Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây vương tùng tại Ninh Bình

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRỊNH THỊ HUYỀN TRANG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT
VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA
CÂY VƯƠNG TÙNG TẠI NINH BÌNH
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRỊNH THỊ HUYỀN TRANG

Mã sinh viên: 1401636

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT
VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA
CÂY VƯƠNG TÙNG TẠI NINH BÌNH
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. PGS.TS Nguyễn Quốc Huy
2. DS. Phạm Thị Linh Giang
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Thực vật – Trường Đại
học Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2019


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp dược sĩ này, em đã nhận được
sự giúp đỡ và chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, anh chị tại Bộ môn Thực vật –
Trường Đại học Dược Hà Nội, cũng như gia đình và bạn bè.
Đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Nguyễn Quốc Huy
(Cục khoa học công nghệ và đào tạo - BYT) – người thầy luôn quan tâm và hướng dẫn
em trong thời gian em thực hiện khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên và các
bạn sinh viên nghiên cứu khoa học tại Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà
Nội đã giúp đỡ em trong thời gian tham gia nghiên cứu khoa học và thực hiện khóa
luận tại bộ môn.
Trong quá trình thực hiện khóa luận, em xin cảm ơn sự giúp đỡ và góp ý nhiệt
tình của Ds. Phạm Thị Linh Giang và Ds. Lê Thiên Kim (Bộ môn Thực vật –
Trường Đại học Dược Hà Nội) – thầy và cô như người anh, người chị của em, luôn là
động lực giúp em vượt qua những giai đoạn nản chí.
Em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn
tạo điều kiện, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận tốt
nghiệp dược sĩ.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và bạn bè – những người
luôn động viên và tạo mọi điều kiện để em hoàn thành tốt quá trình học tập và thực
hiện khóa luận này.

Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2019
Sinh viên
Trịnh Thị Huyền Trang

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 2
1.1. Tổng quan về chi Murraya J. Koenig ex Linnaeus ..........................................2
1.1.1. Vị trí phân loại chi Murraya J. Koenig ex Linnaeus.................................2
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân loại chi Murraya J. Koenig ex Linnaeus ......2
1.1.3. Thành phần hóa học trong chi Murraya J. Koenig ex Linnaeus .............4
1.1.4. Phân bố chi Murraya J. Koenig ex Linnaeus .............................................9
1.1.5. Tác dụng sinh học của chi Murraya J. Koenig ex Linnaeus .....................9
1.2. Tổng quan về ứng dụng của sắc kí lớp mỏng (TLC) và sắc kí khí kết nối
khối phổ (GC-MS) trong kiểm nghiệm tinh dầu. .................................................10
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 12
2.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................................12
2.2. Nguyên vật liệu, thiết bị ...................................................................................12
2.2.1. Hóa chất .....................................................................................................12
2.2.2. Dụng cụ và máy móc..................................................................................13
2.3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................13
2.4. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................14
2.4.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật...................................................................14
2.4.2. Nghiên cứu thành phần hóa học ..............................................................14
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................. 18
3.1. Thực nghiệm và kết quả ..................................................................................18
3.1.1. Đặc điểm thực vật cây Vương Tùng .........................................................18
3.1.2. Nghiên cứu thành phần hóa học trong lá chét của cây VT01 và VT02 .27
3.2. Bàn luận ............................................................................................................36
3.2.1. Về dặc điểm thực vật và giám định tên khoa học .....................................36
3.2.2. Về thành phần hóa học..............................................................................38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
GC-MS

Viết đầy đủ
Gas chromatography- mass spectrometry (Sắc kí khí kết
hợp với khối phổ)

HLTD

Hàm lượng tinh dầu

M.

Murraya

NXB

Nhà xuất bản

R-T

R-Time (thời gian lưu)

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

STT

Số thứ tự

TLC

Thin layer chromatography – Sắc ký lớp mỏng


DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên bảng

Trang

Bảng 2.1. Bảng mã hóa ký hiệu các mẫu nghiên cứu.................................................... 12
Bảng 2.2. Chương trình nhiệt độ ................................................................................... 17
Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất chính ......................................................... 28
Bảng 3.2: Phân tích sắc kí đồ hai mẫu VT01-4 và VT02-4 .......................................... 31
Bảng 3.3. Thành phần tinh dầu hai mẫu VT01-4 và VT02-4 ........................................ 32
Bảng 3.4. Kết quả định lượng tinh dầu các mẫu theo thời gian .................................... 33
Bảng 3.5. Kết quả phân tích sắc kí đồ các mẫu theo thời gian ...................................... 35
Bảng 3.6. Kết quả xác định thành phần tinh dầu các mẫu theo thời gian ..................... 36


DANH MỤC CÁC HÌNH
Tên hình

Trang

Hình 1.1. Cấu trúc một số thành phần thường gặp trong timh dầu chi Murraya ............ 5

Hình 1.2: Cấu trúc khung carbazole alcaloid .................................................................. 8
Hình 1.3: Cấu trúc khung indol alcaloid ......................................................................... 8
Hình 1.4: Cấu trúc khung euflavonoid ............................................................................ 8
Hình 2.1. Bộ dụng cụ xác định hàm ẩm bằng phương pháp cất với dung môi ............. 15
Hình 2.2. Bộ dụng cụ định lượng tinh dầu nhẹ hơn nước của Bộ môn Thực vật –
Trường Đại học Dược Hà Nội ....................................................................................... 16
Hình 3.1. Cây Vương tùng ở vùng núi đá vôi Ninh Bình ............................................. 18
Hình 3.2. Đặc điểm hình thái cành và lá của mẫu VT01 .............................................. 19
Hình 3.3. Đặc điểm hình thái hoa của mẫu VT01 ......................................................... 21
Hình 3.4. Đặc điểm hình thái quả và hạt của mẫu VT01 .............................................. 21
Hình 3.5. Đặc điểm vi phẫu thân của mẫu nghiên cứu.................................................. 23
Hình 3.6. Đặc điểm vi phẫu gân lá của mẫu nghiên cứu ............................................... 24
Hình 3.7. Đặc điểm vi phẫu phiến lá của mẫu nghiên cứu............................................ 25
Hình 3.8. Đặc điểm bột lá của mẫu nghiên cứu ............................................................ 26
Hình 3.9. Đặc điểm bột thân của mẫu nghiên cứu ........................................................ 27
Hình 3.10: Hình ảnh sắc kí đồ hai mẫu VT01-4 và VT02-4 ......................................... 31
Hình 3.11. Kết quả chồng pic sắc kí đồ hai mẫu VT01-4 và VT02-4........................... 32
Hình 3.12: Sự thay đổi HLTD ở mỗi cây VT01 và VT02 theo thời gian ..................... 34
Hình 3.13. Sắc kí đồ của các mẫu theo thời gian .......................................................... 34
Hình 3.14. Kết quả chồng pic các mẫu tinh dầu VT01 ................................................. 35
Hình 3.15. Kết quả chồng pic các mẫu tinh dầu VT02 ................................................. 35
Hình 3.16. Cấu trúc hai thành phần chính trong tinh dầu VT01 ................................... 39
Hình 3.17. Cấu trúc thành phần chính trong tinh dầu VT02 ......................................... 39


ĐẶT VẤN ĐỀ
Tinh dầu là một trong những sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên đã được sử dụng
từ lâu đời với nhiều công dụng khác nhau, có ứng dụng rộng rãi trong Y dược cũng
như cuộc sống đời thường. Trong đó, một số loại tinh dầu từ họ Cam (Rutaceae) như
tinh dầu vỏ bưởi, tinh dầu hoa bưởi, tinh dâu vỏ chanh, tinh dầu vỏ quýt,… rất được ưa

chuộng với nhiều tác dụng quan trọng đặc biệt trong làm đẹp, kĩ nghệ sản xuất mỹ
phẩm, nước hoa, hương lệu [1]. Trong thực tế, gần đây, một nguồn tinh dầu mới từ chi
Murraya J. Koenig ex Linnaeus thuộc họ Cam (Rutaceae) bắt dầu được nghiên cứu và
cho kết quả rất khả quan với hàm lượng cao và sự đa dạng về các chemotype khác
nhau của cùng một loài cũng như các cấu tử trong thành phần tinh dầu.
Tại Ninh Bình, một loài cây gỗ nhỏ có tên thường gọi là Vương tùng, mọc
hoang tại vùng núi đá vôi, hay được người dân địa phương dùng để chữa cảm cúm,
cảm sốt, đau nhức. Qua quan sát nhận thấy mẫu cây có đặc điểm hình thái phù hợp với
đặc điểm của chi Muraya J. Koenig ex Linnaeus họ Cam. Mặt khác, qua quan sát ban
đầu, lá của loài Vương tùng mọc ở vùng này có rất nhiều túi tiết tinh dầu với mật độ
cao. Đặc biệt, mùi hương tinh dầu có sự khác nhau rõ rệt giữa các nhóm cây khác nhau
và giữa các thời điểm khác nhau trong cùng một năm. Vương tùng ở Ninh Bình
thường có hai loại mùi hương tinh dầu đặc trưng: một loại có xu hướng giống như mùi
tinh dầu bạc hà, loại còn lại có xu hướng giống mùi tinh dầu sả chanh. Để có thể xác
định tên loài cũng như tiềm năng khai thác tinh dầu của loài cây này đề tài: “Nghiên
cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học cây Vương tùng tại Ninh Bình” được
thực hiện với hai mục tiêu:
- Mô tả đặc điểm hình thái thực vật, đặc điểm vi học và giám định tên khoa học
của mẫu Vương tùng thu hái tại Ninh Bình.
- Định tính các nhóm chất hữu cơ chính, định lượng, xác định thành phần tinh
dầu và sự biến đổi thành phần tinh dầu trong năm của các mẫu Vương tùng thu hái tại
Ninh Bình.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về chi Murraya J. Koenig ex Linnaeus
1.1.1. Vị trí phân loại chi Murraya J. Koenig ex Linnaeus
Theo các tài liệu [3], [6] chi Murraya J. Koenig ex Linnaeus được xếp vào họ

Cam (Rutaceae). Trong hệ thống phân loại thực vật, vị trí của chi Murraya J. Koenig
ex Linnaeus được tóm tắt dưới đây:
Ngành Ngọc lan – Magnoliophyta
Lớp Ngọc lan – Magnoliopsida
Phân lớp Hoa hồng – Rosidae
Bộ Cam – Rutales
Họ Cam – Rutaceae
Chi Murraya
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân loại chi Murraya J. Koenig ex Linnaeus
1.1.2.1. Đặc điểm hình thái
Theo Thực vật chí Trung Quốc [37] là tài liệu đầy đủ nhất về chi Muraya hiện
nay, chi Murraya được mô tả đầu tiên bởi J. Koenig ex Linnaeus vào năm 1771, có
đặc điểm chung như sau:
Cây gỗ nhỏ hoặc cây nhỡ, không có gai, không có lông tơ hay vảy trên ngọn,
chồi nách hoặc cụm hoa non.
Lá mọc so le, lá kép lông chim lẻ. Cụm hoa ở ngọn hoặc ở nách, kiểu chùm kép
hoặc cắt giảm thành xim hai ngả hoặc xim một ngả. Hoa lưỡng tính, hình bầu dục tới
hình trứng khi còn là nụ. Đài 4 hoặc 5, rời hoặc hàn liền đến một nửa chiều dài của
chúng. Tràng hoa 4 hoặc 5, tiền khai hoa kiểu vặn hoặc lợp. Nhị từ 5 đến 8 hoặc 10,
rời, không giống nhau về chiều dài, chỉ nhị mảnh hoặc rất mảnh, thẳng hoặc không
thẳng. Đĩa hình nhẫn, phồng lên hoặc hình cột. Bộ nhụy 2-5 lá noãn, hàn liền, vách
ngăn thẳng đi từ trung tâm trở ra, mỗi lá noãn chứa 1-2 noãn. Vòi nhụy 3-7 cho một
bầu nhụy, rụng đồng loạt hoặc rụng không hết khi tạo quả. Quả mọng cùng với thịt
nhầy, không có các khoảng trống trong quả, vỏ quả trong mọng nước. Hạt có lớp vỏ
mỏng hoặc dầy, nội nhũ ít, cây mầm thẳng, lá mầm hình elip, một bên lồi một bên
phẳng, không cuộn vào cũng không gập lại, thân cây mầm phân ra ở giữa gắn các lá
mầm.

2

Trên thế giới, tính đến nay đã có 8 loài thuộc chi Murraya được công nhận là:
Murraya alata Drake, Murraya crenulata (Turcz.) Oliv, Murraya euchrestifolia
Hayata, Murraya koenigii (L.) Spreng, Murraya kwangsiensis (C.C. Huang) C.C.
Huang, Murraya microphylla (Merr. & Chun) Swingle, Murraya paniculata (L.) Jack,
Murraya tetramera C.C. Huang [40].
1.1.2.2. Phân loại chi Murraya J. Koenig ex Linnaeus
Theo Thực vật chí Trung Quốc [37] là tài liệu đầy đủ nhất về chi Muraya hiện
nay, khóa phân loại chi Murraya được thể hiện như sau:
1a. Cánh hoa 1-2 cm, hạt có lông nhỏ.
2a. Cuống lá chét cấp 1 có cánh…………………….…………….............................1. M. alata.
2b. Cuống lá chét cấp 1 không có cánh
3a. Phiến lá chét hình từ gần tròn đến hình ovan đến hình elip,rộng 1,5 đến 6
cm……………………………………………………..……………...2. M. paniculata
3b. Phiến lá chét hình trứng, ngọn phiến lá rộng hơn phần gốc phiến lá, rộng từ 0.5-3
cm ...............................................................................................................3. M. exotica
1b. Cánh hoa không dài quá 0.8 cm, hạt không có lông.
4a. Tràng hoa 4 hoặc 5 - nhiều, bộ nhị 8 hoặc 10.
5a. Phiến lá chét hình mũi mác, rộng 0.8-2 cm, gân phụ không rõ ràng
................................................................................................................4. M. tetramera
5b. Phiến lá chét hình ovan đến elip hoặc hiếm khi là hình mũi mác hoặc hình trứng
ngược;

rộng

từ

2-4

cm,

gân

ở

phụ

trên

mặt

hơi

nhô

ra……………………………….…………………………………….5.M.euchrestifolia
4b. Tràng hoa 5 - nhiều, bộ nhị 10.
6a. Lá kép 11-31 lá chét
7a.

Phiến

lá

chét

rộng

mm,

3-6

đỉnh

lá

tròn….…………………………………………..……………6.M.microphylla
7b. Phiến lá chét rộng 5-20mm, đỉnh lá có một mũi

nhọn ngắn nhô

ra…………………………………………………….………….7. M. koenigii
6b. Lá kép 3-11 lá chét
8a.

Mặt

dưới

phiến

lá

có

nhiều

lông

ngắn……………………………………………….……….9. M. kwangsiensis

8b. Phiến lá không có lông
9a. Phiến lá chét 5-6 x 2-3 cm………………..………8. M. .crenulata
9b. Phiến lá chét 7-18 x 4-10 cm………….……….9.M. kwangsiensis

Theo đó các đặc điểm chính dùng để nhận biết các loài trong chi là: Kích thước
cánh hoa; hạt (có lông hay không có lông); số lượng cánh hoa; bộ nhị; cuống lá chét

3


cấp một (có cánh hay không có cánh); hình dạng của phiến lá chét (nhọn ở đỉnh hay
tròn ở đỉnh); đặc điểm của phiến lá (có lông hay không có lông); kích thước phiến lá
chét, gân phụ (dễ thấy hay không dễ thấy), đỉnh lá (tròn hay nhọn), số lượng lá chét
(nhiều hay ít). Đồng thời, theo cách phân loại trên thì hai loài Murraya paniculata và
Murraya exotica là 2 loài riêng biệt [37], tuy nhiên ở một số tài liệu khác Murraya
exotica được coi là đồng nghĩa với Muraya Paniculata [10], [40].
1.1.3. Thành phần hóa học trong chi Murraya J. Koenig ex Linnaeus
Thành phần hóa học được nghiên cứu nhiều nhất trong chi Murraya là các
nhóm hợp chất sau: tinh dầu, alcaloid, flavonoid, coumarin.
1.1.3.1. Tinh dầu
Tinh dầu là thành phần hóa học chính, phần lớn phân bố ở lá, lượng nhỏ ở cành,
chủ yếu thuộc nhóm monoterpen và sesquiterpen và được nghiên cứu ở tất cả các loài
thuộc chi Murraya J. Koenig ex Linnaeus. Ở các nghiên cứu này, phương pháp chủ
yếu thu tinh dầu được sử dụng là cất kéo hơi nước và xác định thành phần tinh dầu
bằng GC/MS [12], [14], [17], [32], [33].
Thành phần hóa học của tinh dầu chiết xuất từ 6 loài Murraya (gồm: Murraya
tetramera, Murraya euchrestifolia, Murraya koenigii, Murraya kwangsiensis,
Murraya exotica, và Murraya alata) đã được nghiên cứu. Từ các mẫu cành mang lá
của chúng, thu hái tại tỉnh Quảng Tây và Vân Nam Trung Quốc vào tháng 5,6,7 năm
2014, tinh dầu thu được bằng cách cất kéo hơi nước với hàm lượng không cao, đạt từ

0.03 đến 0.23 %. Tất cả 36 thành phần được xác định bởi GC-MS từ các mẫu tinh dầu.
Các thành phần có hàm lượng tương đối cao hơn bao gồm α-cedrene (4,22 - 21,82%),
β-caryophyllene (8,15 - 27,73%), γ-elemene (4,38–12,65%), γ-selinene (3,80–
21,09%), α-selinene (2,60–10,68%), α-zingiberene (2,08–12,68%), spathulenol (3,08–
11,80%), caryophyllene oxit (1,58–10,59%), β-eudesmol (1,33–25,32%), vv. Hơn nữa,
tám hợp chất , được công nhận là thành phần quan trọng trong tinh dầu của M.
tetramera và M. kwangsiensis, đã được phân lập xác định là α-terpinene, βcaryophyllene,

α-caryophyllene,

alloaromadendrene,

camphene và oxit caryophyllen [33].

4

spathulenol,

β-eudesmol,


Hình 1.1. Cấu trúc một số thành phần thường gặp trong timh dầu chi Murraya
Bên cạnh 6 loài trên, ba loài còn lại trong chi là: Murraya paniculata, Murraya
crenulata, Murraya microphylla, thành phần tinh dầu của chúng cũng đã được nghiên
cứu: Loài Murraya paniculata (ở một số tài liệu được cho là đồng nghĩa với Murraya
exotica [10], [40]) đã có nghiên cứu so sánh về thành phần tinh dầu của hai loài này,
kết quả cho thấy sesquiterpene được tìm thấy là thành phần chiếm ưu thế, chiếm 92,8

5

% lượng tinh dầu từ M. paniculata và 87,9 % từ M. exotica. Một phân tích so sánh về
thành phần tinh dầu của hai loại cây này cho thấy mức độ tương đồng cao trong thành
phần chính của chúng, chẳng hạn như sự xuất hiện của E-caryophyllene, spathulenol
và delta-elemene, đã đưa ra bằng chứng hóa học cho ứng dụng y học tương đương của
chúng [17]. Loài Murraya microphylla, Thành phần chính của tinh dầu bao gồm: β caryophyllene (18,0%), α-pinene (13,8%), spathulenol (9,5%), α-humulene (6,0%), γ elemene (5,1%) và zingiberene (4,6%) ), tiếp theo là α-cadinol (3,9%) và oxit
caryophyllene (3,8%) [32]. Loài Murraya crenualata, ít được nghiên cứu về tinh dầu,
hàm lượng tinh dầu là 0.6%, chứa các dẫn xuất p-menthane, chủ yếu là aldehyde
(73,2%), limonene (8,2%), perilla alcohol (6,5%) và các muối acetate của nó (6,0%).
[14].
Tuy nhiên đôi lúc có khác xa nhau về kết quả hàm lượng và thành phần tinh dầu
ở cùng 1 loài giữa các nghiên cứu. Ví dụ như:
+ Với loài Mrraya tetramera: Mẫu thu hái ở Quảng Tây, Trung Quốc có hàm
lượng 3,0-3,3 %, thành phần chính là: menthone (51,09%), isomenthone (7,95%), (+)neomenthol(19.42%), sylvestrene(5,71%), β-phellandrene(3,11%), myrene(2,04%),
menthol(1,52%) [35]. Mẫu thu hái tại tỉnh Vân Nam, Trung Quốc vào 5/2014 cho thấy
hàm lượng là 0,16 %, với thành phần chính là các sesquiterpen: β–Eudesmol
(25,32%); Spathulenol (11.80%), β-Caryophyllene (8,15%), (-)-Alloaromadendrene
(7,11%); α-Terpinene (5,54%); α-Caryophyllene (4,76%); γ-Cadinene (4,52%); γ Elemene (4,38%); α-Cedrene (4,22%) [33]. Trong một nghiên cứu khác, cũng là mẫu
thu hái ở 3 địa phương khác nhau của tỉnh Vân Nam Trung Quốc, nhưng thành phần
chính lại là monoterpen cụ thể là: limonen và perillaldehyd. Cũng trong nghiên cứu
này sự thay đổi tinh dầu theo địa điểm thu hái khác nhau của loài này đã được nghiên
cứu: Tinh dầu được lấy từ cành và lá của cây Murraya tetramera đang phát triển ở 3
địa phương khác nhau là: Yimen, Tonghai và Jianshui của tỉnh Vân Nam Trung Quốc,
27 thành phần hóa học đã được phân lập và xác định. Trong các thành phần này, ngoại
trừ Caryophyllene là sesquiterpen, 26 thành phần khác đều là monoterpen hoặc dẫn
xuất oxy của chúng. Các loại tinh dầu của Murraya tetramera phát triển ở ba địa
phương có chứa tất cả các thành phần chính, cụ thể là limonen và perillaldehyd [12].
+ Với loài Murraya euchrestifolia: Mẫu thu hái tại tỉnh Quảng Tây, Trung
Quốc vào 5/2014 cho thấy hàm lượng tinh dầu là 0.03 %, với thành phần chính là: β–

6


Eudesmol

(10,89%);

Spathulenol

(19,39%),

β-Caryophyllene

(12,94%),

Caryophyllene oxid (10,59%); Curcumene (7,72%); Nerolidol (5,14%); δ-Cadinene
(5,93%); τ-Muurolol (5,07%) [33]. Mặt khác, trong một nghiên cứu khác về tinh dầu
Murraya euchrestifolia, hai thành phần chính lại là limonene (56,10%) và
perillaldehyd (34,10%) [16].
Sự khác nhau này có thể do tinh dầu biến đổi theo các vị trí địa lý, theo các mùa
trong năm, hoặc do các chembotype tinh dầu khác nhau của loài. Tuy nhiên, theo kết
quả thống kê lại các tài liệu viết về chi Murraya trên thế giới, chưa có nghiên cứu bài
bản nào theo dõi sự thay đổi hàm lượng và động hóa thành phần tinh dầu theo mùa hay
theo các chemotype của cùng một loài trong chi này.
Nhận xét: qua các nghiên cứu đã có về tinh dầu các loài trong chi Murraya, có
thể thấy về hàm lượng nguồn tinh dầu này có tiềm năng khai thác ở một số loài, về
thành phần có sự biến đổi đa dạng giữa các địa phương khác nhau và giữa các
chemotype khác nhau của loài.
1.1.3.2. Alcaloid
Alcaloid là nhóm hợp chất nổi bật thứ 2 (chỉ sau tinh dầu) trong chi Murraya.

Các nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy các loài trong chi Murraya đều chứa alcaloid.
Alcaloid phân bố ở rễ, vỏ rễ, cành, lá . Alcaloid trong chi Murraya phần lớn thuộc
nhóm carbazole alcaloid, một số thuộc nhóm indol alcaloid.
Carbazole alcaloid của chi Murraya có thể có 1, 2 hoặc 3 khung carbazole trong
phân tử [30], [19]. Carbazole alcaloid có mặt trong rất nhiều loài thuộc chi Murraya
như sau: lá và cành của loài M. Tetramera [19], lá [30] và vỏ rễ [30] của loài M.
Euchrestifolia, lá và cành của loài M. Microphylla [20], lá của loài M.koenigii [28], Rễ
của loài M.crenulata [34], rễ của loài M. Kwangsiensis [31]. Ngoài ra, cũng đã có
nghiên cứu về sự thay đổi thành phần alcaloid theo các mùa trong năm đối với loài M.
euchrestifolia, cũng trong nghiên cứu này, hàm lượng alcaloid toàn phần tính được là
0.33% [30].

7


Hình 1.2: Cấu trúc khung carbazole alcaloid
Bên cạnh khung carbazole alcaloid một số alcaloid chiết được từ rễ M.
Paniculata, M.exotica và M.alata thuộc nhóm indolalcaloid với hoạt tính chống viêm
[34].

Hình 1.3: Cấu trúc khung indol alcaloid
1.1.3.3. Flavonoid
Flavonoid được tìm thấy trong một số loài thuộc chi Murraya như: trong lá của
loài M. paniculata [22], lá của loài M. exotica [36], cành và lá của loài M.tetramera
[38], lá của loài M.koenigii [13]. Những loài còn lại ít thấy có nghiên cứu về
Flavonoid. Flavonoid thuộc chi Murraya chủ yếu thuộc loại euflavonoid [13], [22],
[36], [38] với các thành phần chính thường gặp là: quercetin, rutin, catechin,
myricetin.

Hình 1.4: Cấu trúc khung euflavonoid

1.1.3.4. Coumarin
Coumarin chỉ được tìm thấy trong một vài loài thuộc chi Murraya như: lá của
M. alata [18], rễ của M. paniculata [29], lá [15] và cành [25] của M. exotica, chủ yếu
thuộc nhóm coumarin chính danh (2 vòng), có thể ở dạng monomer [15] hoặc dimer
[25].

8


1.1.3.5. Các nhóm hợp chất khác
Một số hợp chất anthranoid thuộc nhóm 1,8-dihydroxy anthranoid đã được tìm
thấy trong M.tetramera [38].
Các hợp chất phenolic như: acid gallic, acid ellagic cũng được xác đinh là các
thành phần chính trong dịch chiết cồn từ lá M. paniculata [22].
1.1.4. Phân bố chi Murraya J. Koenig ex Linnaeus
Trên thế giới có khoảng 12 loài thuộc chi Murraya J. Koenig ex Linnaeus phân
bố ở phía Đông, Nam, Đông Nam của châu Á, Australia; Tây Nam Thái Bình Dương
[37]. Ở Trung Quốc đã ghi nhận được 9 loài thuộc chi này [37].
Theo các tài liệu [3], [6], [7], [8], ở Việt Nam đã có ghi chép về 4 loài là:
Murraya alata Drake, Murraya paniculata (L.) Jack, Murraya koenigii (L.) Spreng,
Murraya glabra (guillaum.) Swingle (tuy nhiên loài Murraya glabra (guillaum.)
Swingle hiện nay vẫn chưa được xác nhận trên thế giới [40]).
1.1.5. Tác dụng sinh học của chi Murraya J. Koenig ex Linnaeus
Các loài trong chi Murraya J. Koenig ex Linnaeus thường được biết đến với
các tác dụng kháng khuẩn, kháng côn trùng, chống viêm, chống oxy hóa.
Tác dụng của tinh dầu: Từ các mẫu của 6 loài thuộc chi Murraya: Murraya
tetramera, Murraya euchrestifolia,Murraya koenigii, Murraya kwangsiensis, Murraya
exotica và Murraya alata, các thành phần tinh dầu của chúng đã được phân tích và
chứng minh tác dụng chống lại Tribolium castaneum (một loại côn trùng hay được gọi
là mọt đỏ) [33]. Hoạt tính kháng khuẩn, gây độc tế bào và chống oxy hóa từ tinh dầu

Murraya koenigii (L.) đã được chứng minh [27], [24].
Tác dụng của các nhóm hợp chất khác:Yuehchukene – một indol alcaloid được
phát hiện chỉ trong bốn trong số chín loài thuộc chi Murraya được phân tích (M.
paniculata, M. paniculata , M. exotica và M. alata) với hoạt tính chống viêm nổi bật
[34]. Các carbazole alcaloid từ Murraya koenigii cho thấy khả năng ức chế mạnh mẽ
chống lại các vi khuẩn kháng kháng sinh như Staphylococcus aureus , Psedomonas
aeruginosa , Klebsiella , Escherchia coli và các dòng tế bào ung thư [24]. Một nghiên
cứu đã xác định thành phần polyphenol, flavonoid và hoạt tính kháng khuẩn, chống bài

9


tiết từ lá M. paniculata [22]. Hoạt tính chống viêm bởi các Coumarin and
Benzocoumarin chiết xuất từ loài Murraya alata cũng đã được chứng minh [18].
1.2. Tổng quan về ứng dụng của sắc kí lớp mỏng (TLC) và sắc kí khí kết
nối khối phổ (GC-MS) trong kiểm nghiệm tinh dầu.
-

Ứng dụng của TLC trong kiểm nghiệm tinh dầu

TLC là kĩ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua
pha tĩnh trên đó đã chấm hỗn hợp các chất cần phân tách. Pha tĩnh là chất hấp phụ
được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng chất
và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại. Pha động là một hệ dung môi
đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỉ lệ thích hợp [5] .
TLC là một trong những kĩ thuật sắc kí đầu tiên đã và đang được sử dụng trong
nhiều năm để phân tích tinh dầu. Phương pháp này cung cấp các thông tin rất có giá trị
so với các phương pháp đơn giản khác vì vậy mà nó được thực hiện như là một tiêu
chuẩn để mô tả đặc tính của tinh dầu trong dược điển.
Mặc dù đơn giản và thực hiện nhanh chóng, kĩ thuật này gặp nhiều hạn chế đối

với phân tích các hỗn hợp phức tạp như tinh dầu. Tuy nhiên, trong các cuộc khảo sát
nhanh về thành phần hóa học của tinh dầu, hoặc sự khác nhau về thành phần tinh dầu
của các loài, phương pháp này vẫn rất hữu ích [11].
-

Ứng dụng của GC-MS trong kiểm nghiệm tinh dầu

GC là phương pháp tách dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai
pha không trộn lẫn vào nhau, trong đó pha động là chất khí (khí mang) đi qua pha tĩnh
chứa trong cột. Sắc kí khí được áp dụng để tách những chất hoặc dẫn chất của chúng
mà có thể hóa hơi ở nhiệt độ phân tích [5].
Nguyên tắc của MS: Chất phân tích được chuyển sang thể khí và ion hóa, tạo
thành các ion dương hoặc âm. Phương pháp phổ khố dựa trên việc đo trự tiếp tỉ số m/z,
là tỉ số giữa khối lượng m và điện tích z của ion phân tích. Từ phổ khối ta có thể có
được thông tin về khối lượng phân tử và cấu trúc các mảnh thu được giúp định tính
hay định lượng [5].
Sắc kí khí- khối phổ là một kĩ thuật phân tích hiện đại và ngày càng được ứng
dụng rộng rãi, đặc biệt là trong lĩnh vực kiểm ghiệm tinh dầu. Mặc dù thiết bị đắt tiền

10


và tốn nhiều thời gian hơn, nhưng khả năng phân tách của GC-MS là vượt trội hơn hẳn
so cới các kĩ thuật phân tách khác [11].
Sự phù hợp của sắc kí khí đối với kiểm nghiêm tinh dầu: Thành phần tinh dầu
chủ yếu là các terpenoid, có khối lượng phân tử nhỏ, dưới 400, rất dễ bay hơi, nên đặc
biệt phù hợp để sử dụng sắc kí khí phân tích . Sau khi đi qua cột sắc kí các tinh dầu
phức tạp có thể cho các pic chồng chất, khi đó, khối phổ trở nên hiệu quả vì có thể
nhận ra các pic chồng chất. Ngoài ra GC-MS còn có khả năng xác định thành phần
trong tinh dầu theo tên và phát hiện sự giả mạo [21].

Tóm lại, các loại tinh dầu thường là một hỗn hợp phức tạp của rất nhiều chất
khác nhau, trong đó một số chất có cấu trúc hóa học tương tự nhau, đồng thời khả
năng phân tách của sắc kí lớp mỏng lại rất hạn chế. Do khả năng phân tách tốt các hỗn
hợp phức tạp, chứa các thành phần dễ bay hơi như tinh dầu nên GC-MS có thể sử dụng
trong cả định tính, thử tinh khiết, định lượng từng thành phần cấu thành trong tinh dầu.

11


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Cành mang lá và lá chét của 2 cây Vương tùng VT01 và VT02 thu hái tại xã
Gia Sinh, huyện Gia Viễn, tỉnh Ninh Bình..
Cành mang lá được thu hái vào cùng một thời điểm trong ngày, sau khi thu hái
được tách riêng giữa lá chét (chỉ chọn các lá bánh tẻ) và phần còn lại, hong khô ngoài
không khí trong phòng, sau đó được bảo quản trong túi kín, để nơi khô ráo thoáng mát.
Mã hóa các mẫu lá chét tại các thời điểm như bảng 2.1:
Bảng 2.1. Bảng mã hóa ký hiệu các mẫu nghiên cứu
Thời điểm

Cây VT01

Cây VT02

Ngày 16/9/2018

VT01-1

Không thu được mẫu

Ngày 1/12/2018

VT01-2

VT02-2

Ngày 14/2/2019

VT01-3

VT02-3

Ngày 15/4/2019

VT01-4

VT02-4

Mẫu tiêu bản được làm bằng phương pháp khô [4], lưu trữ tại Phòng tiêu bản
Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội. Mã hiệu tiêu bản: NHIP/18555/19
(mẫu VT01); NHIP/18556/19 (mẫu VT02).
2.2. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.2.1. Hóa chất
Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích bao gồm:
- Hóa chất làm tiêu bản và soi bột: nước cất, nước Javen, acid acetic, xanh
methylen, đỏ son phèn, dd Clorahydrat.
- Dung môi chiết xuất: cloroform, ether dầu hỏa, EtOH 96%, nước cất.
- Hóa chất để định lượng tinh dầu và đo hàm ẩm: Toluen, nước cất, tinh thể
Natri sulfat khan.
- Dung môi pha loãng tinh dầu: Chloroform, n-hexan.

- Dung môi chạy sắc kí lớp mỏng: Toluen, ethylacetat.

12


- Pha động trong GC-MS: Khí He.
2.2.2. Dụng cụ và máy móc
- Nghiên cứu đặc điểm thực vật:
+ Chụp ảnh mẫu nghiên cứu bằng máy ảnh Canon IXY 30S.
+ Kim mũi mác, dao lam, chổi lông, phiến kính, lamen,…
+ Kính hiển vi soi nổi Nikon SMZ 745T kết nối camera Nikon DS-Fi2 và
máy tính.
+ Kính hiển vi Nikon Eclipse Ci kết nối camera Nikon DS-Fi2 và máy tính.
+Tủ sấy WiseVen.
- Nghiên cứu thành phần hóa học:
+ Cân kỹ thuật Sartorius.
+ Cân phân tích hiện số Shimadzu AY 220.
+Bộ dụng cụ xác định hàm lượng nước trong dược liệu bằng phương pháp cất
với dung môi của bộ môn thực vật – trường Đạo học Dược Hà Nội.
+ Bộ dụng cụ định lượng tinh dầu nhẹ hơn nước của Bộ môn Thực vật – Đại
học Dược Hà Nội.
+ Bộ máy phân tích GC-MS: Gas Chromatograph GC-2010 plus Shimadzu,
GCMS-QP2020 kết nối máy tính.
+ Sắc ký lớp mỏng sử dụng bản mỏng tráng sẵn TLC Silica gel 60 F254.
+ Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC: thiết bị chấm mẫu
Linomat 5 CAMAG, máy khai triển CAMAG ADC2, buồng chụp ảnh TLC Visualizer
CAMAG kết nối máy tính.
2.3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu đặc điểm thực vật
+ Đặc điểm hình thái

+ Giám định tên khoa học.
+ Đặc điểm vi học
- Nghiên cứu thành phần hóa học
+ Định tính sơ bộ các nhóm chất: tinh dầu, acid amin, acid hữu cơ, alcaloid,
anthranoid, caroten, chất béo, courmarin, đường khử, flavonoid, glycosid tim,
polysaccharid, saponin, sterol, tanin.

13


+ Định lượng tinh dầu trong mẫu nghiên cứu theo dược liệu khô tuyệt đối
+ Xác định thành phần tinh dầu của mẫu nghiên cứu bằng SKLM và sắc kí
khí kết hợp khối phổ.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật
- Đặc điểm hình thái: Tiến hành theo phương pháp mô tả phân tích, quan sát
bằng mắt thường và bằng kính lúp soi nổi, chụp ảnh các đặc điểm về hình thái [4].
- Giám định tên khoa học: giám định tên khoa học của hai cây VT01 và VT02
theo phương pháp hình thái so sánh dựa vào các tài liệu [7], [8], [10], khóa phân loại
chi Murraya trong thực vật chí Trung Quốc [37], kết hợp tham khảo ý kiến chuyên gia.
- Đặc điểm vi học:
+ Đặc điểm vi phẫu: Tiêu bản vi phẫu được thực hiện bằng phương pháp
nhuộm kép. Các đặc điểm cấu tạo giải phẫu của thân và lá được mô tả phân tích theo
nguyên tắc nghiên cứu tiêu bản vi phẫu [4]. Tiêu bản được soi và chụp ảnh qua kính
hiển vi kết nối camera ở các vật kính 10x và 40x.
+ Đặc điểm bột: Mẫu cành và lá chét, sau khi sấy khô đem xay nhỏ, làm tiêu
bản, quan sát và chụp ảnh các đặc điểm của bột qua kính hiển vi ở các vật kính 10x và
40x.
2.4.2. Nghiên cứu thành phần hóa học
2.4.2.1. Định tính xác định sơ bộ các nhóm hợp chất có trong lá dươc liệu

Định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ (tinh dầu, acid amin, acid hữu cơ,
alcaloid, anthranoid, caroten, chất béo, courmarin, đường khử, flavonoid, glycosid tim,
polysaccharid, saponin, sterol, tanin) có mặt trong lá chét của hai cây VT01 và VT02
theo phương pháp thường quy ghi trong tài liệu “Thực tập Dược liệu” và “Phương
pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc” [2], [9].
2.4.2.2. Xác định hàm lượng và thành phần tinh dầu.
a. Xác định hàm lượng tinh dầu theo dược liệu khô tuyệt đối
Tiến hành gồm 2 bước:

14


+ Bước 1: Đo hàm ẩm của dược liệu bằng phương pháp cất với dung môi song
song với mỗi lần định lượng tinh dầu. Cách tiến hành được tham khảo trong dược điển
Việt Nam V [5] được tóm tắt như sau: Thêm 200 ml toluen và khoảng 3 ml nước vào
bình cầu khô. Lắp bộ dụng cụ (hình 2.1), cất 2 h, để nguội trong 30 min, dùng 5ml
toluen rửa ống sinh hàn rồi đọc thể tích nước cất được ở ống hứng (V1). Thêm vào
bình cầu chính xác khoảng 15g mẫu thử đã cắt nhỏ. Tiếp tục cất 3 giờ cho đến khi mực
nước cất được trong ổng hứng không tăng lên nữa, dùng 5 ml toluen rửa thành trong
ổng sinh hàn, cất tiếp 5 phút, đợi cho ống hứng nguội đến nhiệt độ phòng,. Nếu có
những giọt nước còn đọng trên thành ông sinh hàn thì dùng 5 ml toluen rửa kéo xuống.
Khi lớp nước và lớp toluen đã được phân tách hoàn thì đọc thể tích nước cất được
(V2). Hàm ẩm trong mẫu thử được tính theo công thức:
𝐻𝐴 =

(𝑉2 − 𝑉1)
× 100
𝑚

Trong đó:

HA: hàm ẩm của dược liệu đem cất tinh dầu (%)
V1: số ml nước cất được sau lần cất đầu
V2: số ml nước cất được sau lần cất thứ hai.
m: Khối lượng dược liệu đem thử (g).

Hình 2.1. Bộ dụng cụ xác định hàm ẩm bằng phương pháp cất với dung môi
+ Bước 2: Định lượng tinh dầu bằng phương pháp cất kéo hơi nước, làm song
song với mỗi lần đo hàm ẩm, sử dụng bộ dụng cụ định lượng tinh dầu nhẹ hơn nước
của Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội (hình 2.2) kết hợp tham khỏa
cách tiến hành trong Dược Điển Việt Nam V [5]: Cân chính xác khoảng 35 g lá chét
Vương tùng đã hong khô và cắt nhỏ tới kích thước 2-3mm cho vào bình cầu dung tích

15


500 ml. Thêm 250 ml nước, lắp bình cầu với dụng cụ cất và sinh hàn. Thêm nước cất
qua đường sinh hàn vào hệ thống cất sao cho một chút nước vừa tràn sang bình cầu thì
dừng lại. Đun bình cầu bằng bếp điện cho đến sôi thì điều chỉnh tốc độ cất sao cho cất
được 2-3 ml dịch cất trong 1 phút, duy trì suốt quá trình cất trong vòng 4 giờ. Ngừng
cất, chờ khi nhiệt độ ống hứng trở về nhiệt độ phòng thì đọc thể tích tinh dầu cất được.
Tỉ lệ phần trăm tinh dầu theo dược liệu khô tuyệt đối trong mẫu thử được tính theo
công thức sau:
𝑋% =

𝑉
𝐻𝐴
𝑀 × (1 −
)
100

× 100%

Trong đó:
X: Hàm lượng phần trăm tinh dầu theo dược liệu khô tuyệt đối (tt/kl)
V: thể tích tinh dầu thu được (ml)
M: Khối lượng mẫu đem cất tinh dầu (g)
HA: Hàm ẩm của dược liệu đem cất tinh dầu (%);

Hình 2.2. Bộ dụng cụ định lượng tinh dầu nhẹ hơn nước của Bộ môn Thực vật –
Trường Đại học Dược Hà Nội
Mỗi mẫu được tiến hành xác định hàm lượng tinh dầu theo dược liệu khô tuyệt
đối 3 lần, lấy kết quả trung bình.
b. Phân tích tinh dầu bằng sắc kí lớp mỏng (TLC)
-

Chuẩn bị dịch chấm sắc kí:
Các mẫu tinh dầu sau khi cất được pha loãng 100 lần bằng Chloroform để làm

dịch chấm sắc kí.
-

Tiến hành:
+ Chất hấp phụ: Bản mỏng Silicagel 60 F254, hoạt hóa ở 110 ℃ /1 giờ

16


+ Chấm dich chiết: Sử dụng máy CAMAG – Limonat 5 kết hợp với phần mềm
WinCATS. Thể tích chấm 8 µl, chiều dài vết 8 mm.
+ Khai triển bản mỏng bằng máy CAMAG ADC2 kết hợp với phần mềm

WinCATS. Sau khi lựa chọn và khảo sát hệ dung môi khai triển thường dùng cho tinh
dầu Toluen: ethyl acetat [1] với các tỉ lệ khác nhau, nhận thấy Toluen: ethyl acetat
(9:1) với quãng đường di chuyển 8 cm cho kết quả tách tốt nhất trên sắc kí đồ.
+ Hiện vết: Bản mỏng sau khi khai triển để khô và hiện màu bằng thuốc thử
Vanillin-acid sulfuric. Sau đó chụp ảnh bằng buồng chụp ảnh TLC Visualizer
CAMAG kết hợp với phần mềm WinCATS dưới ánh sáng trắng.
+ Xử lý kết quả sắc kí đồ bằng phần mềm VideoScan.
c. Phân tích tinh dầu bằng sắc kí khí kết hợp khối phổ (GC-MS)
Thực hiện:
-

Chuẩn bị dung dịch thử: Lấy 10 µL tinh dầu vào lọ vial, thêm 10 mg Na2SO4.
Thêm 1000 µL n-hexan hòa tan. Ly tâm, thu lấy phần dịch nổi chạy sắc ký.

-

Điều kiện sắc ký:
+ Pha tĩnh: Cột Rtx-5MS (Dài 30m, đường kính 0,25 mm, kích thước
hạt 0,25 um)
+ Chương trình nhiệt độ thể hiện ở bảng 2.2:
Bảng 2.2. Chương trình nhiệt độ
Tỷ lệ tăng

Nhiệt độ (oC)

-

30

2

3

150

3

10

240

5

-

Chế độ tiêm chia dòng: 50.

-

Điều kiện khối phổ:
+ Nhiệt độ interface: 250oC
+ Nhiệt độ ion hóa: 200oC.
+ Khoảng quét (m/z): 50 – 900

-

Thời gian giữ (phút)

Thư viện phổ: NIST 2.2

17


CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Thực nghiệm và kết quả
3.1.1. Đặc điểm thực vật cây Vương Tùng
3.1.1.1. Đặc điểm hình thái và giám định tên khoa học
Hai mẫu VT01 và VT02 có đặc điểm hình thái tương tự nhau (dưới đây là các
hình ảnh về hình thái của cây VT01, hình ảnh về hình thái của cây VT02 được bổ sung
trong phụ lục 8), được mô tả như sau:
Cây bụi nhỏ, cây vừa hoặc cây gỗ to, cao khoảng 1-6 m, có thể hơn, thường
mọc nhiều ở khu vực đỉnh núi. Thân già tiết diện tròn, đường kính khoảng 10-15 cm;
bề mặt thân và cành có nốt sần. Lá kép lông chim, mọc so le dài 15-20 cm, gồm 3-7 lá
chét; cuống lá kép mảnh, non màu nâu đỏ, già màu xanh, dài 3-7 cm. Phiến lá chét
hình bầu dục hoặc hình trứng dài 4-6 cm, rộng 2-4 cm, mặt trên màu xanh đậm. mặt
dưới màu xanh nhạt, bề mặt nhẵn; cuống lá chét mảnh, dài 0,1-0,3 cm; gốc lá tù, gần
tròn hoặc hơi lệch; ngọn lá tù thuôn nhọn dần về phía trên; mép lá nguyên, rất ít khi
gợn răng cưa tròn; gân lông chim, gân chính nổi ở hai mặt, có 7-8 cặp gân bên, gân
phụ thấy rõ ở mặt trên. Túi tiết tinh dầu nằm dọc theo mép lá và phân bố đều khắp
phiến lá với mật độ cao, cách nhau khoảng 0,1-0,2 cm, kích thước mỗi túi khoảng 200
µm; quan sát được khi soi dưới ánh sáng.

Hình 3.1. Cây Vương tùng ở vùng núi đá vôi Ninh Bình
Chú thích: 1. Cây VT01; 2. Cây VT02; 3. Cành mang lá; 4. Gốc và thân cây

18