Xác định hàm lượng vitamin c trong viên c sủi bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao hplc/dad

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP HCM
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

BÁO CÁO ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH
XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN C TRONG
VIÊN C SỦI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG
HIỆU NĂNG CAO HPLC/DAD
GVGD: TS. Lê Đình Vũ
SVTH:
MSSV: 11050991
Lớp:

ĐHPT7
1


NỘI DUNG
1

Tổng quan lý thuyết

2

Thực nghiệm xác định hàm lượng vitamin C
trong viên C sủi bằng HPLC/DAD

3

Kết quả và thảo luận

2

2


1. Tổng quan lý thuyết
1.1. Tổng quan về vitamin C
Định nghĩa: Vitamin C, còn
được gọi là acid ascorbic, là một
acid hòa tan trong nước trong
chất dinh dưỡng được tìm thấy
trong một số loại thực phẩm. Trong cơ thể, nó hoạt động như một chất
chống oxy hóa, giúp bảo vệ các tế bào khỏi những thiệt hại gây ra bởi
các gốc tự do.
Nguồn gốc: Vitamin C có nhiều trong các loại rau quả tươi như nước
cam, chanh, quít, và có hàm lượng cao trong rau xanh, đặc biệt là bông
cải xanh, tiêu, khoai tây, cải brussel, rau cải, cà chua, xoong cam, quýt,
chanh. Trong công nghiệp, các sản phẩm chứa vitamin C chủ yếu được
tổng hợp bằng phương pháp hóa học đi từ D-glucose.
3


Tính chất vật lý:
Khối lượng phân tử: 176,13 g/mol
Có dạng: bột màu trắng đến vàng nhạt (khan), không mùi, vị chua
Nhiệt độ nóng chảy: 193oC (phân hủy)
Khả năng hòa tan trong nước: cao
Khó tan trong rượu, không tan trong các dung môi hữu cơ
Acid ascorbic có khả năng hấp thu ánh sáng tử ngoại, UVmax =
254 nm, tại pH = 2, UVmax = 265 nm tại pH = 6.4 .
Tính chất hóa học:

CH2OH
Tính acid
Do hiệu ứng liên hợp của nhóm carboxyl, nên HO CHO
O
nguyên tử hydro của nhóm hydroxyl ở vị trí
số 3 trở nên rất linh động, làm cho vitamin C
HO: OH
có tính acid mạnh.
4


• Có thể định lượng acid ascorbic bằng phương pháp đo kiềm, chỉ
thị phenolphtalein, dung môi là nước.
• Người ta điều chế muối ascorbat natri để pha dung dịch tiêm có
nồng độ cao và trung tính.

• Tác dụng với muối kim loại cho muối mới.


Tính khử
• Việc oxy hoá acid ascorbic xảy ra ở hai mức độ khác nhau:
+ Sự oxy hoá khử thuận nghịch acid ascorbic thành acid
dehydroascorbic

Tính chất này vô cùng quan trọng đối với tác dụng sinh học của acid
ascorbic, nó tham gia vào các hệ enzym xúc tác các quá trình oxy hoá
khử xảy ra trong cơ thể.


+ Sự oxy hoá bất thuận nghịch acid ascorbic:

Quá trình oxy hoá này tạo ra các sản phẩm như acid 2,3-diceto
gulonic (1), acid dehydroascorbic, furfurol (2), và các sản phẩm
không có hoạt tính enzym.
Trong dung dịch, acid ascorbic dễ dàng bị oxy hoá bởi oxy không
khí; Độ bền vững của dung dịch acid ascorbic giảm tỷ lệ thuận với
nồng độ của nó và tỷ lệ nghịch với pH của dung dịch .


Lợi ích của vitamin C đối với sức khỏe con người:
• Tham gia tạo colagen và một số thành phần tạo nên các mô liên kết ở cơ,
da xương, mạch máu.
• Tham gia vào các quá trình chuyển hóa của cơ thể như protid, lipid,
glucid, tăng tỉ lệ hấp thu canxi vào cơ thể.
• Tham gia vào quá trình tổng hợp một số chất như catecholamin, hormon
vỏ thượng thận, tăng mật độ xương cột sống và xương đùi.
• Chống stress nên giúp tăng sức đề kháng cho cơ thể.
• Kết hợp với vitamin A, vitamin E chống ôxy hóa bằng cách trung hòa
các gốc tự do sản sinh ra từ các phản ứng chuyển hóa, nhờ đó bảo vệ
được tính toàn vẹn của màng tế bào.
• Hỗ trợ rất lớn giúp hấp thu sắt của cơ thể, vì khi vào trong cơ thể chỉ có
sắt hóa trị 2 dễ dàng được hấp thu sắt hóa trị 2, còn sắt hóa trị 3 muốn
được hấp thu phải được chuyển thành hóa trị 2, mà quá trình chuyển này
cần có sự xúc tác của vitamin C nên nếu thiếu vitamin C sẽ dễ gây thiếu
máu do thiếu sắt, do vậy khi uống viên sắt cần uống kèm với vitamin C.


1.2. Tổng quan về kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao
Khái niệm:
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó

pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được
phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất
mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá
học với các nhóm chức hữu cơ .

Mobile phase
(Pha động)
Stationary phase
(Pha tĩnh)


- Quá trình tách dựa vào tính chất hóa học, vật lý và hóa lý của các
chất.
- Dựa trên 2 quá trình:
Hấp phụ
Giải hấp phụ
- Xảy ra liên tục giữa 2 pha:
Pha tĩnh: chất rắn hoặc lỏng, giữ chất phân tích
Pha động: chất lỏng (1 chất hoặc hỗn hợp nhiều chất), hòa tan và di
chuyển chất phân tích
- Sắc ký lỏng chia thành 2 nhóm
Sắc ký lỏng áp suất thường (sắc ký cổ điển)
Sắc ký lỏng áp suất cao (Sắc ký lỏng hiệu năng cao: HPLC)


Phân loại:
Dựa vào bản chất của quá trình sắc ký, HPLC chia thành:
SK
phân
bố

SK ghép
cặp ion

Sk trao
đổi ion

SK pha
thường

HPLC
SK
pha
đảo


Khi nối với đầu dò (detector), HPLC cho phép:
-Định tính: dựa vào thời gian lưu
-Định lượng: dựa vào chiều cao hoặc diện tích peak


CẤU TẠO MÁY HPLC


(1) Bình đựng dung môi
- Hiện tại máy HPLC thường có 04 đường
dung môi vào đầu bơm cao áp .Cho phép
chúng ta sử dụng 04 bình chứa dung môi
cùng 1 lần để rửa giải theo tỷ lệ mong
muốn và tổng tỷ lệ dung môi của 4 đường
là 100 % .

- Tuy nhiên theo kinh nghiệm thì chúng ta
ít khi sử dụng 04 đường dung môi cùng
một lúc mà chúng ta chi sử dụng tối đa là 3
và 2 đường để cho hệ pha động luôn được
pha trộn đồng nhất hơn,hệ pha độüng đơn
giản hơn để quá trình rửa giải ổn định .
- Hiện 04 đường dung môi phục vụ chủ
yếu cho việc rửa giải Gradial dung môi
theo thời gian và công tác xây dựng tiêu
chuẩn .

NGUỒN CUNG CẤP
PHA ĐỘNG (MOBILE
PHASE): LÀ BÌNH
ĐỰNG DUNG MÔI
HOẶC DUNG MÔI
CHẠY MÁY


(2) Bộ khử khí Degase
Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại
trong dung môi pha động .
Nếu như trong quá trình phân tích mà dung môi pha động còn
sót các bọt khí thì một số hiện tượng sau đây sẽ sảy ra:
- Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm
cho thời gian lưu của Peak thay đổi .
- Trong trường hợp bọt quá nhiều bộ khử khí không thể loại trừ hết
được thì có thể Pump sẽ không hút được dung môi khi đó áp suất
không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động .

(3) Bơm cao áp (hệ thống cung cấp dung môi)
- Bơm pha động vào cột tách
- Điểu khiển tốc độ dòng, áp suất của pha động
- Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thường có áp suất tối đa
412 Bar (1at = 0.98Bar). Tốc độ dòng 0.1-9.999 ml/phút .

HỆ THỐNG ĐIỀU KHIỂN ÁP SUẤT
HOẶC TỐC ĐỌ DÒNG PHA ĐỘNG,
CÒN GỌI LÀ HỆ THỐNG CUNG CẤP
DUNG MÔI: LC PUMP


(4) Bộ phận tiêm mẫu ( injection valve)
Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp không ngừng
dòng chảy . Với dung tích của l bóp là 5 - 100µl .
Có 02 cách lấy mẫu vào trong cột : Bằng tiêm mẫu thủ công
(tiêm bằng tay) và tiêm mẫu tự động (Autosample) .

BƠM MẪU BẰNG TAY

BƠM MẪU TỰ ĐỘNG
(AUTO SAMPLE)


5. Cột tách (Colume)
LÒ CỘT (COLUME OVEN): DÙNG
ĐỂ ĐIỀU KHIỂN NHIỆT ĐỘ CỘT
TÁCH

CỘT TÁCH: LÀ NƠI XẢY RA CÁC
QUÁ TRÌNH TÁCH CHẤT, GỒM
CỘT PHÂN TÍCH VÀ CỘT BẢO VỆ

- Cột tách có kích cỡ khác
nhau
- Chiều dài: 10 – 25cm
- Đường kính: 2 – 5mm


(5) Cột tách
Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng
hiệu năng cao.
- Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ ,chiều dài cột
khoảng 10 -30cm ,đường kính trong 1-10mm ,hạt chất nhồi cỡ φ = 510 µm.(ngoài ra còn có một số trường hợp đặc biệt về kích thước và
kích cỡ hạt....)
- Với chất nhồi cột cỡ φ = 1.8 -5 µm có thể dùng cột ngắn ( 3-10
cm ) và nhỏ (đường kính trong 1-4.6 mm) loại cột này có hiệu năng
tách cao.
- Chất nhồi cột tùy theo lọai cột và kiểu sắc ký
- Thông thường chất nhồi cột là Silicagel (pha thuận)
hoặc là Silicagel đã được Silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng
hữu cơ ( pha đảo ) , ngoài ra người ta còng dùng các loại hạt khác
như : Nhôm Oxit,Polyme xốp,chất trao đổi ion.
* Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao
hoặc thấp hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong bộ phận điều
nhiệt (Oven column)


(6) Đầu dò (detector)

Có nhiều loại đầu dò khác nhau tùy vào mục đích phân tích
Dùng để phát hiện chất và định lượng: UV-Vis, DAD, huỳnh
quang, độ dẫn, điện hóa, khối phổ,…


(7) Hệ thống ghi nhận và xử lý tín hiệu (interface, software,
PC): Dùng để thu thập và tính toán các kết quả.


III. NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG MÁY HPLC
- Mẫu chất lỏng được đưa vào buồng bơm mẫu sau đó được bơm tự động
vào cột tách.
- Dựa trên sự phân bố liên tục các cấu tử chất phân tích lên hai pha: một
pha thường đứng yên, có khả năng hấp thu chất phân tích gọi là pha tĩnh,
một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi là pha động. Do các cấu tử chất phân
tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác
nhau và tách ra khỏi nhau.
- Các quá trình tách trong sắc ký lỏng:

Quá trình quan trọng nhất trong phương pháp sắc ký

Những cân bằng động xảy ra giữa pha tĩnh và pha động trong cột sắc ký

Là sự vận chuyển và phân bố liên tục của chất phân tích từ đầu cột đến
cuối cột

Chất phân tích luôn phân bố giữa 2 pha, trong đó pha động luôn chảy qua
cột tách với một tốc độ nhất định

Hiệu quả của quá trình tách phụ thuộc rất nhiều vào tương tác giữa các

chất trong pha tĩnh và pha động

Mục đích chính của sắc ký là tách và định tính các chất trong hỗn hợp
chất phức tạp


• Quá trình tách diễn ra trong cột sắc ký

column
Vật liệu nhồi cột 3- 5µm


QÚA TRÌNH TÁCH

mixed sample
Mobile phase

column


Hỗn hợp chất tách khỏi
nhau thế nào ?

Flow

Pha tĩnh