Ứng dụng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang và phân tích hình ảnh tế bào trong đánh giá hoạt tính chống ung thư (ung thư gan và ung thư cổ tử cung)

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN KIM PHƯỢNG

ỨNG DỤNG KĨ THUẬT MIỄN DỊCH
HUỲNH QUANG VÀ PHÂN TÍCH
HÌNH ẢNH TẾ BÀO TRONG ĐÁNH GIÁ
HOẠT TÍNH CHỐNG UNG THƯ (UNG
THƯ GAN VÀ UNG THƯ CỔ TỬ CUNG)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ

HÀ NỘI - 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN KIM PHƯỢNG
Mã sinh viên: 1401488

ỨNG DỤNG KĨ THUẬT MIỄN DỊCH
HUỲNH QUANG VÀ PHÂN TÍCH HÌNH
ẢNH TẾ BÀO TRONG ĐÁNH GIÁ
HOẠT TÍNH CHỐNG UNG THƯ (UNG
THƯ GAN VÀ UNG THƯ CỔ TỬ CUNG)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ
Người hướng dẫn:
1. GS.TS. Phạm Quốc Long
2. PGS.TS. Nguyễn Mạnh Tuyển
Nơi thực hiện:

Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên

HÀ NỘI - 2019


LỜI CẢM ƠN
Trƣớc tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới quý Thầy, Cô trong Ban
giám hiệu cùng toàn thể các giảng viên Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đã tận tình
giảng dạy và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trong suốt thời gian em theo
học chƣơng trình đào tạo dƣợc sĩ đại học hệ chính quy khóa 69.
Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi lời cảm ơn tới GS.TS. Phạm Quốc
Long – Viện trƣởng Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên (Viện Hàn lâm
KHCNVN) cùng PGS.TS. Nguyễn Mạnh Tuyển – Trƣởng bộ môn Dƣợc học cổ
truyền (Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội) đã thu nhận, hƣớng dẫn em tận tình cũng
nhƣ góp ý nhiều nội dung quý báu từ khi nghiên cứu đề tài đến khi hoàn thành khóa
luận này.
Em cũng xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Đỗ Hữu Nghị –
trƣởng phòng Sinh học thực nghiệm – Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên cũng
nhƣ các cô chú, anh chị tại phòng Sinh học thực nghiệm đã giúp đỡ, hƣớng dẫn và
tạo điều kiện cho em thực hiện nghiên cứu này. Khóa luận sử dụng trang thiết bị từ
dự án đầu tƣ phòng thí nghiệm trọng điểm cấp Viện Hàn lâm KHCNVN về thử
nghiệm hoạt tính sinh học và nội dung nghiên cứu thuộc Đề tài "Phát triển kỹ thuật
phân tích hình ảnh hiển vi huỳnh quang nội hàm cao phục vụ sàng lọc, đánh giá
các hợp chất có hoạt tính chống ung thư mức độ tế bào và hướng đích phân tử "
(VAST 04.05/18-19; Chủ nhiệm ĐT: TS. Đỗ Hữu Nghị).
Do thời gian làm thực nghiệm cũng nhƣ kiến thức của bản thân còn hạn chế,
khóa luận này không tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong nhận đƣợc sự góp ý
của các thầy cô cùng với những ngƣời quan tâm để nội dung khóa luận đƣợc hoàn
thiện hơn.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019

Sinh viên
Nguyễn Kim Phƣợng


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................... 1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ..................................... 3
1.1. Tổng quan về ung thƣ ...................................................................................... 3
1.2. Sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học .................................................... 5
1.3. Sàng lọc hoạt tính dựa trên phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào ............... 7
1.4. Phƣơng pháp điều trị ung thƣ hƣớng đích phân tử .......................................... 9
1.5. Tổng quan về yếu tố nhân NF-κB liên quan quá trình viêm và ung thƣ ....... 10
CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 13
2.1. Phạm vi, đối tƣợng nghiên cứu ...................................................................... 13
2.2. Vật liệu, hóa chất và thiết bị .......................................................................... 13
2.2.1. Dòng tế bào ............................................................................................. 13
2.2.2. Môi trường nuôi cấy tế bào ..................................................................... 13
2.2.3. Mẫu thử nghiệm ....................................................................................... 13
2.2.4. Thiết bị ..................................................................................................... 14
2.3. Nội dung nghiên cứu...................................................................................... 15
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................... 15
2.4.1. Phương pháp nuôi cấy và hoạt hóa tế bào .............................................. 15
2.4.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế sự tăng sinh tế bào.................. 16
2.4.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống ung thư đích phân tử NF-κB ... 17
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................. 20
3.1. Sàng lọc hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào ung thƣ: ...................................... 20

3.2. Đánh giá hoạt tính chống ung thƣ đích phân tử NF-κB trên dòng tế bào HeLa
........................................................................................................................ 24
3.2.1. Kích thích chuyển vị NF-κB .................................................................... 24
3.2.2. Thu nhận hình ảnh huỳnh quang ............................................................. 25
3.2.3. Thiết lập thông số phân tích hình ảnh ..................................................... 27
3.2.4. Phân tích hình ảnh chuyển vị NF-κB ...................................................... 29
3.2.5. Hoạt tính ức chế chuyển vị NF-κB .......................................................... 32
BÀN LUẬN ............................................................................................................ 34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................. 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ADN

Acid deoxyribonucleic

Acid deoxyribonucleic

DMEM

Dulbecco’s modified Eagle

Môi trƣờng nuôi cấy tế bào DMEM

medium

DMSO

Dimethyl sunfoxide

Dimethyl sunfoxide

EMEM

Eagle’s Minium Essential

Môi trƣờng nuôi cấy tế bào EMEM

GFP

Green fluorescent protein

Protein huỳnh quang xanh

HCTN

Hợp chất thiên nhiên

Hợp chất thiên nhiên

HeLa

Human cervical cancer cells

Tế bào ung thƣ cổ tử cung

Hep-G2

Hepatocellular carcinoma

Tế bào ung thƣ gan

IC50

Inhibitory concentration 50%

Nồng độ ức chế 50% cá thể/tế bào

MTT

Thiazolyl Blue Tetrazolium

Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide

Bromide
NF-κB

Nuclear Factor kappa B

Yếu tố nhân (yếu tố phiên mã) NF-κb

OD

Optical density

Mật độ quang học

PBS

Phosphate buffer saline

Đệm phosphate

PFA

Paraformaldehyde

Paraformaldehyde


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Danh sách các mẫu hóa học sử dụng trong nghiên cứu sàng lọc hoạt
tính kháng ung thƣ in vitro
Bảng 3.1 Hoạt tính gây độc tế bào của một số mẫu hợp chất trên dòng tế bào
ung thƣ gan Hep-G2
Bảng 3.2 Hoạt tính gây độc tế bào của một số mẫu hợp chất thiên nhiên trên
dòng tế bào ung thƣ cổ tử cung HeLa


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 1.1 Ƣớc tính các ca bệnh ung thƣ mắc mới trên thế giới năm 2018
Hình 1.2 Hệ thống sàng lọc/phân tích hiển vi huỳnh quang
Hình 1.3 Tín hiệu đích phân tử NF-κB liên quan các bệnh viêm
Hình 2.1 Cấu trúc phân tử của tetrazolium và formazan
Hình 3.1 Tƣơng quan nồng độ chất cảm ứng và sự chuyển vị NF-κB ở dòng tế

bào HeLa
Hình 3.2 Autofocus hình ảnh tế bào HeLa trên kênh lọc DAPI theo peak chỉnh
tinh (Fine) và chỉnh thô (Coarse) trên trục Z
Hình 3.3 Tín hiệu protein huỳnh quang xanh gắn với tiểu đơn vị NF-κB p65
(GFP-p65), ADN nhân tế bào (DAPI) và chồng hình ảnh huỳnh
quang (MERGE). Hình ảnh đƣợc ghi trên thiết bị hiển vi huỳnh
quang Olympus scanˆR.
Hình 3.4 Lựa chọn thông số xác định viền và kích thƣớc hình ảnh đối tƣợng
phân tích trên phần mềm Olympus scanˆR Analysis ver.2.7.2
Hình 3.5 Tạo thông số xác định đƣờng viền đối với đối tƣợng phân tích chính
Main Object (kênh DAPI) và phần Sub-Object (tƣơng ứng vùng tế
bào chất “CytoI”, kênh GFP). Hình ảnh đƣờng viền phân tách tốt với
khoảng cách (distance) = -1.
Hình 3.6 Phân tích hình ảnh thực trên phần mềm Olympus scanˆR Analysis
ver.2.7.2. Tế bào HeLa kích hoạt NF-κB bởi IL-1 10 ng/mL trong 30
phút.
Hình 3.7 Phân tích sự chuyển vị NF-κB theo tỷ lệ huỳnh quang của protein p65
vùng tế bào chất và trong nhân (Nuc/Cyto) sử dụng phần mềm
Olympus scanˆR Analysis ver.2.7.2
Hình 3.8 Hợp chất SHTN-Zer4 điều hòa/ức chế yếu tố kappa B (NF-κB) của tế
bào ung thƣ cổ tử cung HeLa qua đánh giá dựa trên sự chuyển vị NFκB (p65 gắn GFP). Nhân đƣợc xác định đồng thời với nhuộm DAPI.


ĐẶT VẤN ĐỀ
Nguồn hợp chất thiên nhiên bao gồm cả sinh vật biển và đất liền vẫn luôn
chiếm đƣợc sự quan tâm lớn trong nghiên cứu phát triển dƣợc phẩm mới có ích cho
con ngƣời từ xa xƣa tới nay. Sự đa dạng về mặt hóa học trong sinh giới đã đóng
một vai trò quan trọng trong lĩnh vực này. Tuy nhiên, vấn đề đáng quan tâm là làm
thế nào để phát hiện và khai thác các chất có hoạt tính sinh học từ nguồn tài nguyên
này một cách có hiệu quả. Sàng lọc, tìm kiếm các chất có hoạt tính là bƣớc đi đầu

tiên nhƣng là bắt buộc đối với quá trình phát triển thuốc. Chỉ thông qua các bƣớc
sàng lọc hoạt tính mới có thể chọn ra các đối tƣợng có triển vọng cho nghiên cứu
tiếp theo (nghiên cứu cấu trúc, cơ chế tác dụng, hoạt tính in vivo...) để cuối cùng
chọn ra đƣợc dƣợc liệu và hoạt chất cho những nghiên cứu cứu sâu hơn, toàn diện
hơn bởi các nhà y-dƣợc học.
Với thời gian nhanh, hiệu quả và có độ tin cậy cao, nghiên cứu hóa học theo
định hướng hoạt tính sinh học đã đƣợc nhiều nƣớc trên thế giới sử dụng nhƣ một
trong những công cụ hàng đầu để phát hiện các dƣợc tố mới. Nhiều cải tiến trong
công nghệ sàng lọc đã đƣợc phát triển và một trong những công nghệ đó là kỹ thuật
ghi hình ảnh tế bào sử dụng kính hiển vi huỳnh quang tự động hay kỹ thuật sàng
lọc và phân tích nội hàm cao dựa trên phân tích hình ảnh để quan sát ảnh hƣởng
của chất thử lên chức năng sinh lý và kiểu hình trong quá trình phát triển của tế
bào. Bằng việc sử dụng các marker huỳnh quang tƣơng thích sinh học có thể đƣa ra
các chuẩn đoán về phƣơng thức tác động của chất dựa vào “dấu vân tay”
(fingerprint) kiểu hình của tế bào. Đó thƣờng là các quá trình đóng vai trò then chốt
trong quá trình sống và phân chia của tế bào. Sử dụng kỹ thuật hình ảnh huỳnh
quang trong đánh giá các chất tiềm năng giúp các nhà hóa học, nhà dƣợc học đánh
giá chính xác hơn về hiệu quả của chất thử do đó tiết kiệm thời gian, kinh phí cho
các thử nghiệm tiếp theo trên động vật đồng thời cung cấp các thông tin về tác dụng
dƣợc lý của chất thử. Do vậy, kỹ thuật sàng lọc dựa trên phân tích hình ảnh tế bào
1


đang là nhân tố cốt lõi trong khoa học sự sống cũng nhƣ nghiên cứu phát triển
thuốc hiện đại (tín hiệu tế bào, các bệnh lý thần kinh, ung thƣ và độc tính thuốc).
Khóa luận tốt nghiệp “Ứng dụng kĩ thuật miễn dịch huỳnh quang và
phân tích hình ảnh tế bào trong đánh giá hoạt tính chống ung thƣ (ung thƣ
gan và ung thƣ cổ tử cung)” đƣợc thực hiện nhằm mục tiêu:
- Sàng lọc và đánh giá hoạt tính chống ung thƣ (tế bào ung thƣ gan HepG2 và cổ tử cung HeLa) trên mức độ tế bào bằng phƣơng pháp MTT.
- Nghiên cứu đánh giá hoạt tính của mẫu chất tiềm năng trên đích phân tử

yếu tố nhân NF-κB ở tế bào HeLa bằng phƣơng pháp miễn dịch huỳnh
quang kết hợp phân tích hình ảnh tế bào.

2


CHƢƠNG I: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1.

Tổng quan về ung thƣ
Ung thƣ là một thuật ngữ đƣợc sử dụng cho các bệnh mà các tế bào bất

thƣờng phân chia không kiểm soát và có thể xâm nhập vào các mô khác. Các tế bào
ung thƣ có thể lan tới các bộ phận khác của cơ thể thông qua máu và hạch bạch
huyết. Có hơn 100 loại ung thƣ khác nhau, hầu hết chúng đƣợc đặt tên dựa vào mô
hoặc cơ quan mà chúng gây bệnh, ví dụ: ung thƣ bắt đầu ở các tế bào của ruột lớn
đƣợc gọi là ung thƣ ruột kết [8]. Ngày nay, ung thƣ đã trở thành một mối đe dọa
cho sức khỏe cộng đồng và đang thu hút sự chú ý trên toàn thế giới. Nguyên nhân
ung thƣ có thể gây ra theo một trong ba yếu tố, đó là: chế độ ăn uống không lành
mạnh, yếu tố di truyền và các yếu tố môi trƣờng. Ngƣời ta ƣớc tính khoảng 95%
các loại ung thƣ là do lối sống và có thể mất khoảng 20-30 năm để phát triển thành
ung thƣ.
Con ngƣời hiện đại đang phải đối mặt với tỷ lệ ung thƣ và tử vong do ung
thƣ ngày càng tăng [18]. Gánh nặng ung thƣ toàn cầu ƣớc tính đã tăng lên 18,1
triệu ca mắc mới và 9,6 triệu ca tử vong trong năm 2018 theo số liệu GLOBOCAN
gần đây nhất của Cơ quan Nghiên cứu Ung thƣ Quốc tế [22]. Các số liệu thống kê
cho thấy đàn ông thƣờng bị ung thƣ phổi, ruột kết, trực tràng và ung thƣ tuyến tiền
liệt, trong khi phụ nữ ngày càng bị ung thƣ vú, ruột già, trực tràng và ung thƣ dạ
dày [1].
Tại Việt Nam, Bộ Y tế dự báo rằng thế kỷ 21 sẽ là thế kỷ ung thƣ, bệnh tim

mạch và các bệnh không lây nhiễm khác do quá trình đô thị hóa, công nghiệp hóa,
cộng thêm các di chứng của chiến tranh vẫn tồn tại và đe dọa đến sức khoẻ con
ngƣời mỗi ngày [2], [23]. Theo thống kê của một số bệnh viện ung bƣớu ở Hà Nội,
Hồ Chí Minh và một số tỉnh khác trong năm 2008, có khoảng 100.000 đến 150.000
ngƣời mắc phải các loại ung thƣ khác nhau và trên 73% bệnh nhân (khoảng 70.000
bệnh nhân) tử vong mỗi năm khiến Việt Nam trở thành một trong những nƣớc có tỷ
lệ tử vong cao nhất trên thế giới và con số này có xu hƣớng tăng trong tƣơng lai
3


gần. Dự báo đến năm 2020 sẽ có khoảng 200.000 ca ung thƣ mới và 100.000 ca tử
vong mỗi năm tại Việt Nam [20]
Các trƣờng hợp ung thƣ mắc mới năm 2018
trên toàn cầu

12%

11%
46%
10%

7%

3% 5%

6%

Phổi
Vú
Đại trực tràng

Tuyến tiền liệt
Dạ dày
Gan
Thực quản
Cơ quan khác

Hình 1.1: Ước tính các ca bệnh ung thư mắc mới trên thế giới năm 2018[22]
Mặc dù có những tiến bộ đáng kể trong những thập kỷ gần đây đã đƣợc thực
hiện trong nghiên cứu điều trị một số loại ung thƣ, thực tế là phòng chống và chữa
bệnh ung thƣ vẫn còn nhiều khó khăn. Gánh nặng bệnh ung thƣ ngày càng gia tăng
ở các nƣớc phát triển kinh tế và đang phát triển do già đi và tăng trƣởng dân số
cũng nhƣ ngày càng có nhiều lựa chọn về lối sống liên quan đến ung thƣ nhƣ hút
thuốc, ít vận động và chế độ ăn [9]. Điều này khiến con ngƣời chú ý nhiều hơn và
có những nỗ lực nghiêm túc trong việc ngăn ngừa và điều trị để ngăn chặn căn bệnh
nguy hiểm này.
Ung thƣ là một bệnh di truyền vì hầu hết các loại ung thƣ phát sinh từ sự
thay đổi (đột biến) trong ADN của tế bào bình thƣờng. Ung thƣ bắt đầu gây tổn hại
tới một hoặc nhiều gen trong một tế bào đơn lẻ. Tổn thƣơng này làm cho các tế bào
tăng sinh không kiểm soát đƣợc và tạo ra những tế bào bất thƣờng. Ở giai đoạn
này, nếu hệ thống miễn dịch của cơ thể không tiêu diệt hay sửa chữa những tế bào
bất thƣờng này, thì chúng sẽ phát triển và cuối cùng chuyển thành tế bào ung thƣ.
4


Các đặc tính của tế bào ung thƣ là chúng phân chia nhanh hơn các tế bào bình
thƣờng và hình thành khối u ác tính, những khối u này sẽ xâm nhập các mô khỏe
mạnh. Quá trình của một tế bào bình thƣờng trở thành ung thƣ khối u thƣờng mất
nhiều năm để phát triển.
1.2.

Sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học
Đầu thế kỷ XIX, Serturner F.W. lần đầu tiên phân lập morphin từ cây thuốc

phiện mở ra kỷ nguyên sử dụng các hợp chất thiên nhiên làm thuốc trong Y-Dƣợc
[5]. Từ đó, các hợp chất và sản phẩm thiên nhiên có hoạt tính sinh học là nguồn
cung cấp quan trọng cho sản xuất thực phẩm chức năng, phụ gia và phát triển các
thuốc điều trị mới. Giá trị của nhiều hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học
không chỉ ở công dụng trực tiếp là thuốc chữa bệnh mà còn vì chúng có thể làm
nguyên mẫu hoặc cấu trúc dẫn đƣờng cho sự phát hiện và phát triển các dƣợc phẩm
mới. Theo tổng quan nghiên cứu các thuốc mới từ năm 1981 đến 2006, có 48%
trong 1.1184 hợp chất mới đã đƣợc chứng nhận bởi Cục quản lý Thực phẩm và
Dƣợc phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration, FDA) [13], [17] và tốc độ
phát triển hàng năm các thuốc nguồn gốc thiên nhiên trên thế giới lên tới 20%. Do
vậy, các hợp chất thiên nhiên đƣợc đánh giá là nguồn có ý nghĩa lớn trong tìm kiếm
và phát triển thuốc.
Tuy nhiên, trong những năm qua ngành công nghiệp hóa dƣợc phải đối mặt
với sự sụt giảm đáng kể số lƣợng các thuốc mới. Mặc dù trong những năm 1990 tổ
hợp hóa học và sàng lọc hiệu năng cao (High-throughput screening, HTS) - một
quy trình cho phép sàng lọc hiệu quả số lƣợng lớn mẫu trong một thời gian ngắn đƣợc áp dụng để sàng lọc thƣ viện các chất tổng hợp nhằm đẩy nhanh quá trình tìm
kiếm thuốc, nhƣng phần lớn sản phẩm đƣa ra lại không đáp ứng đƣợc yêu cầu do
những lựa chọn ban đầu không phù hợp. Do vậy, dễ dàng nhận ra rằng việc sàng
lọc hoạt tính của các chất là vấn đề cần quan tâm đầu tiên trong các chƣơng trình
phát triển thuốc. Nhiều hoạt tính sinh học của các chất tiềm năng đƣợc sàng lọc,
giúp rút ngắn thời gian và chi phí cho quá trình phát triển thuốc và số lƣợng lớn các
5


thuốc mới đã đƣợc chuyển giao từ các chất tiềm năng này. Các phƣơng pháp thử
nghiệm sinh học trong sàng lọc hoạt tính trở thành công cụ mạnh mẽ cho việc tìm
kiếm các hợp chất tiềm năng từ thiên nhiên cho nhiều mục đích sinh học khác nhau.

Trong đó lĩnh vực mà các hợp chất thiên nhiên vẫn giữ vai trò quan trọng là trong
khai thác các thuốc chống ung thƣ. Từ năm 1940, có tới 75% các chất phân tử nhỏ
đƣợc chứng nhận trong điều trị ung thƣ là các hợp chất thiên nhiên hoặc các dẫn
suất (bán) tổng hợp từ các chất thiên nhiên. Gần đây nghiên cứu các hợp chất từ
sinh vật biển cho thấy có nhiều thành công trong lĩnh vực này với 15 chất đƣợc
chứng nhận bởi FDA hoặc qua thử nghiệm lâm sàng trong điều trị ung thƣ [7], [13].
Nguồn hợp chất thiên nhiên (sinh vật biển và đất liền) luôn chiếm đƣợc sự
quan tâm lớn trong nghiên cứu phát triển dƣợc phẩm mới có ích cho con ngƣời tƣ
xa xƣa tới nay. Sự đa dạng về mặt hóa học trong sinh giới đã đóng một vai trò quan
trọng trong lĩnh vực này. Tuy nhiên, vấn đề đáng quan tâm là làm thế nào để phát
hiện và khai thác các chất có hoạt tính sinh học từ nguồn tài nguyên tái tạo này một
cách có hiệu quả. Sàng lọc, tìm kiếm các chất có hoạt tính là bƣớc đi đầu tiên
nhƣng là bắt buộc đối với quá trình phát triển thuốc. Chỉ thông qua các bƣớc sàng
lọc hoạt tính mới có thể chọn ra các đối tƣợng có triển vọng cho nghiên cứu tiếp
theo (nghiên cứu cấu trúc, cơ chế tác dụng, hoạt tính in vivo...) để cuối cùng chọn
ra đƣợc dƣợc liệu và hoạt chất cho những nghiên cứu cứu sâu hơn, toàn diện hơn
bởi các nhà y-dƣợc học.
Với thời gian nhanh, hiệu quả và có độ tin cậy cao, nghiên cứu hóa học theo
định hướng hoạt tính sinh học đã đƣợc nhiều nƣớc trên thế giới sử dụng nhƣ một
trong những công cụ hàng đầu để phát hiện các dƣợc tố mới. Qua những quá trình
phát triển nghiên cứu với việc áp dụng những công nghệ tiên tiến, ngày nay sàng
lọc theo định hƣớng hoạt tính đã trở thành cơ sở chính của sàng lọc hiệu năng cao
HTS [3]. Về một số phƣơng diện nhất định, việc phối hợp các phép thử khác nhau
không chỉ giúp tăng cƣờng khả năng sàng lọc các hợp chất có hoạt tính mà còn có
thể đƣa ra những nhận xét quan trọng về cơ chế tác dụng và hiệu quả của mẫu thử
6


hay chất thử đó. Ngoài ra, kết quả của các quá trình sàng lọc này còn có thể cung
cấp những dấu hiệu ban đầu về những khả năng điều trị mới cho các mẫu thử

nghiệm hay phát hiện những hoạt tính chƣa đƣợc biết trƣớc đó [6].
1.3.

Sàng lọc hoạt tính dựa trên phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào
Hiện nay, sàng lọc hoạt tính chống ung thƣ in vitro thƣờng đƣợc đánh giá

qua hoạt tính gây độc tế bào (cytotoxicity), ức chế sự tăng sinh tế bào
(antiproliferation), kích thích sự chết theo chƣơng trình của tế bào (apoptosis)
thông qua biểu hiện của protein p53, Bax, Bak, Bcl-XL/BH3, hoạt tính enzyme
caspase-3/7; hoạt tính ức chế aurora kinase, serine/threonine kinase, ADN
topoisomerase I, kháng NF-κB (liên quan quá trình viêm và ung thƣ), phosphoryl
hóa, ty thể, chu kỳ tế bào, chuyển vị nội bào,… sử dụng các kỹ thuật nhƣ MTT,
Western blot, SEAP-assay, trắc lƣu tế bào (flow cytometry), miễn dịch huỳnh
quang và phân tích hình ảnh hiển vi tế bào,… Trong đó, tất cả các chiến lƣợc sàng
lọc in vitro tìm kiếm các chất hoạt tính sinh học có thể chia thành 2 nhóm phƣơng
pháp: (i) Sàng lọc trên mức độ (toàn bộ) tế bào và (ii) Sàng lọc trên đích là các
phân tử đặc hiệu. Mặc dù chiếm số lƣợng lớn so với thƣ viện các chất tổng hợp, các
HCTN trong mẫu chiết dƣờng nhƣ không hoàn toàn phù hợp cho sàng lọc hiệu
năng cao HTS trên đích là các phân tử đặc hiệu. Ngƣợc lại, có thể dễ dàng nâng cao
hiệu quả sàng lọc ở mức độ tế bào, nhƣng nhóm phƣơng pháp này không cung cấp
đƣợc thông tin về phƣơng thức hay đích tác động của chất thử, do vậy sẽ khó khăn
trong lựa chọn ƣu tiên chất tiềm năng cho những nghiên cứu tiếp theo (trên mô
hình động vật và lâm sàng).
Nhiều cải tiến trong công nghệ sàng lọc đã đƣợc phát triển với mục đích phối
hợp đƣợc cả hai phƣơng pháp trên. Một trong những công nghệ đó là kỹ thuật ghi
hình ảnh tế bào sử dụng kính hiển vi huỳnh quang tự động để quan sát ảnh hƣởng
của chất thử lên chức năng sinh lý và kiểu hình trong quá trình phát triển của tế
bào. Bằng việc sử dụng các marker huỳnh quang tƣơng thích sinh học có thể đƣa ra
các chuẩn đoán về phƣơng thức tác động của chất dựa vào “dấu vân tay”
7

(fingerprint) kiểu hình của tế bào. Do vậy, kỹ thuật sàng lọc dựa trên phân tích hình
ảnh tế bào đang là nhân tố cốt lõi trong khoa học sự sống cũng nhƣ nghiên cứu phát
triển thuốc hiện đại (tín hiệu tế bào, các bệnh lý thần kinh, ung thƣ và độc tính
thuốc).
Trong lĩnh vực tìm kiếm các thuốc chống ung thƣ, kỹ thuật phân tích huỳnh
quang tế bào có thể đƣợc sử dụng để đánh giá tác dụng của chất thử lên các quá
trình apoptosis, chu trình tế bào (cell cycle), chuyển vị nội bào và di căn. Prével và
cộng sự đã phát triển kỹ thuật huỳnh quang phục vụ sàng lọc hiệu năng cao các
chất điều trị ung thƣ mới hƣớng đích là các kinase phụ thuộc cyclin (Cyclindependent kinases, CDKs) - enzyme có vai trò quan trọng trong điều khiển chu
trình tế bào sống và biểu hiện cao ở hầu hết các bệnh ung thƣ ngƣời [16]. Phƣơng
pháp huỳnh quang đƣợc phát triển sử dụng cảm biến protein/peptide sinh học là
công cụ có độ nhạy cao để phát hiện những thay đổi về thành phần, hoạt tính và
trạng thái cấu trúc của các CDK/Cyclin trong nghiên cứu phát triển thuốc chống
ung thƣ . Sử dụng kỹ thuật huỳnh quang tế bào phân tích trên thiết bị KineticScan®
HCS Reader (ThermoFisher, USA), Wei et al. (2008) đã chứng minh hoạt tính
chống ung thƣ gan của triterpene jaspolide B phân lập từ loài bọt biển Jaspis sp.
Trên 2 dòng tế bào Bel-7402 và Hep-G2 qua hoạt tính cảm ứng apoptosis (66,8% ở
nồng độ 0,5µM) và đích ty thể. Hơn nữa, qua phân tích chu trình tế bào (cell cycle)
và sự thay đổi cấu trúc sợi vi ống xác định đƣợc jaspolide B ức chế phase G1 của
chu trình tế bào và sự phân tách vi ống cấu trúc tế bào ung thƣ gan [19].
Nghiên cứu phát hiện chuyển vị của yếu tố nhân NF-κB trong các thử
nghiệm mức độ tế bào thƣờng gặp nhiều khó khăn do các tƣơng tác protein nội bào
xẩy ra nhanh và phức tạp. Kỹ thuật chuyển gel hay di động điện di EMSA
(electrophoretic mobility shift assay) thƣờng đƣợc sử dụng để phát hiện liên kết đặc
hiệu NF-κB và ADN hoặc có thể sử dụng kỹ thuật Western blot. Một trong các yếu
điểm của phƣơng pháp EMSA và Western blot là chúng không cung cấp đầy đủ
thông tin trong mẫu phân tích phức tạp và do đó thiếu độ tin cậy. Ví dụ, khi quan
8

sát giảm 50 % độ mạnh tín hiệu phát hiện đƣợc không đồng nghĩa với việc giảm 50
% trong 100 % quần thể đó. Mặt khác các phƣơng pháp hóa sinh-phân tử này cũng
không đủ nhạy để phát hiện các hiện tƣợng hiếm khi chỉ thực hiện trên số lƣợng tế
bào hạn chế (vd. 100-200 TB). Trong khi đó phân tích trắc lƣu tế bào Flow
cytometry có thể cung cấp nhiều dữ liệu từ số lƣợng lớn tế bào thử nghiệm, tuy
nhiên rõ ràng kỹ thuật này không thể thu đƣợc các dữ liệu phân tích nội bào từ các
tín hiệu huỳnh quang [11]. Những hạn chế này có thể đƣợc khắc phục bằng kỹ
thuật phân tích hình ảnh tế bào và chuyển vị nội bào sử dụng thiết bị hiển vi huỳnh
quang. Dƣới đây mô tả các bƣớc tiến hành, phân tích trên hệ thiết bị hiển vi huỳnh
quang nội hàm cao Olympus scanˆR.

B
A
D
C
E

F

Hình 1.2: Sàng lọc/phân tích hiển vi huỳnh quang
(A) Nuôi cấy tế bào trên phiến vi lượng, (B) Chuẩn bị mẫu, (C) Kit và thuốc thử,
(D) Thiết bị ghi ảnh hiển vi (có thể tích hợp laser scanner), (E) Phần mềm phân
tích, (F) Thiết bị lưu/xử lý dữ liệu (máy tính, server).
1.4.

Phƣơng pháp điều trị ung thƣ hƣớng đích phân tử
Trong điều trị ung thƣ, các phƣơng pháp chính hay dùng là phẫu thuật, hóa

trị và chiếu xạ, trong đó hóa trị là một liệu pháp điều trị quan trọng. Tuy nhiên,
thành công của liệu pháp này bị hạn chế do thiếu chọn lọc cho các tế bào khối u so
9


với các tế bào bình thƣờng dẫn đến nồng độ thuốc không đủ trong khối u, có độc
tính toàn thân và làm xuất hiện của các tế bào khối u kháng thuốc. Nhằm nâng cao
hiệu quả của các liệu pháp trị liệu ung thƣ, ngƣời ta tiếp tục nghiên cứu thay đổi
công thức, bào chế dạng liposome, tạo các chất điều hoà sự đề kháng (ví dụ
PSC833), chất thay đổi/ức chế độc tố (ví dụ ICRF-187). Liệu pháp nhắm đích phân
tử gần đây đang đạt đƣợc tầm quan trọng do tính đặc hiệu của nó đối với các tế bào
ung thƣ trong khi không gây độc cho các tế bào ngoài mục tiêu [14].
Các liệu pháp điều trị ung thƣ đƣợc nhắm đích phân tử sử dụng các thuốc
hoặc các chất khác ngăn chặn sự phát triển và lây lan của ung thƣ bằng cách can
thiệp vào các phân tử cụ thể ("mục tiêu phân tử") có liên quan đến sự hình thành,
tiến triển và lây lan của ung thƣ. Hầu hết các liệu pháp nhắm đích sử dụng thuốc
phân tử nhỏ hoặc kháng thể đơn dòng. Sự phát triển của các liệu pháp nhắm đích
đòi hỏi phải xác định các mục tiêu tốt, đó là các mục tiêu đóng vai trò chính trong
sự phát triển và sống sót của tế bào ung thƣ. Nhiều liệu pháp nhắm đích khác nhau
đã đƣợc phê duyệt để sử dụng trong điều trị ung thƣ. Những liệu pháp này bao gồm
liệu pháp hormon, thuốc ức chế tải nạp tín hiệu, bộ điều biến biểu hiện gen, thuốc
cảm ứng apoptosis, thuốc ức chế hình thành mạch máu mới, liệu pháp miễn dịch và
phân tử mang độc tố. Hiện nay, việc sử dụng các phân tử nhỏ có khả năng tác động
các đích phân tử là các protein hay gene liên quan đến ung thƣ là một trong những
liệu pháp điều trị phổ biến nhất [21]. Trong phạm vi khóa luận này chúng tôi tập
trung vào đích phân tử là: Yếu tố nhân NF-κB.
1.5.

Tổng quan về yếu tố nhân NF-κB liên quan quá trình viêm và ung thƣ
Yếu tố nhân kappa B, NF-κB, là một yếu tố phiên mã thiết yếu kiểm soát quá

trình biểu hiện gen mã hóa của các cytokine tiền viêm trong quá trình sinh lý bệnh
viêm và ung thƣ. Khi tế bào ở trạng thái nghỉ, NF-κB tồn tại trong bào tƣơng ở
dạng tƣơng tác không đồng hóa trị với các protein IκB (IκB-, IκB-, IκB-ɣ, IκBɛ, Bcl-3, p100 và p105). Tất cả các IκB này đều chứa các đoạn lặp lại là ankyrin.
Các ankyrin này điều hòa quá trình gắn kết giữa IκB - NF-κB và tƣơng tác với một
10


vùng trên RHD của NF-kB do đó che mất phần NLS (nuclear localization
sequence) nên phân tử NF-κB không thể di chuyển từ bào tƣơng vào nhân đƣợc.
Những tác nhân hoạt hóa NF-κB gây nên quá trình phosphoryl hóa các IκB. Kết
quả là IκB bị giáng hóa bởi quá trình thủy phân protein hoặc bị phân hủy do các
proteasome hay các protease khác. Khi đó các NF-κB sẽ đƣợc giải phóng, đi vào
nhân tế bào và kích hoạt quá trình phiên mã tại đây. Sự kích hoạt sai lệch tín hiệu
NF-κB có liên quan đến các bệnh viêm nhƣ viêm khớp dạng thấp và hen suyễn và
một số bệnh chuyển hóa.

Hình 1.3: Tín hiệu đích phân tử NF-κB liên quan các bệnh viêm [10]

Mặt khác, khi viêm không lành dễ chuyển sang giai đoạn viêm mạn tính và
nhiều nghiên cứu đã chứng minh có mối liên hệ giữa viêm mạn tính và nguy cơ ung
thƣ cao thông qua yếu tố NF-κB. Liên quan tới bệnh ung thƣ, NF-κB có vai trò là
yếu tố điều hòa biểu hiện của những gen kiểm soát sự tăng sinh và sống sót của tế
bào. Nhƣ vậy, nhiều loại khối u khác nhau của con ngƣời do sự kiểm soát sai NFκB: NF-κB hoạt động giúp biểu hiện của các gen giữ cho tế bào tăng sinh và bảo vệ
11


tế bào khỏi các điều kiện kích ứng quá trình chết theo chƣơng trình
apoptosis. Trong ung thƣ, các protein kiểm soát tín hiệu NF-κB bị đột biến hoặc
biểu hiện bất thƣờng dẫn đến sự phối hợp không hoàn thiện giữa các tế bào ác tính

và phần còn lại của cơ thể sinh vật. Điều này dẫn tới việc hệ thống miễn dịch loại
bỏ không hiệu quả khối u và những tế bào ung thƣ ác tính. Vì vậy, NF-κB là chủ đề
của nhiều nghiên cứu của các công ty dƣợc phẩm… nhƣ một đích của liệu pháp
kháng viêm và ung thƣ.

12


CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

Phạm vi, đối tƣợng nghiên cứu
Họat tính chống ung thƣ ở mức độ tế bào đƣợc sàng lọc trên 2 dòng tế bào

ung thƣ gan Hep-G2 và cổ tử cung HeLa.
Đánh giá hoạt tính chống ung thƣ trên đích phân tử yếu tố nhân NF-κB ở tế
bào HeLa sử dụng kỹ thuật phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào với kính hiển vi
huỳnh quang tự động.
2.2.

Vật liệu, hóa chất và thiết bị

2.2.1. Dòng tế bào
Dòng tế bào ung thƣ cổ tử cung HeLa (ATCC® CCL-2TM) và tế bào ung thƣ
gan Hep-G2 (ATCC® HB-8065™) sử dụng trong nghiên cứu đƣợc mua từ nguồn
ATCC (American Type Culture Collection, Virginia, USA) và lƣu giữ tại phòng
Sinh học thực nghiệm (Viện Hóa học các HCTN).
2.2.2. Môi trường nuôi cấy tế bào
Môi trƣờng (EMEM, DMEM) có bổ sung 0,1% kháng sinh và 10% huyết
thanh bào thai bò FBS (ThermoFisher hoặc Sigma).

2.2.3. Mẫu thử nghiệm
Mẫu sử dụng cho sàng lọc, đánh giá hoạt tính sinh học là các cao chiết từ
nguồn thực vật, sinh vật biển hoặc các chất tinh sạch và bán tổng hợp (từ HCTN)
đƣợc cung cấp bởi các đơn vị phối hợp nhƣ một số Viện nghiên cứu hóa học thuộc
Viện Hàn lâm KHCNVN, Trƣờng đại học bách khoa Hà Nội, Viện nghiên cứu và
phát triển sản phẩm thiên nhiên... Do các kết quả thu đƣợc trong nghiên cứu này
chƣa đƣợc công bố và thuộc khuôn khổ hợp tác với các đơn vị liên quan nên các
mẫu đƣợc kí hiệu theo bảng sau:

13


Bảng 2.1: Danh sách các mẫu hóa học sử dụng trong nghiên cứu sàng lọc hoạt tính
kháng ung thư in vitro*
TT
1

Kí hiệu mẫu

Loại mẫu

BHX-n, BHX-c, KhS-n, KhS-c, HyT- Mẫu cao chiết thực vật
n, HyT-c, XaC-n, XaC-c, ToT-n, ToT- (bạch hoa xà, khổ sâm, hy
thiêm, xạ can, tơm trơng,

c, BCL-n, BCL-c

bán chi liên…)
2

Nitid, M1 – 7aa, M2 – 7ab, M3 – 7ac, Mẫu thực vật tinh sạch
M4 – 7ad, M5 – 7ba, M6 – 7bb, M7 –
7bc, M8 – 7bd, M9 – 7ca, M10 – 7cb,
M11 – 7cc, M12 – 7cd

3

Mori, MurA, Inoxim, Zeru, Pice, Mẫu thực vật tinh sạch, dẫn
SHTN-Zer4

4

xuất và chất bán tổng hợp

LCN, LCH, LCC, LCE, MN, DH, HD, Mẫu cao chiết, phân đoạn
DE, ME, HT, DC, MH, DN, MC

5

Thuốc chống ung thƣ, sử

Paclitaxel (taxol), Ellipticine

dụng làm chứng (+)
* Các mẫu sử dụng trong khóa luận này chỉ là minh chứng cho kết quả thử nghiệm sàng lọc
và lựa chọn mẫu cho nghiên cứu tiếp theo trên các đích phân tử. Việc sử dụng kết quả về sàng lọc
MTT đã đƣợc sự đồng ý của đơn vị gửi mẫu.

2.2.4. Thiết bị
- Tủ cấy vô trùng (Bio Clean Bench, Sanyo, Nhật)

- Tủ ấm CO2 (Esco, Indonesia)
- Máy ly tâm (Hettich rotofix 32A, CHLB Đức)
- Máy ly tâm lạnh (Hettich universal 32R, CHLB Đức)
- Tủ lạnh (Panasonic, Nhật)

14


- Tủ lạnh sâu (đến -86°C, Sanyo, Nhật), Bình nitơ lỏng (Chart BioMedical,
Trung Quốc).
- Kính hiển vi soi ngƣợc (Optika, Ý)
- Bể siêu âm (Daihan scientific, Hàn Quốc)
- Máy đo quang (Infinite F50, Tecan, Thụy Sỹ)
- Hệ thống hiển vi huỳnh quang tự động Olympus scanˆR (Heidelberg, CHLB
Đức) và phần mềm phân tích scanˆR Analysis Software.
2.3.

Nội dung nghiên cứu
Các hợp chất thiên nhiên, tổng hợp
Sáng lọc hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào
Hep-G2 và HeLa (phƣơng pháp MTT)
Chọn chất tiềm năng
Nghiên cứu thu nhận và phân tích chất lƣợng hình ảnh hiển vi huỳnh quang
Đánh giá hoạt tính chống ung thƣ trên đích phân tử NF-κB

2.4.

Phƣơng pháp nghiên cứu

2.4.1. Phương pháp nuôi cấy và hoạt hóa tế bào

Tế bào ung thƣ đƣợc nuôi cấy ở 37 oC ở tủ ấm cấp CO2 5 % trong môi
trƣờng DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose; Sigma-Aldrich,
USA) có bổ sung L-glutamine 2mM, kháng sinh (Penicillin + Streptomycin sulfate)
và huyết thanh bào thai bò (FBS 10 %). Sau khi tế bào phát triển đạt trên 70 %, loại
bỏ môi trƣờng cũ và rửa với dung dịch đệm phosphate (PBS 0,1 M, pH 7,8), sau đó
bổ sung Trypsin-EDTA 0,05 % để tách tế bào bám dính khỏi đáy đĩa nuôi cấy.
Dịch tế bào đƣợc chuyển sang ống falcon 15 mL có chứa 4-5 mL dịch môi trƣờng
mới và ly tâm 300 vòng/phút. Sau khi loại bỏ phần dịch, phần cặn tế bào đƣợc trộn
15


với môi trƣờng dinh dƣỡng và đƣợc chuyển sang bình nuôi cấy mới để sẵn sàng
cho các thử nghiệm hoạt tính.
2.4.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế sự tăng sinh tế bào
Nguyên tắc: Việc sử dụng thuốc nhuộm tetrazolium (MTT) làm phép đo
chính xác số lƣợng tế bào đã đƣợc công bố từ đầu những năm 1980 [12]. Nguyên lý
của phƣơng pháp MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide] dựa trên sự chuyển hóa MTT thành dạng tinh thể formazan bởi enzyme
oxidoreductase phụ thuộc NAD(P)H của ti thể có liên quan tuyến tính với sự tăng
hoặc giảm số lƣợng tế bào. Do đó, số lƣợng tế bào sống sót có thể đƣợc xác định
gián tiếp bằng cách đo nồng độ hấp thụ MTT-formazan tại bƣớc sóng λ=570 nm.
Trong quá trình phân chia tế bào, việc giảm số lƣợng tế bào phản ánh khả năng ức
chế sự sinh trƣởng của tế bào và hoạt tính của thuốc/chất thử sau đó đƣợc xác định
dựa trên nồng độ của mẫu tại đó ức chế 50% sự phát triển của tế bào so với đối
chứng không xử lý với thuốc (giá trị IC50). Quy trình này dựa trên tài liệu tham
khảo và đƣợc tối ƣu trên các thử nghiệm với chất thử và thuốc có độc tính tế bào để
thu đƣợc kết quả phù hợp với thực nghiệm chuẩn [15].

Hình 2.1: Cấu trúc phân tử của tetrazolium và formazan
Tiến hành: tế bào ung thƣ đƣợc nuôi cấy ở 37oC (tủ ấm CO2 5%) trên phiến

96 giếng (1,5 x 105 tế bào/giếng) trong môi trƣờng DMEM (Dulbecco’s Modified
Eagle Medium) hoặc EMEM (Eagle’s Minimum Essential Medium, SigmaAldrich, USA) bổ sung kháng sinh (Penicillin + Streptomycin sulfate) và huyết
thanh bê 10%. Sau đó, tế bào đƣợc ủ với chất chuẩn Ellipticine (hoặc Paclitaxel) và
16


các mẫu thử ở các nồng độ từ 0,1100 µg/mL (hoặc µM), mỗi nồng độ lặp lại 3
lần. Sau quá trình phơi nhiễm, tế bào sẽ đƣợc nhuộm với chất nhuộm tetrazolium
(MTT 100 mg; Sigma-Aldrich) trong 4 giờ. Cuối cùng, sản phẩm chuyển hóa thành
tinh thể formazan sẽ đƣợc hòa tan trong Dimethyl sulfoxide (DMSO) và đo mật độ
quang (OD) ở λ = 540/720nm (Infinite F50, Tecan, Thụy Sỹ).
Khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào ung thƣ ở nồng độ nhất định của chất
thử tính theo % so với đối chứng theo công thức:
Tỷ lệ ức chế tế bào (%) = [1-(ODmẫu/ODđối chứng (-))] x 100%
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (% ức chế ≥ 50%) đƣợc xác định giá trị IC50
(µg/mL hoặc µM) là nồng độ của mẫu thử mà tại đó ức chế 50% sự sống sót của tế
bào.
2.4.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống ung thư đích phân tử NF-κB
2.4.3.1. Kích hoạt yếu tố NF-κB
Nhỏ mẫu thuốc/chất thử đã pha trong DMSO 0,25-1 % lên phiến đã có dịch
tế bào HeLa (90 µL/giếng), ủ 30 phút ở 37 oC trƣớc khi bổ sung 10 µL chất kích
hoạt [Interleukin-1 (IL-1) hoặc yếu tố hoại tử khối u (TNF), nồng độ cuối 0,5-15
ng/mL]. Tiếp tục ủ ở 37 oC trong 30 phút tới khi kết thúc, rửa phiến 2 lần với PBS
0,1 M lạnh cho bƣớc cố định tế bào.
2.4.3.2. Cố định tế bào
Trong một số trƣờng hợp, ví dụ nhƣ khi cần lƣu mẫu trong thời gian ≥ 1 giờ,
bƣớc cố định tế bào cần đƣợc thực hiện và có thể đảm bảo lƣu giữ mẫu trong 1
tuần. Tế bào có thể cố định bằng dung môi hữu cơ, ở đây trình bày quy trình sử
dụng paraformaldehyde theo tác giả Harlow & Lane (2006):
Xử lý tế bào với paraformaldehyde dẫn đến việc hình thành các liên kết

ngang giữa các nhóm amin tự do. Khi liên kết hóa học hình thành giữa các phân tử
khác nhau, mạng lƣới các liên kết sẽ hình thành và kết nối cấu trúc tổng thể của các
tế bào với nhau.
Các bước tiến hành:
17