Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu phối hợp estcrase và bảo vệ enzyme thủy phân tử nằm trong chuyển hóa phụ phẩm côngnông nghiệp để thu nhận bioethanol

LỜI CAM ĐOAN

Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn
khoa học của TS. Đỗ Hữu Nghị và PGS.TS. Tăng Thị Chính. Các số liệu và kết quả được
nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ cơng trình nào
khác.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2019

Tác giả

Vũ Đình Giáp

i


LỜI CẢM ƠN

Tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc tới TS. Đỗ Hữu Nghị, Viện Hóa học các hợp
chất thiên nhiên và PGS.TS. Tăng Thị Chính, Viện Cơng nghệ môi trường, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, sửa
luận án và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tơi có thể hồn thành Bản luận án này.
Tơi xin cảm ơn Phịng Đào tạo Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên và Học viện
Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều
kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi hồn thành mọi thủ tục cần thiết trong q trình làm nghiên
cứu.
Tơi xin cảm ơn tập thể Phịng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất
thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã chỉ bảo, giúp đỡ tận tình

cho tơi trong q trình thực nghiệm cũng như chia sẻ những kinh nghiệm chuyên mơn
q báu.
Tơi xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ Đề tài Hợp tác song phương Việt Nam - Bỉ
(Mã số: FWO.104.2017.03) và Đề tài Nghị định thư Việt Nam - CHLB Đức (Mã số:
NĐT.45.GER/18) do TS. Đỗ Hữu Nghị làm chủ nhiệm.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã giúp đỡ,
tạo điều kiện và động viên tôi trong suốt thời gian học tập.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2019

Tác giả

Vũ Đình Giáp

ii


MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN……………………………………………………………………...…I
LỜI CẢM ƠN……………………………………………………………………………II
MỤC LỤC.................................................................................................................... III
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... VII
DANH MỤC HÌNH…...………………………………………………………………………VIII

DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT………………………………………………..XI
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 5
1.1. Phụ phẩm công - nông nghiệp giàu lignocellulose .................................................... 5
1.1.1. Nguồn gốc và thành phần .................................................................................. 5
1.1.2. Nguồn nguyên liệu bã mía ............................................................................... 10
1.1.2.1. Nguồn gốc và hiện trạng sử dụng bã mía ở Việt Nam……………………...10

1.1.2.2. Các vấn đề mơi trường từ bã mía ........................................................... 11
1.2. Chuyển hóa vật liệu giàu lignocellulose ................................................................. 12
1.2.1. Quá trình thủy phân vật liệu giàu lignocellulose .............................................. 12
1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến xúc tác sinh học...................................................... 15
1.2.3. Đa dạng nấm Việt Nam cho chuyển hóa vật liệu giàu lignocellulose ............... 18
1.2.4. Ứng dụng của enzyme trong quá trình thủy phân lignocellulose ...................... 20
1.2.5. Vai trò carbohydrat esterase trong thủy phân lignocellulose............................. 23
1.2.5.1. Acetyl esterase từ nấm ........................................................................... 24
1.2.5.2. Feruloyl esterase từ nấm ........................................................................ 25
1.3. Tình hình sản xuất bioethanol ................................................................................. 28
1.3.1. Hiện trạng sản xuất và sử dụng bioethanol ....................................................... 28
1.3.2. Nguồn sinh khối cho sản xuất bioethanol ......................................................... 33
1.3.3. Lên men sản xuất bioethanol ........................................................................... 35
1.4. Tình hình nghiên cứu bioethanol trong và ngồi nước ............................................ 38
1.4.1. Tình hình nghiên cứu bioethanol ngoài nước ................................................... 38
iii


1.4.2. Tình hình nghiên cứu bioethanol trong nước.................................................... 41
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 44
2.1. Vật liệu ................................................................................................................... 44
2.1.1. Vật liệu giàu lignocellulose ............................................................................. 44
2.1.2. Vi sinh vật…………………………………………. …………..……………...44
2.1.3. Thiết bị, hóa chất ............................................................................................. 45

2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 45
2.2.1. Phương pháp vi sinh vật .................................................................................. 45
2.2.1.1. Phân lập nấm ......................................................................................... 45
2.2.1.2. Nuôi cấy và bảo quản nấm men .............................................................. 46
2.2.1.3. Lên men bioethanol ................................................................................ 47
2.2.2. Định danh nấm ............................................................................................... 48
2.2.2.1. Định danh nấm bằng phương pháp hình thái giải phẫu .......................... 48
2.2.2.2. Định danh nấm bằng phương pháp sinh học phân tử ............................. 49
2.2.3. Sàng lọc hoạt tính esterase và lựa chọn chủng nấm ......................................... 50
2.2.3.1. Sàng lọc trên đĩa thạch.......................................................................... 50
2.2.3.2. Sàng lọc trên môi trường lên men bề mặt và dịch thể ............................ 50
2.2.4. Phương pháp đánh giá hoạt độ enzyme ........................................................... 51
2.2.4.1. Hoạt độ acetyl esterase .......................................................................... 51
2.2.4.2. Hoạt độ feruloyl esterase ....................................................................... 52
2.2.5. Xác định điều kiện thích hợp sinh tổng hợp esterase ....................................... 52
2.2.5.1. Xác định nguồn nitơ và cơ chất giàu lignocellulose................................ 52

2.2.5.2. Xác định nhiệt độ, pH thích hợp...............................................................52
2.2.6. Tinh sạch protein enzyme ................................................................................ 53
2.2.6.1. Tách chiết, tinh sạch protein enzyme ...................................................... 53
2.2.6.2. Xác định hàm lượng protein ................................................................... 53
2.2.6.3. Điện di trên gel polyacrylamide có SDS.....................................................54
2.2.6.4. Điện di điểm đẳng điện...............................................................................54
2.2.6.5. Xác định nhiệt độ và pH tối ưu của enzyme tinh sạch................................54
iv


2.2.6.6. Xác định độ bền nhiệt và độ bền pH của enzyme tinh sạch ..................... 55
2.2.7. Phương pháp hóa sinh..................................................................................... 55
2.2.7.1. Sắc ký bản mỏng .................................................................................... 55

2.2.7.2. Sắc kí lỏng hiệu năng cao....................................................................... 55
2.2.7.3. Xác định peptide bằng phổ khối sử dụng nguồn ion hóa mẫu ESI-MS…...56

2.2.7.4. Định lượng đường khử theo phương pháp axit dinitrosalicylic ............... 57
2.2.7.5. Xử lý nguyên liệu……………..………………………………………………….58

2.2.7.6. Xác định hàm lượng bioethanol .............................................................. 59
2.2.8. Xúc tác chuyển hóa sinh học các vật liệu giàu lignocellulose ........................... 60
2.2.9. Quy hoạch thực nghiệm ................................................................................... 61
2.2.10. Xử lý số liệu .................................................................................................. 63
2.3. Xây dựng sơ đồ nghiên cứu ................................................................................... 63
2.3.1. Sơ đồ xác định các điều kiện thích hợp cho mơ hình tối ưu thực nghiệm ........ 63
2.3.2. Sơ đồ xử lý bã mía bằng phương pháp hóa lý kết hợp “enzyme cocktail” ....... 66
2.3.3. Sơ đồ lên men bioethanol từ dịch đường chuyển hóa ....................................... 68
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................... 70
3.1. Phân lập và sàng lọc nấm ....................................................................................... 70
3.1.1. Ngành nấm đảm Basidiomycota ...................................................................... 70
3.1.2. Ngành nấm túi Ascomycota ............................................................................. 70
3.2. Khả năng sinh tổng hợp esterase và lựa chọn chủng nấm ........................................ 70
3.3. Định danh các chủng phân lập hoạt tính cao .......................................................... 75
3.3.1. Định danh chủng SP66 .................................................................................... 75
3.3.2. Định danh chủng A35 ...................................................................................... 78
3.4. Nghiên cứu sinh tổng hợp esterase .......................................................................... 81
3.4.1. Nghiên cứu sinh tổng hợp acetyl esterase bởi nấm X. polymorpha A35............... 81
3.4.2. Nghiên cứu sinh tổng hợp feruloyl esterase bởi nấm Alt. tenuissima SP66 ......... 86
3.5. Tinh sạch enzyme từ môi trường nuôi cấy nấm ....................................................... 91
3.5.1. Tinh sạch và đặc tính acetyl esterase bởi nấm X. polymorpha A35................... 91
3.5.2. Tinh sạch và đặc tính feruloyl esterase bởi nấm Alt. tenuissima SP66 .............. 95
v

3.5.3. Quy trình lên men, chiết tách và tinh sạch enzyme esterase từ nấm.................100
3.5.3.1. Acetyl esterase từ nấm X. polymorpha A35 ...........................................100
3.5.3.2. Feruloyl esterase từ nấm Alt. tenuissima SP66 …………………….…….103
3.6. Sàng lọc nguồn cơ chất giàu lignocellulose cho chuyển hóa bằng xúc tác sinh học105
3.6.1. Sàng lọc cơ chất..............................................................................................105
3.6.2. Hàm lượng đường khử sau chuyển hóa sinh học .............................................106
3.7. Tối ưu hóa “enzyme cocktail” bằng mơ hình quy hoạch thực nghiệm ....................107
3.8. Kết hợp xử lý hóa học nâng cao hiệu quả chuyển hóa ............................................115
3.8.1. Kết hợp thủy phân bã mía bằng kiềm và “enzyme cocktail” ............................115
3.8.2. Kết hợp thủy phân bã mía bằng axít và “enzyme cocktail”..............................117
3.8.3. Kết hợp thủy phân bã mía bằng thiết bị gia nhiệt và “enzyme cocktail” ..........119
3.8.4. Hàm lượng các đường đơn sau chuyển hóa .....................................................121
3.9. Nghiên cứu sản xuất bioethanol .............................................................................122
3.9.1. Ảnh hưởng thành phần môi trường .................................................................122
3.9.2. Ảnh hưởng thời gian lên men ..........................................................................124
3.9.3. Ảnh hưởng pH ................................................................................................127
3.9.4. Ảnh hưởng nhiệt độ ........................................................................................128
3.9.5. Ảnh hưởng tỷ lệ nấm men ...............................................................................130
3.9.6. Đề xuất quy trình sản xuất bioethanol từ bã mía .............................................133
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................136
KẾT LUẬN .................................................................................................................136
KIẾN NGHỊ ................................................................................................................137
DANH SÁCH CÔNG BỐ KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ..................138
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................................139

vi


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Thành phần một số nguồn sinh khối giàu lignocellulose ................................. 6
Bảng 1.2. Một số dự án sản xuất bioethanol nhiên liệu tại Việt Nam ............................. 32
Bảng 2.1. Thành phần môi trường lên men.…………......................................................48
Bảng 3. 1. Hoạt tính feruloyl esterase và acetyl esterase của các chủng nấm.................. 71
Bảng 3. 2. Tinh sạch enzyme hoạt tính acetyl esterase (XpoAE) ................................... 93
Bảng 3. 3. Tinh sạch enzyme AltFAE từ dịch lên men nấm Alt. tenuissima SP66 .......... 96
Bảng 3. 4. Các đoạn peptide của enzyme AltFAE tinh sạch từ nấm Alt. tenuissima SP66
xác định bằng thủy phân với trypsin và LC-ESI-MS/MS ............................................... 99
Bảng 3. 5. Hoạt tính đặc hiệu của “enzyme cocktail” trong chuyển hóa sinh học ......... 100
Bảng 3. 6. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển hóa ......................................... 108
Bảng 3. 7. Kế hoạch trực giao bậc hai Box – Wilson ................................................... 111
Bảng 3. 8. Kết quả thí nghiệm theo kế hoạch trực giao bậc hai Box – Wilson.............. 111
Bảng 3. 9. Ma trận kế hoạch và kết quả thực nghiệm ................................................... 112
Bảng 3. 10. Các hệ số hồi quy và giá trị T ................................................................... 113
Bảng 3. 11. Kết quả thực nghiệm so sánh với kế hoạch trực giao Box – Wilson .......... 114
Bảng 3. 12. Tổng đường khử sau q trình thủy phân bã mía bằng thiết bị gia nhiệt và
“enzyme cocktail” ....................................................................................................... 120
Bảng 3. 13. Hàm lượng một số các đường đơn trong dung dịch sau chuyển hóa ......... 121
Bảng 3. 14. Hiệu suất q trình lên men trên mơi trường BM và BM+ ........................ 123
Bảng 3. 15. Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất lên men .............................................. 124
Bảng 3. 16. Ảnh hưởng pH đến hiệu suất lên men ...................................................... 127
Bảng 3. 17. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất lên men .............................................. 128
Bảng 3. 18. Ảnh hưởng tỷ lệ nấm men đến hiệu suất lên men ...................................... 130

vii


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc của lignocellulose .............................................................................. 6
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của cellulose ........................................................................ 7
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của xylan............................................................................... 9
Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của lignin .............................................................................. 9
Hình 1.5. Hiện trạng sản xuất mía đường các vùng của Việt Nam ................................. 11
Hình 1.6. Vai trò tiền xử lý trong chuyển đổi sinh khối thành nhiên liệu........................ 15
Hình 1.7. Cấu trúc các enzyme tham gia vào q trình chuyển hóa lignocellulose ......... 19
Hình 1.8. Hệ cellulase tham gia thủy phân mạch cellulose ............................................. 21
Hình 1.9. Cấu trúc xylan được tấn cơng bởi những enzyme thủy phân khác nhau ............ 23
Hình 1.10. Liên kết dạng cầu nối của axit ferulic và dimer với arabinoxylan và lignin ... 25
Hình 1.11. Nếp gấp đặc trưng α/β-hydrolase.................................................................. 27
Hình 1.12. Sản lượng nhiên liệu sinh học giai đoạn 2008 – 2022 ................................... 29
Hình 1.13. Sản lượng bioethanol tại một số quốc gia và khu vực trên thế giới ............... 30
Hình 1.14. Cấu trúc amylose ......................................................................................... 34
Hinh 2. 1. Đường chuẩn biểu thị liên hệ giữa mật độ quang và nồng độ ρ-Nitrophenol . 51
Hinh 2. 2 Hệ thống siêu lọc 10 kDa cut-off trên thiết bị amicon Ultra Centrifugal ........ 53
Hinh 2. 3. Phương trình phản ứng giữa đường khử và axít dinitrosalicylic .................... 57
Hinh 2. 4. Đường chuẩn glucose biểu thị giữa mật độ quang và nồng độ glucose ......... 58
Hinh 2. 5. Sơ đồ xác định các điều kiện thích hợp cho mơ hình tối ưu thực nghiệm....... 64
Hinh 2. 6. Sơ đồ xử lý bã mía theo phương pháp hóa lý kết hợp “enzyme cocktail” ...... 66
Hinh 2. 7. Sơ đồ lên men bioethanol từ dịch đường chuyển hóa.................................... 68
Hình 3. 1. Hoạt tính feruloyl esterase của chủng nấm phân lập Alt. tenuissima SP66 ..... 73
Hình 3. 2. Hình ảnh điện di ADN tổng số trên gel agarose 1% (A) và (B) Sản phẩm PCR
của hai chủng nấm (SP66 và A35) ................................................................................. 75
Hình 3. 3. Mối quan hệ họ hàng của chủng SP66 với các lồi/dưới lồi trong cùng chi . 77
Hình 3. 4. Chủng Alt. tenuissima SP66 phát triển trên MT thạch và hình thái bào tử....78
Hình 3. 5. Mối quan hệ họ hàng của chủng nấm A35 với các loài/thứ trong cùng chi .... 80
viii

Hình 3. 6. Động học sinh tổng hợp acetyl esterase bởi nấm X. polymorpha A35 trên mơi
trường rắn ……………………………………………………………………………......80
Hình 3. 7. Sự phát triển của nấm X. polymorpha A35 trên MT lỏng ở ngày thứ 10 ........ 82
Hình 3. 8. Động học sinh tổng hợp acetyl esterase bởi nấm X. polymorpha A35 trên các
mơi trường có bổ sung cơ chất ....................................................................................... 83
Hình 3. 9. Khả năng đồng hóa các nguồn nitơ khác nhau bởi nấm X. polymorpha A35.. 84
Hình 3. 10. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh tổng hợp acetyl esterase bởi nấm X.
polymorpha A35 trên môi trường lỏng .......................................................................... 85
Hình 3. 11. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh tổng hợp acetyl esterase ............................. 86
Hình 3. 12. Động học sinh tổng hợp feruloyl esterase (A) và hoạt tính enzyme cao nhất
(B) trên các mơi trường khác nhau ................................................................................. 87
Hình 3. 13. Khả năng đồng hóa các nguồn nitơ khác nhau ……………………………89
Hình 3. 14. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh tổng hợp feruloyl esterase .................. 90
Hình 3. 15. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh tổng hợp feruloyl esterase ......................... 91
Hình 3. 16. Tinh sạch enzyme XpoAE từ X. polymorpha A35 qua các bước sắc ký lỏng 92
Hình 3. 17. Protein tinh sạch (1,3) biểu hiện hoạt tính acetyl esterase (XpoAE) trên gel
điện di SDS-PAGE (A) và IEF (B); (2,4) protein marker ............................................... 93
Hình 3. 18. Ảnh hưởng của pH (A) và nhiệt độ (B) đến hoạt tính của XpoAE tinh sạch 94
Hình 3. 19. Độ bền của enzyme XpoAE tinh sạch bởi nấm X. polymorpha A35 (XpoAE)
ở các điều kiện nhiệt độ (A) và pH (B) khác nhau ......................................................... 95
Hình 3. 20. Tinh sạch enzyme AltFAE từ nấm Alt.tenuissima SP66 qua cột sắc ký trao đổi
anion Q Sepharose® ....................................................................................................... 96
Hình 3. 21. Protein tinh sạch (1) biểu hiện hoạt tính AltFAE trên gel điện di SDS-PAGE
(A); (2) protein marker .................................................................................................. 97
Hình 3. 22. Ảnh hưởng của nhiệt độ (A) và pH (B) đến hoạt tính enzyme AltFAE từ nấm
Alt. tenuissima SP66 ...................................................................................................... 97
Hình 3. 23. Độ bền nhiệt của enzyme AltFAE từ nấm Alt. tenuissima SP66 ở nhiệt độ
khác nhau (A) và giá trị pH (B) phụ thuộc vào thời gian ................................................ 98

ix

Hình 3. 24. Dữ liệu phổ ESI-MS/MS các đoạn peptide của enzyme AltFAE tinh sạch từ
nấm Alt. tenuissima SP66 .............................................................................................. 99
Hình 3. 25. Quy trình chiết tách và tinh sạch protein enzyme hoạt tính acetyl esterase từ
mơi trường ni cấy nấm X. polymorpha A35 ............................................................. 102
Hình 3. 26. Quy trình chiết tách và tinh sạch enzyme hoạt tính feruloyl esterase từ mơi
trường lên men nấm Alt. tenuissima SP66.................................................................... 104
Hình 3. 27. Vết chất đường đơn xuất hiện trên bản mỏng ............................................ 105
Hình 3. 28. Hàm lượng đường khử tạo thành sau q trình thủy phân bã mía bằng các
đơn enzyme và “enzyme cocktail” ............................................................................... 107
Hình 3. 29. Đường khử sinh ra sau q trình xử lý bã mía bằng kiềm và “enzyme
cocktail” ...................................................................................................................... 116
Hình 3. 30. Đường khử sinh ra sau q trình thủy phân bã mía bằng axít và “enzyme
cocktail” ...................................................................................................................... 118
Hình 3. 31. Ảnh hưởng thành phần mơi trường đến hiệu suất lên men ......................... 124
Hình 3. 32. Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất lên men ............................................... 126
Hình 3. 33. Ảnh hưởng pH đến hiệu suất lên men........................................................ 128
Hình 3. 34. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất lên men ................................................ 129
Hình 3. 35. Ảnh hưởng tỷ lệ giống nấm men đến hiệu suất lên men............................. 131
Hình 3. 36. Quy trình sản xuất bioethanol từ bã mía .................................................... 134

x


DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Tiếng Anh

Nghĩa tiếng Việt

BLAST

Basic local alignment search tool Công cụ so sánh các chuỗi sinh học

bp

Base pair

Cặp bazơ nitơ

M

Marker

Thang chuẩn

CMC

Carboxymethyl cellulose

Carboxymethyl cellulose

DNA

Deoxyribonucleic acid

Axit deoxyribonucleic

kb

Kilo base

Kilo base

kDa

Kilo Dalton

Kilo Dalton

ĐC

Đối chứng

OD

Optical density

Mật độ quang

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi tổng hợp

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE
TLC

Sodium dodecyl sulfate
Điện di trên gel
polyacrylamide gel electrophoresis polyacrylamide có SDS
Thin Layer Chromatography
Sắc ký lớp mỏng

v/v

Volume/volume

Thể tích/thể tích

w/v

Weight/volume

Khối lượng/thể tích

DNS

Acid dinitrosalicylic

HPLC

High performance liquid

chromatography

CE

Carbohydrate esterase

AE
FAE
rpm

Enzyme acetyl esterase
Enzyme Feruloy esterase
Revolutions per minute

Số vòng/phút

Gram dry sustrate

Nhiên liệu sinh học
Gam cơ chất khô

NLSH
gds
IEF
CT

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Điểm đẳng điện
Công thức

Isoelectric focusing

KXĐ

Không xác định

xi


MỞ ĐẦU

Hiện nay, nhu cầu năng lượng luôn là vấn đề nan giải của bất kì quốc gia nào trên
thế giới. Trong số các nguồn năng lượng thay thế dầu mỏ đang sử dụng hiện nay (năng
lượng gió, mặt trời, hạt nhân,…), năng lượng sinh học đang là xu thế phát triển tất yếu,
nhất là ở các nước nông nghiệp và nhập khẩu nhiên liệu. Dựa vào nguyên liệu sản xuất,
người ta chia NLSH thành 4 thế hệ: Thế hệ I (từ tinh bột như ngơ, sắn, mía đường), thế
hệ II (từ sinh khối thực vật như thân cây lúa, ngơ, lúa mỳ, bã mía), thế hệ thứ III (từ các
loài vi tảo) và thế hệ IV - nhiên liệu tiên tiến (dựa trên các chuyển hóa sinh - hóa, nhiệt –
hóa). Chúng phân thành ba nhóm là dầu sinh học (biodiesel), khí sinh học (biogas) và
bioethanol (ethanol sinh học). Trong đó, bioethanol đang rất được quan tâm do từ ngày
01/01/2018 chính phủ ban hành quyết định sử dụng xăng sinh học E5 (5% bioethanol)
thay thế xăng RON 92 trên toàn quốc. Do vậy, nhu cầu sản xuất và tiêu thụ bioethanol
ngày càng tăng cao.
Việc sản xuất nhiên liệu sinh học nói chung và bioethanol theo thế hệ I từ nguồn
tinh bột (sắn, bắp) và đường (mía) rất phổ biến. Bên cạnh đó, bioethanol cịn được sản
xuất từ lignocellulose theo thế hệ thứ II. Nguồn nguyên liệu này chủ yếu bao gồm: gỗ,
rơm lúa, bã mía, thân cây ngơ…là các sinh khối có thành phần lignocellulose phổ biến
nhất trong số các phụ phẩm công-nông nghiệp. Tuy nhiên, nguồn nguyên liệu này sử
dụng chưa hiệu quả mà chủ yếu theo phương pháp truyền thống như làm cơ chất nuôi

nấm, thức ăn gia súc, ủ làm phân bón, đốt... Do vậy, việc tận dụng nguồn cơ chất này để
sản xuất bioethanol là một giải pháp thích hợp, đặc biệt là với các quốc gia với nền nông
nghiệp như Việt Nam. Mặc dù nguồn nguyên liệu giàu lignocellulose rất phổ biến nhưng
những khó khăn để có thể tận dụng hiệu quả nguồn sinh khối này cho sản xuất các sản
phẩm có giá trị cao hơn chủ yếu do lignocellulose có cấu trúc phức tạp, khó chuyển hóa
sinh học. Việc sản xuất bioethanol từ nguồn sinh khối phụ phẩm công - nông nghiệp một
mặt tận dụng nguồn nguyên liệu rồi rào thay thế nguồn nguyên liệu truyền thống, mặt
khác tạo thành nguồn năng lượng sạch giúp giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường do đốt
hoặc xử lý theo phương pháp truyền thống gây ra, đồng thời không ảnh hưởng tới an ninh
1


lượng thực quốc gia. Đây cũng chính là một trong những khâu then chốt trong công nghệ
lên men sản xuất bioethanol thế hệ II. Theo phương thức truyền thống có thể sử dụng
phương pháp hóa học (axít/bazơ) hoặc hóa lý (nghiền/nổ hơi). Tuy nhiên, một trong
những hướng đi mới để giải quyết nhiệm vụ này là sử dụng xúc tác sinh học (enzyme từ
các loài nấm), chúng được biết là có hệ enzyme xúc tác hiệu quả giúp chúng phân hủy tốt
lignocellulose để giải phóng các đơn vị đường cần thiết cho quá trình lên men bioethanol.
Nhìn chung các enzyme thủy phân lignocellulose hoạt động yếu khi sử dụng trực tiếp
trên cơ chất thơ và việc xúc tác chuyển hóa hiệu quả cơ chất cần kết hợp nhiều enzyme
có tác dụng hiệp đồng. Do vậy, mục đích của đề tài luận án “Nghiên cứu phối hợp
esterase và hệ enzyme thủy phân từ nấm trong chuyển hóa phụ phẩm cơng-nơng
nghiệp để thu nhận bioethanol” nhằm sử dụng hỗn hợp các enzyme phù hợp (“enzyme
cocktail”) bao gồm hệ enzyme esterase (acetyl esterase và feruloyl esterase), enzyme
thủy phân và/hoặc oxy hóa từ nấm để phân hủy các cấu trúc polymer phức tạp để lên men
thu nhận bioethanol.
Mục tiêu nghiên cứu:
Hiên nay, khả năng chuyển hóa các vật liệu thơ từ sinh khối giàu lignocellulose
bằng các phương pháp truyền thống còn nhiều mặt hạn chế. Do vậy, mục tiêu của đề tài
luận án nhằm khai thác nguồn đa dạng xúc tác sinh học (enzyme thủy phân) từ nấm để

chuyển hóa hiệu quả sinh khối giàu lignocellulose từ các phụ phẩm công-nông nghiệp
thành các đường (C5 và C6) có khả năng lên men cho sản xuất bioethanol. Đặc biệt, luận
án sử dụng “enzyme cocktail” xúc tác hiệp đồng để tăng khả năng chuyển hóa sinh học.
Trong đó, nghiên cứu sử dụng carbohydrate esterase [feruloyl esterase (FAE), acetyl
esterase (AE)] nhằm phối hợp với các enzyme tấn cơng mạch chính (cellulase/xylanase)
và mạch nhánh để thủy phân cấu trúc lignocellulose. Mục tiêu tiếp theo là đánh giá khả
năng lên men nguồn dịch đường sau thủy phân bằng “enzyme cocktail” thành bioethanol.
Nội dung nghiên cứu:
Để đạt được mục tiêu trên, các nội dung nghiên cứu chính đã thực hiện:
-

Phân lập, sàng lọc và tuyển chọn các chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp
enzyme carbohydrate esterase [feruloyl esterase (FAE), acetyl esterase (AE)];
2


-

Sinh tổng hợp và tinh sạch protein enzyme hoạt tính FAE và AE từ môi trường
nuôi cấy nấm và xác định đặc tính của enzyme tinh sạch.

-

Chuyển hóa vật liệu lignocellulose thành các đường đơn (hexose và pentose) có
khả năng lên men sử dụng đơn enzyme và “enzyme cocktail” hoạt tính
cellulase/xylanase và esterase xúc tác hiệp đồng.

-

Tối ưu quy trình chuyển hóa và nghiên cứu sản xuất bioethanol từ dịch đường

chuyển hóa quy mơ phịng thí nghiệm.

Những đóng góp mới của luận án:
-

44 chủng nấm thuộc 13 họ thuộc ngành nấm Túi (Ascomycota) và nấm Đảm
(Basidiomycota) được phân lập và sàng lọc khả năng sinh tổng hợp carbohydrate
esterase (feruloyl esterase và acetyl esterase).

-

Lần đầu tiên, enzyme feruloyl esterase từ nấm Alternaria tenuissima và acetyl
esterase từ nấm Xylaria polymorpha được phân lập và tinh sạch từ môi trường nuôi
cấy giàu lignocellulose. Trong đó, feruloyl esterase từ Alt. tenuissima (AltFAE) có
trọng lượng phân tử Mw = 30,3 kDa với hoạt tính đặc hiệu 11,2 U/mg. Acetyl esterase
từ X. polymorpha (XpoAE) có trọng lượng phân tử Mw = 44 kDa với hoạt tính đặc
hiệu 13,1 U/mg. Hai enzyme này có độ bền cao trong khoảng nhiệt độ 40 đến 450C
và pH 5,0.

-

Enzyme carbohydrate esterases tinh sạch kết hợp với enzyme thương mại (hỗn hợp
“enzyme cocktail” hoạt tính cellulase/xylanse (cell/xyl)) được tối ưu thành phần và sử
dụng để chuyển hóa sinh khối thực vật thơ (vd. mía bã mía, rơm rạ, bột gỗ, rong
túi…) thành các đường đơn có khả năng lên men bioethanol. Trong đó, bã mía được
chọn làm cơ chất phù hợp để sản xuất các đường C5/C6 (vd: glucose, xylose).

-

Bằng quy hoạch thực nghiệm đã xác định điều kiện tối ưu cho chuyển hóa bã mía

bằng “enzyme cocktail” là ở 400C, pH 5.0, trong 48 giờ và hoạt độ enzyme là
cell/xyl: 100 U/g, AltFAE: 7,56 U/g, XpoAE: 10,8 U/g sinh khối khơ. Khi đó, tổng
các đường lên men là 251,86 mg/g. Kết hợp xử lý bã mía bằng “enzyme cocktail” và
axit H2SO4 lỗng (0,1%) thì các đường lên men sinh ra là 319,5 mg/g, đạt hiệu suất
49,8%.
3


-

Các đường đơn thu được bằng chuyển hóa enzyme đã được chứng minh có khả năng
lên men bioethanol (cồn sinh học) bởi chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae với
hàm bioethanol thu được 178ml/kg bã mía, đạt hiệu suất 79,8% so với lý thuyết.

Ý nghĩa khoa học thực tiễn của luận án:
Bên cạnh sản xuất bioethanol từ nguồn tinh bột (sắn, bắp) và đường (mía),
bioethanol có thể được sản xuất từ lignocellulose. Lignocellulose là loại sinh khối
(biomass) phổ biến nhất trong sinh quyển. Sản xuất bioethanol từ nguồn sinh khối là một
giải pháp thích hợp, đặc biệt là với các quốc gia với nền nông nghiệp như Việt Nam.
Hàng năm sản xuất công-nông nghiệp trong nước sản sinh hàng trăm triệu tấn phụ phẩm
giàu lignocellulose là nguồn cung cấp nguyên liệu vô cùng dồi dào cho sản xuất năng
lượng sạch, mặt khác giải quyết vấn đề ô môi trường do không được xử lý hay loại bỏ
theo phương pháp truyền thống.
Theo các tài liệu công bố và kinh nghiệm nghiên cứu của chúng tơi cho thấy, nhìn
chung các enzyme thủy phân lignocellulose hoạt động yếu khi sử dụng trực tiếp (không
qua tiền xử lý) trên cơ chất thơ. Điều này có thể khắc phục bằng việc sử dụng hỗn hợp
các enzyme phù hợp (“enzyme cocktail”) bao gồm hệ enzyme thủy phân và/hoặc oxy hóa
để phân hủy các cấu trúc polymer phức tạp. Ngồi ra, sàng lọc enzyme bằng ni cấy vi
sinh vật có vai trị quan trọng trong việc tìm ra các enzyme mới với hoạt tính xúc tác thủy
phân cao và các đặc tính hữu ích.

Đề tài luận án khơng nhằm giải quyết được tồn bộ các bước từ chuyển hóa vật
liệu sinh khối thơ thành bioethanol mà mục tiêu chính nhằm khai thác và sử dụng nguồn
xúc tác sinh học từ nấm và tối ưu hóa cho chuyển hóa sinh khối thành đường có khả năng
lên men. Đây cũng chính là một trong những khâu then chốt trong công nghệ lên men sản
xuất bioethanol thế hệ II.

4


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Phụ phẩm công - nông nghiệp giàu lignocellulose
1.1.1. Nguồn gốc và thành phần
Phụ phẩm cơng-nơng nghiệp là một dạng sinh khối có thành phần lignocellulose
phổ biến nhất trong số các phụ phẩm công-nông nghiệp của Việt Nam. Hiện nay, mỗi
năm nguồn sinh khối này sản sinh ra hàng trăm triệu tấn từ quá trình sản xuất công-nông
nghiệp như: rơm rạ, bã cà phê, mùn gỗ, thân cây ngô, vỏ trấu và hàng chục triệu tấn bã
mía thường được sử dụng để đun nấu (lãng phí nhiệt trên 80%), cơ chất để trồng nấm,
thức ăn gia súc và phần lớn được đốt bỏ thu tro làm phân bón [1]. Việc đốt này gây ra
hiện tượng sương mù quang hóa rất độc hại là nguyên nhân gây nên một số bệnh về mắt,
phổi. Nguy hiểm hơn, chúng gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng ở vùng ven các thành
phố lớn và dọc các đường cao tốc làm giảm tầm nhìn dễ dẫn đến tai nạn giao thơng. Đặc
biệt, gây lãng phí lượng lớn chất hữu cơ có giá trị, trong khi đó nếu khai thác sử dụng
hợp lý thì nguồn sinh khối này đem lại lợi ích vơ cùng lớn [2,3].
Lignocellulose ngày càng có vai trị quan trọng về mặt kinh tế khi được sử dụng
như vật liệu thô cho các ứng dụng trong công nghệ sinh học và cơng nghiệp, hơn nữa
chúng chính là cơ sở để thúc đẩy việc nghiên cứu tận dụng sinh khối trong các mơ hình
sản xuất tinh chế và chiến lược cho sự phát triển bền vững [4]. Các polymer sinh học này
có thể thấy ở tất cả các hệ sinh thái trên đất liền và đây là nguồn hợp chất hữu cơ tái tạo
lớn nhất trong sinh quyển. Xét về nguồn gốc, thành phần và mức độ polymer hóa, có thể

phân biệt các loại lignocellulose như: từ cây gỗ cứng, gỗ mềm cũng như từ cây trồng
hàng năm (đặc biệt là cây lúa, ngũ cốc, các loại cỏ, cây mía…) và thân cây thảo [5,6].
Lignocellulose là một phức hợp polyme thành tế bào ở thực vật, chiếm 60% tổng
sinh khối thực vật trên trái đất, bao gồm các thành phần chính là các polymer
carbohydrate (cellulose, hemicellulose) và một polymer thơm (lignin), trong đó cellulose
và hemicellulose chiếm tỉ lệ cao. Cellulose chiếm phần lớn, khoảng từ 40% - 50%, còn
hai hợp chất hemicellulose và lignin lần lượt chiếm khoảng 20 - 40% và 20 - 35% khối
5


lượng khô của cơ thể thực vật (Bảng 1.1) [1]. Ngồi các thành phần này, Lilholt cịn cho
rằng pectin cũng là thành phần chính của lignocellulose thành tế bào, đặc biệt là ở các
cấu trúc sợi thực vật không phải thành phần gỗ [7].
Bảng 1.1. Thành phần một số nguồn sinh khối giàu lignocellulose [1]
Nguồn
lignocellulose

Cellulose
(%)

Hemicellulose
(%)

Lignin
(%)

Thành phần
khác (%)

Gỗ cứng

45-47

25-40

20-25

0,8

Gỗ mềm

40-45

25-29

30-36

0,5

Cỏ

25-40

35-50

-

-

Bã mía

40

24

25

-

Lõi ngơ

45

35

15

Rơm rạ

35

25

12

Bột giấy

50-70

12-20

6-10

Rơm lúa mì

30

50

20

Phế thải nơng
nghiệp khác

37-50

35-50

5-15

12-16

Hình 1.1. Cấu trúc của lignocellulose [8]
Lignocellulose là một vật liệu khó thủy phân do chúng có các liên kết
polysaccharid (cellulose và hemicellulose), liên kết ester và ete (lignin) tạo nên cấu trúc
rất bền vững có độ cứng và độ bền cơ học cao (Hình 1.1). Xét về thành phần
lignocellulose bao gồm:
6

Cellulose:
Cellulose là một polymer mạch thẳng, có cơng thức cấu tạo là (C6H10O5)n. Các
đơn phân hoàn toàn cấu tạo từ đường D-glucose liên kết với nhau bởi liên kết β-1,4glucoside với số lượng lên tới hơn 10.000 đơn vị. Cấu trúc liên kết thẳng cho phép hình
thành liên kết hydro trong và giữa phân tử tạo ra các vi sợi từ 36 chuỗi cellulose xếp song
song, hay cấu trúc tinh thể của cellulose. Mức độ trùng hợp của cellulose tự nhiên có thể
đạt 10.000-14.000 đơn vị glucose trên phân tử, khối lượng tương ứng là 1,5 triệu dalton
với chiều dài phân tử có thể lớn hơn hoặc bằng 5µm [9].
Giữa các chuỗi cellulose có rất nhiều gốc -OH tạo nên rất nhiều liên kết hydro
giúp ổn định sợi cellulose, làm cho sợi cellulose rất bền vững, khó thủy phân.

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của cellulose [10]
Sợi cellulose có thể kết hợp với nhau một cách chặt chẽ, có trật tự hình thành nên
vùng có cấu trúc tinh thể (Hình 1.2). Bên cạnh đó cũng có một số sợi cellulose kết hợp
một cách ngẫu nhiên hình thành nên vùng có cấu trúc vơ định hình. Từ đó cho thấy các
dung mơi và các chất hóa học rất khó xâm nhập vào vùng tinh thể, nhưng lại dễ dàng xâm
nhập vào vùng vơ định hình [11].
Hemicellulose:
Hemicellulose là một loại polymer phức tạp và phân nhánh, độ trùng hợp khoảng
70 - 200 DP. Hemicellulose chứa cả đường 6 gồm D-glucose, D-mannose, D-galactose
và đường 5 gồm D-xylose và L-arabinose. Thành phần cơ bản của hemicellulose là β-D
xylopyranose, liên kết với nhau bằng liên kết β-(1,4). Cấu tạo của hemicellulose khá
phức tạp và đa dạng tùy vào nguyên liệu, tuy nhiên có một vài điểm chung bao gồm [12]:

7


Mạch chính của hemicellulose được cấu tạo từ liên kết β-(1,4), xylose là thành
phần quan trọng nhất và nhóm thế phổ biến nhất là nhóm acetyl-O- liên kết với vị trí 2
hoặc 3.
Mạch nhánh cấu tạo từ các nhóm đơn giản, thông thường là disaccharide hoặc

trisaccharide. Sự liên kết của hemicellulose với các polysaccharide khác và với lignin là
nhờ các mạch nhánh này. Cũng vì hemicellulose có mạch nhánh nên tồn tại ở dạng vơ
định hình và vì thế dễ bị thủy phân. Tùy theo loại gỗ (gỗ cứng, gỗ mềm) mà chúng có đặc
điểm hemicellulose khác nhau:
Gỗ cứng chủ yếu có hai loại hemicellulose:
Acetyl-4-O-methyglucuronoxylan, là một loại polymer có mạch chính gồm β-D
xylopyranose liên kết với nhau bằng liên kết β-D(1,4). Trong đó 70% các nhóm -OH ở vị
trí C2 và C3 bị acetyl hóa, 10% các nhóm ở vị trí C2 liên kết với acid 4-O-methyl-Dglucuronic. Gỗ cứng còn chứa glucomannan, polymer này chứa một tỉ lệ bằng nhau β-Dglucopyranose và β-D-mannopyranose.
Loại thứ hai có mạch chính là β-D-galactopyranose, phân nhánh. Loại
hemicellulose này tạo liên kết -O tại nhóm OH ở vị trí C6 với α-L-arabinose, β-Dgalactose hoặc acid β-D-glucoronic [13].
Gỗ mềm cũng bao gồm hai loại hemicellulose chính:
Loại quan trọng nhất là galactoglucomannan, đây là polymer cấu thành từ các
phân tử D-mannopyranose liên kết với D-glucopyranose bằng liên kết β-(1,4) với tỉ lệ hai
monomer tương ứng là 3:1. Tuy nhiên, tỉ lệ này thay đổi tùy theo loại gỗ.
Arabino-4-O-methylglucuronoxylan, cấu tạo từ các D-xylopyranose, các monomer
này bị thế ở vị trí 2 bằng acid 4-O-methyl-glucuronic, ở vị trí 3 bằng α-Larabinofuranose.
Đối với cỏ, 20-40% hemicellulose là arabinoxylan. Polysaccharide này cấu tạo từ
các D-xylopyranose, OH ở C2 bị thế bởi acid 4-O-methylglucuronic. OH ở vị trí C3 sẽ tạo
mạch nhánh với α-L-arabinofuranose. Cấu tạo phức tạp của hemicellulose tạo nên nhiều
tính chất hóa sinh và lý sinh cho cây [13].

8


Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của xylan [8]
Lignin:
Lignin là một polyphenol có cấu trúc mở. Trong tự nhiên, lignin chủ yếu đóng vai
trị chất liên kết trong thành tế bào thực vật, liên kết chặt chẽ với mạng cellulose và
hemicellulose. Rất khó để có thể tách lignin ra hồn toàn. Lignin là polymer, được cấu
thành từ các đơn vị phenylpropene, vài đơn vị cấu trúc điển hình được đề nghị là:

guaiacyl (G), chất gốc là rượu trans-coniferyl; syringly (S), chất gốc là rượu transsinapyl; p-hydroxylphenyl (H), chất gốc là rượu trans-p courmary. Lignin là một hợp chất
cao phân tử có cấu trúc vơ định hình khác với cellulose, lignin có chứa các nhóm
hydroxyl (-OH), nhóm methoxyl (-OCH3) và nhân benzen bao gồm các đơn vị cơ bản:
coniferyl alcohol, sinapyl alcohol và p-coumaryl alcohol, tỉ lệ ba loại rượu này trong các
loại thực vật khác nhau thì khác nhau (Hình 1.4). Lignin đặc biệt khó phân hủy do các
phân tử được nối với nhau bởi liên kết este và liên kết carbon, tạo thành một mạng lưới
liên kết ngang rộng rãi trong các tế bào [13].

Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của lignin [13]
9


Những nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng, lignin hoàn tồn khơng đồng nhất trong
cấu trúc. Lignin dường như bao gồm vùng vơ định hình và các vùng có cấu trúc hình
thn hoặc hình cầu. Lignin có liên kết hóa học với thành phần hemicellulose và ngay cả
với cellulose (không nhiều) độ bền hóa học của những liên kết này phụ thuộc vào bản
chất liên kết và cấu trúc hóa học của lignin và những đơn vị đường tham gia liên kết.
Carbon alpha (Cα) trong cấu trúc phenyl propane là nơi có khả năng tạo liên kết cao nhất
với khối hemicellulose. Ngược lại, các đường nằm ở mạch nhánh như arabinose,
galactose, và acid 4-O-methylglucuronic là các nhóm thường liên kết với lignin. Các liên
kết có thể là ether, ester (liên kết với xylan qua axít 4-O-methyl-D-glucuronic) hay
glycoxit (phản ứng giữa nhóm khử của hemicellulose và nhóm OH phenolic của lignin).
Cấu trúc hóa học của lignin rất dễ bị thay đổi ở nhiệt độ cao và pH thấp, như quá trình
tiền xử lý bằng hơi nước hoặc trong mơi trường axít/kiềm. Ở nhiệt độ phản ứng cao hơn
2000C, lignin bị kết khối thành những phần riêng biệt và tách ra khỏi cellulose [15,16].
1.1.2. Nguồn nguyên liệu bã mía
1.1.2.1. Nguồn gốc và hiện trạng sử dụng bã mía ở Việt Nam
Về mặt tài nguyên tự nhiên như khí hậu, đất đai, Việt Nam được đánh giá là nước
có tiềm năng để phát triển cây mía. Việt Nam có đủ đất đồng bằng, lượng mưa nói chung
tốt (1400 mm đến 2000 mm/năm), nhiệt độ phù hợp, độ nắng thích hợp. Trên phạm vi cả

nước, các vùng tây nguyên và vùng Đông Nam Bộ, đặc biệt là vùng duyên hải Nam
Trung Bộ có khả năng rất tốt cho trồng mía đường.
Theo Hiệp hội Mía đường Việt Nam (VSSA), hiện nay mỗi năm các nhà máy
đường ép trên 15 triệu tấn mía, phát sinh ra 4,5 triệu tấn bã mía. Tại nhà máy đường
Bourbon (Tây Ninh) với cơng suất chế biến 8.000 tấn mía/ngày, thải ra khoảng 2.800 tấn
bã mía/ngày. Cơng ty đường Biên Hịa (Đồng Nai) có 3 nhà máy, trong đó 2 nhà máy sử
dụng mía làm ngun liệu với tổng cơng suất 5.000 tấn mía/ngày. Mỗi năm, sản lượng
mía cây là 600.000 - 750.000 tấn, tương đương 174.000 - 217.500 tấn bã. Một phần bã
mía mang đốt tạo thành điện cho hoạt động của nhà máy, phần cịn lại vẫn khơng sử dụng
hết, tồn dư rất lớn. Việc tận dụng toàn bộ lượng bã mía thải bỏ sẽ góp phần giảm bớt áp
lực cho các nguồn nguyên liệu sinh học khác như: cây bắp, khoai mì, gỗ...[17].
10


Hình 1.5. Hiện trạng sản xuất mía đường các vùng của Việt Nam [18]
Theo số liệu thống kê của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, niên vụ 2016 2017 diện tích mía cả nước chỉ đạt 268.300 ha, giảm 16.067 ha so với vụ trước. Trong đó,
diện tích ở vùng nguyên liệu tập trung của 25 tỉnh có nhà máy đường là 257.600 ha, giảm
15.205 ha. Đối với những diện tích có hợp đồng và tiêu thụ sản phẩm chỉ đạt 218.343 ha,
chiếm 80% tổng diện tích cả nước và giảm sâu so với kế hoạch đầu vụ.
Qua khảo sát đánh giá, Tây Nguyên là vùng có diện tích, năng suất ổn định nhất
(diện tích 56.700 ha, tăng 371ha; năng suất bình qn 62,6 tấn/ha). Trong khi đó, vùng
Duyên Hải Nam Trung bộ với điều kiện tự nhiên bất lợi, đất canh tác xấu, thường xuyên
đối mặt với hạn hán nên năng suất, chất lượng cho kết quả thấp nhất.
Theo số liệu tổng hợp của các nhà máy đường trên cả nước, vụ 2017 - 2018 tổng
diện tích đã được ký hợp đồng đầu tư và bao tiêu sản phẩm là 248.930 ha, tăng 30.587
ha. Sản lượng mía ép đạt 15,17 triệu tấn, sản lượng đường đạt 1,42 triệu tấn, trong đó
đường tinh luyện là 600.000 tấn [19].
1.1.2.2. Các vấn đề mơi trường từ bã mía
Lượng sinh khối từ phụ phẩm cơng-nơng nghiệp nói chung và bã mía nói riêng
phát sinh sau mỗi vụ thu hoạch là rất lớn, nếu khơng có biện pháp xử lý và quản lý hiệu

quả thì sẽ gây ơ nhiễm mơi trường, đồng thời lãng phí nguồn nguyên liệu phục vụ cho
sản xuất cũng như chăn nuôi [20].
Trong những năm gần đây, do không tận dụng hợp lý các nguồn phụ phẩm này
đúng cách, đồng thời áp dụng phương pháp xử lý tiêu cực đang gây vấn nạn to lớn tới
11


môi trường như việc chất đống để đốt hoặc ủ lưu trong thời gian dài. Sau mỗi vụ mùa, bã
mía thường được đốt ở khắp nơi, khói gây ơ nhiễm ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức
khỏe người dân và góp phần làm biến đổi khí hậu, phế phẩm ủ đống để lưu lâu ngày gây
hôi thối và ô nhiễm môi trường nước, khơng khí rất nghiêm trọng, đặc biệt là bã mía với
thành phần giàu đường Sucroza và mật rỉ đường. Bên cạnh đó, sự tiêu hủy và xử lý
khơng phù hợp nguồn sinh khối này gây lãng phí nguồn nguyên liệu tái sinh có thể sử
dụng lại phục vụ chính cho nơng nghiệp [21].
Theo ước tính, nếu đốt 1 tấn bã mía khơ thì sẽ thải ra 36,32 kg khí CO, 4,54 kg
hydrocarbon, 3,18 kg bụi tro và 56 kg CO2, các thành phần này góp phần gây hiệu ứng
nhà kính, gây ơ nhiễm mơi trường khơng khí. Từ những bất cập trên dẫn đến tình trạng ơ
nhiễm mơi trường do bã mía gây ra ở nước ta ngày càng diễn ra nghiêm trọng hơn [21,
22].
Bã mía là nguồn nguyên liệu phong phú cho việc sản xuất bioethanol nếu chúng ta
biết ứng dụng hợp lý tiến bộ khoa học cơng nghệ. Hiện nay có nhiều hướng tiếp cận,
trong đó có một giải pháp đầy tiềm năng là ứng dụng xúc tác sinh học sử dụng các
enzyme thủy phân từ vi sinh vật (nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn) để chuyển hóa chúng thành
những dạng năng lượng có ích với hiệu suất cao.
1.2. Chuyển hóa vật liệu giàu lignocellulose
1.2.1. Q trình thủy phân vật liệu giàu lignocellulose
Quá trình thủy phân lignocellulose được thực hiện bởi axít, kiềm hoặc hỗn hợp
enzyme thủy phân. Vào cuối thế kỉ 19 và đầu thế kỉ 20, quá trình thủy phân được thực
hiện bởi phản ứng giữa cellulose với axít. Axít lỗng được sử dụng dưới điều kiện nhiệt
độ và áp suất cao, còn axit đậm đặc được sử dụng ở nhiệt độ thấp và áp suất khí quyển.

Q trình thủy phân bằng axít lỗng xảy ra ở nhiệt độ và áp suất cao dẫn đến sự tạo thành
các chất độc hại có thể ảnh hưởng khơng tốt đến q trình lên men như các axít hữu cơ có
trọng lượng phân tử thấp, dẫn xuất furan và các hợp chất vơ cơ. Các mắt xích của
cellulose có thể bị phân cắt thành các phân tử đường glucose riêng lẻ bằng hệ cellulase.
Xét về bản chất quá trình thủy phân được thực hiện theo phương trình phản ứng:
nC6H12O6.

(C6H10O5)n + nH2O
12


Ngày nay, người ta quan tâm nhiều theo hướng nghiên cứu ứng dụng kết hợp xử lý
hóa học và xúc tác sinh học để thủy phân nguồn vật liệu giàu lignocellulose thay cho các
phương pháp hóa lý truyền thống. Sự kết hợp này giúp cho quá trình thủy phân đạt hiệu
quả cao hơn.
Khi có sự tham gia xúc tác sinh học của enzyme thì cơ chất sẽ được hoạt hóa
mạnh. Cơ chất tương tác với enzyme do sự cực hóa, sự chuyển dịch của các electron, sự
biến dạng các liên kết. Từ đó làm thay đổi động năng, thế năng dẫn tới cơ chất trở nên dễ
dàng tham gia vào các phản ứng hơn. Quá trình xúc tác của enzyme xảy ra qua ba giai
đoạn [23].
E +S

ES

E+P

Trong đó: E - enzyme; S - cơ chất; P - sản phẩm
Giai đoạn thứ nhất: Enzyme sẽ kết hợp với cơ chất bằng những liên kết yếu, nhờ
đó sẽ tạo ra phức hợp ES, phức này không bền. Giai đoạn thường này xảy ra rất nhanh và
địi hỏi một ít năng lượng.

Giai đoạn thứ hai: Cơ chất bị biến đổi, dẫn tới làm căng, phá vỡ các liên kết đồng
hóa trị.
Giai đoạn thứ ba: Sản phẩm được tạo thành, tách ra khỏi enzyme, enzyme được
giải phóng và trở lại trạng thái tự do.
Các loại liên kết chủ yếu được tạo thành giữa E và S trong phức hợp ES là: tương
tác tĩnh điện, liên kết hydro, tương tác Van der Waals. Mỗi loại liên kết đòi hỏi những
điều kiện khác nhau và chịu ảnh hưởng khác nhau khi có nước.
Cellulose và hemicellulose khó thủy phân hơn tinh bột do tinh bột chứa
amylopectin có cấu trúc phân nhánh nên dễ dàng tiếp xúc với enzyme. Trong khi
cellulose tinh thể tạo cấu trúc thẳng, khoảng cách giữa các phân tử thấp nên enzyme tiếp
xúc với các phân tử cellulose khó khăn hơn. Bên cạnh đó, việc thủy phân liên kết α - 1,4
– glycosidic trong tinh bột dễ dàng hơn liên kết β- 1,4- glycosidic trong cấu trúc của
cellulose [23].
Q trình chuyển hóa bao gồm sự thủy phân các thành phần chính của
lignocellulose để tạo ra những loại đường (hexose – C6 và pentose – C5) có thể lên men
13


bioethanol. Giai đoạn tiền xử lý là cần thiết để nâng cao hiệu quả quá trình thủy phân
cellulose thành các đường đơn. Quá trình này thường được thực hiện bởi axít hoặc
enzyme cellulase và q trình lên men được thực hiện bởi vi khuẩn hoặc nấm men [24].
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân cellulose bao gồm độ xốp của vật liệu,
kích thước vi sợi cellulose và sự có mặt của lignin, hemicellulose trong vật liệu [25]. Sự
hiện diện của lignin và hemicellulose làm cho hoạt động của cellulase trở nên khó khăn
hơn, do đó hiệu suất của quá trình thủy phân sẽ thấp. Quá trình tiền xử lý làm thay đổi
cấu trúc và kích thước của sinh khối, cũng như thành phần hóa học của nó, sao cho quá
trình thủy phân các hydrocarbon thành các loại đường đơn diễn ra nhanh chóng và đạt
hiệu quả cao. Quá trình thủy phân sẽ đạt hiệu quả cao bằng việc loại bỏ lignin, giảm kích
thước vi sợi cellulose, tăng cường độ xốp thơng qua q trình tiền xử lý [26]. Các loại
đường 6 carbon (hexoses) như D-glucose, D-galactose, và D-mannose dễ dàng lên men

thành bioethanol bởi hoạt động tự nhiên của nhiều sinh vật. Để chuyển hóa các
carbohydrate (cellulose và hemicellulose) trong lignocellulose thành bioethanol, các
polymer phải bị bẻ gãy thành những phân tử đường nhỏ hơn trước khi vi sinh vật có thể
hồn tất q trình chuyển hóa. Do vậy, bước tiền xử lý là bắt buộc để q trình đường
hóa glucose có thể diễn ra hiệu quả [27]. Do vậy, mục đích q trình tiền xử lý là:
- Phá vỡ cấu trúc tinh thể của cellulose vì trong tự nhiên hình thành cấu trúc tinh
thể chiếm khoảng 50-90%.
- Giảm sự bao bọc của lignin quanh cellulose do lignin cùng với hemicellulose tạo
thành cấu trúc mô vững chắc. Những mơ được bền hóa với lignin trong đó lignin đóng
vai trị kết dính những sợi cellulose. Tuy nhiên việc loại bỏ lignin luôn kèm theo sự phân
hủy hemicellulose ngay cả trong phương pháp tiền xử lý nguyên liệu bằng kiềm và axít ở
nhiệt độ thấp [28], loại bỏ được 70% lignin thì cũng có 5% hemicellulose bị hịa tan .
- Tăng mức độ acetyl hóa của hemicellulose: Đây là yếu tố ít được quan tâm,
xylan – thành phần hemicellulose chính trong gỗ cứng và cây thân cỏ - bị acetyl hóa với
tỉ lệ rất cao. Tỉ lệ cellulose bị thủy phân tăng lên 2-3 lần [29, 30].

14