Định lượng isoflavonoid từ rễ củ sắn dây

Tạp chí Dược liệu, tập 24, số 4/2019 (Trang 216 - 220)

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PUERARIN, DAIDZIN VÀ
DAIDZEIN TRONG RỄ CỦ SẮN DÂY TRÊN HỆ THỐNG MÁY HPLC-PDA
Phạm Quốc Tuấn1, Hà Thanh Hòa1, Hà Quang Lợi1, Nguyễn Quốc Tuấn1, Phương Thiện Thương2,
Nguyễn Mai Nam1, Trần Quốc Hưng1, Lương Phong Văn1, Đinh Thị Quỳnh Anh1, Nguyễn Đức Hùng1,*
1

Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ Dược, Cao đẳng Y Dược Phú Thọ;
2

Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam - Hàn Quốc
*Email:
(Nhận bài ngày 11 tháng 7 năm 2019)
Tóm tắt

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép với detector PDA được xây dựng cho định lượng đồng thời puerarin (1), daidzin
(2), daidzein (3) trong rễ củ sắn dây. Điều kiện chiết xuất tối ưu là dung môi ethanol 35%, siêu âm trong một giờ. Các đường chuẩn
trong khoảng nồng độ định lượng, chúng có hệ số tuyến tính cao (R2 > 0,999). Độ chính xác của phương pháp phân tích trong ngày
và các ngày tiếp theo có RSD đều không quá 3,7% và 4,08%. Kết quả nghiên cứu cho thấy, phương pháp định lượng đồng thời các
isoflavonoid trong rễ củ sắn dây có thời gian phân tích nhanh, chính xác và đơn giản.
Từ khóa: Pueraria, Puerarin, Daidzein, Daidzin, HPLC-PDA.
Summary
Development of an HPLC-PDA Method for Simultaneous Determination of Puerarin, Daidzin and Daidzein
in Puerariae Radix
A high-performance liquid chromatography coupled with diode array detection method was developed for simultaneous
quantification of puerarin (1), daidzin (2), daidzein (3) in Puerariae Radix. As a result, the optimized extraction solvent was 35%
ethanol with an ultrasonic extraction in one hour. All calibration curves showed good linearity (R 2 > 0.999) within the test ranges.
The intra-day and inter-day variations were less than 3.7% and 4.08%, respectively. The current study has proposed a rapid,
accurate and simple HPLC method which allows the simultaneous determination of three isoflavones in Puerariae Radix.
Keywords: Pueraria, Puerarin, Daidzein, Daidzin, HPLC-PDA.

1. Đặt vấn đề
Trong y học cổ truyền vị thuốc cát căn (rễ củ sắn
dây) được sử dụng làm thuốc chữa sốt, cứng gáy,
khát, sởi chưa mọc, lỵ và tiêu chảy [1]. Theo Dược
điển Trung Quốc, sắn dây (Kudzu) có hai chuyên
luận khác nhau về hai thứ của loài Pueraria
montana là P. thomsonii (P. montana var.
thomsonii) và P. lobata (P. montana var. lobata) [2].

Chuyên luận sắn dây trong Dược điển Việt Nam V
là rễ củ của P. thomsonii Benth. [1]. Thành phần
hóa học trong rễ củ sắn dây chứa các nhóm như
isoflavonoid, flavon, triterpenoid glycosid và tinh
dầu [3]. Các thành phần isoflavonoid trong sắn dây
như puerarin, daidzin, daidzein đã được chứng
minh có các tác dụng bảo vệ gan, điều trị bệnh tim
mạch, tăng huyết áp, đái tháo đường, giảm độc
ethanol [4]. Các nghiên cứu cho thấy daidzein,


genistein có tác dụng ức chế cạnh tranh với γ2-γ2ADH-isoenzym với ethanol và ức chế không cạnh
tranh với γ2-γ2-ADH isoenzym NAD+ [3]. Các
isoflavonoid của sắn dây còn được chứng minh có
tác dụng giảm hấp thu rượu từ đường uống, giảm
rõ rệt các triệu chứng gây ra do rượu trên động vật
thí nghiệm. Dược điển Trung Quốc quy định hàm
lượng puerarin trong taxon P. lobata từ 2,4% và P.
thomsonii 0,3% trở lên [2]. Dược điển Việt Nam V,
chỉ định tính puerarin dựa trên phương pháp sắc

ký lớp mỏng [1]. Do đó, xây dựng phương pháp
định lượng đồng thời puerarin, daidzin và daidzein
trong rễ củ sắn dây trên hệ thống máy HPLC-PDA
sẽ có vai trò quan trọng góp phần kiểm soát chất
lượng của dược liệu cát căn lưu hành trên thị
trường Việt Nam.
2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.1. Đối tượng, nguyên vật liệu và thiết bị
nghiên cứu
Đối tượng: Mẫu rễ củ phơi sấy khô của cây sắn
dây (Pueraria thomsonii Benth.) (SD1) thu hái tại
Vườn Thực vật - Trường Cao đẳng Y Dược Phú Thọ,
tháng 12 năm 2017. Mẫu tiêu bản
(CDYDPT/TV/SD01/2017) được xác định bởi TS.
Phạm Quốc Tuấn, lưu tại Phòng lưu mẫu, Bộ môn
Dược liệu - Trường Cao đẳng Y Dược Phú Thọ.
Hóa chất: Các dung môi sử dụng gồm:
methanol (MeOH), acetonitril (MeCN), acid formic,
ethanol (EtOH) 96%, nước cất. Chất chuẩn đối
chiếu gồm puerarin (1), daidzin (2) và daidzein (3)
có độ tinh khiết ≥ 98% theo HPLC được mua từ
hãng Sigma-Aldrich.
Thiết bị HPLC: Máy HPLC CBM-20A (Shimadzu
Corporation, Kyoto, Nhật) ghép với detector Diode
Array SPD-M20A, cột SupelcosilTM (250 mm × 4,6
mm, 5 μm).
2.2. Phương pháp nghiên cứu

- Tối ưu hóa điều kiện sắc ký: Dựa trên khảo sát
độ hấp thụ UV của chất phân tích, hệ dung môi pha

động, nồng độ acid formic, tốc độ dòng cho
chương trình sắc ký.
- Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất: Khảo sát hệ
dung môi chiết gồm các hỗn hợp EtOH-H2O;
MeOH-H2O, phương pháp chiết và thời gian chiết.
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Các dung dịch chất
chuẩn gốc 1, 2, 3 nồng độ 1000 µg/mL được pha
trong EtOH 35%, từ dung dịch trên pha loãng thành
các dung dịch có nồng độ phù hợp. Dung dịch chất
chuẩn được đựng trong lọ thủy tinh, đóng kín, dán
màng seal, bảo quản ở 4 ºC trong tủ lạnh. Đường
chuẩn được xây dựng dựa trên tương quan giữa
nồng độ và diện tích pic của các chất phân tích 1, 2
và 3.
- Thẩm định phương pháp phân tích:
Phương pháp phân tích được thẩm định theo
yêu cầu chung của ICH (International Conference
on Harmonisation) gồm các yêu cầu sau: tính
tương thích của hệ thống, khoảng nồng độ tuyến
tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng
(LOQ), độ chính xác, độ đúng [5].
2.3. Áp dụng phương pháp thẩm định được vào
các mẫu thu hái trên địa bàn
2.4. Xử lý số liệu phân tích
Các thí nghiệm được thực hiện ba lần, kết quả
lấy giá trị trung bình (

). Các số liệu thống

kê được tính trên phần mềm GraphPad Prism 7.

3. Kết quả và Bàn luận
3.1. Tối ưu các điều kiện sắc ký
Dựa trên phổ hấp thụ UV, các chất đối chiếu 1,
2, 3 có cực đại hấp thụ tại bước sóng lần lượt là
254, 250 và 258 nm. Do đó, bước sóng 254 nm
được lựa chọn cho định lượng các mẫu phân tích
1, 2 và 3. Các hệ dung môi pha động MeCN-H2O


và MeOH-H2O được khảo sát khả năng tách trên
hệ thống HPLC. Kết quả cho thấy, hệ dung môi
MeOH-H2O tách tốt hơn, giá thành rẻ hơn nên
được lựa chọn. Cuối cùng, pha động MeOH (A)H2O (B) chứa 0,05% acid formic theo chương trình
gradient (0 - 20 phút: 27% A; 20 - 25 phút: 27% 50% A), kết quả sắc ký đồ cho thấy các chất phân
tích tách khỏi nhau hoàn toàn, thời gian ngắn,
không có pic nào chồng lấp được sử dụng cho
phương pháp định lượng. Các chất đối chiếu
được xác định trong mẫu dựa theo thời gian lưu,
phổ hấp thụ UV và xác nhận bởi thêm chất chuẩn
vào mẫu cho từng chất. Điều kiện tối ưu gồm có:
detector UV đo tại bước sóng 254 nm. Hệ dung
môi pha động MeOH (A) và H2O chứa 0,05% acid
formic (B) chạy theo chương trình gradient (0 - 20
phút: 27% A; 20 - 25 phút: 27% - 50% A), thể tích
tiêm mẫu 10 µL, tốc độ dòng 1 mL/phút.
3.2. Tối ưu điều kiện chiết xuất
Mẫu sắn dây (hàm ẩm 8,7%) được xay mịn rây
qua rây 200 µm đảm bảo đồng nhất. Cân 0,3 g bột
trên, thêm 50 mL dung môi chiết xuất được thí
nghiệm như sau: dung môi gồm 95%, 75%, 50%,

25% EtOH và 100%, 75%, 50%, 25%, 0% MeOH, sau
đó được siêu âm 30 phút. Kết quả cho thấy khoảng
nồng độ 25% - 50% EtOH có hiệu suất chiết cao
nhất. Tiếp tục chiết mẫu trong EtOH ở các nồng độ
25, 30, 35, 40, 45, 50%, trên sắc ký đồ tại nồng độ
35% cho diện tích pic lớn nhất, nên được chọn làm
dung môi chiết xuất.
Khảo sát phương pháp chiết bằng siêu âm so
sánh với chiết nóng hồi lưu của mẫu trong thời
gian 30 phút, kết quả diện tích pic của các chất
chuẩn khác nhau không đáng kể. Phương pháp
siêu âm được lựa chọn để chiết mẫu. Tiếp tục khảo
sát thời gian chiết tại 30 phút, 45 phút, 60 phút, 75
phút. Tại thời điểm 60 phút khi siêu âm, diện tích
pic của chúng không tăng, do đó thời gian trên phù
hợp để chiết xuất.

3.3. Thẩm định phương pháp
3.3.1. Tính tương thích của hệ thống, chọn lọc,
đặc hiệu
Hỗn hợp các mẫu chuẩn 1, 2, 3 ở nồng độ 100
µg/mL được phân tích 5 lần liên tiếp với chạy sắc
ký 5 lần, kết quả cho thấy diện tích pic của 3 chất
chuẩn thay đổi không đáng kể, nên hệ thống phù
hợp để phân tích 1, 2 và 3.
Bảng 1. Kết quả khảo sát tính tương thích
của hệ thống của 1, 2 và 3
Chất
phâ
n

tích

Thời gian lưu (phút)

Diện tích pic

tR

RSD
(%)

S

1

5,85 ± 0,03

0,51
%

4838431 ± 34179

2

7,68 ± 0,01

0,13
%

2994198 ± 10286

3

13, 92 ± 0,04

0,28
%

2939041 ± 20177

RSD
(%)
0,7%

0,34%

0,68%

Các kết quả về thời gian lưu và diện tích pic của
các chất chuẩn 1, 2, 3 tại nồng độ 100 µg/mL đều
cho giá trị tin cậy, với giá trị RSD thấp (< 2%) (Bảng
1). Do đó, phương pháp phân tích tương thích với
hệ thống.
Phân tích các mẫu chuẩn 1, 2, 3, mẫu dược liệu
và mẫu trắng trong cùng một điều kiện sắc ký đã
chọn. Trên sắc ký đồ các pic chất chuẩn trên tương
ứng với mẫu dược liệu, đồng thời không xuất hiện
trên pic mẫu trắng. Trên sắc ký đồ, các pic của 1, 2,
3 tách nhau hoàn toàn, cân đối, sắc nét, độ rộng
chân píc nhỏ. Như vậy, phương pháp phân tích lựa

chọn có tính đặc hiệu và chọn lọc.
3.3.2. Khoảng tuyến tính, LOD và LOQ
Khoảng tuyến tính của phương pháp được xây
dựng ở 8 nồng độ từ 250 µg/mL tới 1,95 µg/mL.


Các giá trị LOD và LOQ của 1, 2, 3 được xác định tại
nồng độ của tín hiệu chất phân tích trên tín hiệu

nền lần lượt bằng 3 (S/N) và 10 (S/N). Kết quả phân
tích như Bảng 2.

Bảng 2. Các tham số của phương trình tuyến tính, LOD, LOQ các chất 1, 2 và 3
Nồng độ

Độ dốc

Hệ số chặn

LOD

LOQ

(μg/mL)

(μg/mL)

Hệ số tương quan (R2)

Chất chuẩn

(μg/mL)

(a)

(b)

1

1,95-250

29.712

- 68.767

0,9994

0,430

1,435

2

1,95-250

30.612

- 53.681

0,9994

0,080

0,267

3

1,95-250

49.616

- 95.833

0,9997

0,060

0,200

Kết quả khảo sát cho thấy, tại khoảng nồng độ
(250; 125; 62,5; 31,25; 15,625; 7,5125; 3,90; 1,95
µg/mL, mối tương quan giữa diện tích pic và nồng

độ của các chất chuẩn 1, 2, 3 tuyến tính với R2 từ
0,9994 - 0,9997 (Bảng 2).

Hình 1. Sắc ký đồ của hỗn hợp chất chuẩn (A): puerarin (1), daidzin (2), daidzein (3) và SD1 (B).

3.3.3. Độ đúng, độ chính xác
Độ đúng và độ chính xác được xác định bởi

phân tích 6 mẫu độc lập tại 3 nồng độ khác nhau
(Bảng 3).

Bảng 3. Kết quả của độ đúng và độ chính xác
Chất

Chuẩn

Nồng độ

Trong ngày (n=6)

Nồng độ

Các ngày tiếp theo (n=6)


phâ
n
tích

1

2

3

thêm
vào

mẫu
(μg/mL)

Nồng độ
thu được

SD

(μg/mL)

Độ
đúng
(%)

Độ
chính
xác

mẫu
(μg/mL)

RSD%

Nồng độ
thu được

SD

(μg/mL)

Độ
đúng
(%)

Độ
chính
xác
RSD%

2

88,8

90,8

0,07

100,1

3,7

88,3

28,4

0,05

100,1

1,72

50

88,8

138,1

1,8

98,6

3,5

88,3

77,1

0,14

98,2

0,71

100

88,8

187,8

1,79

99,0

1,7

88,3

227,1

0,37

100,1

0,49

2

16,7

18,7

0,04

99,2

2,0

16,80

18,7

0,1

98,6

4,08

50

16,7

66,6

1,3

99,7

2,6

16,80

66,4

1,2

99,4

0,32

100

16,7

115,9

2,1

98,5

2,1

16,80

117,3

2,0

100,6

0,49

2

24,5

26,5

0,1

101,1

2,6

24,5

26,5

0,31

101,5

2,3

50

24,5

74,4

0,9

99,8

1,7

24,5

73,0

0,10

97,0

3,1

100

24,5

125,6

2,6

98,8

2,2

24,5

125,9

0,30

101,4

1,0

Kết quả phân tích cho thấy độ đúng của 1, 2, 3
của các mẫu phân tích trong ngày từ 98,6 - 101,1%
và các ngày liên tiếp từ 97,0 - 101,5%. Đối với độ

chính xác 1,7 - 3,7% của mẫu phân tích trong ngày
và các ngày liên tiếp từ 0,32 - 4,08%. Kết quả trên
cho thấy phương pháp phân tích có độ đúng và
chính xác cao.
3.4. Áp dụng phân tích các mẫu sắn dây thu hái
trên địa bàn tỉnh Phú Thọ
Năm mẫu rễ của sắn dây trồng trọt (SD1-SD5)
được thu hái tại các địa điểm khác nhau trong tỉnh
Phú Thọ được khảo sát đồng thời hàm lượng 1, 2,
3 dựa vào các điều kiện nghiên cứu ở trên cho kết
quả ở Bảng 4 dưới đây.
Bảng 4. Khảo sát hàm lượng 1, 2, 3 trong 5 mẫu sắn dây
SD2

SD3

SD4

(% kl/kl)

(%
kl/kl)

(%
kl/kl)

(%
kl/kl)

(% kl/kl)

1

1,48

0,41

0,11

0,10

1,69

2

0,28

0,11

0,06

0,07

0,12

3

0,41

0,09

0,08

0,09

0,08

SD1
Chất

SD5

SD2 - SD5 được thu hái tại huyện Cẩm Khê Phú Thọ.
Từ Bảng 4 cho thấy, các mẫu SD1, SD2 và SD5
có hàm lượng puerarin lớn hơn 0,3%, đạt yêu cầu
theo Dược điển Trung Quốc về chuyên luận P.
thomsonii. Tuy nhiên, 2 mẫu SD3 và SD4 có hàm
lượng puerarin thấp 0,10 - 0,11%. Trong y học cổ
truyền của Trung Quốc, dược liệu cát căn
(Puerariae Radix) gồm Puerariae lobatae Radix và
Puerariae thomsonii Radix được chia ra hai chuyên
luận từ năm 2005 do hàm lượng puerarin khác
nhau đáng kể [2]. Các nghiên cứu cũng chỉ ra tác
dụng chống oxy hóa và một số tác dụng dược lý
giữa hai taxon này cũng tương đối khác nhau [6].
Dựa trên hình thái học thực vật, hai taxon này
giống nhau, chỉ phân biệt dựa trên kích thước các
bộ phận của hoa, quả [7]. Hàm lượng hoạt chất
chính có tác dụng sinh học là các isoflavonoid giữa
chúng cũng khác nhau nhiều. Để phân biệt dược

liệu Puerariae lobatae Radix và Puerariae
thomsonii Radix, các nghiên cứu chỉ ra đặc điểm
khác nhau về hình thái học, đặc điểm hiển vi và
thành phần hóa học của chúngtrên TLC, HPLC [7],


[8],[9]. Kết quả nghiên cứu của Du G. và cs. [10],
phân biệt hai taxon trên dựa trên thành phần hóa
học, cho thấy P. thomsonii có hàm lượng puerarin
từ 0,37% - 0,698%, trong khi đó P. lobata từ 2,92%
- 6,13%. Trong nghiên cứu này, các mẫu thu hái có
hàm lượng puerarin từ 0,1 - 1,69% phù hợp với các
công trình nghiên cứu phân biệt giữa hai dược liệu
trên.
4. Kết luận
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã khảo sát, lựa
chọn các các điều kiện chiết xuất isoflavonoid rễ củ
sắn dây với hiệu suất cao, an toàn với dung môi
EtOH 35%, phương pháp siêu âm với thời gian là 60
phút. Đồng thời xây dựng thành công phương pháp
định lượng đồng thời puerarin (1), daidzin (2),
daidzein (3) đơn giản, thời gian ngắn và chính xác.
Phương pháp được thẩm định với các giá trị độ
đúng từ 97,0 - 101,5% và độ chính xác 0,32 - 4,08%.
Phương pháp này góp phần tiêu chuẩn hóa về mặt
định lượng các chất chính trong dược liệu cát căn.


Tài liệu tham khảo
1. Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Tập 2, Nhà xuất bản Y học, 1310-1311. 2. Pharmacopoeia of the People’s Republic of China

(2010), Chinese Pharmacopoeia Com-mission, Vol 1. People’s Medical Publishing House, Beijing, China, 313-321. 3. Zhang Z., Lam T.
N., Zuo Z. (2013), Radix Puerariae: An overview of its chemistry, pharmacology, pharmacokinetics, and clinical use, The Journal of
Clinical Pharmacology, 53(8), 787-811. 4. Wong K. H., Li G. Q., Li K. M., Razmovski N. V., Chan K. (2011), Kudzu root: Traditional
uses and potential medicinal benefits in diabetes and cardiovascular diseases, Journal of Ethnopharmacology, 134(3), 584-607. 5. ICH
(1995), Validationofanalyticalprocedures: Text and methodology ICH guidelines topic Q2 (R1), London, UK. 6. Wong K. H.,
Razmovski N. V., Li K. M., Li G. Q., Chan K. (2015), Comparing morphological, chemical and anti-diabetic characteristics of
Puerariae lobatae Radix and Puerariae thomsonii Radix, Journal of Ethnopharmacology, 164, 53-63. 7. Zhengyi W., Reven P. H,
Deyuan H. (2010), Flora of China, Vol. 10, Science Press (Beijing) and Missouri Botanical Garden Press (St. Louis), 244-248. 8. Jiang
R. W., Lau K. M., Lam H. M., Yam W. S., Leung L. K., Choi K. L., Waye M. M., Mak T. C., Woo K. S., Fung K. P. (2005), A
comparative study on aqueous root extracts of Pueraria thomsonii and Pueraria lobata by antioxidant assay and HPLC fingerprint
analysis, Journal of Ethnopharmacology, 96(1), 133-138. 9. Zhang C. L., Ding X. P., Hu Z. F., Wang X. T., Chen L. L., Qi J., Yu B. Y.
(2011), Comparative study of Puerariae lobatae and Puerariae thomsonii by HPLC-diode array detection-flow injectionchemiluminescence coupled with HPLC-electrospray ionization-MS", Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 59(5), 541-545. 10. Du
G., Zhao H. Y., Zhang Q. W., Li G. H., Yang F. Q., Wang Y., Li Y. C, Wang Y. T. (2010), A rapid method for simultaneous determination
of 14 phenolic compounds in Radix Puerariae using microwave-assisted extraction and ultra high performance liquid chromatography
coupled with diode array detection and time-of-flight mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 1217(5), 705-714.