Xây dựng phương pháp định lượng Cleisindosid D trong quả của một số loài thuộc chi cách hoa (Cleistanthus) bằng HPLC

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN QUANG ĐOÀN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG CLEISINDOSID D TRONG
QUẢ CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI
CÁCH HOA (CLEISTANTHUS) BẰNG
HPLC.
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN QUANG ĐOÀN
Mã sinh viên: 1401142

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG CLEISINDOSID D TRONG
QUẢ CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI
CÁCH HOA (CLEISTANTHUS) BẰNG
HPLC.
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
NCS.Ths.Nguyễn Lâm Hồng
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa phân tích & Độc chất

HÀ NỘI - 2019


LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin cảm NCS.Ths.Nguyễn Lâm
Hồng – Giảng viên bộ môn Hóa phân tích & độc chất, trường Đại học Dược Hà Nội,
người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, dành nhiều thời gian và tâm huyết giúp tôi hoàn
thành khóa luận này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu, Bộ môn Hóa phân tích
và Độc chất trường Đại học Dược Hà Nội cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy và
giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong quá trình thực hiện
khóa luận.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã ủng hộ và động viên
tôi trong suốt quá trình học tập vừa qua.
Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm
Sinh viên

Nguyễn Quang Đoàn


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .....................................................................................2
1.1. TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT CỦA CHI CÁCH HOA ............................2
1.1.1. Vị trí phân loại ..........................................................................................2
1.1.2. Họ Thầu Dầu (Euphorbiaceca) ...............................................................2
1.1.3. Chi Cleistanthus .......................................................................................2

1.1.4. Loài Cleistanthus tonkinensis .................................................................3
1.1.5. Loài Cleistanthus indochinensis ..............................................................4
1.2. TỔNG QUAN VỀ HỢP CHẤT CLEISINDOSID D ...................................5
1.2.1. Sơ lược về hợp chất cleisindosid D..........................................................5
1.2.2. Các nghiên cứu trước đây về hợp chất cleisindosid D ..........................5
1.3. TỔNG QUAN VỀ CÁC KỸ THUẬT CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU .........6
1.3.1. Khái niệm về chiết xuất: ..........................................................................6
1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết xuất ......................................6
1.3.3. Các kĩ thuật chiết xuất .............................................................................7
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................10
2.1. NGUYÊN LIỆU ............................................................................................10
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................10
2.1.2. Nguyên liệu chất chuẩn ..........................................................................10
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ .....................................................................................10
2.1.4. Dung môi, hóa chất .................................................................................10
2.2. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................11
2.2.1. Phương pháp chiết xuất Cleisindosid D từ quả của một số loài chi cách
hoa (Cleistanthus). ............................................................................................11
2.2.2. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Cleisindosid D. ...12
2.2.3. Xác định hàm lượng cleisindosid D trong quả của một số loài thuộc chi
Cleistanthus. ......................................................................................................15
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu .....................................................................15


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................16
3.1. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CLEISINDOSID D BẰNG
HPLC ....................................................................................................................16
3.1.1. Xây dựng qui trình sắc ký định lượng cleisindosid D từ quả của một
số loài thuộc chi Cleistanthus bằng HPLC/DAD. ..........................................16
3.1.2. Xây dựng qui trình chiết xuất cleisindosid D từ quả của cây Chà chôi

(Cleistanthus tonkinensis). ...............................................................................19
3.2. Thẩm định phương pháp định lượng đồng thời cleisindosid D từ quả cây
Chà chôi bằng HPLC/DAD. ................................................................................22
3.2.1. Độ đặc hiệu: ............................................................................................22
3.2.2. Tính thích hợp của hệ thống sắc ký: .....................................................24
3.2.3. Khoảng tuyến tính ..................................................................................24
3.2.4. Độ lặp lại..................................................................................................26
3.2.5. Độ đúng: ..................................................................................................27
3.3. SƠ BỘ ĐỊNH LƯỢNG CLEISINDOSID D TRONG QUẢ CỦA MỘT SỐ
LOÀI THUỘC CHI CLEISTANTHUS ............................................................27
3.3.1. Điều kiện sắc ký ......................................................................................27
3.3.2. Tiến hành chiết xuất và chạy sắc ký .....................................................28
3.3.3. Kết quả định lượng.................................................................................28
3.4. BÀN LUẬN ....................................................................................................29
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .............................................................31
4.1. KẾT LUẬN: ..................................................................................................31
4.2. ĐỀ XUẤT.......................................................................................................32
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................33


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT.

APG

Hệ thống phân loại thực vật

GLP

Thực hành tốt phòng thí nghiệm

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HT29

Tế bào ung thư Đại tràng

IC50

Nồng độ ức chế 50% số lượng cá thể

IUPAC

Hiệp hội quốc tế về hóa học và ứng dụng

KB

Tế bào biểu mô

LOD

Giới hạn phát hiện

LOQ

Giới hạn định lượng

MCF7

Tế bào ung thư vú

MCF7R

Tế bào ung thư vú kháng thuốc

SK

Sắc ký

SKĐ

Sắc ký đồ

WHO

Tổ chức Y Tế Thế giới


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Tiêu bản cây Cleistanthus tonkinensis ........................................................3
Hình 1.2 Quả của cây Cleistanthus tonkinensis ..........................................................3
Hình 1.3. Công thức cấu tạo của cleisindosid D .........................................................5
Hình 3.1. SKĐ khảo sát khả năng tách của cleisindosid C với cleisindosid D và
cleisindosid D với 7,8-dihydrocleisindosid D trong dung dịch chuẩn phân giải ......17
Hình 3.2. SKĐ khảo sát khả năng tách của cleisindosid C và cleisindosid D trong
dược liệu trên cột RP18 Innersustain (250 x 4,6 mm; 5µm) và hệ pha động ACNNước. .........................................................................................................................17
Hình 3.3 Phổ UV của cleisindosid D ........................................................................18
Hình 3.4. Sắc ký đồ khảo sát thể tích tiêm mẫu ........................................................18

Hình 3.5. Kết quả hàm lượng cleisindosid D trong quả cây Chà chôi được chiết xuất
bằng các hệ dung môi khác nhau ..............................................................................20
Hình 3.6. Khảo sát các kỹ thuật chiết .......................................................................20
Hình 3.7. Sơ đồ chiết xuất cleisindosid D từ quả của cây thuộc chi Cleistanthus....21
Hình 3.8. Sắc ký đồ dung dịch chiết xuất bã dược liệu sau chiết .............................22
Hình 3.9. SKĐ của mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn..............22
Hình 3.10. Hệ số tinh khiết Pic .................................................................................23
Hình 3.11. Sắc ký các mẫu thử phân huỷ ở các điều kiện khắc nghiệt .....................23
Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của
cleisindosid D ............................................................................................................25
Hình 3.13. Mẫu thử loài Cleistanthus eberhardtii ....................................................29
Hình 3.14. Mẫu thử của loài Cleistanthus tonkinensis .............................................29


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Xây dựng chương trình Gradient ..............................................................16
Bảng 3.2. Chương trình Gradient được lựa chọn để chạy sắc ký .............................19
Bảng 3.3. Kết quả thu được từ 6 lần tiêm của dung dịch chuẩn ...............................24
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát tính tuyến tính ...............................................................25
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ lặp lại của cleisindosid D trong mẫu thử quả cây ....26
Bảng 3.6.Kết quả đánh giá độ đúng của cleisindosid D trên mẫu thử C.tonkinesis .27


ĐẶT VẤN ĐỀ
Trên thế giới, ung thư là nguyên nhân dẫn đến tử vong đứng thứ hai trên toàn cầu
với 8,8 triệu người chết trong năm 2015 [31]. Có nhiều hướng điều trị đã được sử dụng
như: hóa trị, xạ trị, can thiệp ngoại khoa,…tuy nhiên kết quả vẫn chưa như mong đợi.
Điều này thôi thúc các nhà khoa học luôn luôn cố gắng tìm ra các phương pháp và các
loại thuốc mới, có cả nguồn gốc hóa dược và dược liệu, để chống lại căn bệnh này.
Tại Việt Nam, các thuốc điều trị ung thư cũng đang rất được quan tâm và phát

triển, đặc biệt là các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu. Năm 2009, dự án "Phòng thí
nghiệm hợp tác Pháp - Việt, nghiên cứu hóa thực vật của hệ thực vật Việt Nam" đã được
khởi động, dịch chiết ethyl acetat của hơn 2500 loài thực vật ở Việt Nam đã được đem
thử sàng lọc hoạt tính kháng tế bào ung thư trên dòng ung thư biểu mô. Một trong những
kết quả nổi bật nhất đó là dịch chiết từ quả của cây Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis
Jabl.) đã cho phần trăm ức chế dòng tế bào ung thư biểu mô đạt từ 88,40 - 95,17%. Từ
dịch chiết này, nhóm nghiên cứu đã phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc được 9 hợp
chất tinh khiết nhóm aryltetralin lignan, trong đó có hoạt chất cleisindosid D có cấu trúc
hóa học tương tự etoposid và teniposid, là hai dẫn chất của podophyllotoxin đang được
sử dụng làm thuốc điều trị ung thư phổi. Tuy nhiên nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở mức
phát hiện ra píc của chất trên. Dựa trên các kết quả này, nhóm tác giả quyết định nghiên
cứu nhằm xây dựng qui trình chuẩn để xác định hàm lượng Cleisindosid D được chiết
xuất từ quả của cây Chà chôi để phát triển thành nguyên liệu làm thuốc điều trị ung thư.
Chúng tôi tiến hành đề tài:"Xây dựng phương pháp định lượng Cleisindosid D
trong quả của một số loài thuộc chi cách hoa Cleistanthus bằng HPLC" với mục tiêu:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Cleisindosid D trong quả của một
số loài thuộc chi Cách hoa (Cleistanthus) bằng HPLC.
2. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng sơ bộ định lượng Cleisindosid D trong quả của
một số loài thuộc chi Cách hoa (Cleistanthus).

1


CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT CỦA CHI CÁCH HOA
1.1.1. Vị trí phân loại
Theo APG [24], họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) được phân loại như sau:
Thực vật có hoa (Angiosperms)
Thực vật hai lá mầm thật sự (Eudicots)
Nhánh Hoa hồng (Rosids)

Bộ Sơ-ri (Malpighiales)
Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)
1.1.2. Họ Thầu Dầu (Euphorbiaceca)
Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) hay còn gọi là họ Đại Kích là một họ lớn của thực vật
có hoa với 240 chi và khoảng 6000 loài. Trước đây chia thành 5 phân họ bao gồm
Acalyphoideae, Crotonoideae, Euphorbioideae, Oldfieldioideae và Phyllanthoideae. Ba
phân họ đầu tiên là các phân họ một lá mầm trong khi hai phân họ sau là hai lá mầm
[34]. Phần lớn là thân cây thảo, nhưng ở khu vực nhiệt đới cũng tồn tại các loài cây bụi
hoặc cây thân gỗ, phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới [5].
1.1.3. Chi Cleistanthus
Cleistanthus (do chữ Latin cleisto, bắt nguồn từ chữ Hy Lạp kleistos: đóng, không
mở và anthos: hoa kết hợp thành) được dịch sang Tiếng Việt là cách hoa hoặc cọc rào.
Là cây gỗ nhỏ hay nhỡ, lá mọc so le xếp hai dãy, nguyên. Cụm hoa ở nách lá, thành xim
đơn hoặc bông, nhiều hoa hoặc ít hoa; lá bắc thường ngắn hơn hoa; hoa không cuống
hoặc có cuống, cùng gốc hoặc khác gốc; đài hợp ở gốc. Hoa đực có 4-6 lá đài, thường
là 5, xếp van. Cánh hoa 5 nhỏ, thường nguyên. Đĩa mật phẳng hay lồi. Bầu không lông
hoặc có lông nhung. Quả nang có 3 mảnh vỏ tròn ở lưng; hạt hình trứng - 3 góc [9].
Chi Cleistanthus gồm khoảng 140 loài mọc tự nhiên từ châu Phi, Ấn Độ đến
Australia. Ở nước ta, theo sách "Cây cỏ Việt Nam" của tác giả Phạm Hoàng Hộ [6], chi
Cleistanthus có 14 loài, phân bố khắp cả nước, từ Hà Giang tới Phú Quốc.

2


1.1.4. Loài Cleistanthus tonkinensis

Hình 1.1. Tiêu bản cây Cleistanthus tonkinensis

Quả xanh

Quả chín

Hình 1.2 Quả của cây Cleistanthus tonkinensis
-

Đặc điểm thực vật

Loài Cleistanthus tonkinensis có tên Tiếng Việt là Chà chôi hay Cọc rào, thuộc họ
Thầu dầu (Euphorbiaceca), được miêu tả như sau:
-

Cây gỗ nhỏ cao 1-3 m; nhánh láng, đen.

-

Phiến lá tròn dài, to 7-13 x 2-5 cm, chót có mũi nhọn, đáy tròn, mỏng, cứng, láng,
gân phụ 7-8 cặp; cuống 1cm, lá bẹ 2-3 mm.

-

Chùm hoa cao 1-1,5 cm; hoa nhỏ, không cọng; cánh hoa 5, to 1mm, tiểu nhụy 5,
nhụy cái lép; hoa cái không cọng, cánh hoa 2 mm, đĩa mật quanh noãn sào có ít
lông.

-

Nang (quả) xoan, cao 1,3 cm, nở làm 3 mảnh; hột hoe, cao 7 mm.

Cây phân bố ở khu vực rừng trên đá vôi từ Cao Bằng, Lạng Sơn đến Nghệ An, Hà
Tĩnh [6].

3


1.1.5. Loài Cleistanthus indochinensis
1.1.5.1. Đặc điểm thực vật và phân bố
Cây Cách hoa đông dương có tên khoa học là Cleistanthus indochinensis Merr. ex
Croiz., là loại cây tiểu mộc, lá có phiến bầu dục thon, Quả nang có đường kính 10 mm,
mảnh vỏ 2-3 hạt, hình cầu to 5 mm, nâu tái. Cây phân bố ở miền Bắc và miền Trung
nước ta [6].
1.1.5.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học:
Theo kết quả nghiên cứu thì dịch chiết của quả cây Cách Hoa Đông Dương (C.
indochinensis), quả cây chà chôi (C. tonkinesis) và quả cây C. eberhardtii có khả năng
ức chế sự phát triển của dòng tế bào KB tương ứng là 89% - 95% ở nồng độ 1 µg/ ml.
Năm 2012, từ dịch chiết của quả cây Cách Hoa Đông Dương (C. indochinensis), Trịnh
Thị Thanh vân và cộng sự đã phân lập được và xác định được cấu trúc của 11 hợp chất,
trong đó có 9 hợp chất mới là : hợp chất cleisindosid D, demethoxycleisindosid D,
podocleisindosid D, cleindosid A, cleindosid B, cleindosid C, cleindosid D, cleindosid
E, cleindosid F và hai hợp chất đã biết là axit gallic và amentoflavon. Các hợp chất mới
là thành phần chính của quả, đều có khung cơ sở là aryl tetralin lignan và các dẫn xuất
glycosid của chúng [12]. Trong đó, cleisindosid D có hàm lượng lớn nhất trong quả của
cây, hợp chất này được thử nghiệm trên các dòng tế bào khác (MCF7, MCF7R, HT29)
với giá trị IC50 trong khoảng 14 - 36 nM (tương đương với khoảng 0,006 - 0,014 μg/ml).
(Theo Viện nghiên cứu ung thư quốc gia Mỹ NCI, một hợp chất có hoạt tính gây độc tế
bào mà có giá trị IC50 ≤ 4 µg/ml thì chất đó được coi là có hoạt tính). Điều đặc biệt thú
vị là hợp chất này ức chế chọn lọc dòng tế bào ung thư vú kháng thuốc (MCF7R: IC50
14 nM) khi so sánh với dòng ung thư vú thường (MCF7: IC50 36 nM) [19].

4

1.2. TỔNG QUAN VỀ HỢP CHẤT CLEISINDOSID D
1.2.1. Sơ lược về hợp chất cleisindosid D
Danh pháp IUPAC: 7-hydroxy-6-metoxy-4,5:3’,4’-bis(metylendioxy)-2.7’
xyclolignan-9,9’-olit
Công thức phân tử: C21H18O8
Khối lượng phân tử: 398,0 Da
Công thức cấu tạo:

Hình 1.3. Công thức cấu tạo của cleisindosid D
Tính chất: Tinh thể rắn, màu trắng. Tan tốt trong dicloromethan, aceton và
acetonitril, kém tan trong methanol. Nhiệt độ nóng chảy: 195 - 196ºC (aceton). Độ
quay cực [α]30D -148,0 (c 0,5; CHCl3) [28].
1.2.2. Các nghiên cứu trước đây về hợp chất cleisindosid D
Năm 2012, trong khuôn khổ Dự án hợp tác Pháp - Việt về sàng lọc hoạt tính sinh
học của thảm thực vật Việt Nam, hợp chất cleisindosid D đã lần đầu tiên được phân lập
từ quả của cây Cách hoa Đông Dương (Cleistanthus indochinensis Merr. ex Croiz) bởi
Trịnh Thị Thanh Vân và các cộng sự. Chất này sau đó đã được thử hoạt tính sinh học
gây độc trên tế bào ung thư. Kết quả cho thấy hợp chất cleisindosid D cho hoạt tính ức
chế rất mạnh trên các dòng tế bào thử nghiệm (KB, MCF7, MCF7R, HT29) với giá trị
IC50 trong khoảng 14 - 36 nM (tương đương với khoảng 0,006 - 0,014 μg/ml) [9], [38].
Từ kết quả khả quan trên, hợp chất cleisindosid D tiếp tục được tiến hành thử mô
hình Docking phân tử đánh giá khả năng ức chế enzym topoisomerase IIB và enzym
caspase. Theo dự đoán của mô hình, hoạt chất này có tác dụng kháng tế bào ung thư,
5


kháng khuẩn và kháng virus. Bên cạnh hợp chất Cleisindosid D, các hợp chất glycosid
của cleisindosid D phân lập được từ quả của cây Cách hoa đông dương có cấu trúc hóa
học gần như tương tự etoposid và teniposid là hai dẫn chất của podophyllotoxin đang
được sử dụng làm thuốc điều trị ung thư phổi. Những nghiên cứu trên đã mở ra triển

vọng sản xuất thuốc có nguồn gốc từ dược liệu để điều trị ung thư, điều này chính là
động lực thúc đẩy chúng tôi tiến hành khóa luận này để tìm nguồn dược liệu có thể chiết
xuất cao định chuẩn.
1.3. TỔNG QUAN VỀ CÁC KỸ THUẬT CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU
1.3.1. Khái niệm về chiết xuất:
Chiết xuất là phương pháp sử dụng dung môi để lấy các chất tan ra khỏi mô thực
vật. Sản phẩm thu được sau quá trình chiết xuất là một dung dịch của các chất hòa tan
trong dung môi, dung dịch này được gọi là dịch chiết. [2]
Tầm quan trọng của chiết xuất dược liệu
-

Giúp lấy các hoạt chất dưới dạng cần thiết dạng dung dịch hay bột.

-

Thu được chất tinh khiết để làm thuốc mới hoặc bán tổng hợp ra thuốc mới. Ví
dụ chiết xuất artemisinin từ cây thanh hao hoa vàng để sản xuất ra thuốc điều trị
bệnh sốt rét.

-

Giúp chuyển dạng bào chế từ viên hoàn sang dạng dung dịch hoặc cao thuốc.

-

Góp phần vào tiêu chuẩn hóa dược liệu.

-

Phát triển sản phẩm nghiên cứu và ứng dụng.

1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết xuất
Trong quá trình chiết, để đạt được vận tốc chiết và hiệu suất chiết cao, cần lưu ý các
yếu tố sau: [2]
1.3.2.1. Chênh lệch nồng độ chất cần chiết ở trong nguyên liệu và dung môi phải cao
để quá trình khuếch tán các phân tử cần chiết càng mạnh.
Muốn vậy, có thể lợi dụng nguyên lý chiết ngược dòng để tạo ra sự chênh lệch nồng
độ lớn (trong chiết liên tục) hay thay mới dung môi chiết nhiều lần (trong chiết gián
đoạn).
Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu phải đủ lớn. Tuy nhiên chỉ lớn ở mức độ hợp lý nhất
định: nếu tỷ lệ này quá lớn sẽ làm cho nồng độ chất cần chiết trong dung dịch chiết rút
được thấp, gây khó khăn và hiệu quả kinh tế kém (tốn năng lượng và thời gian đuổi dung
môi).
6


1.3.2.2. Hình thái, tính chất và cấu tạo của tổ chức nguyên liệu:
Mức độ phá vỡ cấu trúc tế bào càng nhiều thì sự tiếp xúc giữa chất cần chiết và dung
môi càng tăng nên rút ngắn thời gian chiết và chiết triệt để hơn.
Kích thước càng nhỏ thì diện tích tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi càng tăng,
hiệu suất chiết tăng. Tuy nhiên, cũng chỉ nên nhỏ tới mức nhất định vì quá nhỏ nguyên
liệu dễ bị vón lại các hạt mịn lắng đọng trên các lớp nguyên liệu. Mặt khác, nguyên liệu
quá nhỏ sẽ bị cuốn vào dịch chiết gây khó khăn cho quá trình xử lý dịch chiết sau khi
chiết.
Tính chất của nguyên liệu cũng ảnh hưởng lớn đến hiệu suất chiết. Khi chiết bằng
dung môi hữu cơ, độ ẩm nguyên liệu giảm thì tốc độ chiết tăng lên. [2]
1.3.2.3. Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ chiết
Thời gian càng dài thì lượng chất khuếch tán tăng, nhưng thời gian phải có giới
hạn. Khi đạt được mức độ chiết xuất cao nhất nếu kéo dài thời gian thì sẽ không mang
lại hiệu quả kinh tế.

Nhiệt độ có tác dụng tăng tốc độ khuếch tán và giảm độ nhớt, do đó phân tử
chất hòa tan chuyển động dễ dàng khi khuếch tán giữa các phân tử dung môi. Tuy nhiên,
nhiệt độ tăng có giới hạn, vì nhiệt độ quá cao sẽ có thể phân hủy phân tử cần chiết và
gây khó khăn cho quá trình công nghệ. [2]
1.3.2.4. Dung môi chiết cần thỏa mãn các điều kiện sau:
-

Hòa tan chất cần chiết ở bất kì tỷ lệ nào.

-

Nhiệt độ sôi thấp để dễ dàng tách dung môi ra khỏi dịch chiết.

-

Thành phần hóa học ổn định, không phản ứng phụ với nguyên liệu.

-

Không độc hại, không ảnh hưởng sức khỏe và chất lượng sản phẩm.

-

Không gây cháy nổ, an toàn cho quá trình sản xuất.

-

Không ăn mòn thiết bị.

-

Rẻ tiền, dễ kiếm, có khả năng sử dụng trong sản xuất.

Tuy nhiên hiện nay chưa có loại dung môi nào đáp ứng đầy đủ những điều kiện trên. Do
đó, tùy trường hợp chiết cụ thể để chọn dung môi cho hợp lý. [2]
1.3.3. Các kĩ thuật chiết xuất
Dựa vào cách tiến hành, có thể chia thành các kĩ thuật chiết sau:
7


1.3.3.1. Chiết gián đoạn [15]:
Theo kĩ thuật này ta ngâm nguyên liệu vào dung môi. Sau một thời gian nhất định,
khi giữa dung môi và nguyên liệu đạt nồng độ chất cần thiết ở mức độ cân bằng, tiến
hành đổ dung môi cũ ra, thay dung môi mới vào. Cứ như thế cho đến khi chiết hết chất
cần chiết.
Ngâm các vật liệu thực vật (thô hoặc bột) trong một bình chứa có nắp với một dung
môi và được để ở nhiệt độ trong phòng trong thời gian tối thiểu 3 ngày với sự khuấy liên
tục => làm mềm và phá vỡ thành tế bào thực vật để giải phóng chất hòa tan. Sau 3 ngày,
hỗn hợp được ép hoặc lọc. Trong phương pháp truyền thống này, nhiệt được truyền qua
sự đối lưu và việc lựa chọn dung môi sẽ xác định loại hợp chất chiết xuất từ các mẫu.
-

Ưu điểm của kỹ thuật này là đơn giản, dễ thực hiện.

-

Nhược điểm là tốn công, tốn thời gian, tốn dung môi chiết nên không kinh tế,

không phù hợp với quy mô sản xuất lớn.
1.3.3.2. Chiết bán liên tục

Nguyên lý của phương pháp này là dùng nhiều thiết bị chiết gián đoạn bố trí thành
một hệ thống liên hợp tuần hoàn nhằm mục đích giảm thời gian chiết, ít tốn công hơn,
tiết kiệm được nhiều dung môi hơn. Đối với phương pháp này quá trình chiết xuất thực
hiện theo nguyên tắc dung môi đi từ nơi có nồng độ chất chiết cao đến nồng độ chất
chiết thấp.
1.3.3.3. Chiết liên tục [18],[11]
Nguyên lý là ngâm dung môi trong dòng chuyển động cùng chiều hay ngược chiều
của dung môi.
Chiết Soxhlet
Mẫu dược liệu mịn được đặt trong một túi xốp hoặc "bao" được làm từ giấy lọc hoặc
cellulose, nơi đặt nằm trong buồng tháo của thiết bị Soxhlet. Dung môi chiết xuất được
làm nóng trong bình cầu, bốc hơi vào lớp túi đựng mẫu, ngưng tụ trong bình ngưng tụ
và nhỏ giọt. Khi hàm lượng chất lỏng đạt đến cánh tay cần xả, dung dịch lỏng sẽ đổ vào
bình đun lại và quá trình này tiếp tục.
-

Ưu điểm:
✓ Cần ít dung môi hơn
8


✓ Phù hợp với dược liệu rắn chắc như rễ, thân, vỏ
-

Nhược điểm
✓ Tiếp xúc dung môi với nguồn cấp nhiệt => dễ cháy nổ
✓ Dung môi độc hại, nguy cơ ôi nhiễm môi trường
✓ Dung môi đòi hỏi độ tinh khiết cao => Tăng chi phí

Chiết hồi lưu

Mẫu dược liệu mịn được đưa vào bình cầu và thêm dung môi. Dung môi được
đun nóng, cùng với các chất bay hơi khác sẽ được chuyển trở lại môi trường phản ứng
thông qua hệ thống ngưng tụ.
- Ưu điểm:
✓ Tiết kiệm dung môi
✓ Hạn chế ô nhiễm
✓ Hiệu suất chiết cao
✓ Dễ thực hiện
- Nhược điểm:
✓ Sau khi chiết xuất phải tiến hành tách riêng các phần với nhau, đó là quá
trình phức tạp
✓ Tốn thời gian
✓ Không khuấy trộn được
✓ Dịch chiết luôn ở nhiệt độ cao nên các chất không bền với nhiệt dẽ bị phân
hủy.

9


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
➢ Đối tượng nghiên cứu trong khóa luận là quả của một số loài cây trong chi Cách
hoa (Cleistanthus).
-

Quả của cây Chà chôi hay Cọc rào (Cleistanthus tonkinensis, Jabl.
Euphorbiaceae) được thu hái tại La Bằng - Đại Từ - Thái Nguyên.

-

Quả của cây Cách hoa Eberhardtii (Cleistanthus eberhardtii, Merr. Euphorbiace)
được thu hái tại Phú Lộc – Thừa Thiên Huế.

Mẫu nghiên cứu đã được giám định đúng tên loài và lưu giữ mẫu tại Viện tài nguyên và
sinh thái, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.1.2. Nguyên liệu chất chuẩn
➢ Chất chuẩn cleisindosid D có hàm lượng 94,31% được phân lập, tinh chế và đóng

ống tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương.
Qui cách đóng ống: đóng 10mg chất chuẩn trong ống thủy tinh.
2.1.3.Thiết bị, dụng cụ
-

Hệ thống máy HPLC Agilent 1200 Series (Mỹ) với cột sắc ký Inertsil® ODS – 3
(250 mm x 4,6 mm; 5 μm – Nhật Bản), sử dụng phần mềm xử lý số liệu Agilent
ChemStation.

-

Máy lắc siêu âm

-

Nồi cách thủy, nồi cất quay.

-

Tủ sấy, tủ hốt

-

Bộ lọc dung môi, màng lọc 0,45μm.

-

Bộ dụng cụ sinh hàn

-

Cân kỹ thuật, cân phân tích điện tử.

-

Bộ chiết Soxhlet 100ml

-

Pipet chính xác và các dụng cụ thủy tinh cần thiết khác.

2.1.4. Dung môi, hóa chất
➢ Acetonitril dùng cho HPLC (Fisher).
➢ Nước cất hai lần.
➢ Acid sulfuric, natri hydroxyd, hydrogen peroxyd đạt tiêu chuẩn hóa chất tinh
khiết phân tích dùng cho HPLC.
➢ Ethanol, dicloromethan, methanol đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích.
10


2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp chiết xuất Cleisindosid D từ quả của một số loài chi cách hoa
(Cleistanthus).
2.2.1.1. Xác định độ ẩm của bột quả của cây thuộc chi Cleistanthus
Phần quả của cây sau khi được làm khô tự nhiên, nghiền thành bột thô rồi xác định
độ ẩm của dược liệu theo phương pháp mất khối lượng do làm khô (Phụ lục 9.6, Dược
điển Việt Nam IV).
Dùng chén thủy tinh có nắp mài làm bì đựng mẫu thử, làm khô bì trong tủ sấy ở nhiệt
độ 105oC dưới áp suất thường trong 30 phút, để nguội tới nhiệt độ phòng trong bình hút
ẩm có silica gel rồi cân để xác định khối lượng bì. Cân ngay mẫu thử vào bì này một
lượng chính xác khoảng 1 gam, dàn mỏng thành lớp có độ dày khoảng 5 mm, sấy ở
105oC đến khối lượng không đổi. Từ đó xác định độ ẩm của bột mẫu nghiên cứu.
2.2.1.2. Chiết xuất
-

Lựa chọn dung môi chiết: Khảo sát chiết siêu âm 60 phút với các dung môi:

methanol, ethanol, acetonitril, hỗn hợp Methanol - Dichloromethane với các tỉ lệ 1-3, 11, 3-1. Cân chính xác khoảng 0,4 g bột dược liệu, thêm 20 ml dung môi, lắc siêu âm 60
phút. Sau đó lọc qua giấy lọc cho vào bình định mức 20 ml và tiến hành rửa cắn bằng
dung môi cho vừa đủ 20 ml. Tiến hành sắc ký các dung dịch thu được, lựa chọn dung
môi có hiệu suất chiết cao nhất để tiếp tục khảo sát.
-

Lựa chọn tỉ lệ dung môi/nguyên liệu: Tiến hành khảo sát với dung môi đã được

lựa chọn ở trên với tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 20 ml/0,4 g.
-

Lựa chọn kỹ thuật chiết: chiết siêu âm, chiết hồi lưu, chiết Soxhlet.

-

Lựa chọn thời gian chiết

-

Lựa chọn số lần chiết

2.2.1.3. Tính hiệu suất chiết
Hàm lượng % của Cleisindosid D trong bột dược liệu được tính theo công thức
sau:
ST . Cc . D . 100 %
HL (%) =
SC . M . (100 – x) . 1000
Trong đó:
11


HL: Hàm lượng (%)
SC:

Diện tích pic cleisindosid D trên sắc ký đồ từ dung dịch chuẩn

ST:

Diện tích pic cleisindosid D trên sắc ký đồ từ dung dịch thử

Cc:

Nồng độ dung dịch chuẩn (mg/ml)

M:

Khối lượng dược liệu đem chiết (g)

DT:

Độ pha loãng của mẫu thử

x:

Độ ẩm dược liệu (%)

2.2.2. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Cleisindosid D.
2.2.2.1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng cleisindosid D bằng HPLC.
a.

Khảo sát điều kiện sắc ký
Khảo sát xây dựng chương trình sắc ký, dựa vào các tài liệu như dược điển, các

-

nghiên cứu khác đã công bố, lựa chọn chương trình sắc ký thích hợp nhất.
Dựa theo cấu trúc phân tử và cấu trúc hóa học của hoạt chất được chiết từ dược liệu

-

để tìm các các điều kiện sắc ký phù hợp như:
✓

Thành phần pha động.

✓

Bản chất pha tĩnh.

✓

Bước sóng phát hiện.

✓

Tốc độ dòng pha động.

✓

Thể tích tiêm mẫu.

✓

Dung môi pha mẫu.

❖ Lựa chọn cột sắc ký
Hiện nay sắc ký phân bố pha đảo là phương pháp được sử dụng phổ biến với nhiều
tính ưu việt. Cleisindosid D là một hợp chất mới, trên thế giới hầu như chưa có nghiên
cứu nào về xây dựng phương pháp định lượng Cleisindosid D trong dược liêu. Nhận
thấy cấu trúc của hợp chất cleisindosid D có những phần tương đồng với etoposide và
tenoposide, dựa trên các kết quả xây dựng phương pháp tách và xác định độ tinh khiết
sắc kí của cleisindosid D trong chất chuẩn gốc. Điều kiện sắc kí được lụa chọn như sau:
-

Cột RP18 có kích thước hạt nhồi là 5 µm, với chiều dài cột là 25 cm

-

Pha động là ACN: H2O một trong những yếu tố quyết định thời gian lưu giữ các chất
phân tích và hiệu quả của sự tách sắc ký.
❖

Lựa chọn bước sóng phát hiện
12


Quét phổ UV – VIS của các hợp chất nghiên cứu để xác định cực đại hấp thụ của
chúng, từ đó chọn bước sóng thích hợp nhất mà tại đó các chất phân tích đều có độ hấp
thụ đủ lớn.
Thẩm định phương pháp phân tích

b.

Sau khi lựa chọn được điều kiện sắc ký, thẩm định quy trình định lượng theo hướng
dẫn của ICH (2005) với các nội dung sau: độ đặc hiệu, tính thích hợp của hệ thống,
khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, độ chính xác trung gian, giới hạn phát hiện (LOD)
và giới hạn định lượng (LOQ).
❖

Độ đặc hiệu
Tiến hành: Tiêm lần lượt dung dịch mẫu trắng, chuẩn, thử và thử thêm chuẩn vào hệ

thống, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn. Ghi nhận SKĐ.
Yêu cầu: trên SKĐ của mẫu thử phải cho pic có thời gian lưu tương ứng với pic

cleisindosid D trên SKĐ của mẫu chuẩn. Trên SKĐ của mẫu trắng không cho pic có
thời gian lưu tương ứng với pic cleisindosid D, nếu có đáp ứng thì phải nhỏ hơn 1% so
với pic cleisindosid D trong mẫu thử. Phổ hấp thụ tử ngoại của pic tương ứng với
cleisindosid D trong mẫu thử và mẫu chuẩn phải tương ứng nhau. SKĐ mẫu thử thêm
chuẩn phải cho pic có thời gian lưu tương ứng với pic cleisindosid D trên SKĐ của mẫu
chuẩn và diện tích pic cleisindosid D so với pic cleisindosid D trên SKĐ mẫu thử.
Tiến hành phân tích mẫu thử là dịch chiết từ quả cây Chà chôi bằng dung môi
methanol được phân huỷ trong các điều kiện khắc nghiệt như đun sôi 100oC trong vòng
2 giờ, soi đèn UV/24 giờ, phân huỷ trong H2O2 30%, dung dịch H2SO4 0,1N và NaOH
0,1N.
Yêu cầu: Tạp phân hủy (nếu xuất hiện) phải tách hoàn toàn khỏi pic chính
cleisindosid D và độ tinh khiết pic cleisindosid D phải xấp xỉ 1,0.
❖ Độ thích hợp của hệ thống
Tiêm lặp lại 6 lần dung dịch cleisindosid D chuẩn có nồng độ thích hợp, và tiến hành
sắc ký theo điều kiện đã chọn. Ghi SKĐ và xác định thời gian lưu, diện tích, hệ số bất
đối của pic cleisindosid D và số đĩa lý thuyết của cột tính theo pic cleisindosid D. Tính
RSD (%) của diện tích pic và thời gian lưu.
Yêu cầu: RSDthời gian lưu ≤ 1,0%, RSDdiện tích pic ≤ 2,0%.
13


❖

Độ lặp lại
Xác định hàm lượng cleisindosid D có trong 06 mẫu thử đã chuẩn bị, xác định RSD

của kết quả định lượng.
Yêu cầu: RSD ≤ 2,0% (n = 6)
❖

Độ tuyến tính và khoảng xác định
Sử dụng các mẫu chuẩn ở nồng độ khoảng 0,1%, 1%, 10%, 50%, 100%, 150%, 200%

và 300% so với nồng độ định lượng ở phần độ lặp lại. Tiến hành sắc ký theo điều kiện
đã chọn. Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ
cleisindosid D có trong mẫu.
Yêu cầu :
• Hệ số tương quan tuyến tính (r) phải ≥ 0,998.
• % Hệ số chắn (so với đáp ứng tại nồng độ 100%) phải ≤ 2%
Công thức tính: %Y =
❖

|Hệ số chắn|
S pic chuẩn 100%

x 100%

Độ đúng
Tiến hành định lượng cleisindosid D ở bốn mức nồng độ khác nhau 50%, 100%,

150% và 200% so với nồng độ định lượng bằng cách thêm chất chuẩn cleisindosid D
vào mẫu thử để được nồng độ cleisindosid D 50%, 100%, 150% và 250% so với nồng
độ định lượng. Mỗi mức nồng độ làm 03 mẫu. Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn.
Tính tỷ lệ lượng cleisindosid D thu hồi lại được so với lượng thêm vào.
Yêu cầu: tỷ lệ thu hồi từ 98,0 – 102,0%, RSD ≤ 2,0%.
❖

Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
Pha loãng dần mẫu thử bằng dung môi pha mẫu. Tiến hành phân tích các dung dịch

pha loãng trên. Trên sắc ký đồ thu được, xác định đáp ứng píc (chiều cao) tương ứng
với mỗi mức nồng độ. Xác định giá trị LOD của phương pháp dựa vào tỷ lệ đáp ứng so
với nhiễu. Trong đó LOD là giá trị nồng độ mà ở đó có đáp ứng pic cleisindosid D gấp
khoảng 3 lần giá trị nhiễu đường nền.
Sau khi xác định giá trị LOD, tính giá trị LOQ thông qua công thức:
LOQ = 3,3 x LOD (kl/tt
14


2.2.3. Xác định hàm lượng cleisindosid D trong quả của một số loài thuộc chi
Cleistanthus.
Áp dụng phương pháp xây dựng ở mục 2.2.2 để định lượng cleisindosid D trong quả
của một số loài chi cách hoa
2.2.3.1. Định lượng cleisindosid D trong quả một số loài chi cách hoa bằng phương
pháp HPLC
Tiến hành xử lý mẫu và chạy sắc ký theo chương trình đã được xây dựng và thẩm
định ở mục 2.2.2, ghi lại SKĐ và diện tích pic. Từ thông số diện tích pic, lượng cân mẫu
chuẩn, thử, hàm lượng chuẩn, hàm ẩm tính ra hàm lượng cleisindosid D có trong dược
liệu.
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu
-

Các số liệu được tính toán và xử lý thống kê bằng Microsoft Excel 2010.
Kết quả thí nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình cộng/trừ độ lệch chuẩn (

 = X  SD ).
-

Tính RSD bằng phương pháp thống kê:

1 n
X =   Xi
n i =1
Giá trị trung bình:
n

Độ lệch chuẩn:

S=

(X
i =1

Độ lệch chuẩn tương đối:

i

− X )2

n −1

RSD (%) =

15

S
 100
X

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CLEISINDOSID D BẰNG
HPLC
3.1.1. Xây dựng qui trình sắc ký định lượng cleisindosid D từ quả của một số loài
thuộc chi Cleistanthus bằng HPLC/DAD.
3.1.1.1 Chuẩn bị mẫu:
-

Mẫu chuẩn cleisindosid D gốc: Cân chính xác khoảng 5 mg cleisindosid D chuẩn
vào bình định mức 10 ml, hoà tan và định mức vừa đủ bằng ACN-H2O (1-1). Lắc
đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm.

-

Mẫu chuẩn làm việc cleisindosid D: Hút chính xác 1,00 mL dung dịch chuẩn
cleisindosid D gốc cho vào bình định mức 10 mL, định mức vừa đủ bằng ACN-H2O

-

(1-1).
Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 0,4 g bột quả cây Chà chôi (mẫu trồng tại La

Bằng - Đại Từ - Thái Nguyên) (đã được nghiền mịn, rây qua rây có kích thước mắt rây
0,250 mm) vào bình nón nút mài, thêm chính xác 20,00 ml MeOH-H2O (9-1), đậy nút
bình và cân xác định khối lượng. Tiến hành siêu âm trong 1 giờ, để nguội và cân lại, bổ
sung dung môi khảo sát để bằng khối lượng ban đầu, lắc đều, lọc. Hút chính xác 10,00
mL dịch chiết thu được đem cô cách thuỷ đến cắn, hoà tan cắn bằng ACN-H2O (1-1),
đưa cắn vào bình định mức 10 ml và định mức vừa đủ bằng ACN-H2O (1-1), lắc đều.
Lọc qua màng lọc 0,45 m được dung dịch thử để tiêm sắc ký.
3.1.1.2 Lựa chọn điều kiện sắc ký

Hoạt chất cleisindosid D là hoạt chất mới chưa có nghiên cứu nào xây dựng
phương pháp định lượng cleisindosid D trong quả cây thuộc chi Cách hoa (cleistanthus)
bằng HPLC/DAD. Dựa trên chương trình sắc kí định lượng tạp chất liên quan của chất
chuẩn gốc cleisindosid D, điều chỉnh chương trình gradient để được chương trình sắc kí
tách và định lượng hoạt chất chính trong quả cây Cách hoa như sau:
❖ Lựa chọn cột sắc kí: RP18 (250 x 4,6 mm; 5µm)
❖ Pha động: ACN : Nước
❖ Chương trình gradient sau:
Bảng 3.1. Xây dựng chương trình Gradient
STT Thời gian (phút)
A
B
1.
0
30
70
2.
12
38
62
3.
13
38
62
4.
30
50
50
5.
31

30
70
6.
Thời gian phân tích 35 phút
16

Tốc độ dòng
1,0 mL/phút
1,5 mL/phút
1,0 mL/phút
1,0 mL/phút
1,0 mL/phút


• Để xác định khả năng tách của cleisindosid D so với các chất bên cạnh là cleisindosid
C, dung dịch phân giải cleisindosid C, cleisindosid D được sử dụng, kết quả trình
bày ở hình 3.1.

Hình 3.1. SKĐ khảo sát khả năng tách của cleisindosid C với cleisindosid D và
cleisindosid D với 7,8-dihydrocleisindosid D trong dung dịch chuẩn phân giải

Hình 3.2. SKĐ khảo sát khả năng tách của cleisindosid C và cleisindosid D trong
dược liệu trên cột RP18 Innersustain (250 x 4,6 mm; 5µm) và hệ pha động ACN-Nước.
Nhận xét: Khi khảo sát trên cột RP18 Innersil (250 x 4,6 mm; 5µm), với hệ pha động
ACN:nước với chương tình gradient đã lựa chọn.
-

Trên SKĐ dung dịch chuẩn phân giải cleisindosid C, cleisindosid D, cho thấy khả
năng tách tốt của cleisindosid C và cleisindosid D với Rs là 4,63 (Rs 1,5).

-

Trên SKĐ của dung dịch thử cho thấy các pic đẹp, cân xứng, cleisindosid C và
cleisindosid D tách nhau hoàn toàn với độ phân giải lần lượt là Rs = 4,63.

3.1.1.3. Lựa chọn bước sóng:
Quét phổ UV của píc sắc kí của dung dịch chuẩn của cleisindosid D từ 200-400
nm, phổ UV của cleisindosid D trình bày ở hình 3.3

17