NGHIÊN cứu BIẾN đổi GEN CYP1A1 và mức độ STRESS OXY hóa ở NAM GIỚI vô SINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BỘ Y TẾ

BÙI THỊ NGA

NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI GEN CYP1A1
VÀ MỨC ĐỘ STRESS OXY HÓA
Ở NAM GIỚI VÔ SINH

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BỘ Y TẾ

BÙI THỊ NGA

NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI GEN CYP1A1
VÀ MỨC ĐỘ STRESS OXY HÓA
Ở NAM GIỚI VÔ SINH
Chuyên ngành : Y Sinh học- Di truyền
Mã số : 62720301
LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS. LƯƠNG THỊ LAN ANH
PGS.TS. TRẦN ĐỨC PHẤN

HÀ NỘI - 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận văn: “Nghiên cứu biến đổi gen CYP1A1 và mức
độ stress oxy hóa ở nam giới vô sinh” dưới sự hướng dẫn của PGS.TS.
Lương Thị Lan Anh và PGS.TS. Trần Đức Phấn là hoàn toàn do tôi thực hiện.
Các số liệu và kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng công bố
trước đây.

Hà Nội, ngày 05 tháng 8 năm 2018

Bùi Thị Nga


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã
nhận được sự hướng dẫn quý báu, sự giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô, các
anh chị, bạn bè và gia đình.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn
chân thành tới:
Ban Giám hiệu trường Đại học Y Hà Nội, phòng Quản lí đào tạo Sau
đại học, Bộ môn Y sinh học - Di truyền trường Đại học Y Hà Nội cùng các
thầy cô và các anh chị trong Bộ môn đã tạo mọi điều kiện, giúp đỡ tôi tận tình
trong học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Lương Thị
Lan Anh - người đã hết lòng giúp đỡ, dạy bảo, dìu dắt, hướng dẫn tôi trong

suốt quá trình làm luận văn cũng như quá trình nghiên cứu, học tập, truyền
cho tôi niềm say mê nghiên cứu khoa học. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới
PGS.TS. Trần Đức Phấn - Thầy đồng hướng dẫn, đã giúp đỡ tôi rất nhiệt tình
trong quá trình nghiên cứu.
Các Thầy cô trong hội đồng khoa học thông qua đề cương và bảo vệ
luận văn đã đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho tôi trong quá trình nghiên cứu
và hoàn thành luận văn.
Xin cảm ơn các bệnh nhân đã đồng ý tham gia vào nghiên cứu này.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình đã luôn động viên tôi,
bạn bè đã giúp đỡ, chia sẻ khó khăn với tôi trong suốt quá trình hoàn thành
luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 8 năm 2018
Bùi Thị Nga


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AR

: Androgen Receptor

AZF

: Azoospermia Factor

CFTR

: Cystic Fibrosis Transmembrance Conductance Regulator

FSH

: Follice Stimulating Hormone

GnRH

: Gonadotropin Releasing Hormone

GTMTT

: Giãn tĩnh mạch thừng tinh

ITT

: Ít tinh trùng

KCTT

: Không có tinh trùng

LH

: Luteinizing Hormone

NST

: Nhiễm Sắc Thể

OS

: Oxidative Stress

RCS

: Reactive Clo Species

ROS

: Reactive Oxygen Species

WHO

: World Health Organization (Tổ chức y tế Thế giới)


MỤC LỤC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI.................................................................................................................1
BÙI THỊ NGA..........................................................................................................................................1
LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC.....................................................................................................................1
HÀ NỘI - 2018........................................................................................................................................1
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI.................................................................................................................2
BÙI THỊ NGA..........................................................................................................................................2
Mã số : 62720301..................................................................................................................................2
LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC.....................................................................................................................2
Người hướng dẫn khoa học:.................................................................................................................2
PGS.TS. LƯƠNG THỊ LAN ANH...............................................................................................................2
PGS.TS. TRẦN ĐỨC PHẤN......................................................................................................................2
HÀ NỘI - 2018........................................................................................................................................2
ĐẶT VẤN ĐỀ...........................................................................................................................................1

Chương 1...............................................................................................................................................3
TỔNG QUAN..........................................................................................................................................3
1.1. Tình hình nghiên cứu vô sinh và vô sinh nam giới....................................................................3
1.1.1. Khái niệm vô sinh và vô sinh nam giới................................................................................3
1.1.2. Tình hình vô sinh và vô sinh nam trên thế giới...................................................................4
1.1.3. Tình hình vô sinh và vô sinh nam ở Việt Nam....................................................................5
1.2. Các nguyên nhân dẫn đến vô sinh nam.....................................................................................5
1.2.1. Phân loại nguyên nhân gây vô sinh nam giới......................................................................5
Vô sinh nam giới có thể do nhiều nguyên nhân khác nhau, hầu hết đều dẫn đến hậu quả là người
nam không có tinh trùng hoặc tinh trùng suy giảm các mức độ khác nhau, bất thường về hình thái
tinh trùng................................................................................................................................................5
1.2.2. Nguyên nhân ảnh hưởng đến số lượng tinh trùng............................................................7
1.2.3. Nguyên nhân ảnh hưởng đến chất lượng tinh trùng và tinh dịch...................................11


1.3. Gốc tự do và stress oxy hóa......................................................................................................12
1.3.1. Khái niệm và phân loại gốc tự do.....................................................................................12
1.3.2. Stress oxy hóa và sự ảnh hưởng lên hệ sinh sản nam.....................................................14
1.3.1. Vai trò của các gốc kháng oxy hóa trong điều trị vô sinh nam.........................................16
1.3.2. Các phương pháp xác định mức độ stress oxy hóa trong tinh dịch.................................18
1.4. Gen chuyển hóa gốc tự do CYP1A1 trong cơ thể....................................................................18
1.5. Kỹ thuật sinh học phân tử xác định biến đổi gen....................................................................20
1.5.1. Khái niệm PCR...................................................................................................................20
1.5.2. Nguyên lý của kỹ thuật PCR..............................................................................................21
1.5.3. Một số phương pháp PCR đặc hiệu.................................................................................22
1.5.4. Kỹ thuật ARMS-PCR..........................................................................................................24
Chương 2.............................................................................................................................................26
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................................................................26
2.1. Đối tượng nghiên cứu..............................................................................................................26
2.2. Số bệnh nhân và số mẫu..........................................................................................................26

2.3. Quy trình nghiên cứu...............................................................................................................27
2.4. Hóa chất và dụng cụ................................................................................................................27
2.5 . Phương pháp nghiên cứu........................................................................................................27
2.5.1. Loại hình nghiên cứu........................................................................................................27
2.5.2. Cách tiến hành nghiên cứu...............................................................................................27
2.5.3. Thu thập kết quả xét nghiệm tinh dịch đồ và xác định mức độ stress oxy hóa bằng kit
Oxisperm.........................................................................................................................29
2.5.4. Tách chiết DNA..................................................................................................................30
2.5.5. Nhân đoạn gen sử dụng phương pháp ARMS-PCR.........................................................30
2.5.6. Điện di...............................................................................................................................31
2.5.7. Xử lí số liệu........................................................................................................................32
2.6. Các chỉ tiêu nghiên cứu...........................................................................................................32
2.7. Đạo đức trong nghiên cứu.......................................................................................................33
Chương 3.............................................................................................................................................34
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU........................................................................................................................34
3.1. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu............................................................................34


3.1.1. Độ tuổi trung bình của nhóm bệnh và nhóm chứng.......................................................34
3.1.2. Đặc điểm nhóm bệnh phân loại theo mật độ tinh trùng................................................34
Dựa vào mật độ tinh trùng trong tinh dịch, chúng tôi phân loại nhóm bệnh thành 2 nhóm nhỏ:
Vô tinh và thiểu tinh...............................................................................................................34
3.2. Kết quả phân tích tinh dịch đồ của hai nhóm đối tượng nghiên cứu....................................35
3.2.1. Tính chất lý hóa của tinh dịch..........................................................................................35
3.2.2. Một số chỉ số trong tinh dịch giữa nhóm chứng và nhóm thiểu tinh.............................37
3.3. Kết quả xác định đa hình A2455G của gen CYP1A1 bằng kỹ thuật ARMS-PCR......................39
3.3.1. Kết quả chạy điện di.........................................................................................................39
3.3.2. Kết quả đa hình A2455G của gen CYP1A1.......................................................................40
CYP1A1 A2455G..................................................................................................................................41
Nhóm bệnh..........................................................................................................................................41

(n=45)..................................................................................................................................................41
Nhóm chứng........................................................................................................................................41
(n=45)..................................................................................................................................................41
p...........................................................................................................................................................41
OR........................................................................................................................................................41
(95%CI)................................................................................................................................................41
Số lượng..............................................................................................................................................41
Tỉ lệ......................................................................................................................................................41
(%)........................................................................................................................................................41
Số lượng..............................................................................................................................................41
Tỉ lệ......................................................................................................................................................41
(%)........................................................................................................................................................41
Alen A..................................................................................................................................................41
61.........................................................................................................................................................41
67,8......................................................................................................................................................41
76.........................................................................................................................................................41


84,4......................................................................................................................................................41
0,016....................................................................................................................................................41
0,49......................................................................................................................................................41
(0,14 - 0,96).........................................................................................................................................41
Alen G..................................................................................................................................................41
29.........................................................................................................................................................41
32,2......................................................................................................................................................41
14.........................................................................................................................................................41
15,6......................................................................................................................................................41
2,96......................................................................................................................................................41
(1,15 - 6,64).........................................................................................................................................41
Tổng.....................................................................................................................................................41

90.........................................................................................................................................................41
100.......................................................................................................................................................41
60.........................................................................................................................................................41
100.......................................................................................................................................................41
Nhận xét:.............................................................................................................................................41
Kết quả ở bảng 3.5 cho ta thấy:..........................................................................................................41
Ở nhóm bệnh, tỉ lệ alen A là 67,8%, tỉ lệ alen G là 32,2%..................................................................41
Ở nhóm chứng, tỉ lệ alen A là 84,4%, tỉ lệ alen G là 15,6%................................................................41
Alen G ở nhóm bệnh cao gấp 2,96 lần nhóm chứng với p= 0,016....................................................41
3.4. Mức độ stress oxy hóa trong tinh dịch và mối liên quan với đa hình A2455G của gen
CYP1A1....................................................................................................................................42
Đo mức độ stress oxy hóa trong tinh dịch:....................................................................................42
Tiến hành lấy ngẫu nhiên 18 mẫu tinh dịch của nhóm bệnh có thiểu tinh và 18 mẫu tinh dịch
của nhóm chứng sau đó tiến hành đo mức độ stress oxy hóa trong tinh dịch. Phân loại
mức độ stress oxy hóa thành 2 nhóm:...................................................................................42


Nhóm 1 (stress oxy hóa ở mức I+II): Nồng độ gốc tự do thấp......................................................42
Nhóm 2 (stress oxy hóa ở mức III+IV): Nồng độ gốc tự do cao.....................................................42
Ta có bảng sau:................................................................................................................................42
Mức OS............................................................................................................................................42
Nhóm bệnh.....................................................................................................................................42
Nhóm chứng...................................................................................................................................42
p

42

Số lượng..........................................................................................................................................42
Tỉ lệ (%)............................................................................................................................................42
Số lượng..........................................................................................................................................42

Tỉ lệ (%)............................................................................................................................................42
Mức OS thấp...................................................................................................................................42
7

42

38,9 42
14 42
77,8 42
<0,05................................................................................................................................................42
Mức OS cao.....................................................................................................................................42
11 42
61,1 42
4

42

22,2 42
Tổng42
18 42
100 42
18 42
100 42
Nhận xét:.........................................................................................................................................42
Ở nhóm bệnh, mức OS thấp có 7 bệnh nhân (chiếm 38,9%), 11 bệnh nhân có mức OS cao
(chiếm 61,1%).........................................................................................................................42
Ở nhóm chứng, mức OS thấp có 14 người (chiếm 77,8%), trong khi đó chỉ có 4 người có mức
OS cao (chiếm 22,2%).............................................................................................................42

Sự khác biệt mức độ stress oxy hóa giữa hai nhóm là khác biệt có ý nghĩa thống kê, với p < 0,05.
.................................................................................................................................................42
3.5. Mối liên quan giữa mức độ stress oxy hóa trong tinh dịch với một số chỉ số tinh dịch đồ. .43
Sau khi đo mức độ stress oxy hóa trong tinh dịch, tiến hành đánh giá mối liên quan với một số
chỉ số tinh dịch đồ như: mật độ, độ di động tiến tới, hình thái bình thường và tỉ lệ sống
giữa nhóm chứng và nhóm thiểu tinh, ta có bảng................................................................43
Chương 4.............................................................................................................................................44
BÀN LUẬN............................................................................................................................................44
4.1. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu............................................................................45
Đặc điểm chung:.............................................................................................................................45
4.2. Phân tích đặc điểm đa hình gen CYP1A1 của nhóm đối tượng nghiên cứu..........................48
4.3. Mối liên quan giữa mức độ stress oxy hóa trong tinh dịch và một số chỉ số tinh dịch đồ....53
Xác định mức độ stress oxy hóa trong tinh dịch............................................................................53
Mức độ stress oxy hóa trong tinh dịch cao là kết quả của sự mất cân bằng giữa hai quá trình sản
sinh gốc tự do và thải trừ chúng ra ngoài cơ thể. Bình thường tinh trùng có thể tránh tác
động của các gốc tự do bởi vì trên màng tế bào có chứa số lượng lớn acid béo không có
khả năng sinh cholesteron và các enzym chống oxy hóa của cơ thể [33]............................54
Khoảng gần chục năm trở lại đây, càng có nhiều báo cáo ảnh hưởng của ROS cao lên cả chất
lượng và chức năng tinh trùng người. Chúng phá vỡ màng tế bào, phân giải lipid, gây đứt
gãy DNA tinh trùng, chết theo chương trình và hậu quả là làm tăng tỉ lệ vô sinh nam. Tác
giả đầu tiên cho rằng hạn chế ROS có thể cải thiện một số chỉ số chất lượng tinh trùng là
Aitken et al (1989), ông còn khuyến cáo sử dụng vitamin E như một chất chống oxy hóa cải
thiện chất lượng tinh trùng [65], [66]. Ilter alkan (1997) cũng cho rằng sự giảm nồng độ
các chất chống oxy hóa và tăng mức độ stress oxy hóa trong tinh dịch có thể gây vô sinh
nam [67]. ROS không chỉ tác động lên màng tế bào mà còn làm tăng đứt gãy DNA. Nghiên
cứu mới nhất của Vũ Thị Huyền và Cs, sự khác biệt giữa nhóm có mức độ đứt gãy DNA
tinh trùng cao ở nhóm stress oxy hóa cao so với nhóm có mức độ stress oxy hóa thấp có ý
nghĩa thống kê với p < 0,01 [68].............................................................................................54
Nghiên cứu của chúng tôi cho kết quả tương đồng với các nghiên cứu trước đó, khẳng định ảnh
hưởng của mức độ stress oxy hóa trong tinh dịch và tình trạng vô sinh nam. Có sự khác

biệt có ý nghĩa giữa các mức độ oxy hóa giữa hai nhóm bệnh và nhóm chứng..................54


Một nghiên cứu khác của Ashok Agarwal vào năm 2006 trên 132 nam giới vô sinh và 34 chứng
khỏe mạnh đã khuyến cáo rằng: ROS cao là một marker độc lập của vô sinh nam, bất kể
kết quả tinh dịch đồ là bình thường hay bất thường. Tác giả gợi ý đưa xét nghiệm ROS
trong tinh dịch trở thành một xét nghiệm thường quy của chẩn đoán nguyên nhân vô sinh
nam giới. Liệu pháp điều trị nên bao gồm cả các hoạt chất chống oxy hóa có thể cải thiện
chất lượng tinh trùng và tình trạng vô sinh nam [69]...........................................................54
Mối liên quan giữa mức độ stress oxy hóa trong tinh dịch với một số chỉ số tinh dịch đồ..........55
ROS có vai trò sinh lý trong hoạt động bình thường của tinh trùng, nhưng có khả năng gây độc
cho tinh trùng nếu ở nồng độ cao. Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng stress oxy hóa
cao có thể gây ảnh hưởng đến cả chất lượng và chức năng của tinh trùng. Nồng độ stress
oxy hóa cao được phát hiện trong mẫu tinh dịch của 25% đến 40% các nam giới vô sinh
[70], [71]. Chẩn đoán sớm và sử dụng tích cực các chất chống oxy hóa (antioxidant) nhằm
giảm tác động của các chất oxy hóa lên tinh trùng được nghiên cứu rất nhiều trong những
năm gần đây và được chứng minh rằng có hiệu quả............................................................55
Chúng tôi đã tiến hành đánh giá mối liên quan giữa mức độ stress oxy hóa trong tinh dịch với
một số chỉ số tinh dịch đồ như tỉ lệ sống, tỉ lệ di động tiến tới, mật độ và bất thường hình
thái của tinh trùng trên 45 bệnh nhân vô sinh nam. Kết quả cho thấy có mối tương quan
nghịch giữa mức độ stress oxy hóa trong tinh dịch với mật độ, độ di động tiến tới cũng
như bất thường về hình thái của tinh trùng. Như vậy, mức độ stress oxy hóa càng tăng thì
mật độ, độ di động tiến tới, tỉ lệ tinh trùng có hình thái bình thường càng giảm. Tuy nhiên,
với tỉ lệ sống của tinh trùng, chúng tôi không thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Điều
này có thể do những nam giới vô sinh có kết quả tinh dịch đồ bình thường (có nguyên
nhân vô sinh chưa được xác định, có thể do nồng độ gốc tự do quá cao hay đứt gãy DNA
tinh trùng nhiều). Bên cạnh đó, lượng mẫu sử dụng trong nghiên cứu cũng chưa đủ lớn, vì
thế có thể chưa biểu hiện được mối liên quan với mức độ stress oxy hóa trong tinh dịch
với một số chỉ số tinh dịch đồ khác........................................................................................55
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả một số báo cáo khác. Năm 1997, Ilter

Alkan đã xác định mức độ stress oxy hóa trong tinh dịch trên nhóm vô sinh nam gồm 18
người và 10 người khỏe mạnh. Kết quả cho thấy nồng độ gốc tự do trong tinh dịch tỉ lệ
nghịch tỉ lệ nghịch với độ di động của tinh trùng và số lượng tinh trùng có hình thái bình
thường [67]. Một nghiên cứu khác của Ramadan A.Saleh và Ashok Agarwal vào năm 2002
trên 47 đối tượng cũng cho kết quả tương đồng..................................................................56


Nhóm chứng...................................................................................................................................56
(n = 8)..............................................................................................................................................56
Nhóm vô sinh nam có ROS thấp.....................................................................................................56
(< 1x106 cpm; n = 14).....................................................................................................................56
Nhóm vô sinh nam có ROS cao.......................................................................................................56
(> 1x106 cpm; n = 25).....................................................................................................................56
A

56

B

56

C

56

Nồng độ ROS tinh dịch....................................................................................................................56
(x106 cpm)......................................................................................................................................56
0,1 56
(0,1 - 0,5).........................................................................................................................................56
0,3 56

(0,1 - 0,5).........................................................................................................................................56
5

56

(3 - 60).............................................................................................................................................56
0,51 56
0,03 56
0,03 56
Mật độ tinh trùng (x106/ml)..........................................................................................................56
0,2 56
(0,1- 0,2)..........................................................................................................................................56
0,1 56
(0,0 - 0,2).........................................................................................................................................56
1,2 56
(0,3 - 2,4).........................................................................................................................................56
0,61 56
0,005................................................................................................................................................56
0,007................................................................................................................................................56
Độ di động (%).................................................................................................................................56
73 56


(67 - 76)...........................................................................................................................................56
59 56
(39 - 63)...........................................................................................................................................56
38 56
(33 - 52)...........................................................................................................................................56
0,002................................................................................................................................................56
< 0,001.............................................................................................................................................56

0,07 56
Hình thái tinh trùng bình thường (%).............................................................................................57
33 57
(31 - 40)...........................................................................................................................................57
23 57
(17 - 32)...........................................................................................................................................57
16 57
(12 - 23)...........................................................................................................................................57
0,02 57
< 0,001.............................................................................................................................................57
0,07 57
Chú thích.........................................................................................................................................57
A: Giá trị p giữa nhóm chứng và nhóm vô sinh có ROS thấp.........................................................57
B: Giá trị p giữa nhóm chứng và nhóm vô sinh có ROS cao..........................................................57
C: Giá trị p giữa 2 nhóm vô sinh có ROS thấp và ROS cao.............................................................57
Như vậy, các chỉ số thể hiện chất lượng tinh trùng đều giảm có thể giải thích do tế bào sinh tinh
tiếp xúc lâu ngày với nồng độ ROS cao, gây phá hủy ống sinh tinh, tổn thương tinh hoàn và
giảm sản xuất tinh trùng về cả số lượng và chất lượng. Điều đó giải thích giãn tĩnh mạch
thừng tinh là bệnh nguyên của cả ROS cao và tổn thương tinh hoàn..................................57
Mối liên quan giữa đa hình A2455G gen CYP1A1 với một số chỉ số tinh dịch đồ........................57
Đa hình A2455G gen CYP1A1 và mối liên quan đến vô sinh nam đã được khẳng định qua nhiều
nghiên cứu. Tuy nhiên, mối đa hình này có tác động như thế nào đến một số chỉ số chất
lượng tinh dịch còn ít được nói đến. Chúng tôi bước đầu phân tích mối liên quan giữa
từng kiểu gen AA, AG và GG với một số chỉ số tinh dịch đồ. Kết quả cho thấy có đa hình
A2455G làm giảm mật độ tinh trùng cũng như tỉ lệ tinh trùng di động tiến tới nhanh, tuy


nhiên chưa phát hiện mối liên quan với một số chỉ số khác như tỉ lệ sống hoặc hình thái
bình thường............................................................................................................................57
Vào năm 2016, trên trang Reproductive Health, Aditi Singh và Cs cũng phân tích mối liên quan

này trên 80 nam giới vô sinh. Tác giả cũng chỉ ra rằng đa hình A2455G gen CYP1A1 làm
giảm tổng số tinh trùng cũng như tỉ lệ tinh trùng di động tiến tới nhanh, tuy nhiên chưa
nhận thấy có mối liên quan với tỉ lệ tinh trùng tiến tới chậm, tỉ lệ tinh trùng không di động,
hình thái tinh trùng bình thường [72]. Vẫn cần nhiều nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn để
khẳng định lại quan điểm này................................................................................................57
58
KẾT LUẬN.............................................................................................................................................59
KIẾN NGHỊ............................................................................................................................................61
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................................................1
PHỤ LỤC.................................................................................................................................................8


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Các nhóm nguyên nhân gây vô sinh nam (WHO, 1999) [20]..........6
Bảng 1.2. Phân loại gốc tự do [34]..................................................................14
Bảng 2.1. Trình tự cặp mồi xác định biến đổi gen CYP1A1 (A2455G).........30
Bảng 2.2. Chu trình luân nhiệt của phản ứng PCR.........................................31
Bảng 3.1. Đặc điểm độ tuổi của nhóm bệnh và nhóm chứng..........................34
Tuổi

34

Nhóm

34

± SD

34

p

34

Nhóm bệnh......................................................................................................34
(n=45)

34

30,8 ± 5,321.....................................................................................................34
(p> 0,05) 34
Min: 21

34

Max: 46

34

Nhóm chứng....................................................................................................34
(n=45)

34

32,8 ± 4,782.....................................................................................................34
Nhận xét: Kết quả ở bảng 3.1. cho thấy: trong 90 nam giới nghiên cứu, tuổi
thấp nhất là 21, tuổi cao nhất là 46. Độ tuổi trung bình của nhóm
bệnh là 30,8 ± 5,321; của nhóm chứng là 32,8 ± 4,782. Độ tuổi của
nhóm bệnh và nhóm chứng là không có sự khác biệt có ý nghĩa

thống kê với p> 0,05......................................................................34


Bảng 3.2. Một số đặc điểm lý hóa trong tinh dịch của nhóm bệnh và nhóm
chứng.............................................................................................35
Bảng 3.3. Một số chỉ số đánh giá chất lượng tinh dịch giữa hai nhóm thiểu
tinh và nhóm chứng.......................................................................37
Bảng 3.4. Tỉ lệ kiểu gen của đa hình CYP1A1 A2455G ở nhóm bệnh và nhóm
chứng.............................................................................................40
Nhận xét: Từ bảng 3.4 ta thu được kết quả sau:..............................................40
Nhóm bệnh: Tỉ lệ kiểu gen bình thường AA tại vị trí 2455 của gen CYP1A1 là
35,6%, kiểu gen dị hợp tử AG là 64,4% và kiểu gen đồng hợp tử
GG là 0%.......................................................................................40
Nhóm chứng: Tỉ lệ kiểu gen bình thường AA tại vị trí 2455 của gen
CYP1A1là 70,0%, kiểu gen dị hợp tử AG là 30,0% và cũng không
có trường hợp mang kiểu gen đồng hợp tử GG.............................40
Kiểu gen dị hợp tử (AG) tại vị trí 2455 của gen CYP1A1 có OR = 4,03; 95%
CI = 1,37-11,84; p = 0,013............................................................40
Như vậy, ở người vô tinh và thiểu tinh, khả năng mang kiểu gen dị hợp (AG)
tại vị trí 2455 của gen CYP1A1 cao hơn người có khả năng sinh
sản bình thường là 4,03 lần, sự khác biệt giữa nhóm chứng và
nhóm thiểu tinh, vô tinh là có ý nghĩa thống kê với p<0,05.........41
Kết quả trình bày ở bảng 3.4 cho thấy, tỉ lệ đa hình chung của gen CYP1A1
tại vị trí 2455 ở người vô tinh và thiểu tinh cao hơn người có khả
năng sinh sản bình thường, sự khác biệt giữa nhóm chứng và nhóm
thiểu tinh, vô tinh là có ý nghĩa thống kê với p<0,05....................41
Bảng 3.5. Tỉ lệ kiểu alen của A2455G giữa 2 nhóm.......................................41
Như vậy, ở người vô tinh và thiểu tinh, khả năng mang alen G tại vị trí 2455
của gen CYP1A1 cao hơn người có khả năng sinh sản bình thường

là 2,96 lần, sự khác biệt giữa nhóm chứng và nhóm thiểu tinh, vô
tinh là có ý nghĩa thống kê với p<0,05..........................................41
Bảng 3.6. Phân bố nồng độ gốc tự do trong tinh dịch giữa nhóm bệnh và
nhóm chứng...................................................................................42
Như vậy, mức độ oxy hóa thấp chủ yếu gặp ở nhóm chứng, nhóm thiểu tinh
chủ yếu có mức độ oxy hóa cao, sự khác biệt giữa nhóm chứng và
nhóm thiểu tinh là có ý nghĩa thống kê với p<0,05.......................42
Bảng 3.7. Mối liên quan giữa mức độ stress oxy hóa trong tinh dịch và một số
chỉ số tinh dịch đồ.........................................................................43
Bảng 3.8. Mối liên quan giữa đa hình A2455G gen CYP1A1 và một số chỉ số
tinh dịch đồ....................................................................................44
Bảng 4.1. Độ tuổi kết hôn của một số nước giai đoạn 2009 - 2014................46
Bảng 4.2. Nghiên cứu đa hình CYP1A1*2A của Jianzheng Fang và cộng sự
(2013) [57].....................................................................................50
Bảng 4.3. Phân bố tần số kiểu gen và alen đa hình CYP1A1 ở vị trí 2455 giữa
các nhóm đối tượng nghiên cứu của Sergey L. Yarosh [42].........53
Bảng 4.4. So sánh một số chỉ số tinh dịch đồ giữa nhóm chứng, nhóm vô sinh
nam (Nguồn: Ramadan A.Seleh và Ashok Agarwal năm 2002)...56


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Ảnh hưởng của stress oxy hóa lên chất lượng và số lượng tinh trùng
(Nguồn: International Journal of Molecular Sciences )..........................................16
Hình 1.2. Vai trò của chất kháng oxy hóa................................................................18
(Nguồn: Dreamstime.com ).....................................................................................18
Hình 1.3. Vị trí gen CYP1A1 trên NST 15.................................................................19
Bảng 1.3. Một số đột biến của gen CYP1A1 [38]....................................................20
Hình 1.4. Chu trình 3 giai đoạn PCR........................................................................22
Hình 1.5. Sơ đồ kỹ thuật ARMS-PCR.......................................................................25

..................................................................................................................................34
Hình 3.1. Tỉ lệ nhóm bệnh phân loại theo mật độ tinh trùng................................34
Nhận xét: Kết quả ở biểu đồ 3.1 cho thấy trong 45 nam giới vô sinh đến khám có
9 trường hợp (20%) không có tinh trùng, còn lại 36 trường hợp thiểu tinh, chiếm
80%...........................................................................................................................35
Phân tích một số chỉ số lý hóa của 90 mẫu tinh dịch như thể tích, pH tinh dịch, độ
nhớt, ta có bảng sau:...............................................................................................35
Nhóm......................................................................................................................35
Chỉ số........................................................................................................................35
Nhóm bệnh..............................................................................................................35
n (%).........................................................................................................................35
Nhóm chứng............................................................................................................35
n (%).........................................................................................................................35
OR (95%CI)...............................................................................................................35
p...............................................................................................................................35
Thể tích....................................................................................................................35
≥ 1,5 mL....................................................................................................................35


30.............................................................................................................................35
(66,7)........................................................................................................................35
32.............................................................................................................................35
(71,1)........................................................................................................................35
0,75..........................................................................................................................35
( 0,5-1,32).................................................................................................................35
> 0,05.......................................................................................................................35
< 1,5 mL....................................................................................................................35
15.............................................................................................................................35
(33,3)........................................................................................................................35
13.............................................................................................................................35

(28,9)........................................................................................................................35
pH.............................................................................................................................35
≥ 7,2.........................................................................................................................35
43.............................................................................................................................35
(95,6)........................................................................................................................35
45.............................................................................................................................35
(100).........................................................................................................................35
> 0,05.......................................................................................................................35
< 7,2.........................................................................................................................35
2................................................................................................................................35
(4,4)..........................................................................................................................35
0................................................................................................................................35
Độ nhớt....................................................................................................................35
Bình thường.............................................................................................................35
31.............................................................................................................................35


(68,9)........................................................................................................................35
33.............................................................................................................................35
(73,3)........................................................................................................................35
0,98..........................................................................................................................35
> 0,05.......................................................................................................................35
Cao...........................................................................................................................35
4................................................................................................................................35
(8,9)..........................................................................................................................35
3................................................................................................................................35
(6,7)..........................................................................................................................35
0,68..........................................................................................................................35
(0,26-1,3)..................................................................................................................35
Giảm.........................................................................................................................35

10.............................................................................................................................35
(22,2)........................................................................................................................35
9................................................................................................................................35
(20,0)........................................................................................................................35
0,78..........................................................................................................................35
(0,46-1,36)...............................................................................................................35
Nhận xét:..................................................................................................................35
Ở nhóm chứng, thể tích tinh dịch ≥ 1,5 mL chiếm 71,1% trong khi đó nhóm bệnh
là 66,7%....................................................................................................................36
Ở nhóm chứng, số mẫu tinh dịch có pH ≥ 7,2 là 100% trong khi ở nhóm bệnh là
95,6%. Số mẫu có pH tinh dịch < 7,2 rất ít, chỉ có ở nhóm bệnh (4,4%) chứ không
có ở nhóm chứng.....................................................................................................36
Độ nhớt tinh dịch của nhóm chứng là: Cao (6,7%), bình thường (73,3%), giảm
(20%). Trong khi đó các chỉ số này ở nhóm bệnh lần lượt là: 8,9%; 68,9% vả
22,2%.......................................................................................................................36


Như vậy, các chỉ số: Thể tích tinh dịch, pH tinh dịch cũng như độ nhớt giữa hai
nhóm bệnh và chứng không có sự khác biệt với p > 0,05......................................36
Phân tích một số chỉ số thể hiện chất lượng tinh dịch đồ như: Tỉ lệ tinh trùng
sống, tỉ lệ tinh trùng di động tiến tới nhanh, tốc độ di động trung bình, hình thái
bình thường của tinh trùng của 45 nam giới nhóm chứng và 36 nam giới thiểu
tinh của nhóm bệnh, kết quả như bảng sau:..........................................................37
Nhóm......................................................................................................................37
Chỉ số........................................................................................................................37
Nhóm thiểu tinh (n =36)..........................................................................................37
Nhóm chứng............................................................................................................37
(n = 45).....................................................................................................................37
p...............................................................................................................................37
TT di động tiến tới nhanh........................................................................................37

≥ 25%........................................................................................................................37
3................................................................................................................................37
(8,3)..........................................................................................................................37
41.............................................................................................................................37
(91,1)........................................................................................................................37
<0,001......................................................................................................................37
< 25%........................................................................................................................37
33.............................................................................................................................37
(91,7)........................................................................................................................37
4................................................................................................................................37
(8,9)..........................................................................................................................37
Hình thái bình thường.............................................................................................37
≥ 15%........................................................................................................................37
2................................................................................................................................37


(5,5)..........................................................................................................................37
43.............................................................................................................................37
(95,6)........................................................................................................................37
<0,001......................................................................................................................37
< 15%........................................................................................................................37
34.............................................................................................................................37
(94,4)........................................................................................................................37
2................................................................................................................................37
(4,4)..........................................................................................................................37
Tỉ lệ sống..................................................................................................................37
≥ 75%........................................................................................................................37
12.............................................................................................................................37
(33,3)........................................................................................................................37
31.............................................................................................................................37

(68,9)........................................................................................................................37
<0,001......................................................................................................................37
< 75%........................................................................................................................37
24.............................................................................................................................37
(66,7)........................................................................................................................37
14.............................................................................................................................37
(31,1)........................................................................................................................37
Tốc độ di động trung bình (µm/s)...........................................................................37
≤ 30...........................................................................................................................37
27.............................................................................................................................37
(75,0)........................................................................................................................37
6................................................................................................................................37


(13,3)........................................................................................................................37
<0,001......................................................................................................................37
30-50........................................................................................................................37
8................................................................................................................................37
(22,2)........................................................................................................................37
31.............................................................................................................................37
(68,9)........................................................................................................................37
≥ 50...........................................................................................................................37
1................................................................................................................................37
(2,8)..........................................................................................................................37
8................................................................................................................................37
(17,8)........................................................................................................................37
Nhận xét:..................................................................................................................38
Tinh trùng di động tiến tới nhanh (≥ 25%), hình thái tinh trùng bình thường (≥
15%) và tỉ lệ tinh trùng sống (≥ 75%) của nhóm thiểu tinh lần lượt là 8,3%; 5,5%;
33,3% thấp hơn so với nhóm chứng (91,1%; 95,6%; 68,9%) với p < 0,001...........38

Tinh trùng di động tiến tới nhanh (< 25%), hình thái tinh trùng bình thường (<
15%) và tỉ lệ tinh trùng sống (< 75%) của nhóm thiểu tinh lần lượt là 91,7%;
94,4%; 66,7% cao hơm so với nhóm chứng (8,9%; 4,4%; 31,1%) với p < 0,001.. .38
Ở nhóm chứng, tốc độ di chuyển của tinh trùng từ 30-50 µm/s chiếm tỉ lệ cao
nhất (68,9%), sau đó là nhóm di chuyển với vận tốc ≥ 50 µm/s (17,8%), tốc độ di
chuyển < 30 µm/s chiếm tỉ lệ thấp nhất (13,3%). Trong khi đó ở nhóm thiểu tinh,
tốc độ di động của tinh trùng < 30 µm/s chiếm tỉ lệ cao nhất (75%), tiếp theo là
nhóm di chuyển với vận tốc 30-50 µm/s (22,2%), thấp nhất là nhóm di chuyển
với vận tốc > 50 µm/s (2,8%)...................................................................................38
Như vậy, tốc độ di chuyển của tinh trùng ở nhóm chứng cao hơn rõ rệt so với
nhóm thiểu tinh với p < 0,001.................................................................................38
Hình 3.2. Hình ảnh sau khi chạy điện di trên máy soi tia UV.................................39
Quy ước N là mồi bình thường, P là mồi đột biến.................................................39
Nếu mồi N (+), mồi P (-) -> KL không có đột biến...................................................39


Nếu mồi N (+), mồi P (+) -> KL Dị hợp tử đột biến.................................................39
Nếu mồi N (-), mồi P (+) -> KL Đồng hợp tử đột biến.............................................39
Hình ảnh điện di sản phẩm ARMS- PCR ở trên cho thấy: các bệnh nhân số 1 và 2:
Dị hợp tử đột biến; bệnh nhân 3: Đồng hợp tử đột biến; bệnh nhân 4 và 5: Không
có đột biến...............................................................................................................39
Phân tích kiểu alen của đa hình gen CYP1A1 A2455G giữa hai nhóm thiểu tinh, vô
tinh và nhóm chứng, kết quả được trình bày ở bảng 3.5:.....................................41