KẾT QUẢ NGHIÊN cứu SÀNG lọc tác DỤNG CHỐNG UNG THƯ TRÊN INVITRO và tác DỤNG điều hòa MIỄN DỊCH CỦACÁC mẫu CAO KHÔ HH TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG bị gây SUY GIẢM MIỄN DỊCH BẰNG CYCLOPHOSPHAMID

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam

BỘ MÔN DƯỢC LÝ

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC TÁC DỤNG CHỐNG
UNG THƯ TRÊN INVITRO VÀ TÁC DỤNG ĐIỀU HÒA MIỄN
DỊCH CỦA CÁC MẪU CAO KHÔ HH TRÊN
CHUỘT NHẮT TRẮNG BỊ GÂY SUY GIẢM MIỄN DỊCH
BẰNG CYCLOPHOSPHAMID

Nơi tiến hành nghiên cứu: Bộ môn Dược lý – Đại học Y Hà Nội
Thời gian tiến hành nghiên cứu: 09-10/2018

Hà Nội – 2018

MỤC LỤC


1. CHẤT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................1
1.1. Thuốc nghiên cứu........................................................................................1
1.2. Hóa chất và máy móc phục vụ nghiên cứu.................................................1
1.2.1. Nghiên cứu sàng lọc tác dụng chống ung thư trên invitro....................1
1.2.2. Nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch trên động vật thực nghiệm.......2
1.3. Đối tượng nghiên cứu..................................................................................2
1.4. Phương pháp nghiên cứu.............................................................................3
1.4.1. Nghiên cứu sàng lọc tác dụng chống ung thư trên invitro....................3
1.4.2. Nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch trên động vật thực nghiệm.......4

1.5. Xử lý số liệu................................................................................................5
2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU................................................................................5
2.1. Nghiên cứu sàng lọc tác dụng chống ung thư trên invitro..........................5
2.2. Nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch trên động vật thực nghiệm.......7
2.2.1. Đánh giá tình trạng chung của hệ miễn dịch........................................7
2.3. Đánh giá đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào...................................17
2.4. Đánh giá đáp ứng miễn dịch dịch thể........................................................20
3. KẾT LUẬN.....................................................................................................21
4. TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................22


CHẤT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.1.Thuốc nghiên cứu
- Thuốc nghiên cứu: Các mẫu bột cao khô HH
Mẫu bột cao khô
HH1
HH2
HH3

Liều trên người
4 g/ngày
4 g/ngày
4 g/ngày

Trong đó, tỷ lệ các bột cao khô như sau:
Mẫu

Bán chi liên

Tỷ lệ các thành phần

Bạch hoa xà thiệt

Nấm linh chi
thảo
HH1
3
3
1
HH2
2
4
1
HH3
4
2
1
1.2.Hóa chất và máy móc phục vụ nghiên cứu
1.2.1. Nghiên cứu sàng lọc tác dụng chống ung thư trên invitro
- Hóa chất
+ Trypsin 10x hãng Sigma
+ RPMI 1640 hãng Gibco, Invitrrogen
+ DMEM hãng Gibco, Invitrrogen
+ FBS hãng Gibco, Invitrogen
+ PBS hãng Gibco, Invitrrogen
+ Peicilin-streptomycin hãng Gibco, Invitrrogen
+ Doxorubicin của Sigma, Mỹ.
- Thiết bị, dụng cụ:
+ Tủ ấm Sanyo (Nhật)
+ Tủ thao tác laminar Telstar
+ Kính hiển vi soi ngược Axiovert 25 CFL Carl-Zeiss, Đức

+ Máy li tâm Beckman Coulter
+ Bình ổn nhiệt Shellab, Mỹ
+ Nồi hấp Human, Đức, Model SS-325
+ Máy đo ELISA của hãng Human Đức.
+ Buồng đếm Thoma (Đức)
+ Các loại vật tư tiêu hao dùng trong nuôi cấy tế bào in vitro như chai T25,
đĩa pettri các cỡ, đĩa 96 giếng, ống ly tâm falcon 50ml và 15ml, 1,5ml,
pipet và đầu côn các loại.
1.2.2. Nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch trên động vật thực nghiệm
- Cyclophosphamid: dạng thuốc bột, biệt dược Endoxan lọ 200 mg của hãng
ASTA Medica, Đức.
1


- Levamisol dạng bột trắng của hãng Sigma, Mỹ.
- Nhũ dịch OA
+ Pha dung dịch Al(OH)3 0,2%: 200 mg + NaCl 0,9% = vừa đủ 100 mL
+ Pha nhũ dịch OA = lòng trắng trứng + Al(OH)3 theo tỷ lệ 1:4 tương ứng
- Máu cừu tube 10 mL do Công ty Nam Khoa (Nam Khoa Biotek) cung cấp
- Kit ELISA định lượng IL2, TNFα, IgM của hãng Cloud-Clone Corp, Mỹ.
1.3. Đối tượng nghiên cứu
- Các dòng tế bào ung thư dùng trong nghiên cứu invitro
STT

Ký hiệu

Dòng tế bào ung thư

1
A549

Dòng tế bào ung thư phổi
2
Hela
Dòng tế bào ung thư cổ tử cung
3
HepG2
Dòng tế bào ung thư gan
4
MCF-7
Dòng tế bào ung thư vú
5
PANC-1
Dòng tế bào ung thư tụy
6
RD
Dòng tế bào ung thư cơ tim
7
NCI-N87
Dòng tế bào ung thư dạ dày
8
OVCAR-8 Dòng tế bào ung thư buồng trứng
- Chuột nhắt trắng chủng Swiss, thuần chủng, cả hai giống, nặng 20



2 gam do

Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp dùng trong nghiên cứu tác dụng
kích thích miễn dịch.
1.4.Phương pháp nghiên cứu

1.4.1. Nghiên cứu sàng lọc tác dụng chống ung thư trên invitro
Các dòng tế bào được lưu giữ trong nitơ lỏng, đánh thức và duy trì
trong môi trường DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), hoặc
RPMI 1640 có bổ sung huyết thanh bê 10%, dung dịch kháng sinh và
kháng nấm 1% (penicillin 50,000 units/L và streptomycin 50 mg/L). Tế bào
được nuôi cấy cho phát triển tới mức khoảng 70%, thay môi trường sạch, tế
bào này được dùng làm thí nghiệm.
Tế bào được cấy chuyển vào đĩa 96 với mật độ 8.000 tế bào/giếng,
để tế bào bám dính ổn định qua đêm rồi ủ với mẫu nghiên cứu, nuôi cấy ở
điều kiện 370C, 5% CO2, 95% độ ẩm trong 24 giờ.
Tiếp theo, từ dung dịch gốc mẫu nghiên cứu và mẫu đối chứng
dương được hòa loãng với môi trường nuôi cấy thành các dải nồng độ 200
và 100 µg/mL. Mẫu thử sau đó được tra vào các giếng đã có chứa tế bào
để thăm dò độc tính của mẫu trên sự phát triển của tế bào. Những mẫu nào
thể hiện độc tính mạnh (ở nồng độ 100 µg/ml có khả năng ức chế trên
2


50% sự phát triển của tế bào so với giếng đối chứng) mới được tiến hành
thí nghiệm để tìm giá trị IC50.
Để tìm giá trị IC50, các mẫu thử có nồng độ khác nhau tương ứng là
6,25; 12,5; 25; 50; 100 µg/ml sẽ được tra vào mỗi giếng đã có chứa tế
bào. Ủ tế bào với mẫu nghiên cứu trong 48 giờ để mẫu thử phát huy tác
dụng.
Kết thúc 48 giờ ủ mẫu, bổ sung 20 µl MTT 5mg/mL vào mỗi giếng
và ủ 3 giờ trong điều kiện nuôi cấy. Tại các tế bào sống 3-(4,5-Dimethyl2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide có màu vàng bị biến đổi
thành tinh thể formazan và bị hòa tan trong dung môi DMSO tạo dung
dịch màu tím. Đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm với bước sóng tham
khảo 630 nm. Mật độ quang ở bước sóng 540 nm sẽ phản ánh số lượng tế
bào sống sót ở từng giếng khi được so sánh với giếng chứng chỉ ủ với

dung môi pha mẫu.
Tỷ lệ % tế bào sống sau khi đã xử lý thuốc so với chứng trắng (tế
bào không ủ với mẫu thử, chỉ ủ với dung môi pha mẫu chứa 0,25%
DMSO) được tính theo công thức như sau:
% tế bào sống =
% ức chế = 100% - % tế bào sống sót
Mỗi nồng độ mẫu thử được tiến hành lặp lại trên 3 giếng, thí nghiệm
lặp lại 2 lần.
1.4.2. Nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch trên động vật thực nghiệm
Tiêm màng bụng cyclophosphamid (CY), liều duy nhất 200 mg/kg
thể trọng để gây suy giảm miễn dịch.
Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 9 lô nghiên cứu. Chuột
ở các lô được uống thuốc thử và tiêm màng bụng CY gây mô hình suy
giảm miễn dịch như sau:
ST
T
1
2
3
4
5

Lô nghiên cứu

Uống thuốc thử

Tiêm màng bụng CY

Chứng sinh học
Mô hình

Chứng dương
HH1 liều cao
HH1 liều thấp

Nước cất 0,2 mL/10 g
Nước cất 0,2 mL/10 g
Levamisol 100 mg/kg/ngày
HH1 liều 2,88 g/kg/ngày
HH1 liều 0,96 g/kg/ngày

Không
Có
Có
Có
Có

3


ST
T
6
7
8
9

Lô nghiên cứu

Uống thuốc thử

Tiêm màng bụng CY

HH2 liều cao
HH2 liều 2,88 g/kg/ngày
HH2 liều thấp
HH2 liều 0,96 g/kg/ngày
HH3 liều cao
HH3 liều 2,88 g/kg/ngày
HH3 liều thấp
HH3 liều 0,96 g/kg/ngày
Mô hình nghiên cứu được tiến hành trong 8 ngày.

Có
Có
Có
Có
Chuột bắt đầu

được uống nước cất và các thuốc liên tục từ ngày thứ 1 đến ngày thứ 7
của nghiên cứu. Trong thời gian uống thuốc:
- Ngày thứ 2: chuột ở tất cả các lô được gây mẫn cảm bằng tiêm màng bụng
hồng cầu cừu 5% (0,5 mL/chuột) và tiêm dưới da gáy kháng nguyên OA
(Al(OH)3 + ovalbumin) (0,1 mL/chuột).
- Ngày thứ 4: tiêm màng bụng CYP liều 200 mg/kg cho các lô 2 đến 16.
- Ngày thứ 7: tiêm phát hiện bằng 50 μl kháng nguyên OA vào một bên gan bàn
chân chuột, bên còn lại tiêm thể tích tương tự dung dịch NaCl 0,9%.
Sau 24 giờ tiêm phát hiện vào gan bàn chân chuột, tiến hành xác
định các chỉ số nghiên cứu bao gồm:
- Cân trọng lượng
- Đo bề dày 2 bàn chân chuột bằng thước palmer → xác định % tăng bề dày

chân giữa chân tiêm OA và chân tiêm NaCl 0,9%
- Lấy máu động mạch cảnh
+ Xác định số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu
+ Nồng độ IL2, TNFα, IgM trong huyết thanh
- Lấy lách, tuyến ức:
+ Cân trọng lượng
+ Quan sát hình ảnh đại thể của lách, tuyến ức ở các lô chuột
+ Giải phẫu mô bệnh học lách, tuyến ức của 30% số chuột mỗi lô.
1.5. Xử lý số liệu
Các số liệu nghiên cứu được biểu diễn dưới dạng ± SD hoặc ± SE,
xử lý thống kê theo thuật toán thống kê T-test Student bằng phần mềm
Microsoft Excel 2010. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05.
p < 0,05

p < 0,01

p < 0,001

Khác biệt so với lô chứng sinh học

*

**

***

Khác biệt so với lô mô hình

+

++

+++

4


2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
2.1. Nghiên cứu sàng lọc tác dụng chống ung thư trên invitro
Các mẫu thử được pha tan hoàn toàn trong Dimethyl Sulfoxide
(DMSO) sau đó pha loãng thành các nồng độ thử trên các dòng tế bào ung
thư. Ban đầu mẫu thử được tiến hành sàng lọc độc tính ở 2 nồng độ là 200
và 100 µg/mL. Do ở nồng độ 200 µg/ml đã xuất hiện hiện tượng mẫu cao
chiết tủa lại trong giếng nuôi cấy tế bào, do đó mẫu nào có khả năng ức
chế lớn hơn hoặc bằng 50% ở nồng độ 100 µg/ml mới được tiến hành tìm
giá trị IC50. Kết quả sàng lọc được trình bày ở Bảng 1.

5


Bảng 1. Tỷ lệ % ức chế sự sống sót của tế bào dưới tác dụng của mẫu thử
Dòng tế
bào ung
thư
HepG2

Nồng độ HH1
100
200

PANC-1
NCI-N87
RD

Nồng độ HH3
100
200

µg/mL
17,13 ±

µg/mL
22,51 ±

µg/mL
21,23 ±

µg/mL
24,91 ±

µg/mL
23,54 ±

µg/mL
32,85 ±

1,71

1,04
14,44 ±

0,81

1,29
14,17 ±

1,41

1,72

A549
MCF7

Nồng độ HH2
100
200

/

/

/

23,94 ±

4,60
48,62 ±

25,50 ±

47,02 ±

1,78
18,79 ±

2,38
9,17 ±

1,57
13,87 ±

2,71
6,65 ±

0,99
10,29 ±

3,20
3,27 ±

3,19
4,41±

4,40

3,29

0,43
37,75±

/

2,74
12,34 ±

0,58
21,33 ±

/

3,78
8,23 ±

8,66 ±

32,37 ±

2,88
30,85±

3,74
51,68 ±

3,04

3,32
6,32 ±

3,42

2,00

3,01

1,84
10,99 ±

13,48 ±

3,59
44,65 ±

0,91
11,84 ±

Hela

/

OVCAR

/

8

/

1,29
8,03 ±

/

/

/

3,27±

10,47 ±

4,51 ±

3,79
6,58 ±

1,34

1,60

1,85

1,41

1,52

Kết quả ở bảng 1 cho thấy:
Nồng độ 200 µg/mL, ba mẫu cao chiết HH1, HH2 và HH3 chỉ thể
hiện tác dụng độc tế bào trên 3 dòng tế bào: dòng tế bào ung thư vú
MCF7, dòng tế bào ung thư cơ tim RD và dòng tế bào ung thư gan
HepG2. Tuy nhiên mức độ gây độc cũng chưa cao, chỉ dao động từ

khoảng 20% đến 50%. Trong số 3 mẫu thử, mẫu HH3 có % ức chế cao
hơn hai mẫu còn lại ở ba dòng tế bào trên. Như vậy, ba mẫu cao nghiên
cứu đều không có độc tính mạnh ở nồng độ 200 µg/mL trên cả 8 dòng tế
bào ung thư thực hiện trong thí nghiệm. Do vậy không có mẫu cao nào
được lựa chọn để nghiên cứu tiếp tìm giá trị nồng độ tại đó ức chế 50% sự
phát triển của tế bào (IC50).
Bảng 2. Giá trị IC50 của doxorubucin trên các dòng tế bào ung thư
Dòng tế bào
HepG2
A549

IC50
1,31
4,50

Dòng tế bào
NCI-N87
RD
6

IC50
2,09
0,80


MCF7
PANC-1

1,85
2,76

Hela
OVCAR8

2,13
2,33

Thí nghiệm được tiến hành song song với chất đối chứng dương là
doxorubucin của hãng Sigma, giá trị IC50 của chất đối chứng dương này
được trình bày ở Bảng 2. Chất đối chứng dương thể hiện độc tính mạnh
trên cả 8 dòng tế bào ung thư với giá trị IC50 rất nhỏ.
2.2.Nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch trên động vật thực nghiệm
2.2.1. Đánh giá tình trạng chung của hệ miễn dịch
Bảng 3. Ảnh hưởng của các mẫu cao khô HH lên
trọng lượng lách và tuyến ức tương đối
ST
T
1
2
3
4
5
6
7
8
9

Trọng lượng tương đối (‰)
Lách
Tuyến ức

Chứng sinh học
6,43 ± 1,03
3,22 ± 0,64
Mô hình
2,99 ± 0,59***
0,82 ± 0,18***
Levamisol
3,32 ± 0,71
0,67 ± 0,22
+
HH1 liều cao
3,93 ± 1,25
0,67 ± 0,21
HH1 liều thấp
3,60 ± 1,08
0,74 ± 0,13
HH2 liều cao
2,98 ± 0,79
0,93 ± 0,23
HH2 liều thấp
3,52 ± 0,77
0,70 ± 0,10
HH3 liều cao
2,65 ± 0,82
0,68 ± 0,19
HH3 liều thấp
2,85 ± 0,64
0,77 ± 0,17
Kết quả ở bảng 3 cho thấy:
Lô nghiên cứu

- Lô mô hình: Trọng lượng lách tương đối và trọng lượng tuyến ức tương đối
đều giảm rõ rệt so với lô chứng sinh học, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với
p < 0,05.
- Lô uống levamisol:
+ Trọng lượng lách tương đối có xu hướng tăng so với lô mô hình, tuy nhiên
sự khác biệt là chưa có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
+ Trọng lượng tuyến ức tương đối không có sự khác biệt so với lô mô hình (p
> 0,05).
- Các lô uống cao khô HH1:
+ Trọng lượng lách tương đối có xu hướng tăng so với lô mô hình, trong đó mức
tăng ở lô uống liều cao là có ý nghĩa thống kê so với lô mô hình (p < 0,05).
+ Trọng lượng tuyến ức tương đối ở các lô uống cao khô HH1 không có sự
khác biệt so với lô mô hình (p > 0,05).

7


- Các lô uống cao khô HH2 và HH3: Trọng lượng lách và tuyến ức tương đối
đều không có sự khác biệt so với lô mô hình (p > 0,05).
Bảng 4. Kết quả giải phẫu vi thể lách
(Tổ chức lympho ngoại biên lớn nhất của cơ thể)
Lô
Lô 1
Lô 2
Lô 3
Lô 4
Lô 5
Lô 6
Lô 7

Lô 8
Lô 9

Lô

Lách
3/3 mẫu bệnh phẩm có hình ảnh lách bình thường
3/3 mẫu bệnh phẩm giảm mức độ nặng tế bào của tủy trắng
3/3 mẫu bệnh phẩm giảm mức độ nhẹ tế bào của tủy trắng
1/3 mẫu bệnh phẩm giảm mức độ vừa tế bào của tủy trắng
2/3 mẫu bệnh phẩm giảm mức độ nhẹ tế bào của tủy trắng
1/3 mẫu bệnh phẩm giảm mức độ vừa tế bào của tủy trắng
2/3 mẫu bệnh phẩm giảm mức độ nhẹ tế bào của tủy trắng
1/3 mẫu bệnh phẩm giảm mức độ vừa tế bào của tủy trắng
2/3 mẫu bệnh phẩm giảm mức độ nặng tế bào của tủy trắng
1/3 mẫu bệnh phẩm giảm mức độ nhẹ tế bào của tủy trắng
2/3 mẫu bệnh phẩm giảm mức độ vừa tế bào của tủy trắng
1/3 mẫu bệnh phẩm có hình ảnh lách bình thường
2/3 mẫu bệnh phẩm giảm mức độ vừa tế bào của tủy trắng
1/3 mẫu bệnh phẩm giảm mức độ nhẹ tế bào của tủy trắng
2/3 mẫu bệnh phẩm giảm mức độ vừa tế bào của tủy trắng
Bảng 5. Kết quả giải phẫu vi thể tuyến ức
(Tổ chức lympho trung ương quan trọng nhất của cơ thể)
Tuyến ức

Lô 1

3/3 mẫu bệnh phẩm có hình ảnh tuyến ức bình thường

Lô 2

3/3 mẫu bệnh phẩm giảm nặng lympho bào

Lô 3

1/3 mẫu bệnh phẩm giảm vừa lympho bào
1/3 mẫu bệnh phẩm giảm nặng lympho bào
1/3 mẫu bệnh phẩm có hình ảnh tuyến ức bình thường

Lô 4

1/3 mẫu bệnh phẩm giảm vừa lympho bào
2/3 mẫu bệnh phẩm giảm nặng lympho bào

Lô 5

1/3 mẫu bệnh phẩm giảm vừa lympho bào
2/3 mẫu bệnh phẩm giảm nặng lympho bào

Lô 6

2/3 mẫu bệnh phẩm giảm vừa lympho bào
1/3 mẫu bệnh phẩm giảm nặng lympho bào

Lô 7

3/3 mẫu bệnh phẩm giảm vừa lympho bào

Lô 8

2/3 mẫu bệnh phẩm giảm nhẹ lympho bào
8


Lô

Tuyến ức
1/3 mẫu bệnh phẩm giảm nặng lympho bào

Lô 9

2/3 mẫu bệnh phẩm giảm vừa lympho bào
1/3 mẫu bệnh phẩm giảm nặng lympho bào

Lách bình thường
Tuyến ức bình thường
Hình 1. Hình ảnh vi thể lách và tuyến ức lô chứng sinh học (chuột số 3)

Lách giảm nặng tế bào của tủy trắng
Tuyến ức giảm nặng lympho bào
Hình 2. Hình ảnh vi thể lách và tuyến ức lô mô hình (chuột số 99)

9


Lách giảm nhẹ tế bào của tủy trắng
Tuyến ức giảm vừa lympho bào
Hình 3. Hình ảnh vi thể lách và tuyến ức lô uống levamisol (chuột số 15)

Lách giảm nhẹ tế bào của tủy trắng

Tuyến ức giảm nặng lympho bào
Hình 4. Hình ảnh vi thể lách và tuyến ức lô uống levamisol (chuột số 108)

Lách giảm nhẹ tế bào của tủy trắng
Tuyến ức bình thường
Hình 5. Hình ảnh vi thể lách và tuyến ức lô uống levamisol (chuột số 109)

10


Lách giảm vừa tế bào của tủy trắng
Tuyến ức giảm nặng lympho bào
Hình 6. Hình ảnh vi thể lách và tuyến ức lô HH1 liều cao (chuột số 38)

Lách giảm nhẹ tế bào của tủy trắng
Tuyến ức giảm vừa lympho bào
Hình 7. Hình ảnh vi thể lách và tuyến ức lô HH1 liều cao (chuột số 134)

Lách giảm nhẹ tế bào của tủy trắng
Tuyến ức giảm vừa lympho bào
Hình 8. Hình ảnh vi thể lách và tuyến ức lô HH1 liều thấp (chuột số 139)

11


Lách giảm vừa tế bào của tủy trắng
Tuyến ức giảm nặng lympho bào
Hình 9. Hình ảnh vi thể lách và tuyến ức lô HH1 liều thấp (chuột số 142)

Lách giảm vừa tế bào của tủy trắng

Tuyến ức giảm vừa lympho bào
Hình 10. Hình ảnh vi thể lách và tuyến ức lô HH2 liều cao (chuột số 50)

Lách giảm nặng tế bào của tủy trắng
Tuyến ức giảm nặng lympho bào
Hình 11. Hình ảnh vi thể lách và tuyến ức lô HH2 liều cao (chuột số 143)

12


Lách giảm vừa tế bào của tủy trắng
Tuyến ức giảm vừa lympho bào
Hình 12. Hình ảnh vi thể lách và tuyến ức lô HH2 liều thấp (chuột số 152)

Lách giảm nhẹ tế bào của tủy trắng
Tuyến ức giảm vừa lympho bào
Hình 13. Hình ảnh vi thể lách và tuyến ức lô HH2 liều thấp (chuột số 154)

Lách bình thường
Tuyến ức giảm nhẹ lympho bào
Hình 14. Hình ảnh vi thể lách và tuyến ức lô HH3 liều cao (chuột số 59)

13


Lách giảm vừa tế bào của tủy trắng
Tuyến ức giảm nặng lympho bào
Hình 15. Hình ảnh vi thể lách và tuyến ức lô HH3 liều cao (chuột số 160)

Lách giảm nhẹ tế bào của tủy trắng

Tuyến ức giảm vừa lympho bào
Hình 16. Hình ảnh vi thể lách và tuyến ức lô HH3 liều thấp (chuột số 66)

Lách giảm vừa tế bào của tủy trắng
Tuyến ức giảm nặng lympho bào
Hình 17. Hình ảnh vi thể lách và tuyến ức lô HH3 liều thấp (chuột số 164)

14


Số lượng
bạch cầu (G/l)

5
4.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0

***

Lô 1 (chứng sinh học)
Lô 4 (HH1 liều cao)
Lô 7 (HH2 liều thấp)

+++

Lô 2 (mô hình)
Lô 5 (HH1 liều thấp)
Lô 8 (HH3 liều cao)

Lô 3 (Levamisol)
Lô 6 (HH2 liều cao)
Lô 9 (HH3 liều thấp)

Biểu đồ 1. Ảnh hưởng của các mẫu cao khô HH đến
số lượng bạch cầu ở máu ngoại vi
Kết quả ở biểu đồ 1 cho thấy:
- SLBC ở lô mô hình giảm rõ rệt so với lô chứng sinh học (p < 0,001)
- Levamisol làm tăng có ý nghĩa thống kê SLBC so với lô mô hình (p < 0,001).
- Các mẫu cao khô HH đều không làm thay đổi số lượng bạch cầu so với lô mô
hình (p > 0,05).
Bảng 6. Ảnh hưởng của các mẫu cao khô HH đến công thức bạch cầu
ở máu ngoại vi
Số lượng tuyệt đối các loại bạch cầu (BC/mm3)
Lô nghiên cứu
BC lympho
BC trung tính
BC mono
Chứng sinh học
3080 ± 940
1080 ± 340
420 ± 120
Mô hình

1030 ± 320***
380 ± 120***
190 ± 60***
+
++
Levamisol
1410 ± 550
550 ± 180
140 ± 50+
HH1 liều cao
660 ± 200++
560 ± 180++
220 ± 60
+
++
HH1 liều thấp
740 ± 270
590 ± 180
220 ± 40
HH2 liều cao
920 ± 230
330 ± 100
150 ± 50
HH2 liều thấp
890 ± 240
430 ± 140
240 ± 80
HH3 liều cao
1040 ± 240
290 ± 90

140 ± 50
HH3 liều thấp
1140 ± 390
390 ± 130
180 ± 60
Kết quả ở bảng 6 cho thấy:
- Số lượng tuyệt đối các dòng BC ở lô mô hình đều giảm rõ rệt so với lô chứng
sinh học (p < 0,001). Levamisol liều 100 mg/kg/ngày có tác dụng khôi phục
số lượng tuyệt đối của dòng BC trung tính và lympho khi so sánh với lô mô
hình (p < 0,05 và p < 0,01).

15


- Các lô uống cao khô HH1 có số lượng tuyệt đối dòng BC trung tính tăng có ý
nghĩa thống kê so với lô mô hình (p < 0,05), không có tác dụng phục hồi số
lượng tuyệt đối dòng BC lympho và mono so với lô mô hình (p > 0,05).
- Các mẫu cao khô HH2 và HH3 không làm thay đổi số lượng tuyệt đối các
dòng BC so với lô mô hình (p > 0,05).

16


2.3.Đánh giá đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào
Bảng 7. Ảnh hưởng của các mẫu cao khô HH đến
phản ứng bì với kháng nguyên OA
Lô nghiên cứu

Phản ứng bì (% tăng)

Lô 1 (chứng sinh học)

59,42 ± 13,79

Lô 2 (mô hình)

43,75 ± 10,08**

Lô 3 (levamisol)

68,01 ± 14,22+++

Lô 4 (HH1 liều cao)

40,61 ± 11,28

Lô 5 (HH1 liều thấp)

51,04 ± 11,64

Lô 6 (HH2 liều cao)

40,76 ± 12,81

Lô 7 (HH2 liều thấp)

47,23 ± 13,25

Lô 8 (HH3 liều cao)

58,58 ± 16,88+

Lô 9 (HH3 liều thấp)

46,19 ± 13,31

Số liệu ở bảng 7 cho thấy:
- Phản ứng bì ở lô mô hình giảm rõ rệt so với lô chứng sinh học (p < 0,01)
- Levamisol làm tăng có ý nghĩa thống kê phản ứng bì với kháng nguyên OA so
với lô mô hình (p < 0,05 và p < 0,001)
- Các mẫu cao khô HH1, HH2 không ảnh hưởng đến phản ứng bì với kháng
nguyên OA khi so sánh với lô mô hình (p > 0,05).
- Mẫu cao khô HH3 có xu hướng làm tăng phản ứng bì với kháng nguyên OA
so với lô mô hình, trong đó mức tăng ở lô uống HH3 liều cao là có ý nghĩa
thống kê với p < 0,05.

17


Bảng 8. Ảnh hưởng của các mẫu cao khô HH đến nồng độ TNFα
Lô nghiên cứu

Nồng độ TNFα (pg/mL)

Lô 1 (chứng sinh học)

786,59 ± 124,84

Lô 2 (mô hình)

666,66 ± 118,77*

Lô 3 (levamisol)

876,63 ± 119,04+++

Lô 4 (HH1 liều cao)

726,56 ± 199,20

Lô 5 (HH1 liều thấp)

723,85 ± 147,85

Lô 6 (HH2 liều cao)

626,59 ± 191,16

Lô 7 (HH2 liều thấp)

758,94 ± 189,04

Lô 8 (HH3 liều cao)

599,17 ± 192,36

Lô 9 (HH3 liều thấp)

699,78 ± 206,43

Kết quả ở bảng 8 cho thấy:
- Nồng độ TNFα trong huyết thanh ở lô mô hình giảm có ý nghĩa thống kê so
với lô chứng sinh học (p < 0,05)
- Levamisol làm tăng đáng kể nồng độ TNFα so với lô mô hình (p < 0,001)
- Các mẫu cao khô HH1, HH2, HH3 không làm thay đổi nồng độ TNFα trong
huyết thanh so với lô mô hình (p > 0,05).

18


Bảng 9. Ảnh hưởng của các mẫu cao khô HH đến nồng độ IL-2
Lô nghiên cứu

Nồng độ IL-2 (pg/mL)

Lô 1 (chứng sinh học)

68,57 ± 12,75

Lô 2 (mô hình)

62,58 ± 12,98

Lô 3 (levamisol)

56,31 ± 10,10

Lô 4 (HH1 liều cao)

54,98 ± 14,24

Lô 5 (HH1 liều thấp)

51,10 ± 15,91

Lô 6 (HH2 liều cao)

53,35 ± 16,68

Lô 7 (HH2 liều thấp)

54,19 ± 13,68

Lô 8 (HH3 liều cao)

57,57 ± 11,88

Lô 9 (HH3 liều thấp)

55,61 ± 11,29

Kết quả ở bảng 9 cho thấy:
- Nồng độ IL-2 ở các lô tiêm CYP (lô 2 đến lô 9) đều có xu hướng giảm so với
lô chứng sinh học), tuy nhiên sự khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
- Các lô uống levamisol và các mẫu cao khô HH đều không có tác dụng cải
thiện nồng độ IL-2 so với lô mô hình (p>0,05).

19

2.4.Đánh giá đáp ứng miễn dịch dịch thể
Bảng 10. Ảnh hưởng của các mẫu cao khô HH đến nồng độ IgM
Lô nghiên cứu

Nồng độ IgM (ng/mL)

Lô 1 (chứng sinh học)

45083,33 ± 14285,77

Lô 2 (mô hình)

31818,18 ± 6735,25*

Lô 3 (levamisol)

42000,00 ± 12093,39+

Lô 4 (HH1 liều cao)

46700,00 ± 13848,79++

Lô 5 (HH1 liều thấp)

47222,22 ± 13245,54++

Lô 6 (HH2 liều cao)

51166,67 ± 14571,66+++

Lô 7 (HH2 liều thấp)

34000,00 ± 9291,57

Lô 8 (HH3 liều cao)

47545,45 ± 14949,00++

Lô 9 (HH3 liều thấp)

40100,00 ± 12269,66

Kết quả ở bảng 10 cho thấy:
- Nồng độ IgM ở lô mô hình giảm rõ rệt so với lô chứng sinh học, sự khác biệt
có ý nghĩa thống kê với p<0,05.
- Levamisol có tác dụng làm tăng đáng kể nồng độ IgM khi so sánh với lô mô
hình (p<0,05).
- Cao khô HH1 ở cả hai mức liều nghiên cứu đều làm tăng có ý nghĩa thống kê
nồng độ IgM so với lô mô hình với p <0,01.
- Các mẫu cao khô HH2 và HH3:
+ Liều thấp: không làm thay đổi nồng độ IgM so với lô mô hình
+ Liều cao: nồng độ IgM tăng rõ rệt so với lô mô hình (p < 0,001 và 0,01)

20


3. KẾT LUẬN
3.1.Nghiên cứu sàng lọc tác dụng chống ung thư trên invitro:
Cả 3 mẫu cao chiết chỉ có tác dụng gây độc trên 3 dòng tế bào ung thư
MCF7, RD, HepG2 với giá trị ức chế dao động trong khoảng từ 20% đến 50% ở

nồng độ 200 µg/mL. Như vậy cả 3 mẫu cao chiết này đều không thể hiện độc
tính mạnh ở nồng độ mẫu thử là 200 µg/mL, do đó không thể tìm được giá trị
nồng độ tại đó ức chế 50% sự phát triển của tế bào ung thư.
3.2. Nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch trên thực nghiệm:
Các mẫu cao khô HH uống liên tục trong 7 ngày đều thể hiện được
tác dụng kích thích miễn dịch trên chuột nhắt trắng bị gây suy giảm miễn
dịch bằng CY liều 200 mg/kg, trong đó mẫu HH1 thể hiện tác dụng tốt
nhất.
3.3. Mẫu cao khô HH1:
3.3.1. Liều thấp: có xu hướng làm tăng TLLTĐ và nồng độ TNFα, phục hồi
số lượng tuyệt đối dòng BC trung tính và tăng rõ rệt nồng độ IgM
3.3.2. Liều cao: làm tăng rõ rệt TLLTĐ và nồng độ IgM, phục hồi số lượng
tuyệt đối dòng BC trung tính, có xu hướng làm tăng nồng độ TNFα
3.4. Mẫu cao khô HH2:
3.4.1. Liều thấp: không làm thay đổi các chỉ số nghiên cứu.
3.4.2. Liều cao: làm tăng nồng độ IgM
3.5.Mẫu cao khô HH3
3.5.1. Liều thấp: không làm thay đổi các chỉ số nghiên cứu
3.5.2. Liều cao: làm tăng phản ứng bì với kháng nguyên OA và nồng độ IgM

21


1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

8.
9.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Sepideh Shahbazi, Azam Bolhassani (2016). Immunostimulants: Types and
Functions. J Med Microbiol Infec Dis, 4(3-4), 45-51.
Sethi J, Singh J (2015). Role of Medicinal Plants as Immunostimulants in
Health and Disease. Ann Med Chem Res, 1(2), 1009.
Winkelstein A (1973). Mechanisms of Immunosuppression: Effects of
Cyclophosphamide on Cellular Immunity. Blood, Vol 41, No 2, 273-284
Nguyễn Trọng Thông (2005). Thuốc tác dụng trên hệ thống miễn dịch.
Dược lý học lâm sàng, Nhà xuất bản Y học, 567-578.
Bộ Y tế (2007). Sinh lý bệnh và Miễn dịch – Phần Miễn dịch học. Nhà xuất
bản Y học.
Vũ Triệu An, Lê Đức Cư, Văn Đình Hoa và cộng sự (1982). Những kỹ
thuật cơ bản dùng trong miễn dịch học. Nhà xuất bản Y học.
Charles A Janeway, Jr, Paul Travers, Mark Walport, Mark J Shlomchik
(2001). Immunobiology: The immune system in health and disease, 5th
edition. New York: Garland Publishing, 1-312.
Janice McCauley, Ana Zivanovic, Danielle Skropeta (2013). Bioassays for
anticancer activities. Methods in Molecular Biology, 1055, 191-205.
Standard Operating Procedures for Sample Preparation for NCI60 Screen.
National Institutes of Health.
Ngày
tháng
năm 20
Trưởng Bộ môn Dược lý

PGS.TS. Phạm Thị Vân Anh

Trường Đại học Y Hà Nội xác nhận
Chữ ký trên của PGS.TS. Phạm Thị Vân Anh là đúng
Trưởng phòng Tổ chức Cán bộ

22