Xây dựng phương pháp định lượng 2MCPD ester và 3MCPD ester trong sữa bột công thức bằng GC MSMS

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

-----  ------

NGUYỄN NHƯ THƯỢNG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG 2-MCPD ESTER VÀ
3-MCPD ESTER TRONG SỮA BỘT
CÔNG THỨC BẰNG GC-MS/MS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN NHƯ THƯỢNG
MSV: 1401600

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG 2-MCPD ESTER VÀ
3-MCPD ESTER TRONG SỮA BỘT
CÔNG THỨC BẰNG GC-MS/MS
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. ThS. Vũ Ngọc Tú
2. ThS. Nguyễn Thị Thùy Linh

Nơi thực hiện:
Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh
thực phẩm Quốc gia

HÀ NỘI – 2019


LỜI CẢM ƠN
Đề tài này được thực hiện tại Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm
Quốc gia, 65 Phạm Thận Duật, Mai Dịch, Cầu Giấy, Hà Nội.
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Thị Thùy
Linh và ThS. Vũ Ngọc Tú đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong
quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Hóa phân tích trường
Đại học Dược Hà Nội đã truyền đạt, cung cấp cho tôi những kiến thức cần thiết,
bổ ích và thiết thực.
Đồng thời tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh
thực phẩm Quốc gia, TS. Trần Cao Sơn cùng các cán bộ khoa Độc học dị nguyên,
Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện và giúp
đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, đặc
biệt là các bạn Hoàng Mai Anh, Phạm Trung Anh, Vũ Thị Thu Hiền, Lê Công
Trực đã luôn ở bên quan tâm, động viên tôi trong suốt thời gian qua.
Trong quá trình thực hiện đề tài, do trình độ lý luận cũng như kinh nghiệm
thực tiễn còn hạn chế nên đề tài không thể tránh khỏi những thiếu sót. Rất mong
nhận được sự góp ý của thầy cô cùng các bạn sinh viên.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2019
Sinh viên

Nguyễn Như Thượng


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ...................................................................................... 2
1.1. Giới thiệu về dẫn xuất của MCPD ....................................................................... 2
1.1.1. Công thức cấu tạo và tính chất hóa lý ........................................................ 2
1.1.2. Nguồn gốc ................................................................................................... 3
1.1.3. Độc tính ....................................................................................................... 5
1.1.4. Quy định hiện hành về MCPD .................................................................... 8
1.2. Phương pháp xác định các dẫn chất của MCPD .................................................. 8
1.2.1. Phương pháp xử lý mẫu .............................................................................. 8
1.2.1.1. Chiết lỏng – lỏng..................................................................................... 8
1.2.1.2. Làm sạch mẫu ......................................................................................... 9
1.2.1.3. Thủy phân................................................................................................ 9
1.2.1.4. Dẫn xuất ................................................................................................ 10
1.2.2. Phương pháp phân tích ............................................................................. 10
1.3. Tổng quan về sắc ký khí khối phổ ..................................................................... 12
1.3.1. Sắc ký khí ................................................................................................... 12
1.3.2. Detector khối phổ ...................................................................................... 13
CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 15
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ..................................................................................... 15
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................................ 15
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ ........................................................................................ 15
2.1.3. Hóa chất .................................................................................................... 15
2.1.4. Pha dung dịch chuẩn ................................................................................. 16
2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 16
2.2.1. Phương pháp xử lý mẫu ............................................................................ 16
2.2.2. Phương pháp phân tích ............................................................................. 17

2.2.3. Phương pháp thẩm định ............................................................................ 17
2.2.3.1. Độ phù hợp hệ thống............................................................................. 17
2.2.3.2. Tính chọn lọc ........................................................................................ 17
2.2.3.3. Giới hạn pháp hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) .................. 18
2.2.3.4. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn ...................................................... 18
2.2.3.5. Độ lặp lại và độ thu hồi ........................................................................ 19
2.2.4. Phương pháp xử lý kết quả........................................................................ 19
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................ 20


3.1. Khảo sát, lựa chọn các điều kiện GC-MS/MS .................................................. 20
3.1.1. Điều kiện sắc ký khí ................................................................................... 20
3.1.2. Điều kiện khối phổ..................................................................................... 20
3.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu ........................................................................... 21
3.2.1. Khảo sát quy trình chiết lỏng – lỏng ......................................................... 22
3.2.2. Khảo sát quy trình làm sạch...................................................................... 24
3.2.3. Khảo sát quy trình dẫn xuất ...................................................................... 24
3.3. Thẩm định phương pháp .................................................................................... 27
3.3.1. Độ phù hợp hệ thống ................................................................................. 27
3.3.2. Tính chọn lọc ............................................................................................. 28
3.3.3. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) ............................ 30
3.3.4. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn ........................................................... 32
3.3.5. Độ lặp lại và độ thu hồi.............................................................................. 34
3.4. Ứng dụng phân tích mẫu thực tế ........................................................................ 35
3.5. Bàn luận ............................................................................................................. 38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................. 39
Kết luận..................................................................................................................... 39
Kiến nghị .................................................................................................................. 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
STT

Chữ viết tắt

1

AOAC

2

AOCS

3

BfR

4

CE

5

EFSA

6
7
8

ECD
EI
FID

9

GC-MS

10

GC-MS/MS

11
12

IP
IS

13

LC-MS

14

LC-MS/MS

15

LD50

16
17
18
19
20
21
22

LOD
LOQ
MCPD
NCI
NPD
PBA
PCI

23

SCF

24
25

SPE
TCD

26

TDI

27

THF

Nội dung đầy đủ
Association of Official Analytical Communities (Hiệp hội
các cộng đồng phân tích chính thức)
American Oil Chemists' Society (Hiệp hội các nhà hóa dầu
Mỹ )
The German Federal Institute for Risk Assessment (Viện
đánh giá rủi ro liên bang Đức)
Collision energy (Năng lượng va chạm)
European Food Safety Authority (Ủy ban an toàn thực phẩm
Châu Âu)
Electron capture detector (Detector cộng kết điện tử)
Electron impact (Va chạm electron)
Flame ionization detector (Detector ion hóa ngọn lửa)
Gas chromatography mass spectrometry (Sắc ký khí khối
phổ)
Gas chromatography tandem mass spectrometry (Sắc ký khí
khối phổ hai lần)
Identification point (Điểm nhận dạng)
Internal standard (Chất chuẩn nội)
Liquid chromatography mass spectrometry (Sắc ký lỏng khối
phổ)
Liquid chromatography tandem mass spectrometry (Sắc ký
lỏng khối phổ hai lần)
Median lethal dose (Liều chết trung bình)
Limit of Detection (Giới hạn phát hiện)

Limit of Quatification (Giới hạn định lượng)
Monochloropropanediol
Negative chemical ionization (Ion hóa hóa học âm)
Nitrogen phosphorus detector ( Detector nitơ phosphor)
Phenylboronic acid
Positive chemical ionization (Ion hóa hóa học dương)
Scientific Committee for Food (Ủy ban Khoa học về Thực
phẩm Châu Âu)
Solid phase extraction (Chiết pha rắn)
Thermal conductivity detector (Detector dẫn nhiệt)
Tolerable daily intake (mức dung nạp hàng ngày chấp nhận
được)
Tetrahydrofuran


DANH MỤC CÁC BẢNG
STT

Tên bảng

Trang

1

Bảng 1.1. Một số phương pháp xác định MCPD ester

11

2

Bảng 2.1. Giới hạn sai lệch cho phép tối đa của tỷ lệ ion

18

3

Bảng 3.1. Điều kiện khối phổ

21

4

Bảng 3.2. Kết quả đánh giá độ phù hợp hệ thống của 3-MCPD

27

5

Bảng 3.3. Kết quả đánh giá độ phù hợp hệ thống của 2-MCPD

27

6

Bảng 3.4. Số điểm IP của 3-MCPD, 2-MCPD

30

7

Bảng 3.5. Bảng tỷ lệ ion của 3-MCPD, 2-MCPD

30

8

Bảng 3.6. Kết quả đường chuẩn 3-MCPD

32

9

Bảng 3.7. Kết quả đường chuẩn 2-MCPD

33

10
11
12

Bảng 3.8. Độ lặp lại và thu hồi của 3-MCPD và 2-MCPD ở
mức thêm chuẩn 25 µg/kg, 62,5 µg/kg và 125 µg/kg
Bảng 3.9. Kết quả phân tích các mẫu sữa bột thực tế
Bảng 3.10. Đánh giá hàm lượng 3-MCPD ester trong sữa bột
công thức

34
35
37

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
STT

Tên hình

Trang

1

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của 3-MCPD

2

2

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của 2-MCPD

2

3

Hình 1.3. Công thức cấu tạo của 2-MCPD ester và 3-MCPD ester

3

4

Hình 1.4. Sự tạo thành MCPD từ triacylglycerols

4

5

Hình 1.5. Sơ đồ chuyển hóa 3-MCPD trong cơ thể

6

7

Hình 1.6. Các dẫn xuất hình thành từ phản ứng của 3-MCPD với
acetone, PBA và HFBI
Hình 1.7. Sơ đồ hệ thống GC-MS

8

Hình 3.1. Dẫn xuất của MCPD với PBA

20

9

Hình 3.2. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu dự kiến

22

10

Hình 3.3. Biểu đồ khảo sát quy trình chiết lỏng – lỏng

23

11

Hình 3.4. Biểu đồ khảo sát quy trình làm sạch

24

12

Hình 3.5. Biểu đồ khảo sát quy trình dẫn xuất

25

13

Hình 3.6. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu tối ưu

26

6

17

Hình 3.7. Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn
của 3-MCPD
Hình 3.8. Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn
của 2-MCPD
Hình 3.9. Sắc ký đồ của 3-MCPD và 2-MCPD tại giá trị LOD,
LOQ

Hình 3.10. Đường chuẩn 3-MCPD

18

Hình 3.11. Đường chuẩn 2-MCPD

14
15
16

10
12

28
29
31
32
33


ĐẶT VẤN ĐỀ
Monochloropropanediol (MCPD) và các ester của nó với acid béo được hình
thành trong quá trình chế biến và sản xuất các loại thực phẩm như nước tương, xì
dầu, dầu hào, dầu ăn, mỡ, bánh bông lan, sữa… trong điều kiện nhiệt độ cao và
có mặt ion chlor. MCPD ester sau khi vào cơ thể sẽ bị enzym lipase tuyến tụy
thủy phân về dạng tự do. Hiện tại có rất ít thông tin về độc tính của 2-MCPD, tuy
nhiên 2-MCPD có cấu trúc tương tự với 3-MCPD. MCPD đã được chứng minh là
gây ung thư trên động vật thí nghiệm, 3-MCPD đã được phân loại là chất có khả
năng gây ung thư ở người.
Ủy ban an toàn thực phẩm châu Âu (EFSA) đã đồng ý với ước tính 100%

hấp thu 3-MCPD ở người là từ dạng ester. Ủy ban Khoa học về Thực phẩm (SCF)
đã đề xuất mức dung nạp hàng ngày chấp nhận được (TDI) là 2 µg/kg trọng lượng
cơ thể đối với 3-MCPD. Do đó, việc kiểm soát hàm lượng của các MCPD ester
trong các sản phẩm sữa bột công thức là rất cần thiết. Đặc biệt, đối với đối tượng
nhạy cảm như trẻ nhỏ, việc kiểm soát hàm lượng các MCPD ester giúp phòng
ngừa nguy cơ mắc ung thư, bảo vệ sức khỏe của trẻ.
Hiện nay, trên thế giới đã có một số nghiên cứu về các phương pháp xác định
MCPD và các ester của MCPD trong các loại thực phẩm. Tuy nhiên, ở Việt Nam
lĩnh vực này mới được quan tâm gần đây và mới chỉ có phương pháp tiêu chuẩn
áp dụng cho phân tích các mẫu nước tương, xì dầu và dầu hào. Do đó, đề tài “ Xây
dựng phương pháp định lượng 2-MCPD ester và 3-MCPD ester trong sữa bột
công thức bằng GC-MS/MS” được thực hiện với 2 mục tiêu:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng 2-MCPD ester và 3-MCPD
ester trong sữa bột công thức bằng GC-MS/MS
2. Ứng dụng phương pháp để sơ bộ đánh giá hàm lượng 2-MCPD ester và
3-MCPD ester trong một số sản phẩm sữa bột công thức.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.

Giới thiệu về dẫn xuất của MCPD

1.1.1. Công thức cấu tạo và tính chất hóa lý
Trong thực phẩm, dẫn chất MCPD tồn tại chủ yếu ở dạng tự do và dạng
liên kết ester với các acid béo.
❖

3-MCPD

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của 3-MCPD
Danh pháp IUPAC: 3-chloropropane-1,2-diol
Tồn tại dưới dạng hỗn hợp racemic của 2 đồng phân (R) và (S)
Tính chất hóa lý
Khối lượng phân tử: 110,537; là chất lỏng, không màu hoặc có màu vàng;
nhiệt độ nóng chảy: 40oC; nhiệt độ sôi: 213oC (760 mmHg); tỉ trọng: 1,32; tan tốt
trong cả nước, ethanol, methanol, chloroform và ethyl acetat
❖

2-MCPD

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của 2-MCPD
Danh pháp IUPAC: 2-chloropropane-1,3-diol
Tính chất hóa lý

2


Khối lượng phân tử: 110,537; là chất lỏng, không màu hoặc có màu vàng;
nhiệt độ sôi: 146oC (18 mmHg); tỉ trọng: 1,32; tan tốt trong cả nước, ethanol,
methanol, chloroform và ethyl acetat
❖

MCPD ESTERS
Ester có thể được hình thành ở một trong hai hoặc cả hai vị trí hydroxyl tự

do của MCPD với bất kỳ acid béo tự nhiên nào trong mẫu.

Hình 1.3. Công thức cấu tạo của 2-MCPD ester và 3-MCPD ester
-

Ester acid béo của 3-MCPD và 2-MCPD hoà tan trong các dung môi không

phân cực, tan kém trong nước.
-

Có thể được giả định rằng, MCPD monoester có độ hòa tan cao hơn diester

trong dung môi phân cực, việc tăng chiều dài chuỗi acid béo trong cả hai mono
và diester làm giảm độ hòa tan trong dung môi phân cực và làm tăng độ hòa tan
trong các dung môi không phân cực [8].
-

Việc xác định các ester của acid béo với 3-MCPD và 2-MCPD rất phức

tạp do nhiều gốc acid béo và sự đa dạng về cấu trúc.
1.1.2. Nguồn gốc
- Các dẫn chất của MCPD được hình thành trong quá trình chế biến và sản
xuất một số loại thực phẩm. Sự hiện diện của chúng được phát hiện lần đầu tiên
vào những năm 1980, bên trong thành phần của acid thủy phân protein thực vật
3


(hydrolyed vegetable protein) được sử dụng như một chất tăng vị mặn trong thành
phần thực phẩm. Một vài các dẫn chất của MCPD đã được phát hiện trong các hệ
thống mô hình nghiên cứu tiếp theo. Các hợp chất dễ bay hơi chính được tìm thấy
là 3-chloropropan-1-ol, 1,3-dichloropropan-2-ol, 2,3-dichloropropan-1-ol. Các
chloropropanols không bay hơi được tìm thấy là 3-monochloropropane-1,2-diol

(3-MCPD), 2-monochloropropane-1,3-diol (2-MCPD) và các ester của chúng với
acid béo [27].
-

Một số nghiên cứu về việc hình thành MCPD đã được thực hiện, tuy cơ chế

tạo thành MCPD vẫn chưa rõ ràng nhưng kết quả đã chỉ ra rằng trong thực phẩm
có yếu tố: nguồn chất béo, xử lý nhiệt và một lượng nhỏ nước, MCPD được hình
thành từ glycerol và acylglycerols với ion chlorid.
-

Cơ chế hình thành MCPD liên quan đến tạo ion trung gian cyclic

acyloxonium. Glycerol được proton hóa bằng acid hydrochloric ở nhóm hydroxyl
thứ nhất và thứ hai để tạo thành ion alkyloxonium. Nước được loại đi từ vị trí đầu
tiên của cations hydroxyl alkyloxonium tạo thành hỗn hợp racemic của 3-MCPD.
Nếu nước được loại đi từ vị trí thứ 2 của ion hydroxyl alkyloxonium sau đó phản
ứng với chlorid sẽ tạo thành 2-MCPD [7].

Hình 1.4. Sự tạo thành MCPD từ triacylglycerols
4


-

Sự tạo thành 3-MCPD và 2-MCPD từ glycerol và acylglycerols tăng khi

tăng nồng độ muối, đạt mức tối đa khi hàm lượng nước khoảng 15%, và được
hình thành từ triacylglycerols nhiều hơn so với glycerol. Trong trường hợp không
có nước, sẽ không có sự thủy phân trước của nhóm acyl và 3-MCPD được hình

thành bởi sự thay thế trực tiếp nhóm hydroxyl glycerol bằng ion chlorua [8].
-

Dưới điều kiện nhiệt độ cao và sự có mặt của nước, triacylglycerols sẽ thủy

phân tạo hỗn hợp các đồng phân của diacylglycerol (1,2-diacylglycerol, 1,3diacylglycerol) cũng như monoacylglycerol (1-acylglycerol, 2-acylglycerol). Các
acylglycerols phản ứng với chlorua sau đó ester hóa. Tốc độ ester hóa tăng lên ở
nhiệt độ cao nhưng tỉ lệ phân hủy cũng tăng [25, 26].
-

Các acid béo ester hóa phụ thuộc vào loại dầu, những phổ biến nhất là acid

lauric, acid myristic, acid palmitic, acid stearic, acid oleic, acid linoleic và acid
linolenic [8].
-

Trong sữa bột công thức, dẫn chất của MCPD tồn tại chủ yếu dưới dạng

ester và không có dạng tự do [8, 21, 33].
1.1.3. Độc tính
-

Thí nghiệm in vitro cho thấy 3-MCPD ester chuyển hóa thành 3-MCPD

thông qua enzyme lipase của tuyến tụy sau vài phút [25].
-

Thí nghiệm in vivo ở chuột đã chỉ ra sinh khả dụng đường uống của 3-

MCPD diester so với 3-MCPD tự do trung bình xấp xỉ 86% [3].

-

Tốc độ giải phóng dạng tự do của diester chậm hơn so với dạng monoester

[25].
❖

3-MCPD
Trong cơ thể, 3-MCPD có thể liên hợp với glutathione tại thành 2,3-

dihydroxypropylmercapturic acid hoặc phản ứng với enzym alcohol
dehydrogenase tạo ra β-chlorolactaldehyde sau đó tiếp tục chuỗi phản ứng tạo
ra oxalic acid.
Các chất chuyển hóa của 3-MCPD là chất gây độc với cơ thể:
-

β-chlorolactic acid: làm giảm khả năng di chuyển của tinh trùng, giảm pH

môi trường mào tinh.
5


-

Mercapturic acid: gây độc tính đối với thận.

-

Oxalic acid: tạo dạng muối calci oxalate gây viêm cầu thận, tắc nghẽn tủy

tuyến thượng thận.

Hình 1.5. Sơ đồ chuyển hóa 3-MCPD trong cơ thể
Chú thích: ADH: alcohol dehydrogenase; ALDH: dehydrogenase aldehyde;
DHPMA: 2,3-dihydroxypropylmercapturic acid
❖

Độc tính trên động vật thí nghiệm
-

Liều gây chết 50% (LD50) động vật thí nghiệm được báo cáo là: 150 mg/kg

thể trọng [18].
6


-

Tiếp xúc kéo dài với liều 2 mg/kg thể trọng mỗi ngày gây độc tính tiến triển

trên thận (đặc trưng bởi tăng sản ống thận), độc với tinh hoàn (teo, viêm động
mạch), tăng sản tuyến vú ở chuột [8].
-

Độc tính trên thận
Độc tính được báo cáo là chỉ quan sát thấy trên đồng phân R của 3-MCPD

[24]. Tiêm phúc mạc đơn liều 120 mg/kg cho chuột đực gây suy thận và tử vong
thường là trong một tuần sau khi tiêm. Liều 100 mg/kg gây lợi tiểu kèm theo
protein niệu và glucose niệu cao, kéo dài 7-15 ngày [19].

-

Độc tính trên huyết học
Liều 30 mg/kg thể trọng cho chuột mỗi ngày làm suy giảm chức năng hồng

cầu bằng cách làm giảm hàm lượng hemoglobin gây thiếu máu đẳng sắc. Liều 30
mg/kg thể trọng khỉ nâu gây ức chế tủy xương nghiêm trọng [18].
-

Độc tính đối với hệ thần kinh

Không có biểu hiện độc tính ở hệ thần kinh với chế độ liều 10, 20 hoặc 30
mg/kg thể trọng [17].
-

Độc tính đối với hệ sinh sản
Liều khoảng 5 mg/kg thể trọng mỗi ngày làm suy giảm khả năng sinh sản ở

chuột đực mà không làm thay đổi sản xuất tinh trùng ở chuột. Hiệu ứng này được
chứng minh là có thể hồi phục. Liều cao 90 mg/kg thể trọng mỗi ngày làm suy
giảm vĩnh viễn khả năng sinh sản ở chuột bằng cách ngăn cản khả năng di chuyển
của tinh trùng từ tinh hoàn [8, 16].
-

3-MCPD liều cao kéo dài gây ung thư ở chuột. Có ý kiến cho rằng tỉ lệ mắc

ung thư tế bào Leydig và u ở tuyến vú là kết quả của sự mất cân bằng nội tiết tố,
các khối u ở thận là do tiến triển mạn tính liên quan đến tích tụ acid oxalic.
-

Ủy ban Khoa học về Thực phẩm (SCF) kết luận không có bằng chứng gây

ung thư in vivo của 3-MCPD, 3-MCPD nên được xem là chất gây ung thư không
thay đổi cấu trúc gen.
❖

2-MCPD
-

Có rất ít thông tin về độc tính ngắn hạn của 2-MCPD.
7


-

Tuy nhiên, nhiều liều 16 hoặc 30 mg/kg thể trọng mỗi ngày, uống 28 ngày

gây ra tổn thương nghiêm trọng dẫn đến chết tế bào cơ vân, đặc biệt là ở tế bào
cơ tim, dẫn đến suy tim gây chết của một số động vật [8].
-

Kể từ ngày thứ 8 ảnh hưởng thận bao gồm gia tăng lợi tiểu, tăng trọng

lượng thận và thay đổi mô bệnh học ở ống thận đã được quan sát ở liều cao nhất
được thử nghiệm (30 mg/kg thể trọng mỗi ngày) [8].
-

Không có độc tính gây ung thư được nghiên cứu thấy trên 2-MCPD.

1.1.4. Quy định hiện hành về MCPD

❖

Thế giới
-

Hiện tại, FAO/WHO chấp nhận mức dung nạp hàng ngày châp nhận được

(TDI) của 3-MCPD là 2 µg/kg.
-

Mức hàm lượng tối đa của 3-MCPD quy định đối với acid thủy phân thực

vật (HVP) và nước tương là 20 µg/kg, với các sản phẩm khô là 50 µg/kg theo quy
định của ủy ban Châu Âu (EC No 1881/2006).
❖

Việt Nam
Quyết định 11/2005/QĐ-BYT ngày 25/03/2005: Hàm lượng 3-MCPD không

vượt quá 1 mg/kg trong nước tương, xì dầu và dầu hào. Chưa có thông tin về quy
định trên các sản phẩm khác [2].
1.2.

Phương pháp xác định các dẫn chất của MCPD

1.2.1. Phương pháp xử lý mẫu
1.2.1.1.

Chiết lỏng – lỏng

❖ Chiết lỏng – lỏng
-

Các mẫu sữa bột công thức được hòa tan vào trong nước và có thể sử dụng

kỹ thuật chiết lỏng – lỏng để chuyển MCPD ester sang pha hữu cơ [32, 33].
-

Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng với chất nhồi có thể được sử dụng. Mẫu sữa bột

công thức được đồng nhất và hấp phụ vào lớp nước bao quanh các hạt nhồi
(polyacrylic acid hặc polyacrylat và cát có cỡ hạt 50-70 mesh) [12, 30], sau đó
chiết lại bằng dung môi thích hợp. Thường sử dụng kỹ thuật chiết pha lỏng tự
động cao áp.
❖

Chiết pha lỏng tự động cao áp
8


-

Phương pháp chiết sử dụng các dung môi thông thường như những phương

pháp chiết khác nhưng hoạt động ở áp suất và nhiệt độ tương đối cao (150 bar;
100-180oC). Nhiệt độ và áp suất cao làm tăng khả năng hòa tan và khuếch tán hiệu
quả hơn. Dựa trên nguyên tắc, nhiệt độ sôi của chất lỏng tăng khi áp suất tăng,
người ta tăng áp suất và đưa nhiệt độ của dung môi lên cao nhưng chưa tới vùng
giới hạn. Cần sử dụng thiết bị chuyên dụng như ASE [12] hoặc PLE [30].
❖

Quy trình chiết béo theo Tiêu chuẩn quốc gia của Trung Quốc
-

Tương tự như chiết lỏng – lỏng thông thường. Mẫu được chiết với diethyl

ether và petroleum ether, thu pha hữu cơ có chứa MCPD ester [13]. Tuy nhiên,
thời gian đợi tách lớp giữa quá trình chiết là tương đối dài (30 phút).
1.2.1.2.

Làm sạch mẫu

Chiết pha rắn (SPE)
-

Phương pháp chiết pha rắn được ứng dụng rất phổ biến trong phân tích hàm

lượng vết do khả năng làm sạch và làm giàu mẫu rất tốt. Dung dịch mẫu được dội
lên cột chiết. Pha tĩnh nhồi trong cột sẽ tương tác với các chất và giữ một nhóm
chất cần phân tích lại trên cột, các nhóm chất khác ra khỏi cột theo dung môi hòa
tan. Một dung môi hoặc hệ dung môi hòa tan tốt chất phân tích được sử dụng để
rửa giải, thu lấy dung dịch có chất phân tích để định lượng.
-

Mẫu chiết lỏng – lỏng thông thường thường sau đó được chiết pha rắn để

làm sạch. Mẫu được thêm chất chuẩn đồng vị của ester trước khi qua cột. Một số
cột đã được nghiên cứu: Fuyu SLE alkaline diatomite, Agela Cleanert, Agilent
ChemElut™, Merk Extrelut NT3 [28], cột silica gel 60 [33] đều cho hiệu suất thu
hồi đạt trên 90%.

1.2.1.3.

Thủy phân

Hầu hết các phương pháp sử dụng dung dịch acid hoặc kiềm trong methanol.
Có thể thủy phân liên kết ester bằng sodium hydroxide hoặc sodium methoxide
trong thời gian ngắn ở nhiệt độ thấp sau đó dừng phản ứng bằng muối không chứa
chlor trong môi trường acid [20, 29]. Cũng có thể thủy phân bằng sulfuric acid
trong 16h, dừng phản ứng bằng muối không chứa chlor trong môi trường kiềm [6,
10]. Một số nghiên cứu sử dụng enzym lipase để thủy phân liên kết ester [23].
9


Nhiệt độ và thời gian là hai yếu tố quan trọng trong quá trình thủy phân do
3-MCPD và glycidol không ổn định và có thể chuyển dạng lẫn nhau [20]. Cần
dùng muối không chứa chlor để ngăn cản việc glycidol phản ứng với chlor tạo
thành một lượng nhỏ 3-MCPD.
1.2.1.4.

Dẫn xuất

MCPD có cấu trúc hóa học tương đối đơn giản tuy nhiên có một số đặc điểm
làm cho MCPD gặp khó khăn trong phân tích: không có nhóm mang màu, điểm
sôi cao, trọng lượng phân tử thấp, vì vậy để phân tích bằng GC-MS cần dẫn xuất
MCPD nhằm tăng khối lượng phân tử để giảm bớt ảnh hưởng của nền mẫu.
MCPD có thể dẫn xuất với aceton [22], 4-heptanon [9], cyclohexanon [5],
heptafluorobutyrylimidazole (HFBI), acid heptafluorobutyric (HFBA) [4, 28, 31]
hoặc PBA [10, 11, 30, 32, 33]. Trong đó hiện nay phương pháp tạo dẫn xuất với
PBA được áp dụng phổ biến nhất.

Hình 1.6. Các dẫn xuất hình thành từ phản ứng của 3-MCPD
với acetone, PBA và HFBI
1.2.2. Phương pháp phân tích
Đã có nhiều nghiên cứu trên thế giới về xác định hàm lượng của MCPD ở cả
dạng tự do và dạng ester. Đối với dạng ester có thể sử dụng cả phân tích trực tiếp
hoặc gián tiếp. Trong phương pháp phân tích trực tiếp MCPD ester, các ester có
10


thể được tách và phát hiện bằng sắc ký lỏng. Tuy nhiên cần sử dụng một lượng
lớn các chất chuẩn do sự đa dạng trong cấu trúc của 2-MCPD ester và 3-MCPD
ester, do vậy phương pháp này ít được sử dụng. Hiện nay, MCPD ester chủ yếu
được xác định gián tiếp thông qua dạng tự do của chúng.
Viện đánh giá rủi ro liên bang Đức (BfR) đã phát triển 2 phương pháp phân
tích MCPD và MCPD ester cho các mẫu sữa bột, kem dâu, bánh bông lan, bánh
mì, onion mỡ lợn, sốt mayonnaise. Hiệp hội các nhà hóa dầu Mỹ (AOCS) cũng
đã phát triển 3 phương pháp để định lượng MCDP, MCPD ester, glycidol, glycidol
esters được công nhận và sử dụng rộng rãi.
Bảng 1.1. Một số phương pháp xác định MCPD ester
Phương
pháp

Nền mẫu

GC-MS

Dầu và
chất béo

GC-MS

Sữa bột

GC-MS
LCMS/MS
LC–
TOFMS

Sữa bột

Sữa bột
Dầu thực
vật

Mô tả

LOD LOQ
(µg/kg)

Phân tích gián tiếp thông qua
MCPD tự do, thủy phân bằng
LOD: 40
H2SO4 trong methanol, tạo dẫn
xuất với PBA
Phân tích gián tiếp thông qua
MCPD tự do, thủy phân bằng
LOD: 100
H2SO4 trong methanol, tạo dẫn
LOQ: 300
xuất với PBA

Phân tích gián tiếp thông qua
MCPD tự do, thủy phân bằng natri LOD: 30
methoxid trong methanol,tạo dẫn
LOQ: 90
xuất với HFBI
Phân tích trực tiếp, sử dụng nhiều
LOQ: 400
chuẩn MCPD ester
Phân tích trực tiếp, sử dụng nhiều
LOD:
chuẩn MCPD ester
160-1690

Tham
khảo

[11]

[33]

[28]

[21]
[15]

Phương pháp phân tích gián tiếp MCPD ester thông qua dạng tự do bằng
GC-MS có nhiều ưu điểm hơn so với phương pháp phân tích trực tiếp như giảm
được giới hạn định lượng, giảm chi phí hóa chất mà vẫn đáp ứng được yêu cầu
quy định.
11

1.3.

Tổng quan về sắc ký khí khối phổ

Hình 1.7. Sơ đồ hệ thống GC-MS
1.3.1. Sắc ký khí
Sắc ký khí (GC) dựa trên nguyên tắc chung của kỹ thuật sắc ký, là sự phân
bố khác nhau của chất phân tích giữa pha động và pha tĩnh. Pha động trong GC
thường sử dụng một số khí trơ (He, Ar, N2...). Pha tĩnh được chứa trong cột, có
thể là chất rắn hoặc chất lỏng phủ trên bề mặt chất mang trơ dạng rắn hay phủ đều
lên thành phía trong của cột. Kỹ thuật sắc ký khí ứng dụng tốt đối với các chất
phân tích ít hoặc không phân cực, dễ bay hơi, nhiệt độ sôi thường nhỏ hơn 500°C.
Các chất phân cực, ít bay hơi cần dẫn chất với thuốc thử thích hợp để tạo dẫn xuất
ổn định, dễ bay hơi và ít phân cực trước khi phân tích bằng sắc ký khí [1, 14].
❖ Khí mang (Carrier gas)
Hệ thống khí mang trong sắc ký khí thường là các khí trơ như heli, hydro,
argon, carbonic, nitơ. Khí mang cần đáp ứng một số yêu cầu cơ bản như: trơ về
hóa học, rẻ, sẵn có, tinh khiết (99,995%- 99,9995%), không gây cháy nổ, phù hợp
với detector [1].
❖ Hệ thống tiêm mẫu (Sample injection systems)
Mẫu được tiêm vào hệ thống sắc ký thông qua buồng tiêm mẫu. Trong sắc
ký khí có thể sử dụng bộ tiêm mẫu trực tiếp, bộ tiêm mẫu chia dòng hoặc không
chia dòng, bộ tiêm mẫu hóa hơi trương trình nhiệt độ [14].
12


❖ Cột và lò
Trong sắc ký khí có hai loại cột chủ yếu là cột nhồi và cột mao quản. Trong

đó, cột mao quản có tính ứng dụng cao nên được sử dụng phổ biến hơn. Trước
đây người ta sản xuất hai dạng cột mao quản WCOT (pha tĩnh là chất lỏng bao
quanh mặt trong thành cột) và SCOT (cột với lớp chất mang pha tĩnh). Dựa vào
sự phát triển của công nghệ cáp sợi quang, cột WCOT được cải tiến với nhiều tính
năng ưu việt và cho hiệu lực tách tốt [1].
Cột phân tích được đặt trong lò, lò có nhiệm vụ điều khiển nhiệt độ cột theo
chương trình nhiệt độ thích hợp, có thể là đẳng nhiệt, gradien nhiệt hoặc kết hợp
cả hai để tách chất phân tích [1].
❖ Detector
Detector là bộ phận có nhiệm vụ phát hiện chất phân tích, chuyển tín hiệu
của chất phân tích thành các tín hiệu điện có thể đo lường được. Một số detector
thường dùng trong sắc ký khí gồm detector ion hóa ngọn lửa (FID), detector dẫn
nhiệt (TCD), detector cộng kết điện tử (ECD), detector nitơ photphor (NPD)... và
detector khối khổ (MS) [1, 14].
1.3.2. Detector khối phổ
Khối phổ (MS) là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích ion (m/z)
từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Detector MS có độ nhạy và độ chọn lọc cao,
rất thích hợp trong phân tích hàm lượng vết [14].
Cấu tạo của máy khối phổ gồm 3 phần là bộ nguồn ion, bộ phân tích khối và
bộ phận phát hiện. Mẫu từ máy sắc ký khí chuyển vào máy khối phổ sẽ được ion
hóa ở bộ nguồn ion, các ion được tách riêng nhờ bộ phân tích khối trước khi đến
detector.
❖ Bộ nguồn ion
Bộ nguồn ion có vai trò ion hóa chất phân tích. Các loại nguồn ion phổ biến
trong GC-MS bao gồm:
-

Va chạm điện tử (Electron Impact, EI): Chùm electron năng lượng cao (70

eV) tương tác với chất phân tích tạo thành các electron thứ cấp và một số phân

mảnh của phân tử [2, 14].
13


-

Ion hóa hóa học ( Chemical ionization, CI): Là kỹ thuật ion hóa “mềm”, sử

dụng một thuốc thử khí (methan, amoniac...) va chạm với chùm electron năng
lượng cao để tạo ra các ion hoặc gốc tự do. Các điện tử này va chạm với chất phân
tích và ion hóa chất phân tích. Dựa vào đặc điểm của chất phân tích mà có thể sử
dụng kỹ thuật ion hóa hóa học dương (PCI) hoặc ion hóa hóa học âm (NCI) [14].
❖ Bộ phân tích khối
-

Sau khi đã được ion hoá, các ion được đưa đến bộ phân tích khối nhằm lựa

chọn các ion cần thiết. Đặc trưng cho các ion là thông số m/z (tỷ số khối lượng
trên điện tích). Các kỹ thuật phân tích khối được sử dụng phổ biến là bộ phân tích
tứ cực, bộ phân tích ba tứ cực, bộ phân tích bẫy ion, bộ phân tích thời gian bay
[14].
-

Kỹ thuật MS một lần có nhược điểm là không nghiên cứu được cơ chế phân

mảnh, sự khác biệt giữa các đồng phân, chịu ảnh hưởng rõ rệt của nền mẫu chất
phân tích, trên phổ đồ chỉ cho thấy ion phân tử. Kỹ thuật MS/MS không chỉ khắc
phục được những nhược điểm trên mà còn tăng độ nhạy phân tích, tăng độ chính
xác của kết quả phân tích, loại bỏ ảnh hưởng của nền mẫu [14].
-

Kỹ thuật MS/MS thường được áp dụng trên bộ phân tích ba tứ cực. Tứ cực

thứ nhất (Q1) có nhiệm vụ tách các ion, lựa chọn tiền ion để chuyển đến để chuyển
đến tứ cực thứ 2 (Q2). Tại Q2, các ion phân tử chạm với khí trơ (N2, Ar, He) cùng
với năng lượng thích hợp phân ly tạo ra tạo ra các ion sản phẩm. Sau đó, tất cả
các ion sản phẩm được chuyển đến tứ cực thứ 3 (Q3). Q3 tách các ion được chuyển
từ Q2 để đi tới bộ phận phát hiện [14].
❖ Bộ phận phát hiện
Sau khi đi ra khỏi thiết bị phân tích khối, các ion được đưa tới phần cuối của
thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận phát hiện cho phép khối phổ
tạo ra một tín hiệu của các ion tương ứng từ các electron thứ cấp đã được khuếch
đại hoặc tạo ra một dòng điện tích di chuyển. Có hai loại là nhân electron (electron
multiplier) và nhân quang (photonmultiplier) [1].

14


CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng của nghiên cứu này là 2-MCPD ester và 3-MCPD ester.
Đối tượng mẫu được lựa chọn là 72 mẫu sữa bột công thức lấy tại Hà Nội,
Hải Phòng, Thái Nguyên, Thừa Thiên Huế.
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ
Hệ thống sắc ký khí khối phổ hai lần gồm máy GC 7890 và MS 7000B của
Agilent

Cột sắc ký DB5-MS (30m × 0,25mm × 0,25µm)
Máy ly tâm Mikro 200R (Hettich); Máy rung siêu âm S100H (Elma); Máy
lắc xoáy (IKA); Máy cô quay; Thiết bị thổi khô mẫu bằng dòng khí nitrogen; Tủ
ấm (Amerex); Cân phân tích (có độ chính xác 0,1 mg XS105, Metter Toledo); Cột
SPE – NH2 (Supleco)
Bình định mức 5, 10 mL; Micropipet có thể tích điều chỉnh được 2-20 µL,
10-100 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL và 1000-5000 µL; Pipet Pasteur; Ống ly tâm
loại 15 mL, 50 mL; Phễu chiết; Lọ đựng mẫu 1,8 mL
2.1.3. Hóa chất
Chuẩn 3-monochloropropane-1,2-diol; 2-monochloropropane-1,3-diol (độ
tinh khiết ≥ 98%, TRC)
Nội chuẩn 3-monochloropropane-1,2-diol-d5; 2-monochloropropane-1,3diol-d5 (độ tinh khiết ≥ 98%, TRC)
Phenylboronic acid (TRC); Kali oxalat (Merck); Natri sulfat (Merck); Natri
hydrogen carbonat (Merck); Ammonium sulfat (Merck); Methanol (Merck);
Ethanol (Merck); Diethyl ether (Merck); Sulfuric acid (Merck); Hexan (Merck);
Ethyl actat (Merck); Tetrahydrofuran (Merck); Iso octan (Merck)
Các hóa chất sử dụng đều là các hóa chất tinh khiết sử dụng cho phân tích.

15


2.1.4. Pha dung dịch chuẩn
❖ Dung dịch chuẩn gốc 1000 µg/mL
Cân chính xác 10 mg chuẩn 3-MCPD vào bình định mức 10 mL, định mức
tới vạch bằng methanol, thu được dung dịch chuẩn gốc 1000 µg/mL. Bảo quản ở
-18oC, sử dụng trong 18 tháng.
Cân chính xác 10 mg chuẩn 2-MCPD vào bình định mức 10 mL, định mức
tới vạch bằng methanol, thu được dung dịch chuẩn gốc 1000 µg/mL. Bảo quản ở
-18oC, sử dụng trong 18 tháng.
❖ Dung dịch nội chuẩn gốc 1000 µg/mL

Cân chính xác 10 mg nội chuẩn 3-MCPD-d5 vào bình định mức 10 mL, định
mức tới vạch bằng methanol, thu được dung dịch nội chuẩn gốc 1000 µg/mL. Bảo
quản ở -18oC, sử dụng trong 18 tháng.
Cân chính xác 10 mg chuẩn 2-MCPD-d5 vào bình định mức 10 mL, định
mức tới vạch bằng methanol, thu được dung dịch nội chuẩn gốc 1000 µg/mL. Bảo
quản ở -18oC, sử dụng trong 18 tháng.
❖ Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian 100 µg/mL
Hút 1 mL dung dịch chuẩn gốc 3-MCPD và 1 mL dung dịch chuẩn gốc 2MCPD vào bình định mức 10 mL, định mức tới vạch bằng methanol.
❖ Dung dịch chuẩn làm việc
Pha loãng dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian 100 µg/mL trong methanol
để thu được các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ 1; 2,5; 5; 10; 25 µg/mL.
Hút 1 mL dung dịch chuẩn gốc 3-MCPD-d5 và 1 mL dung dịch chuẩn gốc
2-MCPD-d5 vào bình định mức 100 mL, thu được dung dịch nội chuẩn làm việc
có nồng độ 10 µg/mL.
Hút 25 µL dung dịch nội chuẩn làm việc, 25 µL dung dịch chuẩn làm việc
tại các nồng độ, tiến hành dẫn xuất với PBA. Sau khi phản ứng kết thúc, thổi
khô và hòa cắn trong 250 µL iso octan để xây dựng đường chuẩn.
2.2.

Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp xử lý mẫu
16


Qua tham khảo các nghiên cứu ở trên, phương pháp chiết lỏng – lỏng đã
được lựa chọn. Mẫu sau đó được làm sạch bằng chiết pha rắn trước khi thủy phân
và tạo dẫn xuất.
Tiến hành khảo sát điều kiện dẫn xuất, điều kiện chiết lỏng – lỏng, điều kiện
chiết pha rắn để thu được quy trình xử lý mẫu tối ưu

2.2.2. Phương pháp phân tích
Trong nghiên cứu này, phương pháp GC-MS/MS đã được sử dụng. Sau khi
được xử lý, mẫu được phân tích trên hệ thống sắc ký khí khối phổ hai lần.
Điều kiện GC được lựa chọn thông qua các nghiên cứu đã công bố trước đây.
Điều kiện MS/MS được khảo sát để đưa ra quy trình phân tích tối ưu.
Các kết quả được tính toán tự động theo phần mềm phân tích của thiết bị.
2.2.3. Phương pháp thẩm định
2.2.3.1.

Độ phù hợp hệ thống

Tính tương thích hệ thống được đánh giá thông qua sự lặp lại của diện tích
pic và thời gian lưu của chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn (n=6). Giá trị RSD
(%) của thời gian lưu và diện tích pic phải ≤ 2,0%.
2.2.3.2.

Tính chọn lọc

Tính đặc hiệu/chọn lọc của phương pháp được đánh giá thông qua so sánh
tín hiệu của chất phân tích trên 3 loại mẫu: Mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm
chuẩn. Mẫu trắng không được lên tín hiệu của chất phân tích, mẫu thêm chuẩn
phải có tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu trên
mẫu chuẩn (chênh lệch không quá 5,0%).
Ngoài ra, tính chọn lọc còn được khẳng định bằng số điểm nhận dạng (IP)
và tỷ lệ các ion theo tiêu chuẩn EC657/2002 của Châu Âu.
-

Số điểm nhận dạng là tổng điểm ion mẹ và ion con, trong đó đối với kỹ

thuật GC-MS/MS, mỗi ion mẹ được tính 1 điểm, mỗi ion con được tính 1,5 điểm.

Số điểm nhận dạng tối thiểu phải đạt là 4 điểm.
-

Tỷ lệ ion là tỷ lệ phần trăm của ion con có tín hiệu thấp hơn chia cho ion

con có tín hiệu cao hơn của cùng một ion mẹ. Tỷ lệ ion cần đáp ứng theo bảng:
17