Phương pháp phát hiện Salmonella spp. trên nền mẫu thực phẩm theo ISO 65791:2017

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành chuyên đề báo cáo thực tập này trước hết em xin gửi đến Ban
Giám hiệu trường Đại học Sư Phạm – ĐHĐN, khoa Sinh – Môi trường, đã quan tâm
và chỉ đạo trong quá trình thực tập.
Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô TS. Phạm Thị Mỹ, người đã tận tình hướng
dẫn, quan tâm và giúp đỡ để em hoàn thành được bài báo cáo thực tập.
Em xin cảm ơn Ban Lãnh Đạo, các phòng ban của Trung tâm chất lượng nông
lâm thủy sản vùng 2, đã tạo điều kiện thuận lợi cho em được tìm hiểu thực tiễn trong
suốt quá trình thực tập tại trung tâm.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến chị Nguyễn Thị Thu Sương –
Trưởng phòng kiểm nghiệm sinh học, người đã hướng dẫn và theo sát chúng em
trong quá trình học tập và làm việc tại Trung tâm. Cảm ơn đến các anh chị kiểm
nghiệm viên phòng Kiểm nghiệm sinh học.
Trân trọng!
Đà Nẵng, ngày 25 tháng 3 năm 2019
Sinh viên thực tập

Phan Phước Thanh Thuận

1


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................................... 1
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .............................................................................................. 4
DANH MỤC HÌNH ẢNH ................................................................................................... 5
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................................... 6
LỜI MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 7
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CƠ SỞ THỰC TẬP .......................................... 8
1.1 Hệ thống Cục quản lý chất lượng Nông lâm và Thủy sản ......................................... 8
1.2. Trung tâm Chất lượng Nông lâm thủy sản vùng 2 .................................................... 9

1.2.1. Vị trí và chức năng.............................................................................................. 9
1.2.2. Nhiệm vụ và quyền hạn ...................................................................................... 9
1.2.3. Hệ thống quản lý chất lượng tại phòng kiểm nghiệm sinh học ........................ 10
CHƯƠNG 2 : NỘI DUNG THỰC TẬP ........................................................................... 13
2.1. Tìm hiểu về các phương pháp thử nghiệm tại phòng kiểm nghiệm: ...................... 13
2.2. Cơ sở lý thuyết phương pháp phát hiện Salmonella spp. (ISO 6579-1:2017) ........ 14
2.2.1. Nguyên tắc phương pháp phát hiện Salmonella spp......................................... 16
2.2.2. Thiết bị và dụng cụ ........................................................................................... 16
2.2.3. Chuẩn bị mẫu thử .............................................................................................. 16
a.

Phần mẫu thử và huyền phù ban đầu ................................................................... 18

b. Tăng sinh sơ bộ không chọn lọc .......................................................................... 18
c.

Tăng sinh chọn lọc ............................................................................................... 18

d. Nuôi cấy trên môi trường thạch chọn lọc ............................................................ 18
e.

Khẳng định ........................................................................................................... 19

2.2.4. Phép thử sinh hoá .............................................................................................. 19
2.2.4. Biểu thị kết quả ................................................................................................. 22
CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ THỰC TẬP.............................................................................. 23
3.1. Thực hành các phép thử .......................................................................................... 23
3.2.1. Quy trình thực hiện ........................................................................................... 24
3.2.2. Tiến độ thực hiện và kết quả ............................................................................. 25
3.2.3. Kết luận ............................................................................................................. 31

3.3. Kết luận .................................................................................................................. 31
TÀI LIỆU VIỆN DẪN ...................................................................................................... 33
2


PHỤ LỤC ......................................................................................................................... 34
Thành phần một số môi trường ...................................................................................... 34
Thành phần nước đệm peptone (BPW) .......................................................................... 34

3


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
ISO

International Standardization Organization.

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam.

BPW

Buffer pepton water.

XLD

Xylo lysine deoxycholate.

RVS

Rappaport-Vassiliadis soil

MKTTn Muller-Kauffmann
NA

Nutrient agar

LDC

Decarboxyl L-Lysine

4


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình ảnh

Trang

Hình 1. Cơ cấu tổ chức của cục Quản lý Chất lượng Nông lâm thủy sản

6

Hình 2. Trung tâm Chất lượng nông lâm thủy sản vùng 2

7

Hình 3. Sơ đồ phòng kiểm nghiệm sinh học tại Trung tâm Chất lượng nông

9

lâm thủy sản vùng 2
Hình 4: Một số thiết bị trong phòng kiếm nghiệm sinh học

10

Hình 5. Quy trình đối với thực phẩm, mẫu thức ăn chăn nuôi và mẫu môi

15

trường từ khu vực chế biến thực phẩm
Hình 6. Quy trình kiểm tra mẫu

22

Hình 7. Các khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella

23

Hình 8. Cấy các khuẩn lạc nghi ngờ sang môi trường dinh dưỡng

24

Hình 9. Môi trường ban đầu (blank)

24

Hình 10. Sự thay đổi của mẫu kiểm tra trên các môi trường sinh hóa

25

Hình 11. Thử nghiệm huyết thanh

25

Hình 12. Salmonella có phản ứng điển hình trên các môi trường sinh hóa

26

Hình 13. Các khuẩn lạc thu được trên môi trường phân lập XLD và Hektoen

27

5


DANH MỤC BẢNG
Bảng

Trang

Bảng 1. Một số phương pháp thử nghiệm trong phân tích thực phẩm tại phòng

12

thử nghiệm
Bảng 2. Giải thích các thay đổi trong môi trường

18

Bảng 3. Diễn giải các phản ứng sinh hóa và thử huyết thanh

20

Bảng 4. Tiến độ thực hiện mẫu tôm

23

Bảng 5. Tiến độ thực hiện mẫu chả cá và cá chai khô

25

Bảng 6. Kết quả các phản ứng sinh hóa trên chủng Salmonella

26

Bảng 7. Tiến độ thực hiện mẫu chả cá và cá chai khô

26

6


LỜI MỞ ĐẦU
Trong những năm học tập tại khoa Sinh – Môi trường trường Đại học Sư phạm – Đại
học Đà Nẵng, khoa đã luôn tạo điều kiện cho sinh viên được học tập trong môi trường tốt
nhất để nắm vững được kiến thức và nâng cao được chất lượng giáo dục. Với phương châm
“học đi đôi với làm”, sau những thời gian trên giảng đường, sinh viên còn được thực hành
và tham gia nghiên cứu khoa học tại các phòng thí nghiệm để được củng cố kiến thức, tiếp

xúc làm quen với thực tiễn và chuyên môn tay nghề được nâng cao để sau khi ra trường
tránh bị bỡ ngỡ, tự ti, tăng khả năng tìm kiếm các cơ hội việc làm.
Với mục tiêu đó, được sự nhất trí của nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Sinh – Môi
trường và sự tiếp nhận của cơ sở, em đã được thực tập tốt nghiệp hai tháng tại phòng kiểm
nghiệm sinh học thuộc Trung tâm Chất lượng nông lâm thủy sản vùng 2. Tại đây em đã
được tìm hiểu về các tiêu chuẩn của phòng kiểm nghiệm theo ISO 17025:2017, các phương
pháp, thao tác đôi với mẫu kiểm tra vi sinh vật theo TCVN 6404, được chia sẻ các kiến
thức thực tiễn về an toàn phòng kiểm nghiệm, các kiến thức về các trang thiết bị vật chất
cũng như được tìm hiểu về phương pháp kiểm vi sinh vật trên nền mẫu thực phẩm tại Trung
tâm. Ở bài báo cáo này em xin trình bày cụ thể chuyên đề về “Phương pháp phát hiện
Salmonella spp. trên nền mẫu thực phẩm theo ISO 6579-1:2017 ”.
Vì kiến thức bản thân còn hạn chế, trong quá trình thực tập và hoàn thiện bài báo cáo
thực tập em không tránh khỏi những sai sót. Kính mong nhận được sự đóng góp ý kiến từ
thầy, cô cũng như từ các anh, chị kiểm nghiệm viên ở Trung tâm.

7


CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CƠ SỞ THỰC TẬP
1.1 Hệ thống Cục quản lý chất lượng Nông lâm và Thủy sản
Cục Quản lý Chất lượng Nông lâm sản và Thuỷ sản là cơ quan trực thuộc Bộ
Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, thực hiện chức năng tham mưu giúp Bộ trưởng
quản lý nhà nước chuyên ngành và thực thi nhiệm vụ quản lý nhà nước trong lĩnh
vực chất lượng, an toàn vệ sinh thực phẩm nông sản, lâm sản, thuỷ sản và muối thuộc
phạm vi quản lý nhà nước được giao.
Cục Quản lý Chất lượng Nông lâm sản và Thuỷ sản có tư cách pháp nhân, có tài
khoản và con dấu riêng, có kinh phí hoạt động theo quy định của pháp luật. Trụ sở
của Cục đặt tại thành phố Hà Nội.
Cục Quản lý Chất lượng Nông lâm sản và Thuỷ sản
( Hà Nội)

Cơ quan Quản lý Chất lượng Nông lâm sản và Thuỷ sản
Trung Bộ (Trụ sở tại Nha Trang) và Nam Bộ (Trụ sở tại
Hồ Chí Minh)

Trung
tâm Chất
lượng
nông lâm
thủy sản
vùng 1
(Trụ sở
tại Hải
Phòng)

Trung
tâm Chất
lượng
nông lâm
thủy sản
vùng 2
(Trụ sở
tại Đà
Nẵng)

Trung tâm
Chất
lượng
nông lâm
thủy sản

vùng 3
(Trụ sở tại
Nha
Trang)

Trung tâm
Chất
lượng
nông lâm
thủy sản
vùng 4
(Trụ sở tại
Tp Hồ Chí
Minh)

Trung
tâm Chất
lượng
nông lâm
thủy sản
vùng 5
(Trụ sở
tại Cà
Mau)

Trung
tâm Chất
lượng
nông lâm
thủy sản

vùng 6
(Trụ sở
tại Cần
Thơ)

Hình 1. Cơ cấu tổ chức của cục Quản lý Chât lượng Nông lâm thủy sản

8


1.2. Trung tâm Chất lượng Nông lâm thủy sản vùng 2

Hình 2. Trung tâm Chất lượng nông lâm thủy sản vùng 2
1.2.1. Vị trí và chức năng
-

Trung tâm Chất lượng Nông lâm thủy sản vùng 2 sau đây gọi tắt là Trung

tâm Chất lượng vùng 2 là đơn vị sự nghiệp có thu, thực hiện chức năng phục vụ quản
lý nhà nước và cung cấp dịch vụ công thuộc lĩnh vực chất lượng, an toàn vệ sinh
thực phẩm nông lâm thủy sản.
- Trung tâm Chất lượng vùng 2 có tư cách pháp nhân, có con dấu riêng và được
mở tài khoản theo quy định của pháp luật.
- Phạm vi hoạt động của Trung tâm Chất lượng vùng 2 gồm các tỉnh, thành
phố: Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Đà Nẵng, Quảng Nam, Quảng Ngãi,
Bình Định, Kom Tum, Gia Lai.
1.2.2. Nhiệm vụ và quyền hạn
- Thực hiện nhiệm vụ phục vụ quản lý nhà nước về chất lượng vật tư nông nghiệp
và chất lượng, an toàn thực phẩm nông lâm thủy sản theo phân công của Cục.
- Cung cấp dịch vụ theo yêu cầu của các tổ chức, cá nhân theo quy định của pháp

luật.
- Thực hiện điều tra, thống kê, quản lý cơ sở dữ liệu, thông tin, báo cáo về chất
lượng, an toàn thực phẩm nông lâm thủy sản theo quy định và phân công của Cục.
9


- Tham gia nghiên cứu khoa học, ứng dụng tiến bộ khoa học công nghệ, kỹ thuật
chuyên ngành và thực hiện các hoạt động hợp tác quốc tế theo quy định.
- Thực hiện hoạt động khuyến nông, khuyến ngư về lĩnh vực chất lượng, an toàn
thực phẩm nông lâm thủy sản theo phân công của Cục.
- Thực hiện cải cách hành chính, phòng chống tham nhũng, lãng phí; kiểm tra,
giải quyết khiếu nại, tố cáo, kiến nghị của tổ chức, công dân theo quy định và phân
công, phân cấp của Cục.
- Quản lý nhân sự, tài chính, tài sản và các nguồn lực khác được giao theo quy
định của pháp luật và phân cấp quản lý của Cục.
- Thực hiện các nhiệm vụ khác theo quy định của pháp luật và phân công của
Cục trưởng.
 Thông tin liên hệ
Địa chỉ: 167-175 đường Chương Dương, phường Mỹ An, quận Ngũ Hành Sơn,
thành phố Đà Nẵng.
Điện thoại: (0236) 3836761 - (0236) 3836155
Fax: (0236) 3836154
Email: -
Website: www.nafiqad2.vn
1.2.3. Hệ thống quản lý chất lượng tại phòng kiểm nghiệm sinh học
- Phòng kiểm nghiệm sinh học thuộc Trung tâm Chất lượng vùng 2 được trang
bị các thiết bị hiện đại và xây dựng phòng kiểm nghiệm đạt chuẩn quốc tế ISO 17025,
phục vụ các dịch vụ về kiểm nghiệm vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm, thức
uống, thức ăn chăn nuôi.
- Lĩnh vực thử nghiệm của phòng kiểm nghiệm sinh học bao gồm :

+ Thực phẩm.
+ Nước, nước đá để bảo quản, chế biến sản phẩm, nước uống, nước sinh hoạt,
nước uống đóng chai...
+ Thức ăn chăn nuôi và nguyên liệu thức ăn chăn nuôi.
+ Dụng cụ, vật liệu bao gói, chứa đựng thực phẩm trong quá trình sản xuất, chế
biến, kinh doanh thực phẩm.
10


- Sơ đồ phòng kiểm nghiệm sinh học tại Trung tâm:
Phòng kiểm nghiệm được bố trí theo mô hình vòng tròn khép kín từ phòng mã
hóa mẫu đến phòng nuôi cấy VSV, tiếp đến là phòng nuôi ủ VSV (hay còn gọi là
phòng thiết bị KNSH), rồi đến phòng đọc kết quả và cuối cùng là phòng rửa dụng
cụ. Điều này giúp cho phòng kiểm nghiệm tránh được một số hiện tượng nhiễm bẩn
chéo làm ảnh hưởng đến kết quả kiểm nghiệm.

Hình 3. Sơ đồ phòng kiểm nghiệm sinh học tại Trung tâm Chất lượng nông lâm thủy
sản vùng 2
- Một số trang thiết bị tại phòng kiểm nghiệm sinh học:
Tất cả các thiết bị trong phòng được sắp xếp gọn gàng, ngăn nắp thuận tiện cho
nhân viên kiểm nghiệm khi làm việc. Đồng thời tất cả đều được giám sát thường xuyên
và hiệu chuẩn định kì để đảm bảo không làm ảnh hưởng đến kết quả kiểm nghiệm.

11


Nồi hấp

Tủ sấy 1600C

Tủ lạnh 5±30C

Máy đếm khuẩn lạc

Tủ an toàn sinh học cấp 2

Máy đồng nhất mẫu

Tủ ấm lạnh -220C

Tủ ấm

Hình 4: Một số thiết bị trong phòng kiếm nghiệm sinh học.

12


CHƯƠNG 2 : NỘI DUNG THỰC TẬP
2.1. Tìm hiểu về các phương pháp thử nghiệm tại phòng kiểm nghiệm:


Nguyên tắc chung trong kiểm tra vi sinh vật (TCVN 6404:2016)
Tiêu chuẩn này áp dụng cho việc hướng dẫn một số nguyên tắc chung về thử

nghiệm vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và môi trường sản xuất thực
phẩm và môi trường sản xuất ban đầu.
 Một số phương pháp kiểm tra vi sinh vật chỉ điểm vệ sinh trong thực
phẩm
Thực phẩm là nguồn cung cấp dinh dưỡng cho sự phát triển của cơ thể, đảm bảo
cho sức khỏe của con người nhưng đồng thời cũng có thể là nguồn gây bệnh nếu

không đảm bảo các chỉ tiêu về thực phẩm.
Về lâu dài, thực phẩm không những có tác động thường xuyên đối với sức khỏe
con người mà còn ảnh hưởng lâu dài đến nòi giống. Sử dụng các thực phẩm không
đảm bảo trước mắt có thể bị ngộ độc cấp tính với các triệu chứng dễ nhận thấy, nhưng
vấn đề nguy hiểm là sự tích lũy dần các chất độc hại ở một số cơ quan trong cơ thể.
Do đó, việc kiểm tra các chỉ tiêu về thực phẩm là việc làm quan trọng và có ý nghĩa
lớn đối với xã hội nói chung và sức khỏe con người nói riêng.

13


Bảng 1. Một số phương pháp thử nghiệm trong phân tích thực phẩm tại phòng thử
nghiệm:
Chỉ tiêu

STT
1

Phương pháp tham chiếu
TCVN 8131:2009

Phát hiện Shigella spp

TCVN 6189-2:2009

2

Định lượng Enterococus

3

Phát hiện và định lượng Vibrio

4

Định lượng vi sinh vật hiếu khí

5

Phát hiện và định lượng Coliform

TCVN 11039-4:2015

6

Phát hiện và định lượng Escherichia coli

TCVN 6846:2007

7

Phát hiện và định lượng Staphylococci có phản
ứng dương tính với coagulase

TCVN 4830-1:2005

8

Định lượng Enterobacteriaceae

TCVN 5518-2:2007

9

Phát hiện Salmonella spp

ISO 6579-1:2017

10

Phát hiện Campylobacter spp

TCVN 7715-1:2017

(ISO 7899-2:2000)
TCVN 8988:2012
TCVN 4884-2:2015
(ISO 4833-2:2013)

…..
2.2. Cơ sở lý thuyết phương pháp phát hiện Salmonella spp. (ISO 6579-1:2017)
Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae (vi khuẩn đường ruột) có hình
que, trực khuẩn gram âm, kị khí tùy nghi không tạo bào tử, di động bằng tiên mao,
sinh sống trong đường ruột, có đường kính khoảng 0,7 µm đến 1,5 µm, dài từ 2 µm
đến 5 µm.

14


Phân loại khoa học

Giới

Bacteria

Ngành

Protebacteria

Lớp

Gammaproteobacteria

Bộ

Enterobacteriales

Họ

Enterobacteriaceae

Chi

Salmonella

Hầu hết các loài Salmonella có thể sinh hydro sulfua. Salmonella không lên men
lactose (trừ Salmonella arizona) và sucrose nhưng lên men được dulcitol, mannitol
và glucose.
Salmonella được tìm thấy trên toàn thế giới trong cả động vật máu lạnh và động
vật máu nóng, và trong môi trường. Các chủng vi khuẩn Salmonella gây ra các bệnh
như thương hàn (do Salmonella typhi), phó thương hàn, nhiễm trùng máu

(do Salmonella choleraesuis) và ngộ độc thực phẩm (Salmonellosis). Các triệu
chứng do Salmonella gây ra chủ yếu là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn xuất hiện sau 12
- 36 giờ sau khi tiêu thụ thực phẩm nhiễm Salmonella. Các triệu chứng thường kéo
dài từ 2 - 7 ngày.
Nhiễm khuẩn Salmonella có thể là do:


Không bảo đảm an toàn thực phẩm trong khâu chế biến, đặc biệt là trong các

nhà bếp lớn phục vụ nhiều thực khách.


Bởi các chất bài tiết (nước bọt, nước tiểu, phân và nước dịch cơ thể khác) của

người bệnh, ngay cả trong trường hợp bệnh chưa phát và người bệnh được xem là
khỏe mạnh khi khám nghiệm lâm sàng; và động vật, đặc biệt là từ các loài bò
sát không bị phát hiện nhiễm bệnh (tỷ lệ nhiễm là 90%), một mối nguy hiểm, đặc
biệt là đối với trẻ nhỏ.


Bởi mặt nước bị ô nhiễm và nước tù đọng (ví dụ như trong ống vòi sen và các

thiết bị truyền nước mà không được sử dụng lâu dài trước đó)


Bởi sự không vệ sinh của gia cầm đông lạnh khi làm tan đá (nhiều vi khuẩn

có trong nước đông).


Bằng trứng tươi sống đến từ gia cầm bị nhiễm khuẩn salmonella (thường là

salmonella chỉ có trên vỏ trứng, nhưng cũng có thể lọt vào trong nếu vỏ trứng bị hư
15


hay là rạn nứt, hay là qua tay người), thường gây ngộ độc khi ăn trứng hoặc sản phẩm
gia cầm chưa chế biến kỹ hoặc nấu chín.


Nhưng cũng có thể qua sữa chưa được tiệt trùng, cá ngừ sống, dưa chuột, cà

chua, giá đỗ nhiễm khuẩn.
2.2.1. Nguyên tắc phương pháp phát hiện Salmonella spp.
- Tăng sinh sơ bộ trong môi trường lỏng không chọn lọc.
- Tăng sinh trong/trên môi trường có chọn lọc.
- Nuôi cấy trên môi trường đặc chọn lọc.
- Khẳng định sinh hóa và huyết thanh.
2.2.2. Thiết bị và dụng cụ
- Thiết bị để khử trùng khô (tủ sấy) hoặc khử trùng ướt (nồi hấp áp lực)
- Que cấy vòng vô trùng, có đường kính khoảng 3 mm (dung tích 10 μl), dung
tích 1 μl và kim cấy hoặc que cấy.
- Máy đo pH, có độ chính xác hiệu chuẩn là ± 0,1 đơn vị pH ở 20oC đến 25oC.
- Ống, chai hoặc bình vô trùng có nắp có dung tích phù hợp.
- Pipet chia độ vô trùng hoặc pipet tự động, có dung tích danh nghĩa là 25 ml, 10
ml, 1 ml và 0,1 ml.
- Đĩa Petri vô trùng, có đường kính khoảng 90 mm và kích thước lớn (tùy chọn)
(đường kính khoảng 140 mm).
2.2.3. Chuẩn bị mẫu thử
Chuẩn bị mẫu thử từ mẫu phòng thí nghiệm theo Tiêu chuẩn quốc tế cụ thể liên

quan đến từng sản phẩm.

16


Mẫu + nước đệm pepton
(BPW) tỉ lệ: 1:9, ủ ở 34 –
38oC trong 18 ± 2 giờ

Cấy 0,1 ml dịch cấy tăng sinh +
10 ml môi trường RVS hoặc
thạch MSRV, ủ ở 41,5oC ± 1oC
trong 24 ± 3 giờ

Cấy 1 ml dịch cấy tăng sinh + 10
ml môi trường MKTTn, ủ ở 37oC
± 1oC trong 24 ± 3 giờ

Cấy vào thạch XLD và môi
trường phân lập thứ 2 ủ ở
37oC ± 1oC trong 24 ± 3 giờ

Chuyển ít nhất 1 khuẩn lạc điển hình hoặc nghi
ngờ lên môi trường thạch dinh dưỡng, ủ ở 34 38oC trong 24 ± 3 giơ

Thử nghiệm Sinh hóa

Phép thử huyết thanh

Nếu âm tính, thử thêm 4 khuẩn lạc khác đã được đánh

dấu (Thử nghiệm Sinh hóa, Phép thử huyết thanh)

Biểu thị kết quả

Hình 5. Quy trình đối với thực phẩm, mẫu thức ăn chăn nuôi và mẫu môi
trường từ khu vực chế biến thực phẩm

17


a. Phần mẫu thử và huyền phù ban đầu
Để chuẩn bị cho huyền phù ban đầu, trong trường hợp chung, sử dụng môi trường
tăng sinh sơ bộ (nước đệm peptone) làm dịch pha loãng. Làm ấm BPW đến nhiệt độ
phòng trước khi sử dụng.
Nói chung, một lượng phần mẫu thử (khối lượng hoặc thể tích) được thêm vào
một lượng BPW (khối lượng hoặc thể tích) để thu lại độ pha loãng gấp mười lần. Để
thực hiện điều này, trộn 25 g mẫu thử nghiệm với 225 ml BPW.
b. Tăng sinh sơ bộ không chọn lọc
Ủ huyền phù ban đầu (ở nhiệt độ khoảng 34oC và 38oC trong 18 ± 2 giờ.
Cho phép bảo quản mẫu tăng sinh sơ bộ tsau khi ủ ở 5oC trong tối đa 72 giờ.
c. Tăng sinh chọn lọc
Chuyển 0,1 ml dịch cấy tăng sinh sơ bộ không chọn lọc thu được sang một ống
chứa 10 ml môi trường RVS (chỉ sử dụng môi trường RVS, không sử dụng MSRV)
Chuyển 1 ml dịch cấy tăng sinh sơ bộ không chọn lọc thu được vào ống chứa 10
ml môi trường MKTTn.
Ủ ấm môi trường RVS đã cấy ở 41,5oC trong 24 ± 3 giờ.
Ủ ấm môi trườngC đã cấy ở 37oC trong 24 ± 3 giờ.
Trong các sản phẩm sữa bột và phô mai, Salmonella có thể bị tổn thương đến
chết, Ủ tiếp môi trường tăng sinh chọn lọc từ các sản phẩm này trong thêm 24 ± 3
giờ

d. Nuôi cấy trên môi trường thạch chọn lọc
Cấy dịch tăng sinh thu được (RVS và MKTTn) vào hai môi trường đặc chọn lọc:
-

Môi trường thạch Xylo Lysine Deoxycholate (môi trường XLD)

-

Môi trường thạch chọn lọc thứ hai được ủ theo hướng dẫn của nhà sản xuất

(Trong phạm vi thực hiện, tiến hành trên môi trường thạch Hektoen)
Để các đĩa thạch XLD và môi trường chọn lọc thứ hai cân bằng đến nhiệt độ
phòng nếu trước đó được bảo quản ở nhiệt độ thấp hơn. Nếu cần, làm khô bề mặt các
đĩa thạch trước khi cấy.
Chú ý: Để có được các khuẩn lạc riêng rẽ, có thể sử dụng các đĩa Petri kích thước
lớn (đường kính khoảng 140 mm) hoặc dùng đĩa thạch có kích thước trung bình
(đường kính khoảng 90 mm).
18


Ủ các đĩa XLD được lập úp ở 37oC trong 24 ± 3 giờ.
Ủ môi trường chọn lọc thứ hai theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Các khuẩn lạc Salmonella điển hình trên môi trường thạch XLD có tâm màu đen
và vùng ngoài có màu đỏ nhạt trong suốt nhẹ do sự thay đổi màu sắc của chỉ thị.
Kiểm tra môi trường chọn lọc thứ hai sau thời gian ủ thích hợp về sự có mặt của
các khuẩn lạc có các đặc trưng điển hình được coi là Salmonella giả định.
e. Khẳng định
Yêu cầu chung
Sự kết hợp giữa các kết quả thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh cho biết liệu một
chủng vi khuẩn phân lập có thuộc chi Salmonella hay không. Để nhận dạng đặc tính

của các chủng Salmonella, cần xác định đầy đủ typ huyết thanh. Hướng dẫn xác định
typ huyết thanh được quy định trong TCVN 10780-3 (ISO / TR 6579-3).
Để phân biệt rõ ràng giữa các phản ứng sinh hóa dương tính và âm tính, nên kiểm
tra xác nhận các phản ứng của môi trường của từng thử nghiệm sinh hóa bằng các
chủng kiểm chứng âm và kiểm chứng dương đặc trưng.
Chọn khuẩn lạc để khẳng định
Đánh dấu các khuẩn lạc nghi ngờ trên mỗi đĩa. Chọn ít nhất một khuẩn lạc điển
hình hoặc nghi ngờ để cấy truyền và khẳng định. Nếu khuẩn lạc này âm tính, chọn
tối đa bốn khuẩn lạc nghi ngờ để đảm bảo rằng các khuẩn lạc này được cấy truyền
từ các tổ hợp môi trường phân lập / môi trường tăng sinh chọn lọc khác nhau cho
thấy các khuẩn lạc nghi ngờ phát triển.
Cấy ria các khuẩn lạc được chọn lên bề mặt môi trường thạch không chọn lọc đã
sấy khô trước theo cách cho phép các khuẩn lạc phân lập phát triển tốt, riêng rẽ. Ủ
các đĩa được cấy trong khoảng từ 34oC đến 38oC trong 24 ± 3 giờ.
Sử dụng các chuẩn cấy thuần để khẳng định bằng phép thử sinh hóa và huyết
thanh.
2.2.4. Phép thử sinh hoá
 Thạch TSI
Cấy ria trên bề mặt nghiêng của thạch và cấy đâm sâu xuống đáy. Ủ ở 37oC
trong 24 ± 3 giờ.

19


Bảng 2. Giải thích các thay đổi trong môi trường
Phương
pháp cấy
Cấy đâm
sâu

Cấy bề

Sự thay đổi của môi trường
Màu vàng

glucose dương tính (lên men glucose)

Màu đỏ hoặc không đổi màu

Glucose âm tính (không lên men glcose)

Màu đen

Sinh hydro sulfid

Bọt khí hoặc nứt thạch

Sinh khí từ glucose
lactose và/hoặc sucrose dương tính (lên

Màu vàng

men lactose và/hoặc sucrose)

mặt
nghiêng

Giải thích

Màu đỏ hoặc không thay đổi màu

lactose và/hoặc sucrose âm tính (không
lên men lactose và/hoặc sucrose)

Phần lớn các chủng Salmonella điển hình thể hiện tính kiềm (màu đỏ) trên bề mặt
thạch và axit (màu vàng) có sự hình thành khí (bọt khí), (với khoảng 90% trường
hợp) hình thành hydro sunfua (làm đen môi trường thạch khi cấy đâm sâu).
Khi Salmonella phân lập được dương tính với lactose, trên bề mặt thạch nghiêng
TSI có màu vàng. Do đó, việc khẳng định sơ bộ các chủng Salmonella sẽ không chỉ
dựa trên kết quả thử nghiệm thạch TSI.
 Thạch Urê
Cấy ria trên bề mặt nghiêng của thạch. Ủ ở 37oC trong 24 ± 3 giờ.
Nếu phản ứng dương tính, urê bị phân giải, giải phóng amoniac. Điều này thay
đổi màu của phenol đỏ sang hồng và sau đó thành màu đỏ sẫm. Phản ứng thường rõ
ràng sau 2 – 4 giờ.
Các chủng Salmonella điển hình không phân giải urê do đó màu của thạch urê
agar sẽ vẫn không thay đổi.
 Môi trường L-lysine Decarboxylation (LDC)
Cấy ngay dưới bề mặt của môi trường lỏng. Ủ ở 37oC trong 24 ± 3 giờ.
Môi trường đục và có màu đỏ tím sau khi ủ cho thấy phản ứng dương tính. Màu
vàng cho thấy một phản ứng âm tính.
Phần lớn các chủng Salmonella điển hình cho thấy phản ứng LDC dương tính.
 Môi trường thử phản ứng Indol

20


Phép thử indole có thể được sử dụng khi có cần phân biệt Salmonella (thường là
indole âm tính) với Escherichia coli và Citrobacter (cả hai đều dương tính) vì các
sinh vật này có thể cho phản ứng điển hình trên một số môi trường phân lập

Salmonella.
Cấy các khuẩn lạc nghi ngờ vào một ống chứa 5 ml môi trường
tryptone/tryptophan.
Ủ ở 37oC trong 24 ± 3 giờ. Sau khi ủ, thêm 1 ml thuốc thử Kovacs.
Sự xuất hiện của một vòng màu đỏ (lớp bề mặt) cho thấy phản ứng dương
tính. Một vòng màu nâu vàng (lớp bề mặt) cho thấy phản ứng âm tính.
 Phép thử thuyết thanh
Nếu các khuẩn lạc thuần cho thấy các phản ứng sinh hóa điển hình đối với
Salmonella sẽ được kiểm tra tiếp để phát hiện sự có mặt của kháng nguyên
Salmonella O - và H (và cũng như kháng nguyên Vi, tại những nơi dự kiến có mặt
Salmonella Typhi trong nguồn cung cấp thực phẩm) bằng cách ngưng kết với kháng
nguyên đa giá trên lam kính. Các khuẩn lạc thuần được nuôi cấy trên môi trường
thạch không chọn lọc và được kiểm tra khả năng tự ngưng kết. Loại bỏ các chủng có
khả năng tự động ngưng kết mà không thử nghiệm tiếp để phát hiện sự có mặt của
các kháng nguyên Salmonella. Sử dụng kháng nguyên theo hướng dẫn của nhà sản
xuất nếu khác với phương pháp được mô tả dưới đây để phát hiện sự hiện diện của
kháng nguyên Salmonella O- và H (và cả với kháng nguyên Vi nếu cần).
Loại bỏ các chủng tự ngưng kết:
Cho một giọt dung dịch nước muối lên lam kính thuỷ tinh sạch. Dùng que cấy
vòng trộn đều dung dịch nước muối với khuẩn lạc cần thử nghiệm để thu được hỗn
dịch đồng nhất và đục.
Lắc nhẹ lam kính trong 5 giây đến 60 giây (tùy theo hướng dẫn của nhà sản
xuất). Quan sát huyền phù, tốt nhất là trên nền tối. Nếu vi khuẩn kết dính thành các
hạt trong huyền phù thì chủng này được cho là tự động ngưng kết và thử nghiệm
huyết thanh sẽ trở nên phức tạp.
Kiểm tra kháng nguyên O
Sử dụng một khuẩn lạc thuần đã được xác định là không tự động ngưng kết, tiến
hành cũng như cách thử nghiệm với dung dịch nước muối, thay dung dịch nước
muối bằng cách sử dụng một giọt huyết thanh kháng nguyên O đa giá.
Nếu sự ngưng kết xảy ra, đây được coi là một phản ứng dương tính.

21


Kiểm tra kháng nguyên Vi (tùy chọn)
Sử dụng một khuẩn lạc thuần đã được xác định là không tự động ngưng kết, tiến
hành cũng như cách thử nghiệm với dung dịch nước muối, thay dung dịch nước
muối bằng cách sử dụng một giọt huyết thanh kháng nguyên Vi đa giá.
Nếu sự ngưng kết xảy ra, đây được coi là một phản ứng dương tính.
Kiểm tra kháng nguyên H
Sử dụng một khuẩn lạc thuần đã được xác định là không tự động ngưng kết, tiến
hành cũng như cách thử nghiệm với dung dịch nước muối, thay dung dịch nước
muối bằng cách sử dụng một giọt huyết thanh kháng nguyên H đa giá.
Nếu sự ngưng kết xảy ra, đây được coi là một phản ứng dương tính.
Bảng 3. Diễn giải các phản ứng sinh hóa và thử huyết thanh:
Phản ứng sinh
hóa

Tự động ngưng
kết (Thử với nước
muối)

Phản ứng huyết
thanh

Kết luận

Cho phản ứng điển
hình

Không

Dương tính

Các chủng được coi
là Salmonella

Cho phản ứng điển
hình

Không

Âm tính

Cho phản ứng điển
hình

Có

Không được kiểm
tra vì tự động
ngưng kết

Salmonella giả
định

Không có phản
ứng điển hình

_

_

Không được coi là
Salmonella

2.2.4. Biểu thị kết quả
Căn cứ vào kết luận, chỉ ra sự có mặt và không có mặt của Salmonella trong phần
thử nghiệm của x g hoặc x ml sản phẩm hoặc trên diện tích bề mặt hoặc trong mẫu
vật phẩm.

22


CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ THỰC TẬP
3.1. Thực hành các phép thử
Phát hiện Salmonella spp trên nền mẫu thực phẩm theo phương pháp ISO 65791:2017 tại Trung tâm Chất lượng Nông – Lâm – Thuỷ sản vùng 2 (NAFIQAD 2).

23


3.2.1. Quy trình thực hiện
Mẫu tôm (đối với mẫu chả cá, cá chai khô quy trình tương tự mẫu tôm)
25g mẫu tôm + 225 ml BPW ủ
ở 34 – 38oC trong 18 ± 2giờ

Cấy 1 ml dịch cấy tăng sinh + 10
ml môi trường MKTTn, ủ ở 37oC
± 1oC trong 24 ± 3 giờ

Cấy 0,1 ml dịch cấy tăng sinh +

10 ml môi trường RVS ủ ở
41,5oC ± 1oC trong 24 ± 3 giờ

Cấy vào thạch XLD và môi trường
thạch Hektoen
ủ ở 37oC ± 1oC trong 24 ± 3 giờ

Thử ít nhất 1 khuẩn lạc điển
hình hoặc nghi ngờ. Nếu âm
tính, thử thêm 4 khuẩn lạc
khác đã được đánh dấu

Môi trường thạch NA, ủ ở
34 -38oC trong 24 ± 3 giờ

Phép thử sinh hoá (TSI,
Urê, indole, LDC)

Phép thử huyết thanh

Biểu thị kết quả

Hình 6. Quy trình kiểm tra mẫu
24


3.2.2. Tiến độ thực hiện và kết quả
Kiểm tra trên 3 mẫu: Tôm, chả cá, cá chai khô
Bảng 4. Tiến độ thực hiện mẫu tôm
Thao tác

Thời gian
10/1/2019
14/1/2019

Chuẩn bị môi trường
Đồng nhất mẫu
Ủ mẫu đồng nhất

15/1/2019

Chuyển mẫu đồng nhất cấy sang môi trường tăng sinh chọn lọc

16/1/2019

Cấy mẫu từ môi trường tăng sinh chọn lọc sang môi trường phân lập

17/1/2019

18/1/2019
19/1/2019

Kiểm tra các khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella
Cấy sang môi trường dinh dưỡng NA (làm thuần)
Kiểm tra các phản ứng sinh hoá
Kiểm tra bằng huyết thanh
Kiểm tra kết quả và xác nhận

Kết quả
Ngày 17/1 kiểm tra trên các đĩa thạch môi trường tăng sinh chọn lọc quan sát thấy

có các đặc điểm giống với khuẩn lạc của Salmonella. Tiến hành cấy sang môi trường
dinh dưỡng NA để làm thuần.

25