Triển khai mô hình in vitro sàng lọc tác dụng chống viêm của thuốc và áp dụng đánh giá tác dụng của một số dược liệu

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ VÂN ANH

TRIỂN KHAI MÔ HÌNH IN VITRO
SÀNG LỌC TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM
CỦA THUỐC VÀ ÁP DỤNG ĐÁNH GIÁ
TÁC DỤNG CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ VÂN ANH
MÃ SINH VIÊN: 1401041

TRIỂN KHAI MÔ HÌNH IN VITRO
SÀNG LỌC TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM
CỦA THUỐC VÀ ÁP DỤNG ĐÁNH GIÁ
TÁC DỤNG CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
ThS. Nguyễn Thu Hằng
Nơi thực hiện:
Bộ môn Dược lực

HÀ NỘI - 2019


LỜI CẢM ƠN
Nhân dịp hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và
lời cảm ơn chân thành nhất tới các thầy cô giáo, gia đình, bạn bè và những người đã
giúp đỡ, ủng hộ em trong thời gian vừa qua.
Trước hết em em xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Nguyễn Thu Hằng người cô đã
luôn tận tụy, hết lòng quan tâm, hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực
hiện đề tài. Cảm ơn cô vì ngoài những kiến thức chuyên môn em còn được dạy
phương pháp làm việc khoa học hiệu quả và trung thực.
Em xin chân thành cảm ơn DS. Đinh Đại Độ và DS. Đinh Thị Kiều Giang là
những anh chị kỹ thuật viên tại Bộ môn Dược lực, chị Nguyễn Thị Xuyến và các anh
chị tại Viện Dược Liệu đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo, tạo điều kiện cho em trong thời
gian nghiên cứu.
Em xin gửi lời cảm ơn Đảng ủy, Ban giám hiệu, phòng Đào tạo cùng các bộ môn,
phòng ban khác của Trường đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho em trong thời
gian học tập và nghiên cứu.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới những người thầy đã dạy dỗ em trong
suốt năm năm học tập dưới mái trường Đại học Dược Hà Nội, cảm ơn các thầy cô vì
sự tận tâm với nghề, luôn là tấm gương sáng cả về lối sống và đạo đức nghề nghiệp
đối với chúng em.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã luôn bên cạnh, ủng
hộ, chia sẻ khó khăn và động viên em thực hiện khóa luận này.

Hà Nội, tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Trần Thị Vân Anh

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

1.1. Đại cương về viêm............................................................................................ 3
1.1.1. Khái niệm về viêm ...................................................................................... 3
1.1.2. Nguyên nhân gây viêm ................................................................................ 3
1.1.3. Cơ chế bệnh sinh của viêm và các thành phần tham gia vào phản ứng viêm 3
1.2. Các đích tác dụng của các thuốc chống viêm hiện nay ................................ 11
1.2.1. Enzym tham gia vào tổng hợp các chất trung gian hóa học ........................ 12
1.2.2. Receptor cặp đôi với protein G .................................................................. 13
1.2.3. Cytokin và các thụ thể cytokin ................................................................... 13
1.2.4. Phân tử tương tác với tế bào ...................................................................... 14
1.3. Mối quan hệ giữa NO, lysosom và bệnh viêm .............................................. 15
1.3.1. Sự hình thành của NO ............................................................................... 15
1.3.2. Cơ chế hoạt động của NO và mối liên quan giữa NO và bệnh viêm ........... 16
1.3.3. Cấu trúc và chức năng hoạt động của màng lysosom ................................. 17
1.3.4. Mối quan hệ giữa bệnh viêm và màng lysosom ......................................... 18
1.4. Một số mô hình in vitro nghiên cứu tác dụng chống viêm của thuốc .......... 18
1.4.1. Nghiên cứu tác dụng chống viêm trên mô hình ổn định màng hồng cầu ..... 18
1.4.2. Mô hình ức chế giải phóng NO trên tế bào đại thực bào RAW 264.7 ......... 19
1.4.3. Mô hình đánh giá sự ức chế biến tính của protein ...................................... 20
1.4.4. Mô hình đánh giá sự ức chế enzym cyclooxygenase và 5-lipooxygenase ... 20
1.5. Một số các dược liệu có tiềm năng chống viêm được nghiên cứu trên thế giới
trên mô hình in vitro ............................................................................................ 21
1.5.1. Các dược liệu có tiềm năng ức chế enzym LOX ........................................ 22


1.5.2. Các dược liệu có tiềm năng ức chế sự biểu hiện của một số cytokin tiền viêm

............................................................................................................................ 23
1.6. Thông tin về một số dược liệu của dự án ARES thu hái ở các tỉnh vùng núi
phía Bắc ................................................................................................................ 24

2.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................... 26
2.1.1. Dược liệu nghiên cứu ................................................................................ 26
2.1.2. Chuẩn bị các mẫu nghiên cứu .................................................................... 26
2.2. Phương tiện nghiên cứu................................................................................. 27
2.2.1. Hóa chất .................................................................................................... 27
2.2.2. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu ...................................................................... 28
2.2.3. Dòng tế bào, hồng cầu ............................................................................... 28
2.3. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 28
2.4. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 29
2.4.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu .......................................................................... 29
2.4.2. Triển khai mô hình gây ly giải màng hồng cầu .......................................... 29
2.4.3. Triển khai mô hình định lượng NO giải phóng từ tế bào RAW 264.7 ........ 31
2.4.4. Áp dụng mô hình đã triển khai để sàng lọc dược liệu chống viêm.............. 35
2.4.5. Đánh giá mối tương quan giữa liều và tác dụng chống viêm của cao dược liệu
tiềm năng ............................................................................................................ 37
2.5. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................. 39

3.1. Kết quả triển khai mô hình sàng lọc tác dụng chống viêm .......................... 40
3.1.1. Kết quả triển khai mô hình gây ly giải màng hồng cầu............................... 40
3.1.2. Kết quả triển khai mô hình ức chế giải phóng NO trên tế bào đại thực bào
Raw 264.7 ........................................................................................................... 42


3.2. Kết quả sàng lọc chọn ra các dược liệu tiềm năng có tác dụng chống viêm
.............................................................................................................................. .47
3.2.1. Kết quả sàng lọc tác dụng ổn định màng hồng cầu của 8 cây thuốc............ 47

3.2.2. Đánh giá tác dụng ức chế giải phóng NO trên tế bào RAW 264.7 của 8 mẫu
dược liệu ............................................................................................................. 48
3.2.3. Đánh giá độc tính của 8 mẫu dược liệu ở hai nồng độ khác nhau trên mức độ
sống còn của tế bào RAW 264.7.......................................................................... 49
3.3. Đánh giá tác dụng chống viêm của cao dược liệu tiềm năng nhất. .............. 50
3.3.1. Đánh giá mối tương quan giữa liều và tác dụng chống viêm của cao toàn phần
của dược liệu tiềm năng trên mô hình ổn định màng hồng cầu ............................ 50
3.3.2. Đánh giá mối tương quan giữa liều và tác dụng chống viêm của cao toàn phần
của dược liệu tiềm năng trên mô hình ức chế giải phóng NO ............................... 52
3.3.3. Đánh giá mối tương quan giữa liều và tác dụng chống viêm của cao toàn phần
của dược liệu tiềm năng trên khả năng ức chế giải phóng TNF-α ........................ 55

4.1. Về kết quả triển khai mô hình sàng lọc tác dụng chống viêm ..................... 57
4.1.1. Về kết quả triển khai mô hình gây ly giải màng hồng cầu. ......................... 57
4.1.2. Về kết quả triển khai mô hình giải phóng NO trên tế bào RAW 264.7 ....... 58
4.2. Về kết quả sàng lọc tác dụng chống viêm của 8 mẫu dược liệu có nguồn gốc
từ Việt Nam........................................................................................................... 59
4.3. Về kết quả đánh giá tác dụng chống viêm của cao dược liệu tiềm năng nhất
............................................................................................................................... 60
4.3.1. Về kết quả đánh giá tác dụng chống viêm của mẫu 7 trên mô hình ổn định
màng hồng cầu. ................................................................................................... 60
4.3.2. Về kết quả đánh giá tác dụng chống viêm của mẫu 7 trên mô hình ức chế giải
phóng NO. .......................................................................................................... 61
4.3.3. Về kết quả đánh giá tác dụng chống viêm của mẫu 7 trên mô hình ức chế giải
phóng TNF-α. ..................................................................................................... 62


TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AA

Acid arachidonic

CAM

Phân tử kết dính tế bào

CD

Cluster of differentiation

CSM

Phân tử đồng kích thích tế bào

CNTF

Ciliary neurotrophic factor

CysLT

Cysteinyl leucotrien

CT-1

Cardiotrophin – 1

ECM

Chất nền ngoài bào

EDRF

Yếu tố nới lỏng nguồn gốc nội mô

GPCR

Thụ thể bắt cặp với protein G

HETEs

Acid hydroperoxyeicosateraenoic

LTs

Leucotrienes

LIF

Leukaemia inhibitory factor

NOS

Nitric oxid synthease

NK

Tế bào diệt tự nhiên

TAX

Thromboxan

NAG-1

NSAID activated gen-1

MAP kinase

Mitogen-activated protein kinase

TNF-α

Yếu tố hoại tử khối u

PAF

Yếu tố hoạt hóa tiểu cầu

PGs

Prostaglandins

PLA2

Phospholipase A2

PPAR

Peroxisome proliferator

IL

Interleukin

IFN

Interferon


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Cơ chế bệnh sinh của viêm ......................................................................... 11
Hình 1.2: Sơ đồ cơ chế chống viêm của NSAIDs và glucocorticoid . ......................... 12
Hình 1.3. Các đích tiềm năng của thụ thể bắt cặp protein G ....................................... 13
Hình 1.4. Các đích cytokin tiềm năng ........................................................................ 14
Hình 1.5. Các đích tiềm năng của CAM và CSM ....................................................... 15
Hình 1.6. Sự hình thành NO....................................................................................... 16
Hình 1.7. Sản phẩm NO và mục tiêu của tín hiệu trung gian NO ............................... 17
Hình 2.1: Quy trình chiết cao khô toàn phần ethanol .................................................. 27
Hình 2.2: Sơ đồ thiết kế nghiên cứu ........................................................................... 29
Hình 2.3. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của nồng độ của LPS ......................................... 32
Hình 3.1: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng ly giải màng hồng cầu .................... 40
Hình 3.2. Ảnh hưởng của diclofenac lên sự ổn định màng hồng cầu .......................... 42
Hình 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ chất kích thích LPS lên khả năng sinh NO của tế bào
Raw 264.7 ................................................................................................................. 43
Hình 3.4. Giá trị phần trăm tế bào sống sót tương ứng với các nồng độ LPS khác nhau
trong 24h ................................................................................................................... 44

Hình 3.5: Ảnh hưởng của thời gian ủ với LPS lên khả năng giải phóng NO của tế bào
Raw 264.7 ................................................................................................................. 45
Hình 3.6. Ảnh hưởng của Indomethacin đến khả năng giải phóng NO từ tế bào RAW
264.7.......................................................................................................................... 46
Hình 3.7. Ảnh hưởng của Indomethacin lên phần trăm sống sót tế bào ...................... 46
Hình 3.8. Khả năng ổn định màng hồng cầu của 8 mẫu dược liệu .............................. 47
Hình 3.9. Khả năng ức chế sản sinh NO của các mẫu cao toàn phần ở hai nồng độ…48
Hình 3.10. Phần trăm tế bào còn sống sót của các mẫu .............................................. 49
Hình 3.11. Khả năng ức chế ly giải màng hồng cầu của cao toàn phần của cây bọ mẩy ở
các nồng độ khác nhau ............................................................................................... 51
Hình 3.12. Khả năng giải phóng của NO trên tế bào RAW 264.7 của mẫu cao toàn phần
của mẫu 7 ở 5 nồng độ khác nhau .............................................................................. 52


Hình 3.13. IC50 của cao toàn phần của mẫu 7 và Indomethacin trên mô hình ức chế giải
phóng NO .................................................................................................................. 53
Hình 3.14. Phần trăm tế bào còn sống sót của cao toàn phần của mẫu 7 (bọ mẩy) với các
nồng độ khác nhau ..................................................................................................... 54
Hình 3.15. Khả năng giải phóng TNF-α của mẫu 7 ở dải nồng độ khác nhau ............. 55


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại các cytokin dựa trên bản chất của phản ứng miễn dịch ................ 8
Bảng 1.2. Phân loại các cytokin dựa trên chức năng của nó ........................................ 9
Bảng 1.3. Những dược liệu đã được nghiên cứu có tác dụng chống viêm theo cơ chế ức
chế 5 – LOX .............................................................................................................. 22
Bảng 1.4. Những dược liệu đã được nghiên cứu có tác dụng chống viêm theo cơ chế
giảm sự biểu hiện của các cytokin tiền viêm ............................................................. 23
Bảng 1.5: Thông tin về các dược liệu trong đề tài ...................................................... 24
Bảng 2.1. Danh sách các cây thuốc nghiên cứu .......................................................... 26

Bảng 3.1: Giá trị mật độ đo quang khi khảo sát thời gian trên mô hình ly giải màng hồng
cầu ............................................................................................................................. 41
Bảng 3.2. IC50 của mẫu 7 và Indomethacin trên mô hình ức chế giải phóng NO từ tế bào
RAW 264.7................................................................................................................ 53


ĐẶT VẤN ĐỀ
Viêm là một phần của phản ứng miễn dịch của cơ thể để chống lại các tác nhân
gây bệnh từ bên ngoài như tia phóng xạ, các chất hóa học, vi khuẩn [57]. Tiến triển của
phản ứng viêm là một quá trình liên tục từ những giai đoạn sớm của một phản ứng viêm
cấp đến những phản ứng viêm mạn tính, theo sau đó là quá trình hàn gắn và sửa chữa
tổn thương [10]. Mặc dù nó có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể, phản ứng
viêm cũng là nguyên nhân dẫn đến một loạt các bệnh mạn tính như viêm khớp dạng
thấp, bệnh viêm ruột, hen suyễn và bệnh đa xơ cứng. Viêm cũng là một trong các nguyên
nhân phổ biến nhất gây tử vong trên toàn thế giới như bệnh tim mạch xơ vữa. Nhờ có
sự tiến bộ của y học, chúng ta đã biết sâu hơn về cơ chế gây viêm, từ đó giúp tìm ra các
đích tác dụng của thuốc và hình thành những hướng đi mới trong việc phát triển thuốc.
Hiện nay, có nhiều thuốc chống viêm đang được sử dụng, đặc biệt NSAIDs và
glucocorticoid là hai nhóm thuốc chống viêm kinh điển, có tác dụng tốt trên nhiều loại
viêm và đang được sử dụng rộng rãi. Tuy nhiên, các thuốc này lại có nhiều tác dụng
không mong muốn trên nhiều cơ quan như gây viêm loét trên đường tiêu hóa, ảnh hưởng
đến quá trình đông máu, tạo máu, gây xốp xương, và nguy cơ tương tác thuốc bất lợi
với nhiều nhóm thuốc khác [57]. Thêm vào đó, giá thành cao của các thuốc này cũng là
vấn đề cần quan tâm khi sử dụng thuốc hàng ngày trong một thời gian dài cho bệnh
nhân. Điều này đặt ra nhu cầu tìm kiếm các thuốc chống viêm mới có nguồn gốc từ dược
liệu, có tác dụng tương đồng, đồng thời hạn chế các tác dụng không mong muốn của các
nhóm thuốc hiện có. Để được đưa vào lưu hành trên thị trường và sử dụng trong lâm
sàng, các thuốc cần được tiến hành thử nghiệm trên mô hình tiền lâm sàng để đánh giá
hiệu quả và bất lợi của thuốc.
Tuy nhiên ở Việt Nam, các mô hình dược lý đánh giá tác dụng chống viêm của các

loại dược liệu hiện nay chủ yếu là các mô hình in vivo trên động vật thực nghiệm với
một số mô hình kinh điển như chống viêm cấp trên mô hình phù bàn chân chuột, chống
viêm mạn trên mô hình u hạt. Các mô hình in vivo giúp khẳng định tác dụng của thuốc,
tuy nhiên các mô hình này thường mất nhiều thời gian và chi phí nên không phù hợp
trong nghiên cứu sàng lọc. Các mô hình in vitro đã được chứng minh mang lại hiệu quả
nhanh và tiết kiệm chi phí trong bước đầu đánh giá sơ bộ tác dụng chống viêm của các
dược liệu.
1


Xuất phát từ thực tế này, nhóm chúng tôi đề xuất nghiên cứu đề tài: “Triển khai
mô hình in vitro sàng lọc tác dụng chống viêm của thuốc và áp dụng đánh giá tác
dụng của một số dược liệu” với ba mục tiêu:
1.

Triển khai được hai mô hình in vitro để sàng lọc các dược liệu chống viêm.

2.

Áp dụng các mô hình in vitro đã triển khai để sàng lọc ra 8 mẫu cao ethanol từ 8

mẫu dược liệu.
3.

Nghiên cứu tác dụng chống viêm của dược liệu tiềm năng nhất trên khả năng ức

chế giải phóng các chất trung gian hóa học.

2

TỔNG QUAN VỀ VIÊM
1.1. Đại cương về viêm
1.1.1. Khái niệm về viêm
Viêm là một phần đáp ứng sinh học phức tạp của các mao mạch với các vị trí bị
tổn thương trên cơ thể do bị kích thích bởi các mầm bệnh nhằm bảo vệ các cơ quan, loại
bỏ hay sửa chữa những vị trí bị tổn thương [84].
1.1.2. Nguyên nhân gây viêm
Hai nguyên nhân chính dẫn đến phản ứng viêm:
 Nguyên nhân ngoại sinh [11]
Do vi sinh vật: vi khuẩn, virus, một số loại nấm, các vi sinh vật đơn bào, ký sinh
trùng và côn trùng.
Do các chất hóa học: do các hóa chất, do thuốc,..
Do yếu tố vật lý: chấn thương, dị vật, nhiệt (bỏng nóng, bỏng lạnh), tia phóng xạ,
bức xạ,…
 Nguyên nhân nội sinh [11]
Sản phẩm chuyển hóa: như ure máu tăng gây viêm màng phổi, màng tim; acid uric
tăng gây viêm khớp trong bệnh gout.
Hoại tử kín gây viêm vô trùng: như hoại tử chỏm xương đùi.
Phản ứng tự miễn: như bệnh thấp khớp, viêm cầu thận.
Viêm xung quanh tổ chức ung thư…
1.1.3. Cơ chế bệnh sinh của viêm và các thành phần tham gia vào phản ứng viêm
Viêm có vai trò quan trọng trong bảo vệ vật chủ khỏi các tác nhân truyền nhiễm
và chấn thương, nhưng nó cũng góp phần vào sinh lý bệnh của nhiều bệnh mãn tính. Sự
tương tác của các tế bào trong hệ thống miễn dịch bẩm sinh, sự đáp ứng của hệ thống
miễn dịch và các chất trung gian gây viêm cùng các khía cạnh khác của viêm cấp tính
và mạn tính làm nền tảng cho nhiều bệnh của các cơ quan. Khởi đầu cho quá trình viêm
là sự hoạt hóa các bạch cầu như bạch cầu đa nhân trung tính, bạch cầu ái kiềm và dưỡng
bào, bạch cầu ái toan, bạch cầu đơn nhân hoặc đại thực bào, lympho bào B,T và tế bào
diệt tự nhiên (NK).

Bạch cầu đa nhân trung tính:
Bạch cầu đa nhân trung tính có trong tủy xương, lưu thông trong máu và tụ tập
nhanh chóng ở những vị trí tổn thương hay nhiễm khuẩn. Chúng được hoạt hóa để đáp
3


ứng với những kích thích thực bào, những cytokin, những chất trung gian hóa hướng
động hoặc những phức hợp kháng nguyên kháng thể, chúng gắn với những thụ thể đặc
hiệu trên bề mặt tế bào. Trong các mô, những bạch cầu đa nhân trung tính thực bào
những vi khuẩn xâm nhập và mô đã chết. [11]
Bạch cầu ái kiềm và dưỡng bào:
Bạch cầu ái kiềm có liên quan chặt chẽ đến dưỡng bào. Cả hai đều có ái lực cao
với thụ thể của IgE và nhanh chóng giải phóng chất trung gian từ nội bào thông qua kích
hoạt trung gian IgE. Tuy nhiên, trái ngược với dưỡng bào, bạch cầu ái kiềm kết thúc sự
trưởng thành ở trong tủy xương và có thời gian tồn tại chỉ từ 1-3 ngày. Số lượng bạch
cầu ái kiềm tăng lên để đáp ứng với IL-3 và di chuyển vào các mô để thúc đẩy phản ứng
miễn dịch. [85].
Bạch cầu ái toan:
Bạch cầu ái toan lưu thông trong máu và được di chuyển đến chỗ viêm theo cách
tương tự như bạch cầu đa nhân trung tính. Chúng được tạo ra do tác động trung gian của
IgE đặc trưng, chẳng hạn như trong quá trình mẫn cảm và những phản ứng dị ứng và
hen. Những bạch cầu ái toan chứa những leucotrien và yếu tố hoạt hóa tiểu cầu (PAF),
cũng như phosphatase acid và peroxidase [10].
Bạch cầu đơn nhân/đại thực bào:
Chúng có nguồn gốc từ tủy xương và đi ra khỏi dòng tuần hoàn để di chuyển vào
mô và trở thành đại thực bào thường trực. Những đại thực bào bắt giữ và xử lý vi khuẩn
và trình diện những kháng nguyên đã gắn với phức hợp hòa hợp mô chính lớp II với
những lympho bào. Những đại thực bào cũng có thể biệt hóa thành những tế bào có tua,
những tế bào này là những tế bào trình diện kháng nguyên hiệu quả cao [10].
Lympho bào B, T và tế bào diệt tự nhiên (NK):

Tế bào T và B có thể xuyên mạch tại các tiểu tĩnh mạch chuyên để vào mô lympho
[2]. Tế bào T và B thực hiện những chức năng quan trọng ở cả những phản ứng miễn
dịch thể dịch và phản ứng do trung gian tế bào. Khi kháng nguyên vào cơ thể sẽ gắn với
tế bào B có kháng thể bề mặt tương ứng rồi kích thích biệt hóa tế bào B thành tương bào
có khả năng sản xuất kháng thể (IgE, IgG, IgA, IgD, IgM) [9]. Những lympho bào T có
chức năng điều hòa việc hoạt hóa và chiêu mô đại thực bào qua việc giải phóng những
chất trung gian đặc hiệu (lymphokin), điều hòa việc sản xuất kháng thể và độc tế bào do
trung gian tế bào và duy trì trí nhớ miễn dịch [10].
4


Tế bào NK là những lympho bào không bào biệt hóa thành lympho B hay lympho
T, chúng tham gia vào đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào do gây độc tế bào [6].
Ngoài sự tham gia của các bạch cầu còn có sự tham gia của tiểu cầu. Ngoài vai trò
cầm máu, tiểu cầu có thể tham gia vào mọi giai đoạn của quá trình viêm. Các thành phần
của chất nền ngoài bào (ECM), chemokin kích hoạt tiểu cầu khi gắn lên các thụ thể tiểu
cầu trên các tế bào viêm [64]. Chúng là nguồn của những chất trung gian gây viêm, bao
gồm những chất mạch hoạt mạch và những yếu tố phát triển điều hòa sự tăng sinh của
tế bào trung mô. Các chất trung gian có nguồn gốc từ tiểu cầu cung cấp các tín hiệu kích
hoạt đến các tế bào đích bao gồm chất nền ngoài bào, tế bào myelomonocytic dẫn đến
sự khuếch đại của viêm. Tiểu cầu được đưa đến các vị trí viêm thông qua rò rỉ mạch
máu, gắn với bạch cầu hoặc thông qua đáp ứng với các tín hiệu hóa học [64].
Sự tiến triển của các tế bào tham gia trong phản ứng viêm này liên quan đến hàng
loạt các chất trung gian quan trọng gây viêm. Cơ chế của con đường viêm dẫn đến hình
thành những tín hiệu trung gian có thể chia thành con đường phụ thuộc acid arachidonic
(AA) và con đường không phụ thuộc AA [78]. Con đường phụ thuộc Arachidonic acid
(AA) bao gồm các chất trung gian: cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LOX) và
phospholipase A2 (PLA2). Mặt khác, cơ chế thứ hai của viêm là con đường không phụ
thuộc AA liên quan đến NOS, NF-kB, thụ thể kích hoạt peroxisome proliferator (PPAR)
và NSAID activated gen-1 (NAG-1).

Cơ chế đầu tiên dẫn đến viêm phụ thuộc AA, khi AA – acid béo được giải phóng
bởi phospholipase từ lớp phospholipid ở màng sinh chất, được chuyển hóa qua con
đường COX để tổng hợp thromboxan A2 và prostaglandins (PGs) hoặc thông qua cơ chế
LOX để sản sinh ra acid hydroperoxyeicosateraenoic (HETEs) and leucotriens (LTs)
[68]. Các sản phẩm đến từ hai con đường đều là những trung gian quan trọng trong quá
trình kiểm soát viêm.
Các chất trung gian hóa học tham gia vào quá trình viêm:
Prostaglandin:
Hầu hết các tế bào trong cơ thể khi bị hoạt hóa bởi các chấn thương cơ học, cytokin
đặc hiệu, yếu tố phát triển, kích thích nơ-ron, hormon dạ dày-ruột hay các kích thích
khác (collagen, histamin, bradykinin, và thrombin ở nội bào) đều có khả năng sinh tổng
hợp prostaglandin [27]. Khi tế bào bị tổn thương, màng phospholipid của tế bào sẽ bị
hoạt hóa bởi phospholipase A2 tạo thành acid arachidonic. Prostaglandin (PG) và
5


thromboxan (TAX) là các sản phẩm chuyển hóa theo con đường cyclooxygenase
(COX). Có hai loại enzym COX với đồng phân là COX-1 và COX-2. COX-1 về cơ bản
được bộc lộ bởi tất cả các tế bào và là enzym quan trọng trong tổng hợp những
prostaglandin sinh lý tham gia vào một số chức năng như: bảo vệ lớp phủ niêm mạc dạ
dày; điều hòa sự cân bằng của nước/chất điện giải; kích thích sự kết dính tiểu cầu để duy
trì việc cầm máu bình thường; duy trì sự đề kháng trên bề mặt tế bào nội mô của mạch
[6], [10]. COX-2 được bộc lộ ít hơn nên khó có thể phát hiện được ở các tế bào nhưng
tăng lên rõ rệt khi có kích thích, chúng sinh ra những chất chuyển hóa quan trọng trong
việc gây đau, viêm [10].
Một số loại prostaglandin: [7], [63]
PGE1: có receptor trên tế bào nội mô, tế bào cơ trơn thành mạch, tế bào trung tâm
điều nhiệt vùng dưới đồi. Nó gây tăng tính thấm thành mạch và gây sốt.
PGE2: có receptor trên các tế bào cơ trơn. Nó liên quan đến quá trình viêm dẫn đến
các dấu hiệu đặc trưng của viêm là sưng, đỏ và đau.

PGI2: có receptor trên tế bào nội mô mạch, tế bào cơ trơn. Nó có liên quan đến quá
trình viêm gây giãn mạch, tăng tính thấm thành mạch dẫn đến các biểu hiện là sưng,
đau, đỏ và sốt.
TXA2: được giải phóng sau khi tiểu cầu kết dính với nội mạch bị tổn thương. TXA2
kích thích sự kết tập tiểu cầu và có tác dụng co mạch.
Trong viêm cấp, các mô và mạch máu tại chỗ sản xuất ra PGE2 và PGI2. Trong
viêm mạn, bạch cầu đơn nhân và đại thực bào giải phóng PGE2 và TXA2.
Leucotrien:
Ngoài con đường COX, acid arachidonic có thể được oxy hóa bởi lipoxygenase để
tạo thành các leucotrien. Ngược với prostaglandin, leucotrien được tổng hợp chủ yếu
bởi các tế bào viêm là bạch cầu đa nhân, đại thực bào, tế bào mast dưới xúc tác của
lipoxygenase [27]. Enzym 5-lipoxygenase (5-LOX) chịu trách nhiệm tổng hợp 5hydroperoxieicosate-traenoic acid (5-HpETE) và leucotrien A4 (LTA4) từ acid
arachidonic. LTA4 có vai trò như một tiền tố để chuyển hóa thành những phân tử
leucotrien khác. Trong bạch cầu đa nhân trung tính và trong quần thể đại thực bào, LTA4
được chuyển hóa thành LTB4. Trong dưỡng bào, bạch cầu ưa kiềm và đại thực bào,
LTA4 được chuyển hóa thành LTC4 và sau đó là LTD4 và LTE4. Những leucotrien này
kích thích co cơ trơn, làm tăng tính thấm thành mạch máu và làm phát sinh nhiều triệu
6


chứng lâm sàng kết hợp với những phản ứng dị ứng. Những leucotrien tác động qua
những thụ thể đặc hiệu ái lực cao, chúng có thể trở thành những đích quan trọng trong
điều trị bằng thuốc [10].
Yếu tố hoạt hóa tiểu cầu (PAF):
Yếu tố hoạt hóa tiểu cầu là một chất trung gian có nguồn gốc từ phospholipid
màng. Chúng được tổng hợp bởi hầu hết tất cả các tế bào viêm đã được hoạt hóa, những
tế bào nội mô, và những tế bào mô bị tổn thương [16]. PAF có tác động kích thích trên
những tiểu cầu, bạch cầu đa nhân trung tính, bạch cầu đơn nhân hoặc đại thực bào,
những tế bào nội mô và những tế bào cơ trơn thành mạch. PAF gây nên sự kết dính và
mất hạt của tiểu cầu ở vị trí tổn thương mô, kích thích việc giải phóng serotonin, vì vậy

gây nên những thay đổi trong tính thấm thành mạch [10].
Các acid amin hoạt mạch:
Histamin
Histamin trong cơ thể có nguồn gốc chủ yếu từ dưỡng bào, ngoài ra còn có trong
bạch cầu ái kiềm và bạch cầu ái toan. Nó được giải phóng trong quá trình mất hạt của
các tế bào khi các tế bào đáp ứng với các kích thích [4], [7].
Histamin tạo ra nhiều tác động của viêm và mẫn cảm, bao gồm giãn mạch, phù nề,
tăng tính thấm thành mạch và co thắt cơ trơn [61].
Serotonin
Serotonin có nguồn gốc từ tế bào mast, đại thực bào hay tiểu cầu [75]. Sự kết dính
tiểu cầu sẽ giải phóng ra serotonin [4].
Các thành phần của lysosom
Các hạt lysosom có chứa trong các bạch cầu đa nhân trung tính và bạch cầu đơn
nhân. Enzym từ các hạt này là lysozym có khả năng phân hủy những vách tế bào vi
khuẩn, hoặc mô vật chủ [10].
Cơ chế thứ hai dẫn đến viêm là con đường không phụ thuộc AA. Trong con đường
này, iNOS tham gia xúc tác tổng hợp NO thông qua oxi hóa vị trí ni-tơ cuối cùng trên
guanidin của acid amino L-arginin [70]. Việc sản sinh NO cũng làm tăng nồng độ COX2 thông qua MAP kinases và superoxid [77]. Đánh giá việc sản sinh NO là một trong
những đích cho sự nghiên cứu và phát triển của thuốc chống viêm. Các yếu tố phiên mã
như NF-kB và AP-1 quy định sự biểu hiện của COX – 2 thường đồng thời quy định biểu
hiện của iNOS, qua đó cũng là những yếu tố quan trọng trong quá trình viêm [58]. Các
7


yếu tố NF-kB và PPAR gây kích thích biểu hiện các gen gây viêm qua đó góp phần vào
quá trình vào phản ứng viêm (hình 1.1).
Một số các yếu tố tham gia trong con đường này như các cytokin, NO, gốc oxy tự
do.
Các cytokin:
Cytokin bản chất là những glycoprotein, có trọng lượng phân tử thấp, do nhiều loại

tế bào sản xuất nhưng chủ yếu từ lympho bào và đại thực bào đã bị hoạt hóa [81].
Cytokin là chất quan trọng của viêm, tham gia vào quá trình viêm cấp tính và mãn tính
thông qua một loạt các tương tác phức tạp. Hiểu rõ hơn về các tương tác này giúp tạo
điều kiện xác định chính xác hơn các tác nhân gây viêm trung gian và điều trị các bệnh
viêm nhiễm. Có thể phân loại các cytokin dựa trên bản chất của phản ứng miễn dịch
(bảng 1.1), hoặc dựa vào vai trò cụ thể của nó trên vị trí của tế bào (bảng 1.2). Các
cytokine tiền viêm chủ yếu bao gồm interleukin-1 (IL-1), interleukin-6 (IL-6) và yếu tố
hoại tử khối u (TNF-α).
Bảng 1.1. Phân loại các cytokin dựa trên bản chất của phản ứng miễn dịch [73]
Đáp ứng

Họ

Thành viên

Chuỗi phối tử thụ thể của γ

IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-

miễn dịch

15, IL-21.
Chuỗi phối tử thụ thể của β (CD131)

IL-3, IL-5, GM-CSF.

Chuỗi IL-2β (CD122)

IL-2, IL-15

Các receptor

IL-13 (IL-13R–IL-4R)
TSLP (TSLPR–IL-7R)

Tín hiệu tiền

IL-1

IL-1α, IL-1β, IL-1ra, IL18, IL-33, IL-36α, IL-36β,

viêm

IL-36γ, IL-36Ra, IL-37
and IL-1Hy2.
IL-6

IL-6, IL-11, IL-31, CNTF,
CT-1, LIF, OPN, OSM

TNF-α

TNF-α, TNF-β, BAFF,
APRIL

IL-17

IL-17A-F, IL-25 (IL-17E)

8

IFNα, IFNβ, IFNω, IFNκ,

Type I IFN

Limitin.
Type II IFN

IFN-γ

Type III IFN

IFNλ-1 (IL-29), IFNλ-2
(IL-28A), IFNλ-3
(IL-28B)

Tín hiệu

IL-12

IL-12, IL-23, IL-27,

chống viêm

IL-35.
IL-10

IL-10, IL-19, IL-20,
IL-22, IL-24, IL-26,

IL-28, IL-29.

Bảng 1.2. Phân loại cytokin dựa trên chức năng của nó [73]
Cytokin

Nguồn tế bào

Đích tế bào

Chức năng
chính

Interleukin

IL-1

Đại thực bào, tế bào

Tế bào B, tế bào

Tiền viêm, tăng

B

T, tế bào diệt tự

sinh và biệt hóa

nhiên
IL-2

Tăng sinh và kích

Tế bào T

hoạt
IL-3

Tế bào T và B, tế

Tế bào gốc

bào diệt tự nhiên
IL-4

Tế bào Th

Tăng sinh và biệt
hóa tế bào máu

Tế bài B, tế bào

Tăng sinh tế bào

T, đại thực bào

B và gây độc tế
bào T, kích thích
sản xuất IgG và
IgE.

IL-5

Tế bào Th

Bạch cầu ái toán,

Tăng sinh, kích

tế bào B

thích IgA, IgM.

9


Yếu tố

TNF-α

Đại thực bào

Đại thực bào

Kích hoạt đại

hoại tử

thực bào và sốc

khối u

nội độc tố
Tế bào đơn nhân

Tế bào khối u

Gây độc tế bào
khối u

TNF-β

Tế bào T

Thực bào, tế bào
khối u

Interferon

IFN-α

Bạch cầu

Nhiều đích tế bào

IFN-β

Nguyên bào sợi

Nhiều đích tế bào

IFN-γ

Tế bào T

Nhiều đích tế bào

Từ vị trí được giải phóng, các cytokin có thể tác động lên tế bào đích theo 3 cách [4],
[12]:
+ Tác động trên chính tế bào đã tiết ra chúng (hiệu quả tự tiết).
+ Tác động trên tế bào lân cận với tế bào tiết ra chúng (hiệu quả cận tiếp).
+ Tác động trên tế bào đích ở xa tế bào tiết ra chúng do sự vận chuyển của các
cytokin qua vòng tuần hoàn máu (hiệu quả nội tiết).
Các interleukin-1 (IL-1), interleukin-6 (IL-6) và TNF-α hiệp đồng hoạt động và
gây ra nhiều biến đổi tại chỗ tổn thương cũng như toàn thân [4], [12].
Các gốc oxy tự do [3]
Các bạch cầu có thể giải phóng các gốc dẫn xuất oxy tự do sau khi tiếp xúc với tác
nhân hóa ứng tự động, các phức hợp miễn dịch hoặc sau các hoạt động thực bào phức
tạp. Khi các gốc tự do tràn ra ngoài sẽ tạo điều kiện cho quá trình peroxyd hóa lipid
màng tế bào gây tăng tính thấm thành mạch và thuận lợi cho việc giải phóng acid
arachidonic từ phospholipid màng tế bào để tổng hợp các chất trung gian hóa học.
Ngoài ra, còn có các thành phần có nguồn gốc từ huyết tương tham gia vào quá
trình viêm như hệ thống bổ thể, hệ thống bradykinin, hệ thống đông máu, hệ thống tiêu
tơ huyết, globulin miễn dịch.
Như vậy, nhìn vào con đường của viêm, chúng ta có thể nhận thấy rất nhiều các
đích tác dụng mà các nhà khoa học đang hướng tới trong việc nghiên cứu và phát triển
thuốc mới.

10

Hình 1.1. Cơ chế bệnh sinh của viêm [33]
1.2. Các đích tác dụng của các thuốc chống viêm hiện nay
Viêm là một cách cơ thể đối phó với nhiễm trùng và tổn thương mô. Nếu không
được kiểm soát kịp thời, các đợt viêm sẽ dẫn đến các bệnh nặng hơn như sự phát triển
của bệnh hen suyễn mãn tính, viêm khớp dạng thấp, đa xơ cứng, bệnh viêm ruột và vẩy
nến. Dựa trên cơ chế bệnh sinh của viêm, các đích tác dụng phân tử then chốt của thuốc
chống viêm đã được xác định, điều này mang lại những đóng góp to lớn cho kỷ nguyên
phát triển thuốc chống viêm. Hầu hết, các thuốc này đều là các chất đối kháng hoặc ức
chế các chất trung gian gây viêm như prostaglandin, leucotrien và histamin. Những mục
tiêu phân tử bao gồm thụ thể H1 cho histamin, enzym COX-1 và COX-2, các yếu tố hoại
tử khối u (TNF-α) và thụ thể cho cysteinyl leucotriens C4, D4. Tuy nhiên, trong 20 năm
qua, sự gia tăng đáng kể về kiến thức miễn dịch học và cơ chế phân tử đã mở ra nhiều
đích tác dụng mới cho thuốc chống viêm như việc phát hiện hơn 80 cytokin và thụ thể
của nó, hơn 20 chemokin và các thụ thể bắt cặp với protein G (GPCR) và ngoài ra hơn
50 GPCR khác có vai trò tiềm năng trong viêm. Sau đây là một số các đích tác dụng
chính của thuốc chống viêm.

11


1.2.1. Enzym tham gia vào tổng hợp các chất trung gian hóa học
Enzym COX và LOX là hai enzym quan trọng tổng hợp ra yếu tố gây viêm. Ức
chế enzym COX làm giảm tổng hợp prostaglandin do đó làm giảm viêm là một trong
những đích tác dụng của các thuốc NSAIDs (Hình 1.2). COX-1 có mặt trong các tổ chức
bình thường, điều hòa các hoạt động sinh lý của hệ thống tiêu hóa, thận và nội mô mạch
máu. Nếu COX-1 bị ức chế sẽ gây ra các tác dụng bất lợi trên các tổ chức như hệ tiêu
hóa, thận và tiểu cầu. Trong khi đó, COX-2 hầu như không có mặt trong các tổ chức
thông thường, mà được tạo ra do cảm ứng, chủ yếu tại các tổ chức viêm. Nếu COX-2 bị
ức chế sẽ kiểm soát được quá trình viêm mà không ảnh hưởng tới các chức năng khác

của cơ thể. Thuốc kinh điển được điều trị viêm thông qua ức chế COX, cụ thể ức chế
chọn lọc COX-2 là meloxicam, celecoxib.
Ngoài ra, trên con đường phụ thuộc AA, phospholipase A2 (PLA2) là đích đến của
các thuốc corticoid. Chúng ức chế PLA2 thông qua kích thích tổng hợp lipocortin làm
giảm tổng hợp acid arachidonic do đó làm giảm tổng hợp leucotrien và prostaglandin,
vì vậy ức chế phản ứng viêm (Hình 1.2).

Hình 1.2: Sơ đồ cơ chế chống viêm của NSAIDs và glucocorticoid [8].

12


1.2.2. Receptor cặp đôi với protein G
Receptor cặp đôi với protein G cũng là một trong các đích tác dụng trong điều trị
viêm. Dựa trên các đích này, nhiều thuốc mới đã được nghiên cứu, thử nghiệm lâm sàng
và ứng dụng trong điều trị, chăm sóc sức khỏe cho bệnh nhân [28].

Hình 1.3. Các đích tiềm năng của thụ thể bắt cặp protein G
Hình 1.3 minh họa 73 đích tiềm năng của GPCR trong nghiên cứu phát triển thuốc.
Hai thụ thể bắt cặp với protein G là thụ thể histamin H1 và thụ thể cysteinyl leucotrien
1 (CysLT-1) được coi là những đích tiềm năng trong phát triển thuốc. Cụ thể các thuốc
Clarinex®, Allegra® và Zyrtec® được phê duyệt điều trị viêm mũi dị ứng với đích tác
dụng là thụ thể H1; Singulair®, Accolate® và Onon® được phê duyệt điều trị hen suyễn
với đích tác dụng là thụ thể CysLT-1 [28].
1.2.3. Cytokin và các thụ thể cytokin
Cytokin là một tập hợp các protein lớn gồm 93 thành viên và 96 thụ thể là trung
gian truyền tín hiệu quan trọng trong hệ thống miễn dịch. Đây là một nguồn phong phú
trong việc nghiên cứu phát triển thuốc mới trong tương lai [28].

13

Hình 1.4. Các đích cytokin tiềm năng
Hình 1.4 minh họa tất cả các cytokin tiềm năng và các thụ thể của chúng đang hiện
có. Trong số các cytokin trên, một số các cytokin quan trọng như TNF- α; IL-1β, IL-2,
IL-2R, IL-6R, IL-11; Interferon α2a, Interferon β1, Interferon γ, đã và đang là đích tiềm
năng cho rất nhiều thuốc chống viêm mới. Việc áp dụng các thuốc trên các đích trên đã
đem lại hiệu quả vượt trội trong điều trị các bệnh lý liên quan đến quá trình viêm. Một
số các ví dụ về thuốc điều trị dựa trên đích tác dụng: thuốc Intron A, Roferon, Pegintron
điều trị các bệnh viêm gan B, viêm gan C dựa trên đích tác dụng Interferon α2a; các
thuốc Remicade, Enbrel điều trị các bệnh viêm khớp dạng thấp, viêm cột sống dính
khớp, viêm khớp vẩy nến, bệnh vẩy nến dựa trên đích tác dụng TNF-α (chất đối kháng)
[28].
1.2.4. Phân tử tương tác với tế bào
Các phân tử tương tác với tế bào bao gồm phân tử kết dính tế bào (CAM) và phân
tử đồng kích thích tế bào (CSM), là những thành phần đóng vai trò đặc biệt trong các
quá trình viêm. Các phân tử kết dính tế bào (CAM) là nhân tố chính trong di chuyển
bạch cầu từ dòng máu đến các vị trí viêm và sau đó lưu thông bạch cầu đến hệ thống
bạch huyết và các cơ quan bạch huyết. CAM tạo thành các cặp thụ thể và phối tử thể
hiện trên các tế bào lân cận dẫn đến sự kết dính giữa các tế bào. Các thuốc ức chế quá
14