng xác định đồng thời các PAs trong cùng một quy trình chiết, làm sạch và định
lượng. LC-MS/MS có nhiều ưu điểm vượt trội như độ nhạy tốt, độ đặc hiệu cao, thời
gian phân tích nhanh, xử lý mẫu không quá phức tạp như sắc ký khí đã được nhiều tác
giả nghiên cứu để xác định PAs trong các nền mẫu. Bảng 1.4 giới thiệu một số nghiên
cứu xác định PAs bằng LC-MS/MS.
Bảng 1.4. Một số nghiên cứu xác định PAs bằng LC-MS/MS
Tác giả

Bodi [6]

Nền mẫu

Số lƣợng PAs

Trà, thảo dược,
thuốc, mật ong

Kỹ thuật
LC-MS/MS

17

ESI (+)

LOQ
0,18-6,4
µg/kg

Dubecke [13]

Mật ong, phấn hoa

14

ESI (+)

1,0-3,0 µg/kg

Joosten [20]

Thực vật

25

ESI (+)

1,0-2,0 µg/kg

Zhou [33]

Thực vật

7

ESI (+)

3,9 µg/kg

Mudge [25]

Thực vật, mật ong

5

ESI (+)

1,2-1,8 µg/kg

Griffin [16]

Mật ong

14

ESI (+)

1,3-6,3 µg/kg

Crews [11]

Mật ong

5

APCI (+)

6,0 µg/kg

Beales [3]

Mật ong

15

APCI (+)

-

Có thể thấy rằng, phần lớn các nghiên cứu sử dụng nguồn ion hóa phun điện tử
(ESI) ở chế độ ion dương để xác định đồng thời nhiều PAs trong cùng một lần phân
tích. Nguồn ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI) cũng được sử dụng nhưng có
giới hạn định lượng cao hơn, hơn nữa APCI ít thông dụng hơn.
Trong nghiên cứu này, sắc ký lỏng khối phổ hai lần với nguồn ESI đã được sử
dụng để khảo sát các điều kiện xác định các PAs trong thảo dược hướng đến đạt được
độ nhạy đáp ứng yêu cầu của châu Âu (1 µg/kg).

12


CHƢƠNG II. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là 4 loại độc tố PAs được trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.1.Các độc tố PAs được sử dụng trong nghiên cứu
Độc tố PAs

TT

Ký hiệu

Công thức

Khối lƣợng

phân tử

phân tử

1

Senecionin

Sn

C18H25NO5

335

2

Echimidin

Em

C20H31NO8

413

3

Intermidin

Im

C15H25NO5

299

4

Jacobin

Jb

C18H25NO6

351

Đối tượng phân tích là 1 số thảo dược và trà thảo dược dạng túi lọc có trên thị trường.
2.2. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.2.1. Thiết bị, dụng cụ
2.2.1.1. Thiết bị
-

Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ gồm sắc ký lỏng HPLC LC20AD-XR của
Shimadzu và khối phổ ABSciex Triple Quad 5500.

-

Máy đồng nhất mẫu, Phillips.

-

Hệ thống chiết pha rắn SPE, Waters.

-

Cân phân tích (có độ chính xác 0,1 mg), Metter Toledo.

-

Máy lắc xoáy, IKA.

-

Máy ly tâm Mikro 200R, Hettich.

-

Máy rung siêu âm.

2.2.1.2. Dụng cụ
-

Cột chiết pha rắn SPE SCX, Supelco.

-

Micropipet có thể tích điều chỉnh được 20-200µL, 100-1000µL, 1000-5000 µL.

-

Bình định mức: 10, 50 mL.

-

Ống ly tâm 50 mL.

-

Vial loại 1,8 mL.

-

Màng lọc mẫu 0,22 µm.
13


2.2.2. Dung môi, hóa chất
Các loại hoá chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích.
-

Methanol (Merck)

-

Acetonitril (Merck)

-

Acid formic (Merck)

-

Acid sulfuric 98% (Merck)

-

Amoni hydroxid (Merck)

-

Nước cất hai lần.

2.2.3. Chất chuẩn
-

Chuẩn Jb 5 mg, PhytoLab (Đức), số lô 83434, độ tinh khiết 99,5%.

-

Chuẩn Em 10 mg, PhytoLab (Đức), số lô 89553, độ tinh khiết 99,5%.

-

Chuẩn Im 10 mg, PhytoLab (Đức), số lô 82424, độ tinh khiết 99,5%.

-

Chuẩn Sn 10 mg, PhytoLab (Đức), số lô 89789, độ tinh khiết 99,5%.

2.2.4. Chuẩn bị dung dịch chuẩn
-

Chuyển toàn bộ mỗi chất chuẩn vào bình định mức 10 mL, định mức tới vạch
bằng MeOH, lắc đều, thu được các dung dịch chuẩn gốc jacobin 500 µg/mL,
echimidin 1000 µg/mL, intermidin 1000 µg/mL, senecionin 1000 µg/mL. Bảo
quản ở -3oC – -8 oC, sử dụng trong 1 năm.

-

Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 10 µg/mL: hút mỗi dung dịch chuẩn gốc
theo bảng 2.2 vào bình định mức 10 mL, định mức tới vạch bằng MeOH, lắc
đều. Bảo quản ở -3oC – -8 oC, sử dụng trong 1 tháng.
Bảng 2.2. Dung dịch chuẩn trung gian
Tên chất
Vdd chuẩn gốc (µL)

-

Jb

Em

Im

Sn

200

100

100

100

Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 1 µg/mL: hút 1 mL dung dịch chuẩn trung
gian hỗn hợp 10 µg/mL vào bình định mức 10 mL, định mức tới vạch bằng
MeOH, lắc đều. Bảo quản ở -3oC – -8 oC, sử dụng trong 1 tuần.

-

Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 100 ng/mL: hút 1 mL dung dịch chuẩn
trung gian hỗn hợp 1 µg/mL vào bình định mức 10 mL, định mức tới vạch bằng
MeOH, lắc đều. Pha mới khi sử dụng.

-

Dãy dung dịch chuẩn làm việc: pha dung dịch chuẩn làm việc theo bảng 2.3.

14


Bảng 2.3. Dung dịch chuẩn làm việc của PAs
1

2

5

10

20

40

ng/mL

ng/mL

ng/mL

ng/mL

ng/mL

ng/mL

Vdd chuẩn 100 ng/mL (µL)

10

20

50

100

200

400

VMeOH

990

980

950

900

800

600

Nồng độ chuẩn

2.3. Nội dung nghiên cứu
2.3.1. Khảo sát các điều kiện phân tích
-

Khảo sát điều kiện khối phổ: tìm các điều kiện tối ưu của MS để xác định ion
mẹ; lựa chọn các ion con phù hợp.

-

Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng: so sánh hiệu lực tách giữa các cột tách C18 và
TSK Gel; khảo sát điều kiện gradient.

2.3.2. Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu
-

Khảo sát dung môi chiết.

-

Khảo sát nồng độ dung môi chiết.

-

Khảo sát nhiệt độ chiết mẫu.

-

Khảo sát các bước làm sạch bằng SPE.

2.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích
-

Độ đặc hiệu.

-

Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lượng LOQ.

-

Khoảng tuyến tính và đường chuẩn các chất phân tích.

-

Độ lặp lại và độ thu hồi

2.3.4. Đánh giá hàm lượng độc tố PAs trong thảo dược có trên thị trường
-

Lấy mẫu tại địa bàn Hà Nội.

-

Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để phân tích mẫu và đánh giá kết quả.

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp xử lý mẫu
* Chuẩn bị mẫu sơ bộ:
Mỗi mẫu lấy tối thiểu 20 – 50 g, xay nghiền nhỏ bằng máy đồng nhất mẫu.
* Quy trình chiết dự kiến [16]
-

Cân chính xác khoảng 2,5 g mẫu vào ống ly tâm 50 mL.

-

Chiết với 15 mL dung dịch H2SO4 0,05M.

-

Lắc xoáy trong 1 phút, sau đó lắc ngang hoặc siêu âm trong 30 phút, 70oC
15


-

Ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút.

-

Dung dịch phía trên được gạn vào bình định mức 25 mL.

-

Chiết lặp lần 2 với 10 mL H2SO4 0,05M.

-

Gộp dịch, định mức tới vạch bằng H2SO4 0,05M.

-

Lấy 5 mL mẫu làm sạch qua cột SPE SCX

-

Thổi khô bằng khí N2, hòa cặn 1 mL MeOH.

-

Lọc qua màng lọc mẫu 0,22 µm.

-

Phân tích trên LC-MS/MS.

2.4.2. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS)
- Sử dụng hệ thống thiết bị sắc ký lỏng khối phổ hai lần LC - MS/MS
- Mỗi chất phân tích lựa chọn 1 ion mẹ và 2 ion con, ion có cường độ cao hơn được
sử dụng để định lượng, ion có cường độ thấp hơn để định tính.
2.4.3. Phương pháp thẩm định.

2.4.3.1. Độ đặc hiệu
Độ đặc hiệu của phương pháp được đánh giá thông qua so sánh phổ của các chất
phân tích trên 3 loại mẫu: mẫu trắng (mẫu âm tính), mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm
chuẩn ở cùng nồng độ 10µg/kg. Mẫu trắng không được lên tín hiệu chất phân tích,
mẫu trắng thêm chuẩn phải có tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng thời
gian lưu trên mẫu chuẩn.
Ngoài ra, tính chọn lọc còn được khẳng định bằng số điểm nhận dạng và tỷ lệ các
ion theo tiêu chuẩn EC657/20002 của Châu Âu.
2.4.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
LOD, LOQ được xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu nhiễu đường (S/N): Phân tích
mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. Xác
định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio).
LOD là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu (S/N = 3).
LOQ là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu (S/N = 10).
2.4.3.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Để xác định khoảng tuyến tính, thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ
thay đổi từ 1 đến 40 µg/kg và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ. Sau đó
vẽ đường cong phụ thuộc giữa diện tích pic thu được vào nồng độ, quan sát sự phụ
thuộc cho đến khi không còn tuyến tính

16