GIÁ TRỊ của PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH tự GEN THẾ hệ mới PHÁT HIỆN LỆCH bội NHIỄM sắc THỂ THAI BẰNG DNA THAI tự DO TRONG máu mẹ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BỘ Y TẾ

HOÀNG HẢI YẾN

GIÁ TRỊ CỦA PHƯƠNG PHÁP
GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI
PHÁT HIỆN LỆCH BỘI NHIỄM SẮC
THỂ THAI BẰNG DNA THAI TỰ DO
TRONG MÁU MẸ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BỘ Y TẾ

HOÀNG HẢI YẾN

GIÁ TRỊ CỦA PHƯƠNG PHÁP
GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI
PHÁT HIỆN LỆCH BỘI NHIỄM SẮC
THỂ THAI BẰNG DNA THAI TỰ DO
TRONG MÁU MẸ
Chuyên ngành : Hóa sinh

Mã số
: 62720112
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
GS.TS. TẠ THÀNH VĂN
PGS.TS. NGUYỄN DUY ÁNH

HÀ NỘI - 2019


LỜI CAM ĐOAN
Tôi là Hoàng Hải Yến, nghiên cứu sinh khóa 34, Trường Đại học Y Hà
Nội, chuyên ngành Hóa sinh Y học, xin cam đoan:
1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn
của GS.TS. Tạ Thành Văn và PGS.TS. Nguyễn Duy Ánh.
2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã
được công bố tại Việt Nam.
3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung
thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi
nghiên cứu. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về
những cam kết này.
Hà Nội, ngày 31 tháng 07 năm 2019
Người viết cam đoan

Hoàng Hải Yến

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AF

Amniotic fluid

AFP

Alfa feto-protein

BoBs

BACs-on-Beads

BP

Base pair

cffDNA

Cell free fetal DNA

CMA

Chromosomal microarray-based analysis

CSS

Chromosome-selective sequencing


CV

Chrionic villus

DNA

Deoxyribonucleic acid

DTBS

Dị tật bẩm sinh

FISH

Fluorescent in situ hybridization

NGS

Next generation sequencing

NIPS

Noninvasive prenatal testing

SNPs

Single nucleotide polymorphisms

NST

Nhiễm sắc thể

PAPP-A

Pregnancy - associated plasma protein A

PGD

Preimplantation Genetic Diagnosis

PN BoBs

Prenatal-BoBs

uE3

Unconjugated Estriol - Estriol không liên hợp

βhCG

Beta human chronic gonadotropin

MPS

Massively parallel sequencing

MPSS

Massively parallel shotgun sequencing

NCVs

Normalized chromosome values

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................1
Chương 1: TỔNG QUAN.................................................................................3
1.1. Bất thường nhiễm sắc thể thai nhi...........................................................3
1.1.1. Tần suất xuất hiện.............................................................................3
1.1.2. Hậu quả bất thường nhiễm sắc thể....................................................4
1.1.3. Các dạng lệch bội nhiễm thể thường gặp trong sàng lọc và chẩn
đoán trước sinh..................................................................................5


1.2. Tổng quan về một số phương pháp sàng lọc, chẩn đoán trước sinh phát
hiện bất thường NST.............................................................................11
1.2.1. Các phương chẩn đoán trước sinh...................................................11
1.2.2. Các phương pháp sàng lọc truyền thống.........................................15
1.3. Tổng quan về DNA thai tự do trong máu mẹ........................................20
1.3.1. Lịch sử phát hiện DNA tự do trong máu mẹ...................................20
1.3.2. Nguồn gốc DNA huyết tương........................................................21
1.3.3. Nguồn gốc và đặc điểm DNA thai tự do (cffDNA) trong huyết tương mẹ....22
1.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến nồng độ cffDNA...................................23
1.3.5. Các phương pháp tiếp cận tin sinh học ước tính nồng độ cffDNA. 23
1.3.6. Ứng dụng lâm sàng của cffDNA trong huyết tương mẹ.................25
1.4. Giải trình tự gen thế hệ mới (Next-Generation Sequencing- NGS) trong
xét nghiệm NIPS...................................................................................28
1.4.1. Nguyên lý........................................................................................28
1.4.2. Một số hệ thống máy giải trình tự thế hệ mới phổ biến trên thế giới.....29
1.4.3. Ứng dụng phương pháp giải trình tự thế hệ mới trong sàng lọc trước
sinh không xâm lấn.........................................................................30
1.4.4. Nghiên cứu NIPS bằng phương pháp NGS phân tích cffDNA tại Việt Nam.....44
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................45

2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................45
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn........................................................................45
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ...........................................................................45
2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................46
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu.........................................................................46
2.2.2. Cỡ mẫu nghiên cứu.........................................................................46
2.2.3. Quy trình nghiên cứu.......................................................................47
2.3. Phương tiện nghiên cứu........................................................................50
2.3.1. Máy móc và dụng cụ.......................................................................50
2.3.2. Hóa chất...........................................................................................50
2.4. Các biến số nghiên cứu.........................................................................51


2.4.1. Biến số thai phụ...............................................................................51
2.4.2. Kết quả xét nghiệm sàng lọc truyền thống: siêu âm hình thái,
combined test, triple test.................................................................52
2.4.3. Kêt quả giải trình tự........................................................................52
2.4.4. Kết quả xét nghiệm chẩn đoán: karyotype......................................52
2.4.5. Theo dõi lâm sàng thai hoặc theo dõi sau sinh: sau sinh 1 tháng....52
2.5. Các tiêu chuẩn đánh giá trong nghiên cứu............................................53
2.5.1. Đánh giá chất lượng giải trình tự....................................................53
2.5.2. Kết quả phân tích NST từ tế bào ối.................................................55
2.5.3. Theo dõi sau sinh.............................................................................55
2.6. Sơ đồ nghiên cứu (Sơ đồ 2.1):..............................................................56
2.7. Địa điểm và thời gian nghiên cứu.........................................................57
2.8. Phương pháp tính toán và xử lý số liệu.................................................57
2.9. Đạo đức trong nghiên cứu của đề tài.....................................................58
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU...........................................................59
3.1. Một số đặc điểm của đối tượng nghiên cứu..........................................59
3.1.1. Phân bố tuổi ở thai phụ trong nghiên cứu.......................................59

3.1.2. Phân bố nghề nghiệp và địa dư.......................................................60
3.1.3. Phân bố theo địa dư.........................................................................60
3.1.4. Đặc điểm cân nặng, chỉ số khối lượng cơ thể thai phụ...................61
3.1.5. Tuổi thai của thai phụ tại thời điểm làm xét nghiệm NIPS.............61
3.1.6. Đặc điểm sàng lọc trước sinh truyền thống của thai phụ................62
3.2. Ứng dụng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới phát hiện lệch bội
NST 21, 18, 13, X, Y bằng DNA thai tự do (cffDNA) trong huyết tương
mẹ..........................................................................................................65
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tự do (cfDNA) và chuẩn bị thư viện........65
3.2.2. Kết quả chất lượng giải trình tự......................................................67
3.2.3. Kết quả giải trình tự........................................................................69
3.3. Xác định tỷ lệ lệch bội NST 21, 18, 13, X, Y bằng phương pháp giải
trình tự gen thế hệ mới phân tích DNA thai tự do trong máu mẹ.........74


3.3.1. Tỷ lệ thai phụ dương tính với lệch bội NST....................................74
3.3.2. Kết quả NIPS dương tính liên quan đến yếu tố nguy cơ.................75
3.4. Đánh giá giá trị của phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới phát hiện
lệch bội NST thai bằng DNA thai tự do trong huyết tương mẹ............77
3.4.1. Kết quả phân tích NST từ tế bào nuôi cấy ối trên mẫu có NIPS dương tính.....77
3.4.2. Kết quả chẩn đoán lệch bội NST.....................................................80
3.4.3. Các trường hợp kết quả NIPS không phù hợp với kết quả chẩn đoán
xác định bằng nuôi cấy dịch ối........................................................82
3.4.4. Giá trị của cffDNA trong xét nghiệm NIPS....................................83
3.4.5. Giá trị của NIPS sàng lọc lệch bội..................................................89
Chương 4: BÀN LUẬN..................................................................................91
4.1. Đặc điểm chung của các đối tượng nghiên cứu....................................91
4.2. Ứng dụng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới phát hiện lệch bội
NST 21, 18, 13 và NST giới tính bằng DNA thai tự do trong huyết
tương mẹ...............................................................................................95

4.2.1. Kết quả tách huyết tương, tách chiết cffDNA và chuẩn bị thư viện......95
4.2.2. Kết quả chất lượng giải trình tự......................................................99
4.2.3. Kết quả giải trình tự chung............................................................103
4.3. Xác định tỷ lệ lệch bội NST 21, 18, 13, X, Y bằng phương pháp giải
trình tự gen thế hệ mới sử dụng DNA thai tự do trong máu mẹ..........111
4.3.1. Tỷ lệ lệch bội NST thai..................................................................111
4.3.2. Kết quả NIPS dương tính lệch bội NST 21, 18, 13, và giới tính liên
quan đến yếu tố nguy cơ................................................................112
4.4. Đánh giá giá trị của phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới phát hiện
lệch bội NST thai bằng DNA thai tự do trong huyết tương mẹ...........116
4.4.1. Chẩn đoán thai lệch bội NST bằng phương pháp di truyền tế bào phân tích NST trên mẫu có kết quả NIPS dương tính..................117
4.4.2.Kết quả chẩn đoán trong trường hợp NIPS dương tính và trường hợp
đặc biệt..........................................................................................120
4.4.3. Giá trị của cffDNA trong xét nghiệm NIPS..................................125


4.4.4. Giá trị của NIPS sàng lọc lệch bội NST 21, 18, 13 và NST giới tính.134
KẾT LUẬN...................................................................................................136
KIẾN NGHỊ..................................................................................................137
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1.

Tỷ lệ phát hiện và tỷ lệ dương tính giả trisomy 21......................15

Bảng 1.2.

Các thử nghiệm lâm sàng của NIPS ...........................................37

Bảng 1.3.

Kết quả phát hiện trisomy 21 theo tuổi mẹ và nguy cơ*.............39

Bảng 1.4.

Kết quả xét nghiệm phát hiện trisomy 18, 13*............................39

Bảng 1.5.

Kết quả sàng lọc trisomy 21, 18, 13 trên quần thể dân số chung
và nguy cơ cao.............................................................................42

Bảng 2.1.

Giá trị z-score và lệch bội NST 13, 18, 21..................................54

Bảng 2.2.

Giá trị z-score và lệch bội NST giới tính nam.............................54

Bảng 2.3.

Giá trị z-score và lệch bội NST giới tính nữ...............................54

Bảng 2.4.

Đánh giá kết quả xét nghiệm NIPS.............................................57

Bảng 3.1.

Đặc điểm tuổi thai phụ trong nghiên cứu....................................59

Bảng 3.2.

Đặc điểm cân nặng, chỉ số khối lượng cơ thể thai phụ................61

Bảng 3.3.

Tuổi thai tại thời điểm làm xét nghiệm NIPS..............................61

Bảng 3.4.

Đặc điểm sàng lọc trước sinh truyền thống của thai phụ............62

Bảng 3.5.

Kết quả siêu âm bất thường của thai phụ....................................62

Bảng 3.6.

Đặc điểm độ dày da gáy của thai nhi...........................................63

Bảng 3.7.

Kết quả sàng lọc huyết thanh truyền thống.................................64

Bảng 3.8.

Kết quả sàng lọc huyết thanh nguy cơ cao trisomy 21................64

Bảng 3.9.

Kết quả sàng lọc huyết thanh nguy cơ cao trisomy 18................65

Bảng 3.10. Nồng độ DNA tự do và thư viện..................................................65
Bảng 3.11. Kết quả chất lượng thư viện ISP..................................................67
Bảng 3.12. Chất lượng sắp gióng cột của đoạn đọc với trình tự hg19...........68
Bảng 3.13. Tỷ lệ cffDNA<3.5% trên tổng số mẫu........................................69
Bảng 3.14. Kết quả giải trình tự chung..........................................................70
Bảng 3.15. Kết quả hệ số z-score...................................................................70
Bảng 3.16. Tỷ lệ thai phụ dương tính với lệch bội NST................................74
Bảng 3.17. Tỷ lệ giới tính thai trong nghiên cứu...........................................74
Bảng 3.18: Phân loại bất thường NST theo kết quả NIPS.............................74
Bảng 3.19. NIPS dương tính với từng loại lệch bội NST liên quan đến yếu tố
nguy cơ........................................................................................75
Bảng 3.20. NIPS dương tính theo tuổi mẹ.....................................................77
Bảng 3.21. Kết quả phân tích NST từ tế bào ối nuôi cấy...............................77
Bảng 3.22. Kết quả chẩn đoán lệch bội NST.................................................80
Bảng 3.23. Kết quả chẩn đoán lệch bội NST giới tính..................................81
Bảng 3.24. Các trường hợp kết quả NIPS không phù hợp.............................82
Bảng 3.25. Tỷ lệ cffDNA trung bình ở nhóm thai phụ bình thường...............83
Bảng 3.26. Độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm NIPS............................89
Bảng 4.1

Tỷ lệ cffDNA trong huyết tương thai phụ qua các nghiên cứu. 127

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Phân bố nghề nghiệp của thai phụ..............................................60
Biểu đồ 3.2. Phân bố theo địa dư....................................................................60
Biểu đồ 3.3. Phân bố z-score NST 21.............................................................72
Biểu đồ 3.4. Phân bố z-score NST 18.............................................................72


Biểu đồ 3.5. Phân bố z-score NST 13.............................................................73
Biểu đồ 3.6. Phân bố z-score NST X..............................................................73
Biểu đồ 3.7. cffDNA và tuần thai....................................................................84
Biểu đồ 3.8. cffDNA và tuổi mẹ......................................................................85
Biểu đồ 3.9. cffDNA và cân nặng (: r = -0.1604; p = 0,000)..........................85
Biểu đồ 3.10. cffDNA và BMI (r = - 0.1512; p = 0,000)................................86
Biểu đồ 3.11. cffDNA và trisomy 18, 21.........................................................86
Biểu đồ 3.12. Tương quan giữa cffDNA và z-score NST 21..........................87
Biểu đồ 3.13. Tương quan giữa cffDNA và z-score NST 18..........................87
Biểu đồ 3.14. Tương quan giữa cffDNA và z-score NST 13..........................88
Biểu đồ 3.15. Tương quan giữa cffDNA và z-score lệch bội NST giới tính...88

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Tỉ lệ bất thường các NST được chẩn đoán khi trẻ <1 tuổi................4
Hình 1.2. Trẻ mắc hội chứng Down (Trisomy 21)............................................6
Hình 1.3. Trẻ mắc hội chứng Edwards..............................................................6
Hình 1.4. Trẻ mắc hội chứng Patau...................................................................7
Hình 1.5. Trẻ mắc hội chứng Turner và karyotype 45,X...................................9
Hình 1.6. Chọc hút dịch ối dưới hướng dẫn của siêu âm................................12
Hình 1.7. Lấy mẫu gai rau dưới hướng dẫn của siêu âm................................12
Hình1.8 . DNA tự do thai trong máu mẹ........................................................21
Hình 1.9. Các cách tiếp cận để xác định hàm lượng cffDNA.........................24
Hình 1.10. Giải trình tự trên hệ thống Illumina...............................................30

Hình 1.11. Giải trình tự trên hệ thống Ion Torrent..........................................30
Hình 1.12. Biểu đồ phân bố chuẩn của hệ số z-score......................................32
Hình 1.13. Giải trình tự MPS phát hiện lệch bội.............................................33
Hình 2.1. Các bước chính trong quá trình tạo thư viện...................................49


Hình 2.2. Các bước chính chuẩn bị mẫu giải trình tự trên Ion Chef...............49
Hình 2.3. Giải trình tự trên máy Proton..........................................................49
Hình 3.1. Kết quả kiểm tra chất lượng thư viện..............................................66
Hình 3.2. Hiệu quả nạp mẫu vào chip giải trình tự.........................................67
Hình 3.3. Kết quả phân tích NST từ tế bào ối nuôi cấy của thai phụ N.T.K.L.....79
Hình 3.4. Kết quả phân tích NST từ tế bào ối nuôi cấy của thai phụ N.T.N.L.
chuyển đoạn không cân bằng giữa NST 18 và 21 tạo ra trisomy
nhánh dài NST 18...........................................................................80


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bất thường nhiễm sắc thể (NST) thai xảy ra khoảng 1/150 trẻ sinh sống,
là một trong số những nguyên nhân hàng đầu gây nên tử vong và bệnh tật cho
trẻ sơ sinh trên toàn thế giới [1],[2]. Chiếm khoảng 83% của những bất
thường này là do lệch bội NST 21, 18, 13 và NST giới tính gây ra hội chứng
Down, Edwards, Patau, Turner...., [3].
Các phương pháp sàng lọc trước sinh truyền thống phát hiện lệch bội NST
bao gồm siêu âm hình thái và phân tích huyết thanh mẹ trong thai kỳ 1 và thai
kỳ 2. Tuy nhiên, tỷ lệ phát hiện lệch bội NST 21 với ngưỡng nguy cơ là 1/250
dao động từ 30-95% với tỷ lệ dương tính giả trên 5% tùy thuộc vào phương
pháp sàng lọc được sử dụng [4]. Để chẩn đoán xác định thì các thai phụ có
nguy cơ cao sẽ được thực hiện các thủ thuật xâm lấn như sinh thiết gai rau hoặc

chọc hút dịch ối để khảo sát số lượng NST bằng các kỹ thuật Karyotype, QFPCR, FISH, Prenatal BoBs, MLPA. Các thủ thuật xâm lấn này có thể gây mất
thai với tỷ lệ là 0.5 - 1% tùy theo phương pháp [5]. Do đó, rất cần có những
phương pháp sàng lọc với tỷ lệ dương tính giả thấp đồng thời tỷ lệ phát hiện
cao hơn, thai phụ không cần chịu thủ thuật xâm lấn, tránh được nguy cơ ảnh
hưởng đến mẹ và thai [6].
Việc phát hiện DNA thai tự do (cffDNA) có nguồn gốc từ rau thai lưu hành
trong máu mẹ vào năm 1997 [7] đã mở ra khả năng thực hiện xét nghiệm sàng
lọc trước sinh không xâm lấn (Noninvasive prenatal screening - NIPS) bằng
phương pháp giải trình tự thế hệ mới (Next Generation Sequencing - NGS) [6]
giúp các nhà nghiên cứu có thể sàng lọc sớm thai trên nhiều phương diện khác
nhau, điển hình như: xác định sớm giới tính thai giúp tiên lượng khả năng mắc
các bệnh do NST liên kết với giới tính; nguy cơ mắc các bệnh di truyền của thai
trong những gia đình có nguy cơ cao, khảo sát yếu tố RhesusD, xác định nguy cơ


2
tiền sản giật, trong đó nổi bật là ứng dụng phân tích cffDNA trong sàng lọc sớm
lệch bội NST [6]. Đây được xem là một phát hiện mang tính bước ngoặt, do việc
lấy mẫu và phân tích cffDNA không đòi hỏi tính can thiệp sâu, giảm thiểu nguy
cơ cũng như các biến chứng trên thai phụ và thai nhi. Hơn nữa, sàng lọc trước
sinh không xâm lấn có tỷ lệ phát hiện trisomy 21 gây hội chứng Down trên 99%
với tỷ lệ dương tính giả thấp dưới 1% [8].
Hiện tại, việc ứng dụng giải trình tự thế hệ mới phát hiện lệch bội NST
thai trong sàng lọc trước sinh đang là hướng đi mới và được áp dụng rộng rãi
trên toàn thế giới. Với mong muốn tìm hiểu rõ hơn về giá trị của xét nghiệm
sàng lọc trước sinh không xâm lấn bằng phương pháp giải trình tự thế hệ mới
trong lĩnh vực sản khoa, giúp thầy thuốc lâm sàng có thêm một phương pháp
sàng lọc sớm bất thường NST thai, nhằm giảm thiểu tối đa nguy cơ cũng như
các biến chứng trên mẹ và thai do việc thực hiện các thủ thuật xâm lấn, chúng
tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu giá trị của phương pháp giải

trình tự gen thế hệ mới phát hiện lệch bội nhiễm sắc thể thai bằng DNA
thai tự do trong máu mẹ” với 3 mục tiêu:
1. Ứng dụng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới phát hiện lệch bội
NST 21, 18, 13, X, Y bằng DNA thai tự do trong máu mẹ.
2. Xác định tỷ lệ lệch bội NST 21, 18, 13, X, Y bằng phương pháp giải
trình tự gen thế hệ mới sử dụng DNA thai tự do trong máu mẹ.
3. Đánh giá giá trị của phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới phát
hiện lệch bội NST thai bằng DNA thai tự do trong máu mẹ.


3

Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Bất thường nhiễm sắc thể thai nhi
1.1.1. Tần suất xuất hiện
Bất thường nhiễm sắc thể chiếm khoảng 15% các dị tật bẩm sinh được
chẩn đoán trước 1 tuổi tại châu Âu và liên quan đến 25% trường hợp tử vong
chu sinh do dị tật bẩm sinh [9]. Kết quả trong một nghiên cứu 34.910 trẻ sinh
sống cho đến 13 tuổi tại Đan Mạch cho thấy tần suất bất thường NST thường
và NST giới tính là 1/118 hay 8.45/1000 trẻ sống. Tần suất bất thường NST
thường là 1/164 và NST giới tính là 1/426 trẻ sinh sống, trong đó hội chứng
Down chiếm tỷ lệ 1/592, chuyển đoạn tương hỗ là 1/712 trẻ sinh sống, hội
chứng Klinerfelter chiếm tỷ lệ 1/576 trẻ trai, 47,XYY là 1/851 trẻ trai, trisomy
X là 1/947 trẻ gái và hội chứng Turner là 1/1893 trẻ gái [10]. Nghiên cứu tại
cộng đồng các nước ở Châu Âu năm 2004 cho thấy khoảng 1/4 trường hợp tử
vong sớm ở trẻ sơ sinh là do dị tật bẩm sinh trong đó 18% là bất thường NST.
Bất thường NST phổ biến nhất là trisomy 21, 18 và 13, và bất thường NST giới
tính [11]. Trong nghiên cứu từ 10.323 trường hợp được chẩn đoán trước sinh
hoặc trước 1 tuổi từ 16 trung tâm từ 11 quốc gia tại châu Âu năm 2000 đến

năm 2006. Các trường hợp bất thường NST bao gồm các trường hợp sinh con
sống, thai chết khi tuổi thai trên 20 tuần hoặc chấm dứt thai kỳ vì dị tật thai nhi.
Kết quả cho thấy tỷ lệ sinh là 43,8/10.000 ca sinh, trong đó có 7.335 trường
hợp mắc trisomy 21, 18 hoặc 13 với tần suất là 23; 5.9 và 2.3/10.000, lần lượt
là 53% trisomy 21, 13% trisomy 18 và 5% trisomy 13. Trisomy X/Y được báo
cáo có 473 trường hợp chiếm tỷ lệ 5% và 778 trường hợp (8%) monosomy X
với tần suất là 2 và 3.3/10.000. Chỉ có 1737 trường hợp bất thường NST hiếm
gặp (17%) tần suất là 7.4/10.000 bao gồm tam bội, trisomy các NST khác,
chuyển đoạn không cân bằng, mất đoạn và nhân đoạn (Hình 1.1) [3].


4
13.00%
5.00% Trisomy 21
4.00%
Trisomy 18

8.00%

53.00%

Trisomy 13
X/Y trisomy

17.00%

45,X
Other

Hình 1.1. Tỉ lệ bất thường các NST được chẩn đoán khi trẻ <1 tuổi

Tại Trung Quốc, mỗi năm có khoảng 16 triệu trẻ mới sinh, trong đó dị tật
bẩm sinh chiếm khoảng 4-6%. Bất thường nhiễm sắc thể chiếm tỷ lệ 1/160 trẻ
sinh sống tại Mỹ và 1/60 tại Trung Quốc [11],[12]. Thống kê của tổng cục dân
số cho thấy, mỗi năm Việt Nam có khoảng gần 1.5 triệu trẻ em mới được sinh
ra, trong đó tỷ lệ dị tật bẩm sinh chiếm khoảng 1,5-2% trẻ sinh sống. Đáng
lưu ý, mỗi năm có khoảng 1.400-1.800 trẻ bị mắc bệnh Down, khoảng 200250 trẻ mắc hội chứng Edwards. Theo nghiên cứu của Phùng Như Toàn
(2003) nuôi cấy tế bào ối cho 213 trường hợp phát hiện 24 trường hợp bất
thường NST (11,2%) [13]. Hoàng Thị Ngọc Lan, Nguyễn Việt Hùng, Trịnh
Văn Bảo, Trần Thị Thanh Hương (2004) phát hiện 7 mẫu có bất thường số
lượng NST trong tổng số 40 trường hợp chọc ối chiếm tỷ lệ 17.5% [14], Trần
Danh Cường (2005) báo cáo kết quả nuôi cấy tế bào ối trên 95 trường hợp
phát hiện 11 trường hợp bất thường NST (11,6%), trong đó lệch bội NST 21
chiếm 50,79% [15].
1.1.2. Hậu quả bất thường nhiễm sắc thể
Mặc dù có rất nhiều loại bất thường nhiễm sắc thể thường gặp ở thai
nhi nhưng hầu hết đều có những hậu quả như gây sẩy thai ngẫu nhiên, gây ra
các dị tật bẩm sinh như tình trạng phát triển chậm về tâm thần và vận động, có


5
những biểu hiện bất thường đặc thù trên khuôn mặt, lùn có thể kèm theo nhẹ
cân, gia tăng tần số của các dị tật bẩm sinh, đặc biệt là các dị tật bẩm sinh gây
gánh nặng cho gia đình và xã hội [16].
1.1.3. Các dạng lệch bội nhiễm thể thường gặp trong sàng lọc và chẩn đoán
trước sinh
1.1.3.1. Hội chứng Down hay ba nhiễm sắc thể 21 (trisomy 21)
Hội chứng Down được đặt theo tên của John Landon Down, một bác sỹ
người Anh đã mô tả hội chứng này vào năm 1866. Trước đó, hội chứng này
đã được mô tả bởi J.E.D.Esquirol năm 1838 và Edouart Seguin năm 1844.
Phải đến năm 1959, hội chứng Down mới được xác định là do bất thường về

số lượng NST 21 bởi bác sỹ J. Lejeune.
Hội chứng Down (47,XX,+21; 47,XY,+21) là bất thường bẩm sinh hay
gặp trong các bệnh rối loạn NST. Tỷ lệ khoảng 1/700 trẻ đẻ sống, 1/400 thai
nhi ở tuổi thai 12 tuần, tỷ lệ bệnh theo giới là 3 nam/2 nữ [15]. Nguyên nhân
gây hội chứng Down có thể do rối loạn số lượng, cấu trúc NST 21 dạng thuần
hay dạng khảm. Theo Zoltán Papp thì 95% hội chứng Down là đột biến số
lượng NST 21 dạng thuần; 4% do chuyển đoạn; 1% là thể khảm [16].
Hội chứng Down có tỷ lệ tử vong cao, khoảng 20% trẻ mắc hội chứng
Down sinh ra chết trước 5 tuổi, 44% số trẻ còn lại có thể sống tới tuổi 60 [15].
Trẻ mắc hội chứng Down với bộ mặt điển hình: trán thấp, gáy rộng và dẹt, sống
mũi tẹt..., thường kèm theo dị tật ở tim (46%), bất thường ống tiêu hoá (7%),
10% bị động kinh ở tuổi 50, luôn kèm theo chậm phát triển trí tuệ một cách
trầm trọng..., nên ảnh hưởng lớn đến khả năng hoà nhập cộng đồng. Các gia
đình có con mắc hội chứng down có một gánh nặng lớn về tâm lý cũng như
gánh nặng tài chính, gánh nặng cho sự phục vụ và chăm sóc y tế của xã hội.


6

Hình 1.2. Trẻ mắc hội chứng Down (Trisomy 21)
1.1.3.2. Hội chứng Edwards hay ba nhiễm sắc thể 18
Hội chứng Edwards là bất thường số lượng NST 18 (47,XX,+18;
47,XY,+18). Lần đầu tiên được một nhóm các nhà di truyền học người Anh
đứng đầu là Edwards mô tả đầy đủ năm 1960. Bệnh xuất hiện với tần suất
1:5000 trẻ sinh ra [17]. Đây là hội chứng bất thường số lượng NST đứng thứ 2
sau hội chứng Down.

Hình 1.3. Trẻ mắc hội chứng Edwards
Trẻ mắc hội chứng Edwards được sinh ra thường thiếu cân (trọng lượng
trung bình khoảng 2kg), trong khi thai lại thường bị già tháng. Các biểu hiện

lâm sàng ở hội chứng này cũng đa dạng như các tổn thương cấu tạo của mặt
và hệ thống cơ xương là ổn định, ở các trường hợp kinh điển, sọ não có dạng
kéo dài nghiêng dần từ xương trán tới vùng thóp, hàm dưới và lỗ miệng bé,
các khe mắt hẹp và ngắn, vành tai bị biến dạng và trong phần lớn các trường
hợp có tai mọc thấp, các tật ở chi trên là sự xếp lộn xộn của xương bàn, bất


7
thường khớp giữa ngón Ι, bất thường ở bàn chân cũng có tới 80% các trường
hợp. Khe hở môi được gặp ở 50% các trường hợp, nhưng khác với hội chứng
Patau là chỉ khe hở môi ở một phía [18].
Do có nhiều dị tật ở nhiều hệ thống cơ quan, nên thời gian sống của các
trẻ mắc hội chứng Edwards không được lâu. Có tới 60% các trường hợp bị
chết trước 3 tháng (trong đó 30% là trước 1 tháng). Chỉ 1/10 trẻ bị bệnh là
sống được đến 1 tuổi [18].
1.1.3.3. Hội chứng Patau hay ba nhiễm sắc thể 13
Hội chứng Patau là bất thường số lượng NST 13 (47,XX,+13; 47,XY,
+13). Lần đầu tiên được Patau cùng các cộng sự mô tả đầy đủ vào năm 1960.
Bệnh gặp với tần số 1:5000 đến 1:10000 trẻ sống. Tỷ lệ bệnh gặp ở nữ nhiều hơn
nam. Các trẻ mắc hội chứng Patau có trọng lượng khi sinh thấp hơn mức trung
bình khoảng 900g và thường sinh thiếu tháng. Các dấu hiệu lâm sàng bên ngoài
của hội chứng này rất điển hình đến mức có thể dựa vào đó để nhận dạng và
chẩn đoán bệnh. Các bất thường đặc trưng biểu hiện ở sọ và mặt: chu vi hộp sọ
thường bị giảm, đầu bé cùng với trán thấp và nghiêng, khe mắt hẹp, gốc mũi
rộng, tai mọc thấp với vành tai biến dạng, khoảng cách giữa hai mắt giảm, da
đầu thường bị loét, có u mạch máu ở vùng đầu và chẩm [17],[19].

Hình 1.4. Trẻ mắc hội chứng Patau

8
Một trong những dấu hiệu điển hình nhất của hội chứng Patau là khe hở
môi trên và vòm miệng, các khe hở thường là ở cả hai phía. Trong số các bất
thường của hệ thống cơ xương, hay gặp nhất là tật nhiều ngón ở cả hai tay và
hai chân. Ngoài ra, các dị tật bẩm sinh ở tim chiếm 80% các trường hợp, ở hệ
thống bài tiết trên 60%, ở hệ thống cơ quan sinh sản 75%.
Do có quá nhiều dị tật nặng nề, nên những trẻ trisomy 13 không sống
được lâu, 90% bệnh nhân chết trong vòng 1 tuổi, trong đó 40% là chết chu
sinh [17],[19].
1.1.3.4. Các bất thường số lượng nhiễm sắc thể giới tính (X, Y)
Bất thường NST giới tính X, Y gây nên hội chứng Kilinefelter, Tuner và
trisomy X...
* Hội chứng Turner hay monosomy X
Hội chứng Turner (TS) là bệnh lý rối loạn NST giới tính phổ biến nhất,
gây ra một loạt các bất thường kiểu hình ở người nữ. Các bất thường này là
hậu quả thiếu hụt gen của cặp NST giới tính do thiếu hoàn toàn hoặc một
phần NST giới tính X hoặc Y [20],[21]. Tần suất mắc TS vào khoảng 1/2000 1/3000 trẻ sơ sinh gái. Ở giai đoạn phôi thai, tỷ lệ này cao hơn rất nhiều, chỉ
riêng dạng mất hoàn toàn một NST giới X chiếm 3% thai nữ được hình thành
[20]. Tuỳ thuộc vào số lượng gen thiếu hụt mà biểu hiện của TS rất đa dạng.
Bất thường hình thái điển hình là lùn, tóc mọc thấp, cổ ngắn, nếp da thừa ở
cổ, biến dạng xương chi… Các bất thường này làm bệnh nhân có những mặc
cảm tự ti khi hoà nhập cộng đồng nhưng nguyên nhân chính gây ảnh hưởng
nặng nề đến sức khoẻ và đời sống của người bệnh TS là các dị tật nội quan và
rối loạn chức năng. Bệnh nhân TS thường thiểu năng sinh dục, giới tính thứ cấp
không phát triển, vô sinh; các rối loạn nội tiết gây chậm phát triển về thể chất,
đôi khi chậm phát triển về trí tuệ [22]. Các dị tật nội quan như dị tật tim, thận là
nguyên nhân gây tử vong sớm của các bệnh nhân TS. Để hạn chế các biểu hiện
bất thường của TS cần theo một chế độ điều trị đặc biệt, lâu dài từ giai đoạn sớm
và cũng chỉ hạn chế được một phần các biểu hiện của bệnh [23].

9

Hình 1.5. Trẻ mắc hội chứng Turner và karyotype 45,X
* Hội chứng Klinefelter với kiểu nhiễm sắc thể 47, XXY
Là dạng bệnh NST giới tính hay gặp nhất ở nam giới với tần số khoảng
1:500 đến 1:1000 lần trẻ sơ sinh nam, 80% người Klinefelter với kiểu nhiễm
sắc thể 47,XXY; Một số thể khảm 47,XXY/46,XY; 45,X/46,XY/47,XXY...
Tuổi mẹ cao làm tăng bất thường ở giảm phân I. Theo Simpson, hội chứng
Klinefelter thường là vô sinh do vô tinh và thiểu tinh nhưng biểu hiện lâm
sàng có sự khác nhau [24]. Số lượng và mức độ của các triệu chứng phụ thuộc
vào số lượng và vị trí của các mô tế bào có thêm NST X. Tuy nhiên Krausz và
Forti (2000) thấy ở một số ít bệnh nhân Klinefelter thể khảm tinh hoàn vẫn có
thể sinh tinh nên vẫn có khả năng sinh sản nhưng thường là thiểu tinh nặng
(severe oligozoospermia) [25]. Biểu hiện lâm sàng của hội chứng Klinefelter
thường không đặc hiệu trong thời kỳ trẻ nhỏ. Ở giai đoạn sơ sinh và trẻ nhỏ
rất khó nhận biết vì không có dị dạng quan trọng hoặc có những dị dạng
nhưng không đặc hiệu như tinh hoàn lạc chỗ, lỗ đái lệch thấp, dương vật kém
phát triển. Ở giai đoạn dậy thì có thể thấy người cao, chân tay dài nhưng
nhiều trường hợp có hình thái nam bình thường. Thường thấy tinh hoàn không
phát triển, mào tinh hoàn đôi khi lớn hơn tinh hoàn, tinh hoàn teo nhỏ, dáng
người giống nữ, chứng vú to, FSH tăng cao và thường vô sinh do vô tinh. Bởi
vậy, chẩn đoán hội chứng này thường ở giai đoạn dậy thì và trưởng thành.
Trường hợp hội chứng Klinefelter khảm có thể có con nhưng đều cần đến hỗ
trợ sinh sản. Một số trường hợp có thể lấy tinh trùng từ tinh hoàn để làm kỹ
thuật tiêm tinh trùng vào bào tương trứng.


10
* Kiểu nhiễm sắc thể 47, XYY

Trong số nam giới có karyotyp 47,XYY, một số có khả năng sinh sản,
tỷ lệ bệnh này nhiều hơn trong quần thể vô sinh nam. Có trường hợp dương
vật nhỏ, tinh hoàn lạc chỗ và lỗ đái lệch thấp. Trên lâm sàng người bệnh có
dáng vóc cao, xét nghiệm tinh dịch vô tinh hoặc thiểu tinh nặng. Trên mẫu
sinh thiết, mô học tinh hoàn thấy tế bào dòng tinh thiểu sản và hầu như không
trưởng thành, ngoài ra còn xơ hóa ống sinh tinh. Cơ chế bệnh sinh hầu hết do
sự không phân ly của NST Y xảy ra trong phân bào giảm nhiễm lần thứ hai ở
bố. Tần số người 47,XYY trong quần thể là 1/1000 nam giới. Khả năng sinh
sản của những người 47,XYY khác nhau đáng kể, từ số lượng tinh trùng bình
thường đến vô tinh. Nhiều nam giới 47,XYY vẫn sinh con bình thường, tuy
nhiên chưa có nghiên cứu hệ thống về con của những người này [26].
* Trisomy X hay kiểu nhiễm sắc thể 47,XXX
Trisomy X là bất thường số lượng NST X (47,XXX) được mô tả lần
đầu vào năm 1959 với tần số khoảng 1:1000 trẻ gái, tuy nhiên ước tính chỉ có
10% được chẩn đoán [27]. Những biểu hiện bên ngoài rất khó phân biệt người
bệnh với những người bình thường do không có những biến đổi rõ ràng về
hình thái cũng như trí tuệ và thể lực. Tuy nhiên, một số người bệnh cũng có
một số bất thường như tầm vóc cao hơn bình thường, huyết áp thấp, bất
thường ở thận, bộ phận sinh dục và suy buồng trứng sớm (premature ovarian
failure: POF). Trẻ em bị trisomy X có tỷ lệ chậm nói và vận động chậm hơn,
tăng nguy cơ thiếu hụt nhận thức và khuyết tật học tập trong những năm đến
tuổi đi học đặc điểm tâm lý bao gồm thiếu hụt chú ý, rối loạn tâm trạng (lo
lắng và trầm cảm), bệnh tâm thần phân liệt và các rối loạn tâm lý khác cũng
phổ biến hơn so với dân số nói chung. Nguy cơ trisomy X tăng theo tuổi mẹ.
Những phụ nữ trisomy X vẫn có khả năng sinh đẻ bình thường song nguy cơ
các bất thường các NST ở con cái cao hơn những người khác [27].


11
1.2. Tổng quan về một số phương pháp sàng lọc, chẩn đoán trước sinh

phát hiện bất thường NST
Bất thường số lượng NST là nguyên nhân chính gây tử vong chu sinh
và tàn tật ở trẻ em. Phát hiện các bất thường NST thường dựa vào các phương
pháp sàng lọc và chẩn đoán trước sinh.
1.2.1. Các phương chẩn đoán trước sinh
Muốn chẩn đoán xác định thai lệch bội NST phải dựa vào các xét
nghiệm di truyền. Các xét nghiệm này có thể phân tích ở mức độ tế bào (phân
tích NST), ở mức độ phân tử (phân tích DNA, RNA) hoặc cả ở mức độ tế bào
và phân tử (kỹ thuật FISH). Tất cả xét nghiệm này cần phải lấy được tế bào
hoặc DNA có nguồn gốc từ thai. Hai phương pháp lấy mẫu xét nghiệm để
chẩn đoán trước sinh là phương pháp xâm phạm thai và phương pháp không
xâm phạm thai.
Phương pháp chẩn đoán trước sinh lấy mẫu xâm phạm thai
Phương pháp lấy mẫu này ảnh hưởng trực tiếp đến thai nhi và có thể gây tai
biến cho thai cũng như cho thai phụ (sẩy thai, rỉ ối,...). Để giảm bớt rủi ro trên,
việc sàng lọc trước sinh không xâm lấn những thai phụ có nguy cơ cao sinh con
lệch bội NST sẽ giảm đáng kể số thai phụ phải thực hiện xét nghiệm này.
* Chọc hút dịch ối: được thực hiện khi thai được 16 đến 18 tuần. Dịch ối
có các loại tế bào ối, da, phổi và tế bào biểu bì đường tiết niệu của thai nhi.
Những tế bào này sẽ được nuôi cấy với các môi trường thích hợp để thu được
lượng tế bào thai nhi nhiều hơn; mặt khác, nuôi cấy tế bào dịch ối còn giúp loại
bỏ tế bào máu của người mẹ. Tỉ lệ mất thai do chọc út dịch ối khoảng 0,5-1,0%
[5]. Mặc dù chọc hút dịch ối ở ba tháng giữa có nhiều thuận lợi nhưng cũng có
hạn chế do làm thủ thuật và kết quả tế bào thường có sau tuần thai thứ 18, vì vậy
nếu thai phụ lựa chọn đình chỉ thai do bất thường NST thì có thể bất lợi hơn so
với ba tháng đầu.


12

Hình 1.6. Chọc hút dịch ối dưới hướng dẫn của siêu âm
(Nguồn:)
* Lấy mẫu nhung mao màng nuôi hay còn gọi là sinh thiết gai rau
(Chorionic Villus Sampling-CVS): kỹ thuật CVS được thực hiện đầu tiên
vào những năm 1960. Từ năm 1983, CVS đã trở thành một xét nghiệm phổ
biến để chẩn đoán trước sinh trong 3 tháng đầu của thai kỳ. Dưới sự hướng
dẫn của siêu âm, CVS thường thực hiện từ 10-12 tuần thai qua cổ tử cung
hoặc qua thành bụng, cũng có thể làm qua đường âm đạo. Vì vậy, kết quả thu
được ở tuổi thai sớm hơn so với chọc hút dịch ối. Hạn chế của CVS là tỷ lệ
mất thai cao hơn so với chọc hút dịch ối kinh điển [5].

Hình 1.7. Lấy mẫu gai rau dưới hướng dẫn của siêu âm
(Nguồn:)


13
Phương pháp lấy mẫu không xâm phạm thai
Hiện nay, các nhà khoa học đang quan tâm đến phương pháp lấy mẫu
thai nhi bằng phương pháp không xâm phạm thai. Phương pháp lấy mẫu
không xâm phạm thai giúp tránh được nguy cơ mất thai có thể xảy ra đối với
thai nhi và thai phụ.
1.2.1.1. Kỹ thuật nhuộm băng nhiễm sắc thể lập karyotype
Để phân tích đặc điểm bộ NST của một cá thể về cả số lượng lẫn cấu
trúc, người ta dựa trên bộ NST của tế bào ở kỳ giữa (metaphase) hoặc tiền kỳ
giữa (pro-metaphase) của nguyên phân để lập karyotype. Kỹ thuật được sử
dụng phổ biến để lập karyotype là kỹ thuật nhuộm băng G hiện được sử dụng
trong hầu hết các phòng xét nghiệm di truyền tế bào học và được coi là một
trong những phương pháp phân tích di truyền tế bào học truyền thống [28].
1.2.1.2. Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH-Fluorescent in situ hybridization)
Kỹ thuật FISH sử dụng để xác định một cách hiệu quả số lượng và vị trí

của các đoạn DNA đặc hiệu trên NST ở kỳ giữa hoặc trong nhân tế bào ở gian kỳ
và cũng được coi như là một phương pháp phân tích di truyền tế bào học truyền
thống. Việc thực hiện kỹ thuật FISH trên tế bào ở gian kỳ đã làm cho việc chuẩn
bị mẫu xét nghiệm trở nên đơn giản và thời gian thực hiện xét nghiệm nhanh
chóng hơn rất nhiều so với việc lập karyotype, điều này đặc biệt có ý nghĩa đối với
các xét nghiệm cần có kết quả nhanh như trong trường hợp phát hiện các bất
thường số lượng của NST 13, 18, 21 và X, Y trong chẩn đoán trước sinh [29].
1.2.1.3. Kỹ thuật định lượng huỳnh quang PCR (QF-PCR: Quantitative
fluorescence-polymerase chain reaction)
Kỹ thuật QF-PCR sử dụng các cặp mồi được thiết kế để khuếch đại các
trình tự lặp nối tiếp ngắn (STR: short tandem repeat sequences) của các NST
đặc hiệu và của các vùng có tính đa hình cao. Bằng cách kết hợp màu huỳnh
quang trong quá trình khuếch đại nên kỹ thuật này cho phép định lượng các


14
sản phẩm cho mỗi STR đặc hiệu của từng NST. Dựa trên nguyên tắc này QFPCR có thể phát hiện các dạng lệch bội phổ biến và các bất thường số lượng
NST giới tính một cách nhanh chóng thông qua chỉ một phản ứng [30].
1.2.1.4. Kỹ thuật ARRAY CGH (CGH: Comparative Genomic Hybridization)
Trong thập niên 1990 kỹ thuật CGH bắt đầu được phát triển. Về bản
chất kỹ thuật này cũng tương tự kỹ thuật FISH nhưng cho phép đánh giá trên
toàn bộ genome tình trạng mất cân bằng của bộ NST. CGH cũng vấp phải giới
hạn về độ phân giải, kỹ thuật CGH cho phép phát hiện các bất thường có kích
thước trong giới hạn 5 - 10Mb [31]. Với array CGH những bất thường trên
NST xảy ra ở dưới mức phát hiện của kính hiển vi (submicroscopic) dưới
dạng vi mất đoạn (microdeletion) hoặc vi nhân đoạn (microduplication) có thể
được phát hiện một cách dễ dàng.
1.2.1.5. Kỹ thuật Prenatal-BoBs
Prenatal-BoBs (PN BoBs) là kỹ thuật di truyền phân tử sử dụng rộng
rãi trong xét nghiệm chẩn đoán trước sinh. So với kỹ thuật FISH, QF-PCR là

những kỹ thuật được ứng dụng để phát hiện thêm hoặc mất DNA trong các
vùng NST liên quan tới các hội chứng lệch bội NST 13, 18, 21 và NST giới tính,
PN BoBs còn phát hiện thêm 9 loại đột biến vi mất đoạn thường gặp như
DiGeorge, Williams-Beuren, Prader-Willi, Angelman, Smith-Magenis, WolfHirschhorn, Cri du Chat, Langer-Giedion, Miller-Dieker. Kỹ thuật BoBs
(BACs-on-Beads) dựa trên công nghệ sử dụng mẫu dò là các dòng nhiễm sắc
thể nhân tạo có chứa các đoạn ngắn DNA của người có gắn các hạt bead,
thông qua sự khác biệt giữa DNA mẫu với DNA chứng để phát hiện các
trường hợp mất đoạn hoặc nhân đoạn trên DNA dựa trên khả năng bắt cặp
giữa các DNA dò với một mạch đơn của DNA mẫu theo nguyên tắc bổ sung
giữa các base khi phản ứng lai xảy ra [32].