NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN TP53 TRÊN BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO THẦN KINH ĐỆM GLIOBLASTOMA

1

I. ĐẶT VẤN ĐỀ

U nguyên bào thần kinh đệm (Glioblastoma-GB) là một trong các khối u
não phổ biến nhất hiện nay, chiếm khoảng 12% đến 15% của tất cả các khối u
não. Glioblastoma thường hình thành trong chất trắng não, phát triển nhanh
chóng, và có thể thành khối u lớn trước khi xuất hiện những triệu chứng đầu tiên
nên biểu hiện lâm sàng bằng hội chứng tăng áp lực nội sọ nặng nề. Về mô học, u
được đặc trưng bởi vùng mô hoại tử, bao quanh là các tế bào biệt hóa kèm theo
là hiện tượng tăng sinh mạch [1,2].. Tổ chức y tế thế giới (WHO) phân loại
Glioblastoma như một u tế bào hình sao (Astrocytoma) cấp IV với độ ác tính
cao nhất [3,4]. Bệnh nhân mắc loại ung thư này thường có tiên lượng không tốt
do sự tiến triển nhanh chóng và xâm lấn các tổ chức mô não, thần kinh của khối
u trong hộp sọ. Tỷ lệ mắc Glioblastoma trên thế giới được thống kê là khoảng 35 ca/100.000 dân. Nghiên cứu của Richard Johnson và cộng sự cho thấy năm
2010 có khoảng 10.800 bệnh nhân tại Hoa Kỳ được chẩn đoán u nguyên bào
thần kinh đệm, trong đó có gần 10.000 ca tử vong. Tỷ lệ mắc u nguyên bào thần
kinh đệm ở nam giới xấp xỉ 1.6 lần so với nữ giới. Tỷ lệ Glioblastoma phát hiện
ra nhiều nhất vào độ tuổi từ 45 đến 62 và dưới 10% các trường hợp ung thư
dạng này xảy ra ở trẻ em [3,4,17].
Hiện nay trên thế giới với những hiểu biết về cơ chế phân tử và sự kết hợp
nhiều phương pháp điều trị, trong đó có liệu pháp điều trị đích dựa trên phân
tích tình trạng đột biến gen, đã làm gia tăng đáng kể thời gian sống của bệnh
nhân u nguyên bào thần kinh đệm trong những năm qua. Bên cạnh đó, xác định
đột biến gen của các đối tượng cùng huyết thống đã chỉ ra những yếu tố nguy cơ
góp phần vào việc làm giảm tỷ lệ mắc và ngăn ngừa sự phát sinh, phát triển ung
thư [6, 8,9].
Nghiên cứu đầu tiên về tổn thương gen trong u nguyên bào thần kinh đệm
được công bố khoảng 35 năm trước đây. Trong nhiều năm sau đó, những gen
đóng vai trò quan trọng trong bệnh sinh ung thư như thụ thể yếu tố phát triển

2

nguyên bào sợi (fibroblast growth factor receptor, FGFR), một số gen đánh giá
mức độ ác tính và biệt hoá, hay kiểm soát sự phân chia của tế bào ung thư như
RTEL1 và Hes3, gen áp chế ung thư TP53 đã được nghiên cứu. Dựa trên tình
trạng đột biến gen, các nhà khoa học, các bác sỹ lâm sàng có một cái nhìn tổng
thể về nguy cơ, mức độ tiến triển để có biện pháp can thiệp điều trị kịp thời,
nâng cao hiệu quả điều trị cũng như theo dõi tiên lượng đối với bệnh nhân u
nguyên bào thần kinh đệm [6, 8,9]..
TP53 là gen áp chế ung thư nằm trong con đường tín hiệu TP53 đóng vai
trò quan trọng trong việc duy trì tính ổn định của bộ gen dưới tác động của các
yếu tố có hại như sự thương tổn DNA, giảm oxy máu, rối loạn chuyển hóa hay
tăng cường hoạt động của các gen sinh ung thư. Khi hoạt động, TP53 có tác
dụng sửa chữa thương tổn DNA, thúc đẩy sự chết tế bào khi thương tổn DNA
không thể sửa chữa. Ngoài ra TP53 còn kiểm soát nhiều hoạt động chức năng
khác của tế bào thông qua sự tăng cường hay ức chế sao chép một loạt các gen
trong con đường tín hiệu TP53 [11,20].. Chính vì vậy, p53 được xem như trạm
gác của bộ gen tế bào (guardian genome). Do vậy, nếu gen TP53 bị đột biến, tế
bào bị tổn thương DNA sẽ không được sửa chữa và nhân lên không giới hạn, đó
là cơ sở dẫn đến phát triển các khối u ung thư. Tỷ lệ đột biến gen TP53 trong u
nguyên bào thần kinh dao động từ 30% đến 35%, tỷ lệ này cao hơn trong các
khối u thứ phát và phát triển từ u thần kinh đệm có mức độ ác tính thấp hơn
[26]. Đột biến gen TP53 trong u nguyên bào thần kinh đệm hầu hết là các đột
biến điểm nằm rải rác trên toàn bộ chiều dài gen TP53 nhưng tập trung chủ yếu
ở 3 bộ ba mã hoá codon-175, -248 và -273 thuộc exon 5-8. Các dạng đột biến
này được chứng minh có vai trò quan trọng đối với quá trình tiến triển và xâm
lấm của ung thư [26]. Chính vì vậy việc xác định đột biến gen TP53 được xem
như là một marker quan trọng đánh giá tiên lượng trong điều trị đối với bệnh
nhân u nguyên bào thần kinh đệm.

Tại Việt Nam, tỷ lệ người mắc u nguyên bào thần kinh đệm chiếm tỷ lệ
lớn, tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào về đặc điểm gen đột biến nói chung cũng
như gen TP53 nói riêng trên đối tượng bệnh nhân này. Do đó, phân tích gen


3

TP53 sẽ giúp bác sỹ lâm sàng đánh giá được nguy cơ mắc loại ung thư ác tính,
nâng cao hiệu quả điều trị và tiên lượng , tiến triển của bệnh trên bệnh nhân u
nguyên bào thần kinh đệm .
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện nghiên cứu về trạng
thái các gen biến đổi trong GB với mục tiêu:
1.

Xác định đột biến gen TP53 trong u nguyên bào thần kinh đệm
(Glioblastoma).


4

II. TỔNG QUAN
2.1. Tổng quan u não
2.1.1.Triệu chứng lâm sàng
Triệu chứng lâm sàng u não rất đa dạng. U não có thể có một khoảng thời
gian rất dài không có biểu hiện triệu chứng hoặc có biểu hiện triệu chứng duy
nhất là đau đầu, tính chất dữ dội hoặc rất mơ hồ không rõ vị trí đau. Tính chất
của đau đầu trong u não là đau thường xuyên và có xu hướng ngày một tăng
thêm, phát sinh khi xúc cảm mạnh, khi ho, khi đỡ bệnh nhân ngồi dậy quá mạnh,
đôi khi đau tăng hoặc giảm phụ thuộc vào tư thế đầu. Người ta thấy rằng 80%
đến 90% bệnh nhân bị u não đều có đau đầu cục bộ hoặc toàn thể. Đau đầu cục

bộ được giải thích do yếu tố cơ học chèn ép vào các dây thần kinh sọ não hoặc
các xoang tĩnh mạch gây ra phản xạ co thắt các mạch máu của não và màng não.
Bruns và Busep cho rằng đau đầu toàn thể là do tăng áp lực nội sọ, sự kích thích
các thụ cảm thể được thực hiện thông qua tăng áp lực nội sọ cho nên khi chọc
não thất hoặc cho thuốc chống phù não thì đau đầu có đỡ hơn. Người ta cũng
chứng minh rằng nếu tràn dịch não thất chỉ gây giãn một bên não thất thì đau
đầu cũng chỉ biểu hiện nửa đầu cùng bên (Wolff và Agdubr). Hội chứng tăng
áp lực nội sọ với nhức đầu lan toả, buồn nôn, ói mửa, soi đáy mắt có phù gai thị
là những triệu chứng có giá trị khi nghĩ đến u não [1, 2,3]..
Triệu chứng hay gặp nữa trong u não là động kinh - dấu hiệu thần kinh
gợi ý nghĩ đến u não trong khoảng 40% trường hợp.
Một vài dấu hiệu thần kinh khu trú nào đó từ nhẹ đến nặng khác như:
- Liệt một dây thần kinh sọ nào đó, yếu tay chân, giảm trí nhớ hoặc thị
lực giảm cũng có thể gợi ý đến u não.
- Nôn: Có khoảng 65-68% trường hợp có biểu hiện nôn là dấu hiệu của
tăng áp lực nội sọ. Nôn trong u não có đặc điểm là nôn vọt, nôn không liên quan
với bữa ăn, không có biểu hiện cơn đau bụng trước nôn. Trong các u não ở hố
sau hay gặp nôn nhiều nhất, u ở trên lều là ít gặp nhất, chóng mặt có thể đồng
thời với nôn và buồn nôn và cũng gặp ở các u sọ ở hố sau.


5

- Phù gai thị: Phù hoặc teo gai thị giác là triệu chứng khách quan. Khi
tăng áp lực nội sọ sẽ đè ép vào các bó mạch của dây thần kinh thị giác dẫn đến ứ
máu tĩnh mạch và phù gai thị. Phù nề gai thị sẽ dẫn đến teo gai thị giác, cho nên
cần phải khám và phát hiện sớm hội chứng tăng áp lực nội sọ để tránh di chứng
về mắt.
2.1.2.Triệu chứng cận lâm sàng
Hiện nay, u não nói chung và GB nói riêng sử dụng các phương tiện chẩn

đoán cận lâm sàng là chẩn đoán hình ảnh và chẩn đoán mô bệnh học.
X quang hộp sọ:
Chụp sọ có thể thấy hình ảnh tăng áp lực nội sọ, các đường khớp cách xa
nhau, dấu ấn ngón tay lưu ý rằng thời gian tăng áp lực nội sọ từ 6 tháng trở lên
thì các dấu hiệu trên mới có giá trị. Ngoài ra có thể thấy hình ảnh biến đổi ở hố
yên như bào mòn hố yên và mất chất vôi do tăng tăng áp lực nội sọ lâu ngày.
Đối với u sọ hầu có thể thấy u bị ngấm vôi toàn bộ. Hình ảnh tiêu xương có thể
gặp trong u dây VIII làm cho lỗ tai trong rộng ra và thay đổi bờ trên xương đá.
Các u màng não cũng có thể ăn khuyết xương sọ.
Điện não đồ:
Đo điện não có thể phát hiện được những sóng chậm delta, bêta ở một khu
vực nào đó nếu kết hợp với các triệu chứng lâm sàng đúng đắn có thể giúp ta
chẩn đoán định khu của u não.
Siêu âm:
Siêu âm đường giữa, nếu có sự dịch chuyển của đường giữa từ 1-1,5cm
là có giá trị chẩn đoán. Siêu âm hai chiều hay còn gọi là hiệu quả Doppler, được
áp dụng trong việc chẩn đoán bệnh não ở trẻ sơ sinh thóp còn hở, phương pháp
siêu âm hai chiều thuận lợi và rẻ tiền trong chẩn đoán u não đối với trẻ em. Đối
với người lớn có thể khoan một lỗ sọ để chẩn đoán như trên.


6

Chụp động mạch não:
Đây là phương tiện chẩn đoán u não trong những thập niên 70, lần đầu
tiên do Egas Monis thực hiện năm 1927 qua hai đường từ động mạch cảnh trong
(CAG) và động mạch đốt sống (VAG).
Ngoài ra người ta cũng chụp được động mạch não bằng kỹ thuật
Seldinger (1953) bằng chọc kim vào động mạch đùi và luồn cathéter lên động
mạch đốt sống.

Sự tăng sinh và xô đẩy mạch máu trong não là hình ảnh gián tiếp của khối
choán chỗ.
Chụp cắt lớp vi tính:
Hình ảnh vi tính cho phép xác định được vị trí, kích thước của tổ chức học
u não theo S.Wende thì trong 3750 trường hợp u não vấn đề chẩn đoán tổ chức
học trên phim cắt lớp vi tính đúng đến 80% trường hợp, trong đó loại
meningioma chẩn đoán đúng 84% các trường hợp của các loại u này.
Chụp cộng hưởng từ (MRI):
Định vị được vị trí của u não. Đánh giá sự tương quan 3 chiều của thương
tổn với tổ chức lân cận.
Chẩn đoán mô bệnh học:
Theo phân loại của WHO (2000) u tế bào thần kinh đệm bao gồm u tế nào
hình sao, u tế bào thần kinh đệm ít nhánh và u tế nào thần kinh đệm lợp ống nội
tuỷ. U tế nào hình sao bao gồm: u tế nào hình sao thể long là lành tính, còn u tế
bào hình sao lan toả độ II, u tế bào hình sao giảm biệt hoá (độ III) và u nguyên
bào thần kinh đệm (độ IV) thuộc loại ác tính [9]..
U nguyên bào thần kinh đệm (Glioblastoma): Các tế bào của u nguyên
bào thần kinh đệm có nguồn gốc phôi thai giảm biệt hoá tăng sản được chia
thành 2 loại dựa vào nguồn gốc phát sinh là u phôi thai tiên phát (60%) và u thứ
phát từ tế bào hình sao. Hình ảnh đại thể của u nguyên bào thần kinh đệm khá
điển hình với ranh giới hình vòng cung không rõ rệt, cắt ngang u có thể gặp màu
xám hay hồng, có điểm hoại tử màu vàng hoặc ở vùng có xuất huyết máu thì đỏ
màu nâu thẫm. Thành mạch máu trong u tăng sinh dày. Có thể gặp u thể nang


7

hay u nhiều ổ, u thường có mật độ mềm và chỉ cứng khi xâm lấn dính vào màng
não, gây chảy máu. Hình ảnh vi thể của các khối u nguyên bào thần kinh đệm rất
khác nhau. Khối u luôn dày đặc tế bào, nhưng có thể đồng dạng và đa hình với

nhiều giai đoạn trung gian giữa 2 loại tế bào. Tính biệt hoá thấp, tạo sự giảm
thiểu các nhánh bào tương và nhân bắt màu đậm, hình thái thường cho phép
chẩn đoán là u nguyên bào thần kinh đệm. Nhiều tác giả cho là thường gặp 3 thể
u chủ yếu sau:
U nguyên bào thần kinh đệm đa hình: U gồm chủ yếu là những nguyên bào thần
kinh đa hình xen kẽ một số neuron của vỏ não. Các tế bào này ít biệt hoá, nhân
bắt mầu đậm, thô, nhiều hình nhân chia, chúng cụm xung quanh một số điểm
hoại tử nhỏ. Mao mạch u thành dày, tăng sản mạnh tế bào nội mô, nhiều điểm
xuất huyết rải rác, có chỗ lòng mạch bị chít hẹp và tổ chức hoá hay vôi hoá.

Hình 2.1. U nguyên bào thần kinh đệm nhuộm HE và phóng đại 400 lần
Nhận xét: trên tiêu bản thấy mật độ u dày đặc, đa hình dạng, có dị nhân,
nhân quái, nhân chia. Tế bào biệt hóa theo hướng khác nhau, hoại tử hình bản
đồ, tăng sinh nội mạch dạng cuộn.
U nguyên bào thần kinh đệm thể hỗn hợp với sacome xơ: Mô não lành liền kề
xen kẽ với tổn thương sát bề mặt u gồm dày đặc tế bào đa hình thái, chủ yếu là
tế bào dạng thoi, ít nhánh thần kinh đệm. Vùng não lành xung quang thấy có
một số tế bào u lan tràn, nhưng không có phản ứng mạch máu.
U nguyên bào thần kinh đệm thể tế bào khổng lồ: U gồm dày đặc các tế bào đa
hình thái, kích thước to nhỏ khác nhau, phần lớn là các tế bào tròn nhỏ hay hình
ô van với nhân bắt màu kiềm đậm, thô, hay gặp hình nhân chia, lác đác một số tế


8

bo khng l, kớch thc ln gp nhiu ln t bo nh, nhõn bt mu thụ m
dng hỡnh thỏp hoc a din gúc tự vi ht nhõn rừ, nhiu hỡnh nh phõn bo. C
2 loi t bo ny u ớt t thn kinh. Trong t chc u cú nhiu im hoi t thõm
nhp bi cỏc vi bo m thn kinh, mt s vựng xut huyt nh ri rỏc.
Quan sỏt siờu cu trỳc các tế bào glioblast dới kính hiển vi

điện tử cho thấy rõ tính chất đa hình (dị hình của tế bào
và nhân). Màng tế bào nhiều nếp gấp khúc, ty thể tăng, nhiều
khi gặp các tế bào u có những sợi thần kinh đậm trong bào tơng là biểu hiện của loạn sản. Giảm biệt hoá rõ khi trong bào tơng tế bào u chỉ thấy một số ít bào quan nh lới nội bào có hạt,
ribosome tự do và ty thể, đặc biệt nhân lớn, hình dạng kỳ dị,
chia nhiều thuỳ và tỷ lệ nhân/bào tơng rất lớn. Thờng gặp
hình ảnh phân bào của tế bào u, phần nhiều là nhân chia
không điển hình biểu hiện vùng trung tâm nhiễm sắc thể
dài ra, kèm theo teo nhỏ trung thể [1,3].
Thể u tế bào khổng lồ hay đa nhân cũng thờng gặp ở u
nguyên bào thần kinh đệm và một số tác giả lại phân ra nhiều
nhóm, trong đó nhóm tế bào u khổng lồ tăng sản mạnh thờng
đợc coi là một ung th ác tính, cả trong bào tơng và gian bào
của các tế bào u thể này thờng gặp các thể vùi. Hình ảnh siêu
cấu trúc cho thấy có cả các thể vùi trong nhân. Nghiên cứu siêu
cấu trúc tế bào u còn cho biết các tổn thơng ở mức siêu vi,
nhất là các hệ thống nội bào đặc biệt mẫn cảm là màng tế
bào, bộ máy hô hấp tế bào trong ty thể, hệ thống sinh tổng
hợp protein và bộ gen ở nhân tế bào.
Mạch máu trong u nguyên bào thần kinh đệm thay đổi
liên quan đến sự phát triển của u và vùng lân cận rất rõ và kéo
dài. Biến đổi hình thái quan trọng nhất là tăng sản nội mô
mạch máu nhỏ nuôi u, đặc biệt có thể gặp các búi những tế


9

bào nội mô xếp cụm lại. Nhân tế bào nội mô trải rộng hay gặp
hình phân chia. Đôi khi thấy một số biến đổi nh các điểm
mao mạch thành dày lòng mạch giãn ra tạo hình ảnh sao mạch.
2.1.3.T l mc u nóo

Nhiều thống kê cho thấy tỷ lệ mắc u não dao động từ 1020/100.000 dân trong một năm. Theo nhiều tác giả, tỷ lệ mắc
u não đợc phát hiện đã tăng lên trong hai thập niên vừa qua nhờ
có các phơng pháp chẩn đoán sớm, hiện đại nh chụp ct lp vi
tớnh, chp cng hng t. Ti Hoa K, 16.800 ca u não đợc chẩn đoán
trong năm 1999, cũng trong năm đó có 13.100 ngời đã chết vì
u não nguyên phát và hơn 100.000 ngời chết vì u di căn vào
hộp sọ từ các ung th cơ quan khác.
Phân loại theo giới tính và lứa tuổi cho thấy nam giới thờng mắc u não nhiều hơn n gii, ngoại trừ u màng não thờng
gặp nữ nhiều hơn nam. Tỷ lệ mắc u não tăng theo tuổi, nhiều
nhất là từ 65 đến 74 tuổi. U não nguyên phát ở trẻ em chiếm
khoảng 10%, hay gặp nhất là trớc 5 tuổi, riêng về mô học các
nhóm u thờng gặp là u tế bào hình sao thể lông và u nguyên
tuỷ bào (Médulloblastome).
Tần suất mắc u não theo phân loại hình thái mô học gồm
2 loại nguyên phát và thứ phát. U thứ phát có nguồn gốc từ các
cơ quan khác trong cơ thể di căn vào não nh từ phổi, vú, đờng
tiêu hoá, biểu bì...luôn là những khối u ác tính. U nguyên phát
có nguồn gốc từ não, màng não và các tuyến trong sọ. Theo
P.Muller và St.Michael u tế bào thần kinh đệm thờng gặp nhất
chiếm khoảng 50%, u màng não 20%, u tuyến yên 10%, còn lại
là các khối u khác. Trong s cỏc khi u ỏc tớnh thỡ cú khong 8/10 l u t bo
thn kinh m [1,3]..
2.1.4. Nguyờn tc iu tr v phũng bnh


10

Điều trị chủ yếu phẫu thuật cắt khối u, tia xạ, hoá chất và điều trị triệu
chứng. Tuy nhiên các can thiệp này đem lại kết quả rất hạn chế.
Phẫu thuật:

Mục tiêu của việc phẫu thuật là loại bỏ u và không gây tổn thương đến tổ
chức não lành. Tuy nhiên mục tiêu đó đạt được hay không còn phụ thuộc vào vị
trí u nông hay sâu, u có giới hạn rõ hay không. Liên quan với u, khối lượng u và
trình độ chuyên khoa của phẫu thuật viên. Nhờ chụp cắt lớp vi tính và kính hiển
vi phẫu thuật người ta có thể lấy bỏ u một cách triệt để hơn. Tuy nhiên không
phải loại u nào cũng có thể lấy bỏ triệt để được, u màng não có giới hạn rõ
nhưng đôi khi cũng chỉ lấy được một phần.
U não ở sâu, ở hành não, thân não, ở các mạch máu lớn, ở nền sọ thì việc
lấy bỏ u sẽ rất khó khăn vì gần trung khu hô hấp, tim mạch và khó cầm máu.
Điều trị tia xạ:
Tia phóng xạ trước hết được dùng để diệt những tế bào ác tính còn lại sau
khi cắt bỏ hoặc những u ác tính ở sâu mà người ta chỉ phẫu thuật tối thiểu
Stereotaxy với kết quả giải phẫu bệnh kèm theo. Người ta còn dùng để ngăn
không cho các u lành tính hoặc tương đối lành tính tái phát như Adenoma tuyến
yên hoặc Craniopharynoma. Nói chung trong những năm qua điều trị các u não
bằng tia phóng xạ đã có những bước tiến đáng kể do sự tiến bộ của trang thiết
bị máy móc. Hiện nay, người ta dùng dao gamma điều trị u não, phẫu thuật an
toàn, hiệu quả cao.
Điều trị hoá chất:
Hiện nay kết quả điều trị u ác tính bằng hoá chất rất đáng khích lệ,
nhưng đối với u của mô não chưa thay đổi rõ rệt về tiên lượng. Người ta khuyên
chỉ nên dùng các hoá chất trong những trường hợp u ác tính phát triển nhanh, cụ
thể đối với các loại Glioblastoma, Astrocytoma độ III và độ IV. Nhiều tác giả đã
cho rằng hoá chất đã làm cho kết quả điều trị tốt hơn.
Các hoá chất được dùng trong điều trị u não có thể kể một vài loại sau:
Cyclophosphamide

(Endoxan),

5

Fluoro-Uracyle

(5FU),

Methotrexate


11

(Aethopterin), Vincristine (Oncovin), Mythramycine (Mithrancin), Doxorabicine
(Adriamycine).
Hoỏ cht dựng sau tia phúng x, c hai phng phỏp ny dựng iu tr b
sung sau phu thut.
iu tr corticoid v iu tr bng min dch cng c cp n trong u
nóo. Mc ớch ca iu tr corticoid l ngn nga tỡnh trng phự nóo quanh u v
iu tr min dch l mt hng iu tr cũn thi k nghiờn cu.
Túm li, mt u nóo lnh tớnh thỡ vic iu tr cú hiu qu nht l ct b
trit nhng cũn ph thuc vo v trớ gii phu, mi liờn quan v chc nng v
khi lng ca khi u. Cỏc u nóo ỏc tớnh khi phu thut c gng ly b ti a
khi lng ca chỳng kốm theo iu tr phi hp phúng x v hoỏ cht
t hiu qu cao hn [1,3]..
2.2. C ch bnh sinh u nóo
2.2.1. Cỏc yu t liờn quan n bnh sinh u nóo
Yếu tố di truyền: Các yếu tố di truyền có tác động vào sự
xuất hiện một số loại u não nh u nguyên bào võng mạc cũng nh u
thần kinh da. Trong nhóm u xơ thần kinh typ 1, các u tế bào
hình sao hay gặp nhiều gấp 4 lần. Nhóm 2 (đợc đặc trng bởi u
dây VIII hai bên) là tập hợp rất nhiều u khác nhau (u thần kinh
đệm ngoại biên, u xơ thần kinh, u màng não, u thần kinh đệm).

Các u nguyên bào mạch trong não và trong ống sống thờng xuất
hiện với bệnh Von Hippel Lindau.
Suy giảm miễn dịch làm tăng nguy cơ mắc các u lymphô
ở não. Khoảng 20% bệnh nhân có biểu hiện suy giảm miễn
dịch kéo dài và từ 5% đến 8% bệnh nhân AIDS bị u lymphô
ác tính, thờng là lympho B.
Nhiu nguyờn nhõn cha rừ rng khỏc, ngi ta thy GB hay gp nam
gii. Phn ln GB xy ra ngu nhiờn khụng cú tớnh cht gia ỡnh. Khụng cú mi
liờn quan gia GB vi hỳt thuc, ch n hay phi nhim in t. GB cú liờn


12

quan đến tình trạng nghiện rượu, nhiễm virus SV40 và cytomegalovirus, nhiễm
phóng xạ, nhiễm polyvinyl chlorid – một chất hay sử dụng trong xây dựng. Năm
2006, một nghiên cứu đã chứng minh u não liên quan đến bệnh sốt rét và người
ta cho rằng muỗi Anopheles ngoài truyền ký sinh trùng sốt rét đã truyền thêm
một loại virus hoặc chất gây ung thư dẫn đến GBM.
Một số yếu tố nguy cơ khác:
Giới: nam nhiều hơn nữ.
Tuổi: trên 50 tuổi.
Chủng tộc: người da trắng và châu á.
Gia đình: người ta đã thấy một số gen đột biến có nguy cơ gây GBM hoặc
một số bệnh lý rối loạn hệ thống gen [1,3]..
2.2.2. Cơ chế bệnh sinh
Hiện nay người ta thấy GB liên quan đến nhiều đột biến gen khác nhau
với tỷ lệ cao như gen TP53, EGFR, RTEL1, PDGFRA, IDHl, NF1. Đột biến gen
hay gặp nhất trong GB là TP53. Đột biến gen TP53 thì thường đi kèm đột biến
gen PDGFRA, mã hóa thụ thể yếu tố phát triển nguồn gốc tiểu cầu plateletderived growth factor receptor, và gen IDHl, mã hóa enzym isocitrate
dehydrogenase-1. Thể trung mô đặc trưng bởi tỷ lệ đột biến cao gen NF1 mã

hóa Neurofibromatosis type 1 và có tỷ lệ thấp biến đổi gen EGFR hơn thể khác.
Một dấu ấn sinh học khác trong GB là sự hiện diện của nguyên bào gốc ung thư
với sự xuất hiện của protein Hes3 trong môi trường nuôi cấy giữ vai trò điều
khiển quá trình nhân lên của tế bào này. Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài
này, chúng tôi tập trung nghiên cứu gen có tần suất đột biến cao trong GB là
TP53 [7, 10,14]..
2.2.3. Gen TP53
Gen TP53 nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể 17, dài 20kb với exon 1
không mã hóa và intron 1 dài tới 10kb. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh gen
TP53 mã hóa protein có vai trò quan trọng phòng chống ung thư nhờ cơ chế:
- Hoạt hóa các protein có vai trò sửa chữa DNA khi DNA bị sai sót.


13

- Kéo dài kỳ trung gian trong chu kỳ nhân lên của tế bào để các protein có
thời gian sửa chữa các vị trí sai sót trên DNA.
- Khởi động quá trình chết theo chương trình của tế bào nếu tổn thương
DNA không có khả năng khôi phục.
Do vậy, nếu gen TP53 bị đột biến, tế bào bị tổn thương DNA sẽ không
được sửa chữa và nhân lên không giới hạn, đó là cơ sở dẫn đến phát triển các
khối u ung thư. Người ta đã chứng minh đột biến TP53 liên quan đến nhiều loại
ung thư tại phổi, khung chậu, hệ tiêu hóa trong đó có ung thư hệ thần kinh, đặc
biệt là u nguyên bào thần kinh đệm. Trên thế giới, nhiều nghiên cứu đã chứng
minh u nguyên bào thần kinh đệm có liên quan đến nhiều gen khác nhau, trong
đó có TP53. Tỷ lệ đột biến TP53 trên GB khoảng 30% đến 35%. Các đột biến
hay gặp trên u nguyên bào thần kinh đệm là các đột biến điểm từ exon 5 đến 8.
Hiện tại ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về gen TP53 trên bệnh nhân u
nguyên bào thần kinh đệm. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu gen này trên bệnh
nhân u nguyên bào thần kinh đệm giúp các bác sỹ lâm sàng phân loại, tiên lượng

khả năng mắc GBM ở bệnh nhân u não [11,12,15]..
2.3. Kỹ thuật phân tích gen chẩn đoán Glioblastoma
2.3.1. Kỹ thuật khuếch đại gen - polymerase chain reaction (PCR)
Nguyên tắc chung: Dựa vào hoạt tính của các DNA polymerase có khả
năng tổng hợp mạch DNA mới từ mạch DNA khuôn, với nguyên liệu là bốn loại
nucleotid. Phản ứng này đòi hỏi sự có mặt của những mồi xuôi và mồi ngược có
trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự DNA khuôn. Phản ứng PCR là một
chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba bước:
- Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation), phân tử DNA được biến
tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử, thường là 94 oC 95oC trong vòng 30 giây - 1 phút.
- Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing). Nhiệt độ được hạ thấp cho
phép các mồi bắt cặp với khuôn, dao động trong khoảng 40 oC - 70oC, tuỳ thuộc
Tm của các mồi sử dụng và kéo dài khoảng 30 giây - 1 phút.


14

- Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension). Nhiệt độ được
tăng lên 72oC để DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq
polymerase, Tth polymerase, Pfu polymerase,…) hoạt động tổng hợp tốt nhất.
Thời gian phụ thuộc vào độ dài của trình tự chuỗi DNA cần khuếch đại, thường
kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi DNA mới tạo thành sẽ tiếp tục được dùng
làm các DNA nền để tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo. Sản phẩm
cuối của phản ứng PCR là những đoạn DNA mạch kép có chiều dài là khoảng
cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm được xác định
bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi [5,7].
Số lượng sản phẩm DNA tạo thành khi hoàn thành phản ứng PCR được
biểu thị bằng công thức sau:
N = 2n

N: số lượng bản copy sản phẩm tạo thành.
n: là số chu kỳ của phản ứng.
2.3.2. PCR lồng
Kĩ thuật PCR : Nguyên tắc chung dựa vào hoạt tính của các DNA
polymerase có khả năng tổng hợp mạch DNA mới từ mạch DNA khuôn, với
nguyên liệu là bốn loại nucleotid. Phản ứng này đòi hỏi sự có mặt của những
mồi xuôi và mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự DNA
khuôn.Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm
ba bước:
+ Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation), phân tử DNA được biến
tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử, thường là 94 oC 95oC trong vòng 30 giây - 1 phút.
+ Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing). Nhiệt độ được hạ thấp cho
phép các mồi bắt cặp với khuôn, dao động trong khoảng 40 oC - 70oC, tuỳ thuộc
Tm của các mồi sử dụng và kéo dài khoảng 30 giây - 1 phút.


15

+ Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension). Nhiệt độ được
tăng lên 72oC để DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq
polymerase, Tth polymerase, Pfu polymerase,…) hoạt động tổng hợp tốt nhất.
Thời gian phụ thuộc vào độ dài của trình tự chuỗi DNA cần khuếch đại, thường
kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi DNA mới tạo thành sẽ tiếp tục được dùng
làm các DNA nền để tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo.
PCR lồng là kĩ thuật khá tin cậy cho phép phát hiện nhanh sản phẩm PCR.
Người ta sử dụng cặp mồi nằm trong sản phẩm PCR đầu tiên. Sản phẩm PCR
đầu sẽ là khuôn cho phản ứng tiếp theo sử dụng cặp mồi nội phân tử [5,7].

1

A

Khuôn
PCR lần 1
1

2
3

Sản phẩm 1
(mồi 1 và 2)

4

PCR lồng

Sản phẩm 2 (mồi 1 và 4)

Sản phẩm 3 (mồi 3 và 4)


16

Hình 2.2. Sơ đồ của PCR lồng
Do vậy sản phẩm của PCR lần 2 sẽ có kích thước nhỏ hơn sản phẩm lần 1.
Người ta ước tính rằng PCR lồng cho phép làm tăng tới 10 4 lần độ nhậy của kĩ
thuật PCR đơn thuần. Mặc dù sản phẩm PCR lần 1 không rõ (ít hoặc nhiều sản
phẩm phụ) song các khuôn đích sẽ được khuếch đại lên nhiều lần nhờ PCR lồng
tiếp theo. Còn các sản phẩm phụ trong sản phẩm PCR lần 1 sẽ ít có khả năng
gắn với mồi (của PCR lồng lần 2) do vậy sẽ không được khuếch đại.

Hạn chế: khi sản phẩm PCR lần 1 không đặc hiệu song lại đủ lớn và có
thể làm khuôn cho PCR lồng tiếp theo, dẫn đến các sản phẩm gen không được
đặc hiệu cũng sẽ được khuếch đại và làm sai lệch kết quả. Có thể khắc phục
bằng cách pha loãng sản phẩm PCR lần 1 hoặc tinh chế sản phẩm này trước khi
tiến hành PCR lồng lần 2. Thêm vào đó, trong mọi trường hợp, việc tiến hành
song song các mẫu đối chứng là hết sức cần thiết. [7]


17

2.3.3. Phương pháp giải trình tự gen bằng máy tự động
 Định nghĩa:
Giải trình tự gen là phát hiện được thứ tự sắp xếp của 4 loại nucleotid trên
phân tử DNA
 Các phương pháp giải trình tự gen:
Phương pháp hóa học giải trình tự gen:
Do Maxam và Gilbert phát minh năm 1977, với nguyên tắc: trước hết
đánh dấu một đầu của đoạn DNA cần phải giải trình tự bằng một gốc phospho
đồng vị phóng xạ (32P). Sau đó xử lý các đoạn DNA đã đánh dấu này với các
chất hóa học có thể làm biến đổi đặc hiệu một hoặc hai loại base của
nucleotid trên đoạn DNA. Ví dụ: dimethylsulfat để biến đổi Guanin bằng cách
thêm một gốc Methyl ở vị trí nitrogen thứ 7 (N7), hydrazin làm biến đổi
Thymin và Cytosin, hydrazin và NaCl làm biến đổi Cytosin, acid làm biến đổi
Guanin và Adenin, NaOH làm biến đổi Adenin và Cytosin với Adenin ưu tiên
hơn Cytosin. Như vậy, trong giai đoạn này phải dùng ít nhất 4 ống nghiệm và
trong mỗi ống DNA được xử lý với một lượng rất giới hạn của một trong các
chất hóa học nêu trên để mỗi ống nghiệm chỉ có chứa các đoạn DNA mà trên
mỗi đoạn DNA này chỉ có một vị trí nucleotid đặc hiệu với chất hóa học là bị
biến đổi. Các nucleotid bị biến đổi này sẽ được lấy ra khỏi khung đường –
phosphat của đoạn DNA và nhờ đó tách ra được các đoạn mạch đơn có một

đầu đánh dấu 32P và một đầu bị mất phân tử base vì phân tử này đã bị lấy ra
khỏi mạch khung.
Cuối cùng điện di mẫu DNA đã xử lý trong 4 ống nghiệm này trên 4 hàng
của một gel polyacrylamid biến tính để các mạch đơn trong mẫu di chuyển trong
gel không bị biến đổi trong quá trình điện di. Nhờ đó, sau khi hoàn tất điện di,
các mạch đơn sẽ bị dừng tại các vị trí khác nhau, tùy thuộc vào mạch đơn này
dài ngắn khác nhau, theo hàng dọc suốt chiều dài của gel. Áp gel đã điện di này
trên một phim nhạy cảm với tia X, các vị trí dừng lại của các mạch đơn trên gel
điện di sẽ tạo thành các vạch trên phim vì các vị trí này đều bị đánh dấu phóng
xạ do các mạch đơn đều có một đầu được đánh dấu bằng 32P. Từ các vạch trên
phim xạ ký tự ghi này, có thể đọc được trình tự của các nucleotid của đoạn
DNA. Nhược điểm: Phương pháp này rất phức tạp nên ít được sử dụng, thay vào
đó là việc sử dụng phương pháp enzym [5,7].


18

III. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Đối tượng nghiên cứu
Mẫu mô bệnh học 20 bệnh nhân được chẩn đoán xác định Glioblastoma.
Tiêu chuẩn lựa chọn :
- Mẫu mô bệnh học của bệnh nhân đã được chẩn đoán xác định dựa trên kết
quả mô bệnh học, tại khoa Giải phẫu bệnh bệnh viện Việt Đức.
Tiêu chuẩn loại trừ :
- Mẫu mô bệnh học của bệnh nhân có khối u nhưng không được chẩn đoán
thể Glioblastoma.
- Mẫu mô bệnh học của bệnh nhân được chẩn đoán thể Glioblastoma kèm
theo bất kỳ một khối u hay ung thư ở một cơ quan nào khác.
3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian thực hiện nghiên cứu : từ tháng 12 năm 2014 đến tháng 5 năm
2015
- Địa điểm :
 Lấy mẫu mô bệnh học : Khoa Giải phẫu bệnh – Bệnh viện Việt Đức
 Phân tích gen : Trung tâm Gen – Protein – Trường Đại học Y Hà
Nội
3.3. Phương pháp nghiên cứu:
- Thiết kế nghiên cứu
+ Phương pháp: mô tả cắt ngang.


19

+ Nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ sau:

-

Dụng cụ, trang thiết bị hoá chất và phương pháp nghiên cứu

+ Trang thiết bị:
 Máy li tâm Kubota 3300, hoặc máy Centrifuge 5424 R (Eppendorf),
 Máy minispin
 Máy lắc vortex
 Máy đo mật độ quang Nanodrop 1000 (Thermo)
 Máy ủ nhiệt Thermomixer comfort (Eppendorf)
 Máy PCR mastercycle epgradient (eppendorf)
 Máy điện di Mulpid Exu (Japan)
 Tủ an toàn sinh học
 Tủ lạnh bảo quản ở -4oC, -20oC, -80oC
 Ống PCR 0,2 ml, Ống eppendorf 1.5 ml được khử trùng

 Bộ pipet 1000ml, 200μl, 100μl, 20μl, 10 μl
 Đầu côn các loại khử trùng và không có ADNase.
 Giá để ống, Phiến lạnh để mẫu.
 Găng tay, áo choàng, giấy thấm


20

 Bút dạ, đồng hồ bấm giờ, thùng đựng rác.
+ Hoá chất và sinh phẩm:
Bộ hoá chất để tách DNA
 Lysis buffer HD, protein K
 Toluen
 PCI (25/24/1), CI (24/1)
 Ethanol 100%
 CH3COONa
 Ethanol 70% ở nhiệt độ phòng (bảo quản ở 4oC)
 Isopropanol tinh sạch (96 -100%) ở nhiệt độ phòng (bảo quản ở 4oC)
 TE
Bộ hoá chất để PCR
 Goldtaq
 Mồi xuôi
 Mồi ngược
 DNA
 Nước
- Lấy mẫu:
Mẫu mô paraffin.
Tại khoa Giải phẫu bệnh bệnh viện Việt Đức.
- Tách DNA:
Quy trình cụ thể tách DNA từ mẫu mô paraffin:

 Cạo phần ung thư đã được khoanh vùng từ lam paraffin slide
 Thêm 1ml Toluen, Votex, Li tâm 15000 v/3-5 phút, loại bỏ dịch nổi
 Thêm 1ml Ethanol 100%, Votex, Li tâm 15000v/ 3-5 phút


21










Loại bỏ dịch nổi. Để khô cặn 56 độ C
Thêm 650 µl Lysis buffer HD + 5µl Protein K
Ủ 56 độ C
Thêm 500 µl PCI (25:24:1).
Vontex, ly tâm 15000 v/20 phút/4oC, sau đó thu lớp trên trong suốt.
Thêm 500 µl CI (24:1).
Vontex, ly tâm 15000 v/10 phút/4oC, sau đó thu lớp trên trong suốt.
Thêm: 1000 µl ethanol 100% và 40 µl CH3COONa 3M, sau đó lắc đều và
để ở -20oC trong 2 giờ.

Đo mật độ quang học
- Mục đích: Xác định nồng độ và đo độ tinh sạch của mẫu DNA tổng số.
- Nguyên lý:
Acid nucleic có phổ hấp phụ cực đại ở bước sóng 260nm là do sự có mặt

của base purin và base pyrimidin. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260nm
(OD260nm) của các mẫu cho phép xác định nồng độ acid nucleic có trong mẫu
nghiên cứu.
Protein hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 280nm do sự có mặt của
các acid amin nhân thơm và dị vòng (tyrosin, tryptophan phần nhỏ nhờ
phenylalanine).
Dựa vào tỷ lệ OD260nm/OD280nm để kiểm tra độ tinh sạch của DNA. Nếu
OD260nm/OD280nm = 1,8 - 2 thì DNA được coi là tinh sạch.
- Tiến hành: Lấy 1,5 µl DNA tổng số tách được đo trên máy Nanodrop.
Trước khi đo tiến hành trừ trắng với dung dịch pha DNA (TE hoặc nước cất).
Khuếch đại đoạn gen Tp53 bằng kỹ thuật PCR lồng.
- Tiến hành: DNA sau khi được tách chiết và kiểm tra nồng độ, độ tinh
sạch đạt yêu cầu được sử dụng làm khuôn mẫu để khuyếch đại đoạn gen TP53
với cặp mồi đặc hiệu bằng máy PCR Eppendorf. Tất cả các mẫu DNA được
tách chiết đều được pha loãng về nồng độ khoảng 50 ng/μl để thực hiện phản
ứng PCR.


22

Bảng 2.1.Thành phần của phản ứng
STT
1
2
3
4
5

Thành phần
Nước cất 2 lần

GOLTAQ 2x
Mồi xuôi (2,5 pmol/ μl)
Mồi ngược (2,5 pmol/ μl)
DNA (50 ng/ μl)
Tổng thể tích

Thể tích
1μl
5 μl
1,5μl
1,5μl
1 μl
10.0 μl

- Chu trình nhiệt:
Biến tính:

94 oC trong 5 phút

Biến tính:

95 oC trong 30 giây

Gắn mồi:

57 oC trong 30 giây

Kéo dài:

72 oC trong 30 giây

Kéo dài:

72 oC trong 5 phút

Bảo quản:

15 oC

x 40chu kỳ

- Đoạn gen được khuyếch đại với cặp mồi đặc hiệu là một đoạn dài 560 bp.
- Sản phẩm PCR được sử dụng làm khuôn cho phản ứng tiếp theo-PCR lồng.
- Sản phẩm sau đó được điện di kiểm tra.
Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose.
- Mục đích: Kiểm tra chất lượng và ước lượng nồng độ DNA tách chiết
được. Bên cạnh đó điện di DNA còn là phương pháp đánh giá kết quả phản ứng
PCR, xem đoạn gen được khuyếch đại có đúng kích thước, có đặc hiệu không.
- Nguyên lý: Điện di là hiện tượng các phân tử mang điện dịch chuyển
trong điện trường dưới tác dụng của dòng điện, phân tử tích điện âm di chuyển
về cực (+) và phân tử tích điện dương dịch chuyển về cực (-).
Acid nucleic là phân tử mang điện tích âm nhờ khung phosphat của mình,
dưới tác dụng của dòng điện một chiều acid nucleic sẽ di chuyển về cực dương.
Các đoạn DNA có kích thước khác nhau sẽ di chuyển khác nhau. Tùy mục đích,
có thể sử dụng các chất giá khác nhau để điện di DNA, phổ biến nhất là sử dụng
gel agarose.


23

Một phần sản phẩm PCR sau khi điện di, được nhuộm với ethidium
bromide. Các phân tử ethidium bromide sẽ xen vào giữa các base của nucleic
acid, khi chụp dưới ánh sáng tử ngoại sẽ cho ta hình ảnh DNA.
Dựa trên những hình ảnh thu được và so sánh marker tương ứng với độ
dài gen đích ta biết được sản phẩm PCR có đạt yêu cầu hay không. Phản ứng
PCR đạt yêu cầu khi vạch điện di rõ nét, băng gọn, đúng kích thước đoạn cần
khuyếch đại chứng tỏ phản ứng PCR tối ưu. Sản phẩm PCR có thể được sử dụng
ở các công đoạn tiếp theo (giải trình tự…)
- Tiến hành: gồm các bước sau:
Đổ gel

Tra mẫu

Chạy điện di

Nhuộm gel

Chụp ảnh

Đánh giá kết quả

+ Đổ gel agarose 1,5%:
 Chuẩn bị khay đổ gel và lược: Tùy vào số lượng mẫu DNA cần kiểm tra
mà ta chọn loại khay và răng lược thích hợp.
 Cho 15 ml TBE 1X + 0.225g agarose (loại 6 giếng) hoặc 25 ml TBE 1X +
0.375g agarose (loại 12 giếng) sau đó đun hỗn hợp bằng lò vi sóng trong
1,5 phút - 2 phút cho agarose tan hoàn toàn.
 Đổ gel vào khay điện di đã được đặt sẵn lược để tạo giếng.
 Để 30 - 45 phút cho tới khi gel đông đặc hoàn toàn. Bản gel điện di phải
có độ dày 3-4 mm.

 Sau đó, cho gel đã đông đặc vào bể điện di, đổ đệm TBE vào bể điện di
sao cho bản gel được ngâm chìm hoàn toàn trong bể điện di.
+ Tra mẫu và marker vào giếng:
 Tra 3 µl marker loại 100 bp vào 1 giếng.
 Với các giếng còn lại, mỗi giếng tra 3 µl sản phẩm DNA tương ứng.
+ Chạy điện di:
 Cài đặt máy và tiến hành điện di với hiệu điện thế 95V trong 30 phút.
+ Nhuộm bản gel:
 Ngâm bản gel trong dung dịch ethidium bromide 1 µg/ml trong 5'.
 Sau đó rửa bản gel 2 lần để loại bỏ phần ethidium bromide dư và tiến
hành chụp ảnh.
+ Quan sát và chụp ảnh:
 Cho bản gel vào máy chụp ảnh tử ngoại tự động, quan sát các băng sáng
của DNA xuất hiện trên bản gel và chụp hình lưu trữ kết quả.


24

+ Đánh giá kết quả : yêu cầu các băng rõ nét, phân tách rõ ràng, kích thước đo
trên thang chuẩn tương ứng với kích thước tính toán trên lý thuyết.
Giải trình tự gen
1. TP53
- DNA sau khi được tách chiết từ mô ung thư được khuếch đại từng exon từ 6-8
với 2 cặp mồi đặc hiệu [11].
Exons 5, 6: Mồi xuôi 5′-GTTGCAGGAGGTGCTTACG-3′53
Mồi ngược 5′-CATGGGGTTATAGGGAGGTC-3′
Exons 8, 9 Mồi xuôi 5′-GACAAGGGTGGTTGGGAGTAG-3′56
Mồi ngược 5′-CCAGGAGCCATTGTCTTTGAG-3′
- Giải trình tự gen với các mồi trên
- Thống kê phân tích số liệu:

3.4. Vấn đề đạo đức của đề tài
- Các đối tượng tham gia nghiên cứu là hoàn toàn tự nguyện và có quyền
rút lui khỏi nghiên cứu khi không muốn tham gia nghiên cứu.
- Các thông tin liên quan đến bệnh nhân được đảm bảo bí mật.
- Các kỹ thuật thao tác trên bệnh nhân được bảo đảm đúng chuyên môn.
- Đề tài nghiên cứu này được thực hiện hoàn toàn vì mục đích khoa học chứ
không vì mục đích nào khác.

IV. KẾT QUẢ
4.1. Một số đặc điểm bệnh nhân trong nghiên cứu
4.1.1. Đặc điểm về tuổi
Bảng 4.1. Đặc điểm về nhóm tuổi của bệnh nhân
Độ tuổi
Số lượng

<50 tuổi
9

>50 tuổi
11

Tổng số BN
20


25

Tỷ lệ

9/20

11/20

Nhận xét: Trong 20 bệnh nhân Glioblastoma có 9/10 bệnh nhân dưới 50
tuổi. Còn lại 11/20 bệnh nhân có độ tuổi trên 50 tuổi. Độ tuổi trung bình của
nhóm bệnh nhân là 51,6 tuổi (giới hạn từ 32 đến 70 tuổi).
4.2. Áp dụng qui trình xác định đột biến gen
4.2.1. Kết quả tách chiết DNA
Tất cả các mẫu mô được tách chiết theo quy trình chuẩn , kiểm tra nồng
độ và độ tinh sạch bằng phương pháp đo mật độ quang(OD) trên máy NanoDrop
1000. Kết quả được trình bày ở Bảng 4.2, và hình ảnh biểu đồ biểu diễn một lần
đo OD trên máy NanoDrop 1000 (Thermo) được thể hiện ở bảng 4.2
Bảng 4.2. Kết quả chiết tách DNA
Mẫu mô

GB1
GB2
GB3
GB4
GB5
GB6
GB7
GB8
GB9
GB10

Nồng độ
DNA
(ng/µl)
727,3

1575,4
900,8
1437,1
364,1
2312,8
206
1147,2
498,9
198,9

Độ tinh sạch Mẫu mô
(A260/A280)
1,9
1,97
1,96
2
1,94
1,92
1,93
1,95
1,92
1,82

GB11
GB12
GB13
GB14
GB15
GB16
GB17

GB18
GB19
GB20

Nồng độ
DNA
(ng/µl)
875,3
1323,4
1248,5
402,3
2026,1
2180
1714,4
871,7
243,4
685

Độ tinh
sạch
(A260/A280)
1,91
1,94
2
1,96
1,99
2
1,83
1,99
1,94

1,96

Nhận xét: DNA được tách chiết từ mẫu mô được đo bằng máy quang phổ
nano Drop 1000 ở các bước song 260 nm và 280 nm, kết quả thu được như sau,
hàm lượng DNA chiết tách được từ 206 – 2312.8 ng/µl trung bình là 1046.93
ng/µl, tỉ số OD260nm/280nm = 1,82 – 2, trung bình là 1.94 ng/µl. Như vậy sản phẩm
tách chiết DNA được sử dụng cho các kĩ thuật PCR và PCR lồng là đạt yêu cầu.
- Kiểm tra chất lượng DNA tách từ mẫu mô bằng phenol/chloroform:
Phương pháp đo quang: Nồng độ và chất lượng DNA đạt tiêu chuẩn