điều tra, nghiên cứu tảo độc gây hại ở một số vùng nuôi trồng thuỷ sản tập trung ven biển, đề xuất giải pháp phòng ngừa, giảm thiểu những tác hại do chúng gây ra - hàm lượng một số độc tố vi tảo trong nghêu meretrix lyrata và

Viện khoa học và công nghệ việt nam
Viện hải dơng học
=========000=========


Đề tài cấp nhà nớc kc-09-19

Điều tra, nghiên cứu tảo độc, tảo gây hại ở một số vùng
nuôi trồng thuỷ sản tập trung ven biển, đề xuất giải pháp
phòng ngừa, giảm thiểu những tác hại do chúng gây ra

Chủ nhiệm đề tài: TS. Chu Văn Thuộc



Báo cáo chuyên đề
hàm lợng một số độc tố vi tảo trong nghêu và
vẹm xanh tại một số khu vực nuôi trọng điểm
miền trung và nam việt nam

Ngời thực hiện:
đào việt hà
viện hải dơng học




6132-18
02/10/2006

nha trang 12/2004
HÀM LƯỢNG MỘT SỐ ĐỘC TỐ VI TẢO TRONG NGHÊU MERETRIX
LYRATA VÀ VẸM XANH PERNA VIRIDIS TẠI MỘT SỐ KHU VỰC
NUÔI TRỌNG ĐIỂM MIỀN TRUNG VÀ NAM VIỆT NAM

Đào Việt Hà – Viện Hải Dương Học

MỞ ĐẦU

Gần đây, việc nuôi trồng thủy sản nói chung và nuôi các loài hai mảnh vỏ
nói riêng đã và đang phát triển rầm rộ ở nhiều địa phương ven biển nứơc ta.
Điều này đã đóng góp vào việc phát triển ngành kinh tế biển, phục vụ cho nhu
cầu thị trường tiêu thụ trong và ngoài nước, tăng thêm thu nhập, cải thiện đời
sống cho nhiều hộ cư dân ven biển. Tuy nhiên, việc khai thác quá mức nguồn lợi
hải sản ven bờ, phát triển nghề nuôi trồng thủy sản không theo qui hoạch, phát
triển du lịch không bền vững, phát triển giao thông vận tải biển, công nghiệp,
khu dân cư ven biển… mà không có các qui hoạch hợp lý cũng như các biện
pháp quản lý hữu hiệu của nhà nước về môi trường sẽ làm môi trường biển ngày
càng bị suy thoái. Những hoạt động tự phát của nghề nuôi trồng biển là một
trong những tác nhân chủ yế
u gây ô nhiễm môi trường - Các chất thải hữu cơ từ
nguồn thức ăn dư thừa có thể chứa các mầm bệnh, các hóa chất (và các sản
phẩâm sinh học khác được sử dụng trong quá trình nuôi) cũng là một trong
những nguyên nhân dẫn đến sự ô nhiễm, tạo điều kiện cho sự xuất hiện và bùng
nổ của các loài vi tảo độc hại. Trong trường hợp này, các loài thân mềm hai
mảnh vỏ là đố

i tượng trung gian chính để gây ra hiện tượng ngộ độc do các độc
tố tảo ở con người và các sinh vật bậc cao khác (chim biển, thú biển…)
(Shumway, 1990; Shumway et al., 1995; Bricelj & Shumway, 1998 ;
Thorarinsdottir, 1998 ). Đồng thời, sự bùng nổ của các loài vi tảo độc hại còn
gây ra những hậu quả xấu cho hệ sinh thái biển, là nguyên nhân dẫn đến cái
chết hàng loạt của một số loài tôm, cá biển (Tufts, 1979)…
Hiện nay, ở nước ta, kiểm định chất lượng hai mảnh vỏ về m
ặt độc tố vi tảo
mới chỉ được tiến hành đối với một số lô hàng xuất khẩu nhất định. Việc nghiên
cứu, điều tra sự có mặt, tích lũy của những độc tố vi tảo nguy hiểm (độc tố PSP,
DSP, ASP) có mặt trong đối tượng hai mảnh vỏ chưa được theo dõi một cách
định kỳ tại các khu vực nuôi. Do đó, đây là một trong những nghiên cứu bước
đầu tập trung theo dõi hàm lượng các độc tố vi tảo trong loài Nghêu (Meretrix
lyrata) và Vẹm xanh Perna viridis – Là những loài có giá trị và sản lượng xuất
khẩu khá cao tại các tỉnh miền Trung và Nam nước ta, nhằm góp phần cung cấp
những dẫn liệu khoa học cho các nhà quản lý biển, nhằm tránh những thiệt hại
kinh tế và góp phần bảo đảm an toàn sức khỏe cộng đồng.




I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Các loài vi tảo độc hại có thể chia thành 03 nhóm khác nhau: Nhóm thứ nhất có
khả năng sản sinh các độc tố có thể tích lũy trong các sinh vật biển hoặc làm
chết cá. Nhóm thứ hai là các loài có khả năng phát triển với mật độ tế bào cao,
dẫn đến hiện tượng thiếu oxygen cho nhiều sinh vật khác. Nhóm thứ ba bao gồm
một số loài vi tảo có cả hai khả năng trên.
Một trong những tác hại chính từ sự
nở hoa của các loài vi tảo là chúng gây ra

hiện tượng ngộ độc ở con người thông qua việc tiêu thụ các sinh vật hai mảnh
vỏ. Trong trường hợp này, có thể chỉ cần mật độ tế bào tảo khá thấp cũng có thể
dẫn đến biểu hiện bệnh lý hoặc tử vong của con người. Các loài hai mảnh vỏ
như sò, vẹm, hàu hoặc điệp là bọn ăn lọc trực tiếp các loài vi tảo trong
đó có các
loài vi tảo độc, bằng con đường này, chúng có khả năng tích lũy độc tố vi tảo
trong cơ thể với một thời gian dài nhưng không hế gây ra hiệu ứng độc với bản
thân chúng. Nhưng các độc tố được tích lũy này lại là một mối nguy hại lớn cho
con người hoặc các sinh vật khác khi tiêu thụ hai mảnh vỏ bị nhiễm độc tố
(Thorarinsdottir 1998).
Dựa vào biểu hiện khi ngộ độ
c, các độc tố được đặt tên là paralytic, diarrhetic,
neurotoxic and amnesic shellfish poisoning (PSP, DSP, NSP and ASP). Ngoài
ra, một loại độc tố khác-ciguatera fish poisoning (CFP) sản sinh từ một số loài
tảo giáp sống bám đáy trên bề mặt cửa nhiều quần xã san hô.

1. Nguồn gốc, bản chất và hiệu ứng sinh học của độc tố vi tảo
Dựa theo các triệu chứng ngộ độc lâm sàng, các độc tố vi tảo này được đặt tên
như sau:
Độc tố gây tê liệt (Paralytic Shellfish Poisoning – PSP).
Độ
c tố gây tiêu chảy (Diarrhetic Shellfish Poisoning – DSP).
Độc tố gây mất trí nhớ tạm thời (Amnesic Shellfish Poisoning – ASP).
Độc tố gây tắc nghẽn kênh trao đổi ion Na
+
của tế bào thần kinh (Neurotoxic
phenomena – NSP và Ciguateric fish poisoning – CFP)

1.1. Độc tố gây tê liệt (Paralytic shellfish poisoning - PSP):
PSP là hiện tượng ngộ độc của con người gây ra do tiêu thụ các sinh vật có vỏ

(chủ yếu là bọn hai mảnh vỏ -HMV) đã bị nhiễm độc tố của các loài vi tảo (chủ
yếu là bọn tảo giáp thuộc các giống như Alexandrium, Pyrodinium, và
Gymnodinium) (Hashimoto & Noguchi 1989). Ngoài ra, một số loài tảo lam
sống nước ngọt {Carmichael, Ahmood, et al. 1990 ID: 38}, tảo calcareous red
macroalgae và có thể một số loài vi khuẩ
n biển {Kodama, Ogata, et al. 1990 ID:
39} cũng sản sinh loại độc tố thần kinh này. Độc tố PSP không chỉ tìm thấy ở
trong các sinh vật HMV ăn lọc mà còn ở cả cua, ốc, cá ngừ và các loài cá ăn
thực vật khác nữa.
Độc tố PSP có bản chất là Saxitoxin và khoảng hơn 20 dẫn xuất - Các hợp chất
này tan trong nước và hầu hết đều bền nhiệt (Baden et al. 1993). Saxitoxin và
các dẫn xuất khác phong bế kênh Na
+
của tế bào thần kinh, ngăn cản sự truyền
xung thần kinh và do đó chúng gây ảnh hưởng đến cả hoạt động thần kinh và
các phản ứng của hệ cơ (Baden et al. 1993).
Triệu chứng ngộ độc thường xuất hiện khoảng 5 –90 phút sau khi ăn, với cảm
giác ban đầu là bỏng rát ở lưỡi và miệng, lan toả đến vùng hầu và cổ họng; ngứa
và đau như kim chích ở đầ
u ngón tay, ngón chân. Tiếp theo đó là cảm giác nhức
đầu, chóng mặt, buồn nôn, nôn và có thể tiêu chảy. Trong trường hợp nghiêm
trọng, quá trình liệt cơ xuất hiện, đặc biệt biểu hiện rõ nhất là liệt cơ hô hấp gây
ra triệu chứng phát âm và hô hấp khó khăn. Nạn nhân ngộ độc nặng có biểu
hiện như bị kích động và hiện tượng tử vong do liệt cơ hô hấp có thể xảy ra
trong vòng 2-24 giờ sau khi ăn. Tỉ l
ệ tử vong gây ra do độc tố PSP là khoảng 1-
14%, có thể lên tới 20% nếu như không được cấp cứu kịp thời. Tuy nhiên, biện
pháp chữa trị chỉ là hỗ trợ hô hấp, tăng cường sức chống chịu của người bệnh.
Giới hạn an toàn của độc tố PSP là 80 µg/100 g thịt HMV (Ở hầu hết các quốc
gia trên thế giới), hoặc 40 µg/100 g (ở Philippine, Đức){Hallegraeff 1995 ID:

1}.

1. 2. Độc tố
gây tiêu chảy (Diarrhetic shellfish poisoning - DSP):
Độc tố DSP gây nên triệu chứng ngộ độc ở hệ tiêu hóa, độc tố này có nguồn gốc
từ bọn vi tảo giáp sống trôi nổi hoặc sống đáy, phần lớn thuộc giống Dinophysis
và giống Prorocentrum (Yasumoto, wt.al. 1985), Lee et. al. 1989). Độc tố DSP
là chuỗi polyether tan trong chất béo(QUlliam & Wright 1995). Độc tố này bao
gồm các nhóm Okadaic acid (OA), dinophysistoxin (DTX 1, 2, 3),
pectenotoxins (Yasumoto et al. 1985) và nhóm yessotoxin (Murata et al. 1987).
Okadaic acid là chất ức chế serin/threonine phosphatase, là nhóm enzyme quan
trọng, cần thiết, có mối tương quan chặt chẽ v
ới nhiều quá trình trao đổi chất
chủ yếu trong tế bào, Và vì vậy, sự rối loạn của các enzyme phosphatase này
thông qua sự tăng quá trình phosphoryl hóa sẽ ảnh hưởng đối với hàng loạt các
quá trình chuyển hóa tiếp theo (Bialojan &Takai 1988, Haystead et al. 1989)
gây ra sự rối loạn tiêu hóa ở dạ dày và ruột. Ngoài ra, pectentoxin (PTX 1- 4)
gây hoại tử gan, yessentoxin (YTX) ảnh hưởng cơ tim. Đáng chú ý là sự nhiễm
độc lâu dài có thể là tác nhân kích thích sự phát triển của các tế bào u, ung thư
của hệ tiêu hóa.
Các triệu ch
ứng ngộ độc ở người thường xuất hiện khoảng 30 phút đến vài giờ
sau khi ăn, bao gồm đau như bị chuột rút ở vùng bụng, tiêu chảy, nôn mửa – Và
thường hồi phục sau 3 ngày. Ở liều 14 MU, độc tố này gây ra ngộ độc nhẹ cho
người, xác suất các triệu chứng ngộ độc là tiêu chảy 92%, buồn nôn 80%, nôn
mửa 79% và đau thắt vùng bụng 53%. Liều tối thiểu gây tiêu ch3y ở người lớn
của okadaic acid và DTX-1 là khoảng 40 đến 36 µg. Tiêu chuẩn an toàn đối với
độc tố DSP trong sinh vật có vỏ có thể từ mức độ không thể phát hiện được
(Denmark, Germany, Italy, The Netherlands, Spain, và Portugal) cho đến 20
µg/100 g thịt hoặc 2 µg/100 g nội quan (Japan, Korea, and Norway), hoặc 40-

60 µg/100 g ở Sweden (Hallegraeff, 1995).

1.3. Độc tố gây mất trí nhớ tạm thời (Amnesis shellfish poisoning – ASP):
ASP là triệu chứng ngộ độ
c của người khi tiêu thụ hai mảnh vỏ bị nhiễm độc tố
domoic acid từ các loài tảo silic thuộc giống Pseudo-nitzchia. Domoic acid là
một hợp chất bền nhiệt, tan trong nước, nhưng lại không bền pH,ï có tính chất
đặc trưng của nhóm amino acid.
Domoic acid hoạt động như một chất cạnh tranh mạnh mẽ của glutamic acid - nó
bịt kín điểm tiếp nhận glutamate của tế bào thần kinh với ái lực hóa học rất
mạnh . Triệu chứng ngộ độc ở người thường gặp 4 h sau khi ăn (hoặc có thể sau
72h) bao gồm buồn nôn, nôn mửa, rối loạn dạ dày, chảy máu dạ dày và tiêu chảy
(Triệu chứng ở hệ tiêu hóa). Tiếp theo là các triệu chứng ngộ độc thần kinh như
chóng mặt, yếu, nhầm lẫn, ngủ lịm đi, hôn mê, lên cơn, và hội chứng mất trí nhớ
tạm thời (Quilliam & Wright, 1995). Giới hạn an toàn
đối với domoic acid là 20
µg/g mô (Hallegraeff, 1995).
1. 4. Độc tố thần kinh (Neurotoxic shellfish poisoning – NSP):
NSP (đôi khi còn gọi là BSP-Brevetoxin shellfish poisoning) là hiện tượng ngộ
độc bởi các loài hai mảnh vỏ nhiễm độc tố từ loài vi tảo Gymnodinium breve.
Loài vi tảo này là tác nhân gây ra cái chết của hàng loạt cá, sự nhiễm độc của
các sinh vật có vỏ mà nếu ăn phải chúng, con người sẽ bị ngộ độc NSP. Ngoài
ra, loài vi tảo này còn có thể gây ra triệu chứng giống như là hen suyễn cho
người n
ếu như hít phải.
Độc tố NSP là hợp chất polyether vòng tan trong chất béo, được phân ra làm 2
dạng cấu trúc chính gồm 9 hợp chất khác nhau (Shimizu et al. 1986). Độc tố
NSP gây hiệu ứng độc do sự gắn kết của nó tại vị trí đặc biệt (vị trí số 5) trên
kênh trao đồi Na
+

gây ra sự hoạt hóa làm tăng dòng ion Na
+
dẫn đến hiện tượng
kích hoạt tế bào, làm tăng dòng ion Na
+
đi vào tế bào, dẫn đến phá vỡ cân bằng
điện giải.
Độc tố này vượt trội hơn tất cả các độc tố biển khác về liều chết đối với chuột
thí nghiệm (0.13 µg/kg) và chúng tác động đến hệ thống miễn dịch của cơ thể.
Triệu chứng ngộ độc ở người bao gồm ngứa và nóng rát ở môi, lưỡi, họng và
hầu, đ
au nhức cơ, rối loạn dạ dày và chóng mặt, hoa mắt. Thường sự ngộ độc
này không dẫn đến tử vong, các triệu chứng thường bắt đầu và kéo dài trong vài
giờ hoặc vài ngày. Giới hạn an toàn cho brevetoxins là 80 µg/100 g hai mảnh vỏ
ở tất cả các quốc gia trên thế giới (Hallegraeff, 1995).

1. 5. Độc tố CFP (Ciguateric fish poisoning):
CFP là hội chứng ngộ độc cấp tính ở người do ăn phải các loài cá sống ở rạn san
hô và quanh các đảo có tích lũy độc tố từ bọn vi tảo sống rặng như
Gambierdiscus toxicus và một số loài tảo sống đáy khác. Độc tố CFP là chuỗi
polyether vòng có thể tan trong nước (nhóm Maitotoxins) hoặc tan trong lipid
(nhóm Ciguatoxins). Nhóm độc tố tan trong nước gây ra sự mở kênh Na
+
nên
tăng cường tính thấm của màng đối với ion Na
+
; ảnh hưởng đến dạ dày, thần
kinh và tim mạch. Nhóm không tan trong nước (CTX và những dẫn xuất) tạo
ảnh hưởng lên kênh Ca
++

trên màng tế bào, dẫn đến sự co thắt cơ trơn màng ruột
(Murata et al. 1991).

2. Sự tích lũy sinh học:
Nhiều loài vi tảo đã được khẳng định hoặc nghi ngờ là nguồn gốc sinh ra các
độc tố. Hầu hết các loài vi tảo độc này sống trong môi trường biển và nước lợ,
thuộc ngành tảo giáp; ngoài ra, tảo si líc, tảo đỏ, tảo xanh lam và tảo roi bám
cũng có thể chứa độc tố. Các độc t
ố vi tảo có thể gây nguy hại trực tiếp cho hệ
thực vật và hệ động vật khác, hoặc chúng có thể tích lũy trong các sinh vật thông
qua chuỗi thức ăn như hai mảnh vỏ, bọn cá xương, và thông qua đó sẽ gây nguy
hại cho các loài động vật ăn thịt trong đó bao gồm cả con người. (Backer et al.
2003, Hallegraeff 2003, Landsberg 2002).
Hàm lượng độc tố cao nhất trong tế bào tảo có thể bắt gặp ở các giai đoạn sinh
trưởng khác nhau ở các loài tảo khác nhau. Ví dụ như ở một loài tảo giáp
Alexandrium, hàm lượng độc tố cao nhất là ở giai đọan tăng trưởng hàm số mũ
(Cembella 1998 và các tài liệu trích dẫn liên quan), trong khi đó, ở tảo si líc
Pseudo-nitzschia, độc tố đựơc sản sinh chủ yếu ở giai đoạn ổn định (Bates 1998,
and references therein). Ngoại trừ trường hợp đặc biệt, dường như tế bào tảo của
loài Prorocentrum cordatum chỉ
độc ở giai đoạn sau ổn định và giai đoạn tàn
lụi.
Mặt khác, trong cùng một loài tảo nhưng chúng có thể rất độc, độc, hoặc không
độc, tùy theo phân bố tại các vùng địa lý khác nhau, ví dụ như ở các loài tảo
giáp Alexandrium (Cembella 1998), Gynodinium catanetum (Oshima et al.
1993), và các loài tảo si líc Pseudo-nitzchia (Bates et al. 1998). Chính vì vậy,
những loài được bắt gặp trong khảo sát hiện nay tại vùng biển ven bờ Việt Nam,
mặc dù chúng được coi là loài độc ở nh
ững vùng biển khác nhưng không thể
khẳng định là loài độc tại Việt Nam– Ở đây sẽ gọi là những loài có khả năng gây

độc. Một vài loài đã được kiểm chứng là loài độc, và cần phải có những nghiên
cứu tiếp tục để xác định rõ những loài nào trên thực tế thực sự độc ở vùng biển
Việt Nam.
Con đường chính mà độc tố vi tảo có thể gây ảnh hưởng cho con người và
các sinh v
ật biển bậc cao khác (chim biển, thú biển…) là sự tích lũy trong
nhuyễn thể (chủ yếu là các loài hai mảnh vỏ) và một số sinh vật khác như cua,
cá ăn thực vật. Các sinh vật nhuyễn thể sử dụng các vi tảo (trong đó có thể có
các loài vi tảo độc) như là nguồn thức ăn chính của chúng trong tự nhiên và tích
lũy độc tố mà không hề có biểu hiện bệnh lý nào. Nhưng khi con người và các
sinh vật bậc cao khác ăn phải những loài nhuyễn thể đã tích lũy một hàm l
ượng
độc tố nhất định nào đó, sẽ có triệu chứng nhiễm độc và có thể dẫn đến tử vong.
Hàm lượng độc tố tích lũy trong các loài nhuyễn thể cũng rất khác nhau, phụ
thuộc vào khả năng tích lũy, lưu giữ và tốc độ đào thải của từng loài. Theo
Bricilj & Shumway (1998) và Shumway (1994), tốc độ tích lũy độc tố của các
loài nhuyễn thể ăn lọc có liên quan đến số lượ
ng tế bào vi tảo thích hợp với
chúng; trong khi đó, tốc độ đào thải độc tố này lại phụ thuộc vào bộ phận mà
chúng lưu giữ độc tố trong cơ thể. Ví dụ như độc tố được tích lũy trong hệ tiêu
hóa (như ở giống vẹm Mytilus) sẽ được đào thải nhanh hơn độc tố lưu giữ trong
các mô cơ (như ở các giống Placopecten,
Spisula, Saxidomus). Trong các loài
hai mảnh vỏ, vẹm (Mytilus spp., Modiolus spp., Perna spp…) được xem như là
nhạy cảm nhất với độc tố PSP không chỉ ở khả năng tích lũy nhanh mà còn ở
khả năng tự đào thải nhanh (trong khoảng 2 tuần) so với các loài khác. Do đó,
vẹm xanh (Mytilus edulis, Perna viridis) được dùng làm sinh vật chỉ thị trong
chương trình giám sát môi trường về tảo độc ở hầu hết các quốc gia trên th
ế
giới. Trong khi đó, một số loài sò và hàu lại có khả năng lưu giữ độc tố rất lâu

trong các mô của cơ thể (có thể đến 2 năm) (Shumway & Cembella, 1993;
Shumway, 1994). Nhìn chung, khả năng tích lũy độc tố phụ thuộc vào đặc điểm
sinh học và cơ chế trao đổi chất của từng loài cũng như từng cá thể trong loài.
Ngoài ra, điều kiện sống của sinh vật cũng đóng vai trò quan tr
ọng trong quá
trình tích lũy độc tố.
Sự tiêu thụ các hải sản đã bị nhiễm độc tố vi tảo có thể gây ra hàng loạt các
triệu chứng hệnh lý về hệ tiêu hóa hoặc hệ thần kinh ở người. Hiện nay, không có
thuốc giải đặc hiệu cho việc ngộ độc từ độc tố vi tảo, nhưng việc cung cấp các
thiết bị hô hấp nhân tạo có thể cứu sống nhi
ều nạn nhân trong trường hợp ngộ độc
PSP, hay việc dùng mannitol cũng làm giảm nhẹ các triệu chứng trong trường hợp
ngộ độc CFP (Hallegraeff 2003).
Một điều rất quan trọng là các độc tố tảo không hề gây ra bất kỳ mùi
vị khác lạ nào trong đối tượng hản sản khi chúng ta ăn phải, do đó, ngư dân
hoặc người tiêu thụ không thể nào phát hiện ngay lập tức sự có mặt của
chúng mà ch
ỉ có thể phát hiện bằng các phương pháp thử nghiệm sinh học
hoặc phân tích hóa học. Mặt khác, các độc tố tảo không bị phá hủy trong
qúa trình nấu chín; chính vì vậy, chúng có thể tồn tại ở cả các sản phẩm hải
sản đồ hộp, đông lạnh hoăc các sản phẩm chế biến khác.
Khó khăn chính trong theo dõi và giám sát sự nở hoa của các loài vi tảo độc
hại là vấn đề thiếu cơ sở v
ề mối tương quan giữa sự xuất hiện của các loài vi tảo
độc và độc lực trong sinh vật có vỏ. Có thể có rất nhiều lý do cho sự thiếu nhất
quán bao gồm thiếu kiến thức về sinh thái học đối với bọn vi tảo và các loài ăn
lọc có liên quan; và cả chương trình thu mẫu kém hiệu quả cũng như việc phân
tích và sử dụng số liệu một cách chưa chính xác.

II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Thu và bảo quản mẫu:
Từ 04/2004 đến 04/2004, tiến hành thu mẫu định kỳ hàng tháng đối với mẫu
Nghêu (Meretrix lyrata) tại một số khu vực nuôi trọng điểm thuộc tỉnh Cần Giờ
và Vẹm xanh Perna viridis tại đầm Nha Phu, Khánh Hòa. Sau khi thu, mẫ
u được
rửa sạch bên ngoài bằng nước ngọt, để ráo, tách loại bỏ phần vỏ cứng, tách riêng
lấy phần tuyến tiêu hóa giữ trong túi plastic kín ở điều kiện nhiệt độ -18
0
C dùng
cho phân tích các độc tố vi tảo.

2. Phương pháp phân tích:

a. Chiết rút độc tố:

- Độc tố PSP: Hỗn hợp mẫu (100g) và HCl (100 ml) được nghiền nhỏ bằng máy
xay, chuyển sang cốc thủy tinh và đun sôi cách thuỷ trong 5 phút, để nguội, hiệu
chỉnh pH 3-4, định mức đến thể tích 200 ml và ly tâm lấy dịch trong. Dịch này
được bảo quản ở nhiệt độ 2-6
0
C cho phân tích độc tố bằng phương pháp ELISA
(Kodama et.al. 2006, inpress): Dựa vào phản ứng liên kết đặc hiệu giữa kháng
nguyên và kháng thể; trong đó, kháng nguyên (Saxitoxin) có thể được xác định
khi được nhận biết đặc hiệu bằng kháng thể thứ hai (HRP-labeled anti-goat IgG)
đã cộng hợp với enzym Horse Raddish Peroxidase thông qua kháng thể thứ nhất
là Goat anti serum against PSP-KLH (Keyhole Limpet Hemoglocyanin) sẽ tạo
ra sản phẩm có màu khi tác dụng với cơ chất (Ortho-phenylenediamin). Cường
độ màu của phản ứng tỉ l

ệ nghịch với hàm lượng độc tố có mặt trong dịch chiết.

- Độc tố DSP: Chiết rút trong acetone, loại béo bằng n-Hexan, sau đó chiết
trong chloroform, cô chân không cho phân tích độc tố bằng phương pháp PP 2A
(Yasumoto, 1989a,b): Okaidaic acid (OA) hoặc DTX 1 có tác dụng ức chế hoạt
động của emzyme PP2A trong phản ứng bẻ gãy liên kết phosphoryl của hợp chất
Para-nitorophenyl (không màu) để tạo thành hợp chất có màu vàng. Cường độ
màu của phản ứng tỉ lệ nghịch v
ới hàm lượng độc tố có mặt trong dịch chiết.

- Độc tố ASP: Chiết rút trong Methanol 50%, ly tâm lấy dịch trong và phân tích
độc tố bằng phương pháp ELISA (Takata Y. 2006). Dựa vào phản ứng liên kết
đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể; trong đó, kháng nguyên (Acid
Domoic - DA) có thể được xác định khi được nhận biết đặc hiệu bằng một
kháng thể thứ hai đã cộng hợp với enzym (Horse Raddish Peroxidase) thông qua
kháng thể thứ nhất là Rabbit anti serum against DA-BSA (Bovine Serum
Albumin) sẽ tạo ra sản phẩm có màu khi tác dụng với cơ chất (Ortho-
phenylenediamin). Cường độ màu của phản ứng tỉ lệ nghịch với hàm lượng độc
tố có mặt trong dịch chiết.


III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1. Độc tố PSP:

Các kết quả phân tích độc tố PSP trong mẫu Nghêu Meretrix lyrata thu tại Cần
Giờ, TP.HCM và Bến Tre, Vẹm xanh Perna viridis thu tại Nha Phu, Khánh Hòa
được trình bày tại b
ảng 1 dưới đây.

Bảng 1: Kết quả phân tích hàm lượng độc tố PSP (µg/100g) trong Meretrix lyrata và Perna
viridis tại các điểm nghiên cứu (2004-2005)


Thời gian thu mẫu
P
erna viridis Meretrix lyrata

N
ha Phu Cần Giờ Bến Tre
04/2004 37.25 28.56 22.37
05/2004 21.23 21.69 27.10
06/2004 13.16 14.70 18.50
07/2004 14.72 15.27 11.50
08/2004 16.65 14.76 11.85
09/2004 19.45 16.91 14.72
10/2004 18.72 18.56 16.16
11/2004 10.79 20.26 17.10
12/2004 18.91 20.50 13.75
01/2005 14.34 18.75 11.83
02/2005 17.17 13.22 12.55
03/2005 13.02 15.15 12.80
04/2005 27.19 26.75 23.50
Trung bình 18.66 18.85 16.44

Từ kết quả nghiên cứu, có thể nói rằng các mẫu này không có sự tích lũy
cao đối với độc tố PSP, và chúng đều nằm trong tiêu chuẩn giới hạn an toàn cho
người tiêu dùng (< 80 µg/100 g). Mặt khác, không thấy có sự khác biệt đáng kể
giữa hàm lượng độc tố PSP trong Perna viridis và Meretrix lyrata (bảng 1).
Khá dễ dàng lý giải kết quả về hàm lượng độc tố này ở Nghêu Meretrix

lyrata: Meretrix spp. là các loài ăn lọc nhưng sống đ
áy (detritus filter feeding
species) nên nguồn thức ăn của chúng không những chỉ là các loài vi tảo (bao
gồm vi tảo độc) mà còn có thể là những hạt vật chất hữu cơ khác của quá trình
xáo trộn trầm tích đáy biển (Defossez & Hawkins 1997). Hầu hết các loài vi tảo
sản sinh độc tố PSP đều thuộc nhóm tảo giáp dinoflagellate sống trôi nổi, có thể
di chuyển theo dòng chảy bề mặt, trong khi Nghêu là sinh vật ăn lọc thụ động
(hầu như không di chuyển) nên tần xu
ất để chúng bắt gặp các loài vi tảo độc này
trong thức ăn là không cao (Shumway et al. 1985). Tuy nhiên, chúng vẫn sử
dụng các loài vi tảo độc này như là một trong những nguồn thức ăn luôn có mặt
trong môi trường. Điều này đã được chứng minh từ các kết quả phân tích sắc ký
lỏng cao áp trong các nghiên cứu trước đây của chúng tôi, một hàm lượng độc tố
PSP vẫn được ghi nhận ở tất cả các mẫu phân tích, dù ở mức độ khá nhỏ. Trong
khi đó, Vẹm xanh Perna viridis
thường sống ở tầng nước giữa, và thức ăn chủ
yếu của chúng là các loài vi tảo bao gồm cả các loài vi tảo độc có mặt trong môi
trường. Vẹm được coi là loài HMV nhạy nhất đối với sự tích lũy độc tố từ các
loài vi tảo độc, chúng được sử dụng là sinh vật chỉ thị cho sự nở hoa của vi tảo
độc. Như vậy, kết quả chỉ phát hiện đượ
c hàm lượng nhỏ độc tố PSP này chỉ có
thể lý giải do trong thời điểm nghiên cứu, không có sự xuất hiện mật độ cao của
các loài vi tảo độc sản sinh độc tố PSP ở cả 03 địa điểm nghiên cứu.
Theo đồ thị 1, hàm lượng độc tố PSP trong các mẫu nghiên cứu biến thiên
một cách khá ngẫu nhiên, chưa thấy biểu hiện tính qui luật theo thời gian -
Không tìm thấy sự khác biệt củ
a chúng giữa các mẫu cũng như giữa các đợt thu
mẫu trong các thời điểm khác nhau.

0.00

5.00
10 . 0 0
15 . 0 0
20.00
25.00
30.00
35.00
40.00
Apr-04 May-04 Jun-04 Jul-04 Aug-04 Sep-04 Oct-04 Nov-04 Dec-04 Jan-05 Feb-05 Mar-05 Apr-05
Thời gian thu mẫu (tháng)
ug/100g
Perna viridis Nha Phu
Meretrix lyrata Cần Giờ
Meretrix lyrata Bến Tre


Hình 1: Sự biến thiên của độc tố PSP trong Nghêu Maretrix lyrata và Vẹm Xanh Perna
viridis theo thời gian tại các vùng nghiên cứu

Một nhận xét là hàm lượng độc tố PSP tại cả 03 vùng nghiên cứu thường
đạt giá trị cao vào thời điểm tháng 04, 05 (hình 1), trùng hợp là giai đoạn chuyển
tiếp giữa 2 mùa Xuân - Hạ mà theo nhiều tác giả nhận định rằng là một trong
những thời điểm thích hợp về nhiệt độ nước và ánh sáng cho sự phát triển của
các loài tảo giáp trong đó có các loài sản sinh độc tố PSP. Tuy nhiên, cần thiết
có những so sánh, đố
i chứng với số liệu về mật độ và thành phần các loài vi tảo
có mặt trong môi trường theo các thời điểm thu mẫu này để có thể tìm hiểu mối
tương quan giữa mật độ vi tảo sinh độc tố PSP và độc tính trong mẫu hai mảnh
vỏ.
Hàm lượng độc tố PSP cao nhất được ghi nhận ở dịch chiết từ P.viridis tại

vùng biển Nha Phu với giá trị 37.25 µg/100g vào thời điểm tháng 04/2003. Mặc
dù giá trị này thấp hơn giá trị an toàn tiêu dùng, nhưng cần thận trọng giám sát
mật độ các loài vi tảo sản sinh độc tố PSP cũng như hàm lượng độ
c tố PSP trong
P.viridis trong thời gian chuyển mùa nhằm đề phòng, giảm thiểu nguy cơ ngộ
độc cho con người thong qua tiêu thụ loài sinh vật này.
Trong cùng loài M.lyrata, hàm lượng độc tố PSP trung bình tại vùng biển
Cần Giờ (18.86 µg/100g) cao hơn tại Bến Tre (16.44 µg/100g) (bảng 1). Tuy sự
khác biệt không đáng kể, nhưng tạm thời có thể nhận định bước đầu rằng vùng
biển Cần Giờ có tiềm năng nguy cơ cao hơn vùng biển Bến Tre v
ề mặt ô nhiễm
độc tố PSP.

Sơ đồ 1: Sắc ký đồ của STXs và GTXs trong Meretrix lyrata

Một điều rất rõ nét được ghi nhận từ các sắc ký đồ trong phân tích HPLC
là hầu hết các độc tố đều thuộc nhóm STXs, và một hàm lượng rất nhỏ thuộc
nhóm GTXs (Sơ đồ 1), trong khi hàm lượng độc tố thuộc nhóm Cs là không
đáng kể. Đây có thể xem như là một gợi ý về sự có mặt của các nhóm vi tảo độc
tại các khu vực nuôi trên cơ sở chúng là nguồn thức ăn của Nghêu. Theo
Yoshida et al. 2000, các loài vi tả
o sản sinh nhóm độc tố STXs và GTXs phần

lớn thuộc giống Alexandirum. Do đó, khi có mặt của các nhóm độc tố này trong
cơ thể hai mảnh vỏ ăn lọc, chúng ta có thể liên hệ trực tiếp đến sự có mặt của
các loài vi tảo Alexandirum trong môi trường.
Mặt khác, sự luôn có mặt của độc tố thuộc nhóm STXs còn có thể liên
quan đến quá trình chuyển hóa nội phân tử trong cơ thể các sinh vật HMV sau
khi đã tích lũy độc tố từ nguồn thứ
c ăn vi tảo độc {Sekiguchi, S.Sato, et al. 2001
ID: 331}.

2. Độc tố DSP:

Hoàn toàn tương tự như đối với độc tố PSP, tất cả các mẫu nghiên cứu đều cho
kết quả khá thấp đối với độc tố DSP, có thể nhận định rằng chưa thấy có dấu
hiệu nhiễm độc tố DSP trong các mẫu nghiên cứu. Hàm lượng độc tố cao nhất
chỉ đạt tới giá trị 80 ng/100g đối v
ới các mẫu tại Cần Giờ vào tháng 07/2004 và
tháng 03/2005, thấp hơn 1000 lần so với liều an toàn tiêu dùng (80 µg/100g)
(bảng 2). Như vậy, có thể nói rằng tất cả các mẫu nghiên cứu nói trên đều nằm

trong phạm vi an toàn cho người tiêu dùng với mức độ an toàn cao.

Bảng 2: Kết quả phân tích hàm lượng độc tố DSP (ng/100g) trong Meretrix lyrata và Perna
viridis tại các điểm nghiên cứu (2004-2005)

Thời gian thu mẫu
P
erna viridis Meretrix lyrata
Nha Phu Cần Giờ Bến Tre
04/2004
30.0 40.0 60.0
05/2004 20.0
60.0 47.0
06/2004 40.0
75.0 52.0
07/2004 45.0 80.0
52.7
08/2004 25.0 60.0
50.9
09/2004 30.0
65.0
40.0
10/2004 0.0 70.0 40.0
11/2004 0.0 60.0
25.0
12/2004 0.0
40.0 40.0
01/2005 0.0
60.0 60.0
02/2005 0.0

75.0 28.0
03/2005 40.0
80.0 45.0
04/2005 25.0
60.0 40.0
Trung bình 19.60
63.46 44.66

Trong một vài nghiên cứu trước đây đối loài Ngao Meretrix meretrix thu tại
vùng biển Hạ Long, Cát Bà, đã bắt gặp hàm lượng độc tố DSP khá cao; hoặc đối
với Meretrix lyrata tại Cần Giờ cũng đã có những thời điểm tích lũy độc tố DSP
cao hơn gấp nhiều lần ngưỡng an toàn tiêu dùng (số liệu của NAFIQUAVES 4).
Như vậy, nguyên nhân có thể tại các khu vực nghiên cứu, chưa thấy có sự
xuất
hiện các loài vi tảo sản sinh độc tố DSP với mật độ cao.
Khi so sánh giữa 3 vùng nghiên cứu thì vùng biển Cần Giờ cũng là nơi có hàm
lượng độc tố DSP cao hơn cả. Hàm lượng độc tố tại các mẫu thu tại Cần Giờ dao
động trong khoảng 40 - 80 ng/100 g, với 2 đỉnh cao nhất tại tháng 07/2003 và
tháng 04/2005 (hình 2). Một điều khá thú vị là thời điểm này hoàn toàn tương tự
với thời điểm phát hiện hàm lượng độc tố DSP cao nhất ở vùng biển Thanh Hóa
trong giai đoạn 2002-2003 (Nguy
ễn Văn Nguyên & Đào Việt Hà, 2005). Kết
hợp kết quả của 02 nghiên cứu này, chúng tôi có nhận định bước đầu là giai
đoạn tháng 3, 4 và tháng 7, 8 hàng năm rất có thể là thời điểm nhạy cảm đối với
sự xuất hiện hàm lượng cao của độc tố PSP trong mối tương quan với mật độ
các loài Dinophysis, do đó, cần tiếp tục nghiên cứu với tần suất thu mẫu cao hơn
(2 tần/lần). Ở vùng biển Nha Phu, phần lớn các mẫu đều nằm dưới mức độ phát
hiện của phương pháp, do đó khó có thể đưa ra những nhận xét chi tiết về biến
động hàm lượng của độc tố này theo thời gian thu mẫu (hình 2).
0.0

10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
60.0
70.0
80.0
90.0
Apr-04 May-04 Jun-04 Jul-04 Aug-04 Sep-04 Oct-04 Nov-04 Dec-04 Jan-05 Feb-05 Mar-05 Apr-05
Thời gian thu mẫu (tháng)
ng/100g
Perna viridis Nha Phu
Meretrix lyrata Cần Giờ
Meretrix lyrata Bến Tre


Hình 2: Sự biến thiên của độc tố DSP trong Nghêu Maretrix lyrata và Vẹm Xanh Perna
viridis theo thời gian tại các vùng nghiên cứu

Kết quả phân tích HPLC cũng cho thấy thành phần độc tố DSP chủ yếu thuộc
okadaic acid (OA) (Sơ đồ 2) mà chủ yếu được sản sinh bởi các loài vi tảo thuộc
giống Dinophysis (Yashumoto et.al. 1983) ,hầu hết không tìm thấy sự có mặt
của nhóm DTX1-4.



Sơ đồ 2: Sắc ký đồ độc tố DSP trong Meretrix lyrata

3. Độc tố ASP:

Trong suốt thời gian nghiên cứu, hàm lượng độc tố ASP luôn ở mức độ thấp hơn
nhiều lần so với tiêu chuẩn an toàn tiêu dùng của độc tố này (20 µg/100g). Có
thể nhận thấy trong suốt thời gian nghiên cứu hàm lượng độc tố ASP trong
P.viridis thu tại Nha Phu luôn cao hơn trong M.lyrata Cần Giờ và Bến Tre (hình
3). Từ hình 3, sự biến động của độc tố này theo thời gian tại cả 3 vùng thu mẫu
mang tính ch
ất ngẫu nhiên, không theo qui luật. Tuy nhiên, với tần suất thu mẫu
hàng tháng là tương đối khó khăn và hạn chế trong nghiên cứu độc tố ASP vì
các loài hai mảnh vỏ luôn có sự tích lũy rất ngắn với độc tố ASP. Do vậy, cần
phải có những nghiên cứu tiếp theo với tần suất thu mẫu dày hơn (hàng tuần
hoặc 2 tuần) đề tìm hiểu mối tương quan thuận giữa hàm lượng độc tố trong
HMV và mật
độ tế bào loài vi tảo sản sinh độc tố trong môi trường.

Bảng 3: Kết quả phân tích hàm lượng độc tố ASP (µg/g) trong Meretrix lyrata và Perna
viridis tại các điểm nghiên cứu (2004-2005)

Thời gian thu mẫu
P
erna viridis Meretrix lyrata
Nha Phu Cần Giờ Bến Tre
04/2004 2.34 1.62 1.30
05/2004 1.55 1.07 0.99
06/2004 3.88 1.79 0.93
07/2004 1.98 1.10 1.40
08/2004 2.51 0.80 1.30
09/2004 2.25 1.50 2.40
10/2004 3.85 1.64 2.80
11/2004 3.52 1.48 2.90

12/2004 3.42 2.24 1.18
01/2005 2.59 2.50 0.86
02/2005 2.84 1.48 1.56
03/2005 4.78 1.96 0.64
04/2005 1.88 1.34 1.82
Trung bình 2.88 1.58 1.54


0
1
2
3
4
5
6
Apr-04 May-04 Jun-04 Jul-04 Aug-04 Sep-04 Oct-04 Nov-04 Dec-04 Jan-05 Feb-05 Mar-05 Apr-05
Thời gian thu mẫu (Tháng)
ug/g
Perna viridis Nha Phu
Meretrix lyrata Cần Giờ
Meretrix lyrata Bến Tre

Hình 3: Sự biến thiên của độc tố ASP trong Nghêu Meretrix lyrata và Vẹm Xanh Perna
viridis theo thời gian tại các vùng nghiên cứu

Khi so sánh kết quả giữa 03 vùng nghiên cứu, các mẫu thu tại Nha Phu có hàm
lượng độc tố ASP cao hơn so với 02 vùng còn lại. Điều này có thể lý giải do sự
khác biệt về loài thu mẫu (Nha Phu – P.viridis; Cần Giờ và Bến Tre – M.lyrata):
Do khả năng tích lũy và đào thải độc tố rất nhanh qua quá trình ăn lọc, P.viridis
là sinh vật chỉ thị cho sự ô nhiễm độc tố vi tảo, trong khi đó, Nghêu M. lyrata lại

là loài có khả
năng thu nạp độc tố chậm hơn. Như vậy, khi luôn luôn tồn tại các
loài sinh ASP (causative species) trong môi trường với mật độ không cao, tần
suất bắt gặp chúng trong qúa trình ăn lọc sẽ cao hơn ở P.viridis. Mặt khác, theo
Takata, Y. (2006) {Yoshinobu Takata 2006 ID: 688}, nguồn gốc sản sinh độc tố
ASP hiện nay được cho rằng không chỉ riêng từ các loài tảo Si líc
Pseudonitzchia, mà rất có thể từ các loài vi khuẩn biển.

IV. KẾT LUẬN

Nhìn chung, trong các đợt khả
o sát, hàm lượng các độc tố vi tảo PSP, DSP và
ASP ở trong mẫu Vẹm Xanh Perna viridis thu tại 3 vùng Nha Phu – Khánh
Hòa; Nghêu (Meretrix lyrata) thu tại Cần Giờ - TP.HCM và Bến Tre là khá nhỏ,
nằm trong phạm vi an toàn chất lượng cho người tiêu dùng. Có thể nói rằng
trong thời điểm nghiên cứu, chưa thấy có nguy cơ về vi tảo độc tại các vùng
biển này. Tuy nhiên, hàm lượng cả 03 loại độc tố đều đạt giá trị cao hơn vào thời
điểm tháng 3, 4; riêng đối với độc tố DSP, hàm lượng cao còn bắt gặp vào thời
điểm tháng 7, do vậy, cần thận trọng và tiếp tục theo dõi mật độ các loài vi tảo
độc cũng như hàm lượng các độc tố vi tảo trong các loài hai mảnh vỏ trong thời
gian này. Ngoài ra, với xu thế diễn biến môi trường theo chiều hướng bất lợi
hiện nay, cần thiết phải triển khai một kế hoạch quan trắc đồ
ng bộ và lâu dài
hơn, nhằm ngăn ngừa những thiệt hại đáng tiếc cho nền kinh tế biển và an toàn
sức khỏe cộng đồng về mặt độc tố vi tảo.
Từ những gợi ý ban đầu trên cơ sở phân tích bản chất của độc tố trong các
mẫu nghiên cứu, loài vi tảo độc chiếm ưu thế trong môi trường tại các khu vực
này có thể thuộc giống Alexandrium (sả
n sinh GTXs và STXs), Dinophysis (sản
sinh Okadaic acid) do đó, cần chú trọng theo dõi, đề phòng sự nở hoa các loài

này trong những điều kiện môi trường thích hợp để có biện pháp ngăn ngừa và
cảnh báo kịp thời.







TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Baden, D.G. & V.L. Trainer 1993. Mode of action of toxins of seafood
poisoning. Pp. 49-74. - In I.R. Falconer (Ed.), Algal toxins in seafood and
drinking water. Academic Press.
2. Bialojan, C. & A. Takai 1988. Inhibitory effect of marine-sponge toxin,
okadaic acid, on protein phosphatase. Specificity and kinetics. - Biochem.J.
256: 283-290.
3. Bricelj, V.M., & Shumway, S.E. (1998). An overview of the occurence and
transfer kinetics of paralytic shellfish toxins in bivalve molluscs. In The VIII
International Conference Proceeding on harmful algae. Vigo 1997. The VIII
international Conference Proceeding on harmful algae.Vigo 1997., VIII, 431-
436.
4. Carmichael, W.W., N.A. Mahmood & E.G. Hyde 1990. Natural toxins
from cyanobacteria (blue-green algae). Pp. 87-106. - In S. Hall & G.
Strichartz (Eds.), Marine toxins: Origin, structure, and molecular
pharmacology. ACS symposium series 418. Washington. American Chemistry
Society.
5. Cucci, T.L., Shumway, S.E., Newell, R.C., & Yentsch, C.M. (1985). A
preliminary study of the effects of Gonyaulax taramensis on feeding in bivalve
molluscs. In D.M. Anderson, A.W. White, & D.G. Baden (Eds.), Toxic

dinoflagellates. (pp. 395-400). Elsevier.
6. Defossez, J.M., & Hawkins, A.J.S. (1997). Selective feeding in shellfish:
Size-dependednt rejection of large particles within pseudofaeces fromMytilus
edulis, Ruditapes philippinarum and Tapes decussatus. Marine Biology, 129
(1), 139-149.
7. Fleming, L.E., J.A. Bean & D.G. Baden 1995. Epidemiology and public
health. Pp. 475-487. - In G.M. Hallegraeff, D.M. Anderson, & A.D. Cembella
(Eds.), Manual on Harmful Marine Microalgae: IOC Manuals and Guides No.
33. UNESCO.

8. Foxall, T.L., M.I. Shoptaugh, & J.J. Sasner 1979. Secondary intoxication
with PSP in Cancer irroratus. Taylor, D.L.Seliger (eds.).Toxic Dinoflagellate
Blooms, 413-418.
9. Greraci, J.R., D.M. Anderson, R.J. Timperi, D.S.S. Aubin, G.A. Early, J.H.
Prescott & C.A. Mayo 1989. Humpback whales (Megaptera novaeangliae)
fatally poisoned by dinoflagellate toxin. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 46: 1-10.
10. Hallegraeff, G.M. 1995. Harmful Algal Blooms: A global overeview. Pp.
4-18. - In G.M. Hallegraeff, D.M. Anderson, & A.D. Cembella (Eds.),
Manual on Harmful Marine Microalgae: IOC Manuals and Guides No. 33.
UNESCO.
11. Hashimoto, K. & T. Noguchi 1989. Recent studies on Paralytic Shellfish
Poisoning in Japan. Pure appl.Chem. 61: 7-18.
12. Haystead, T.A.J., A.T.R. Sim, D. Carling, R.C. Honnor & Y. Tsukitani
1989. Effects of the tumor promoter okadaic acid on intracellular protein
phosphorylation and metabolism. - Natural 337: 78-81.
13. Lee, J.S., M. Murata & T. Yasumoto 1989. Analytical methods for
determination of diarrhetic shellfish toxins. - Mycotoxins and phycotoxins'88
(Eds Natori, S.Hashimoto, K.and Ueno, Y.), 327-334.
14. Murata, M., M. Kumagai, J.S. Lee & T.Yasumoto 1987. Isolation and
structure of yessotoxin, a novel polyether compound implicated in diarrhetic

shellfish poisoning. - Tetrahedron Lett. 28: 5869-5872.

15. Murata, M., F. Gusovsky, M. Sasaki, A. Yokoyama, T. Yasumoto & J.W.
Daly 1991. Effect of maitotoxin analogues on calcium influx and
phosphoinositide breakdown in cultured cells. - Toxicon 29: 1085-1096.

16. Premazzi, G. & L.Voltera 1993. Microphyte Algae. Commission of the
European Communities.
17. Shimizu, Y., H.N. Bando, G. Vanduyne & J. Clardy 1986. Structure of
brevetoxin-A (GB-1), the most potent toxin in the Florida red tide organism
Gymnodinium breve (Ptychodiscus brevis). - JACS 108: 514-515.
18. Steidinger, K.A. 1993. Some Taxonomic and Biologic Aspects of Toxic
Dinoflagellates. In Ian R.Falconer (Ed.), Algal toxins in Seafood and Drinking
water. (pp. 1-28). Academic Press
.
19. Yasumoto, T., M. Murata, Y. Oshima & M. Sano 1985. Diarrhetic
shellfish toxins. - Tetrahedron 41: 1019-1025.
20. Yasumoto, T. & M. Satake 1998. New toxins and their toxicological
evaluations. Pp. 461-464. - In Proceeding of the XIII International
Conference on Harmful algae, Vigo 1997. UNESCO.
21. Yashumoto, T., Y.Oshima, & Y.Kotachi. (1983). Analysis of paralytic
Shellfish toxins in coral reef crabs and gastropods with the indentification of the
primary source of toxins. toxicon, 513-519.
22. Yoshida, M., Ogata, T., Thuoc, C.V., Matsuoka, K., Fukuyo, Y., Hoi, N.C.,
& Kodama, M. (2000). The first finding of toxic dinoflagellate Alexandrium
minitum in Vietnam. Fisheries science, 66, 177-179.
23. Yoshinobuta Takata (2006). The distributions of Domoic acid and its origin.
Doctor thesis. Kitasato University, Japan.
24. Shumway, S.E. (1990). A review of the effects of algal blooms on shelllfish
and aquaculture. J.World Aquaculture Soc., 21, 65-104.

25. Shumway, S.E., & Cembella, A.D. (1993). The impact of toxic algae on
scallop culture and fisheries. Rev.Fish.Sci., 1, 121-150.
26. Shumway, S.E., H.P.von Egmond, J.W.Hurst, & L.L.Bean. (1995).
Management of shellfish resources. In G.M. Hallegraeff, D.M. Anderson, &
A.D. Cembella (Eds.), Manual on Harmful Marine Microalgae. (pp. 433-463).
UNESCO.
27. Thorarinsdottir, G.G. (1998). Aspects of phytoplankton blooms in relation
to molluscs and man. Phuket marine biological center special publication, 18,
153-158.
28. Tufts, N. (1979). Molluscan transvectors of paralytic shellfish poisoning. In
M. Taylor & Seliger (Eds.), Toxic dinoflagellate blooms. (pp. 403-408).
Elsevier North Holland.
29. Uda, T., H. Itoh, M.Ishimura, T. Usagawa, M.Murata, Y.Yashumoto (1989).
Emzyme immunoassay using monoclonal antibody specific for diarretic
shellfish poisons. In: Natori, S., Hashimoto, K., Ueno.Y. (eds). Mycotoxins and
Phycotoxins. 335-342. Elsevier, Amsterdam.
30. Usagawa, T., M.Nishimura, Y.Itoh, T.Uda, T. Yashumoto (1989).
Preparation of monoclonal antibodies against okadaic acid prepared from the
speonge Halichondria okadai. Toxicon, 27, 1323-1330.