Đánh giá ảnh hưởng của Retinoic Acid lên sự biểu hiện của các gen liên quan tới sự lão hóa và con đường tín hiệu Notch ở tế bào ung thư dạ dày MKN45 (Luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
––––––––––––––––––––

DIỆP THỊ HƯƠNG GIANG

ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA RETINOIC ACID
LÊN SỰ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN LIÊN QUAN
TỚI SỰ LÃO HÓA VÀ CON ĐƯỜNG TÍN HIỆU NOTCH
Ở TẾ BÀO UNG THƯ DẠ DÀY MKN45

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN - 2019
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
––––––––––––––––––––

DIỆP THỊ HƯƠNG GIANG

ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA RETINOIC ACID
LÊN SỰ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN LIÊN QUAN
TỚI SỰ LÃO HÓA VÀ CON ĐƯỜNG TÍN HIỆU NOTCH
Ở TẾ BÀO UNG THƯ DẠ DÀY MKN45
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 84 20 201

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Phú Hùng

THÁI NGUYÊN - 2019
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên




i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là
trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Mọi kết quả
thu được không chỉnh sửa, sao hoặc chép từ các nghiên cứu khác. Mọi trích
dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc.
Tác giả

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên




ii
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Phú Hùng đã định
hướng khoa học, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất
trong suốt quá trình tôi tiến hành nghiên cứu và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và cán bộ Khoa Công nghệ Sinh

học, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tận tình dạy dỗ, chỉ
bảo và truyền cho tôi niềm đam mê nghiên cứu khoa học.
Đề tài luận văn nhận được sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp bộ mã số
B2017 – TNA48.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã
nhiệt tình động viên cho tôi thêm động lực hoàn thành tốt quá trình học tập và
nghiên cứu khoa học.
Thái Nguyên, tháng 5 năm 2019
Tác giả

Diệp Thị Hương Giang

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên




iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii
MỤC LỤC ........................................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .................................................................. v
DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................... vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................... vii
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề...................................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu...................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3
1.1. Dịch tễ học của ung thư dạ dày .................................................................. 3
1.2. Retionic acid............................................................................................... 4
1.2.1. Khái niệm ................................................................................................ 4
1.2.2. Vai trò của Retinoic acid trong điều trị ung thư ..................................... 6
1.2.3. Thụ thể của Retionic acid trong ung thư dạ dày ........................................ 9
1.3. Sự lão hóa tế bào ...................................................................................... 10
1.3.1. Khái niệm .............................................................................................. 10
1.3.2. Các gen trong con đường tín hiệu của sự lão hóa tế bào ...................... 11
1.4. Con đường tín hiệu NOTCH .................................................................... 12
1.4.1. Vai trò của con đường tín hiệu NOTCH trong ung thư ........................ 12
1.4.2. Vai trò của con đường tín hiệu NOTCH trong ung thư dạ dày ............ 13
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHÊN CỨU ................... 15
2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 15
2.2 Địa điểm và thời gian ................................................................................ 15
2.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 16
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên




iv
2.3.1. Nuôi cấy tăng sinh tế bào 2D ................................................................ 16
2.3.2. Nuôi cấy tế bào 3D và xử lý tế bào với ATRA..................................... 16
2.3.3. Tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA ........................................ 17
2.3.4. Phân tích sự biểu hiện gen bằng Realtime PCR ................................... 17
2.3.5. Phân tích sự biểu hiện của protein P21 bằng phương pháp miễn
dịch huỳnh quang ............................................................................................ 18
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 20
3.1. Nuôi cấy tăng sinh tế bào và nuôi cấy tạo các tumorsphere 3D .............. 20

3.1.1. Nuôi tăng sinh tế bào trong điều kiện 2D ............................................. 20
3.1.2. Nuôi cấy tạo các tumorsphere 3D và xử lý tumorsphere với ATRA.... 20
3.2. Kết quả tách chiết RNA tổng số............................................................... 22
3.3. ATRA làm tăng cường sự phiên mã các gen p53, p21 và GADD45....... 23
3.4. ATRA cảm ứng sự biển hiện tăng của protein p21 ................................. 25
3.5. ATRA điều hòa sự biểu hiện các gen thuộc con đường tín hiệu phân
tử Notch ........................................................................................................... 26
3.5.1. ATRA ức chế sự biểu hiện của gen Notch............................................ 26
3.5.2. ATRA điều hòa giảm sự biểu hiện các gen mã hóa cho các Ligand
của Notch......................................................................................................... 27
KẾT LUẬN .................................................................................................... 31
KIẾN NGHỊ ................................................................................................... 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 32

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên




v
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

AMP

: Adenosine monophosphate

ATRA

: Axit retinoic all-trans

CDK

: Cyclin-dependent kinases

cDNA

: complementary DNA

CK

: Cyclin kinases

COX-2

: Cyclooxygenase-2

DAPI

: 4′,6-diamidino-2-phenylindole

DMSO

: Dimethyl sulfoxit

DNA

: Deoxyribonucleic acid

EGF

: Epidermal Growth Factor

EMT

: Biểu mô trung mô

FGF

: Fibroblast growth factor

GCSPC

: Tế bào gốc ung thư dạ dày

JNK

: Jun N-terminal kinase

mRNA

: RNA thông tin

NICD

: Vùng Notch nội bào (intracellular domain)

NRR

: Vùng điều hòa âm tính

NST

: Nhiễm sắc thể

PBS

: Phosphate buffer saline

RA

: Retinoic acid

RAR / RXR : Bộ dị vòng
RARE

: Yếu tố phản ứng RA

RARs

: Thụ thể acid retinoic

Rb

: Retinoblastoma

RNA

: Axit ribonucleic

RXR / RXR : Bộ đồng phân

RXR

: Thụ thể X retinoid

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên




vi
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Mã số các cặp mồi sử dụng cho Realtime-PCR ........................... 18
Bảng 2.2. Mã số các cặp mồi cho phản ứng Realtime PCR ......................... 18
Bảng 3.1. Nồng độ RNA tổng số thu được từ quá trình tinh sạch ................ 23

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên




vii
DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1.

Cấu trúc thế hệ thứ nhất của retioids ............................................ 5

Hình 1.2.

Cấu trúc thế hệ thứ hai của retioids .............................................. 5

Hình 1.3.

Cấu trúc thế hệ thứ ba của retioids ............................................... 5

Hình 1.4.

Cơ chế phân chia của tế bào ung thư ........................................... 7

Hình 1.5.

Con đường tín hiệu Notch........................................................... 13

Hình 3.1.

Hình ảnh nuôi cấy tăng sinh tế bào trong 3 ngày nuôi cấy......... 20

Hình 3.2.

Nuôi cấy tạo tumorsphere (A) trong 5 ngày và xử lý các
tumorsphere trong 48h với ATRA (B), mũi tên màu đen chỉ
các tế bào chết. ............................................................................ 21

Hình 3.3.

Phổ hấp thụ của RNA tổng số thu được từ quá trình tách chiết ........ 22

Hình 3.4.

Mức độ biểu hiện gene P21, P53 và GADD45A giữa mẫu
đối chứng và mẫu xử lý với ATRA. ........................................... 23

Hình 3.5 .

Ảnh hưởng của ATRA lên sự biểu hiện của protein p21 ........... 25

Hình 3.6.

Ảnh hưởng của ATRA lên sự hiệu hiện của các gen ................. 26

Hình 3.7.

Ảnh hưởng của ATRA lên sự hiểu hiện các Ligand của Notch ....... 27

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên




1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Ung thư dạ dày là bệnh lý ác tính của dạ dày. Ung thư dạ dày là loại
ung thư phổ biến thứ tư và là loại ung thư nguy hiểm thứ hai trên toàn thế
giới, với một triệu bệnh nhân mới được chẩn đoán và 600000 ca tử vong mỗi
năm [38]. Khoảng 70% các trường hợp ung thư dạ dày xảy ra ở Đông Á,
Trung và Đông Âu, Nam Phi và Trung và Nam Mỹ [43].
Việt Nam là một trong 20 quốc gia có tỷ lệ mắc ung thư dạ dày cao nhất
thế giới, với tỷ lệ mắc trung bình là 16 người trên 100 nghìn dân. Tỷ lệ sống

sót trên 5 năm của các bệnh nhân ung thư dạ dày cũng thấp dưới 20% (theo
Globocan, 2014).
Bằng chứng ủng hộ sự tồn tại của tế bào gốc ung thư trong ung thư dạ
dày đã xuất hiện trong những năm gần đây, các tế bào gốc ung thư thường
được biến đổi từ các tế bào gốc đặc hiệu của mô [73]. Tế bào gốc ung thư, lần
đầu tiên được xác định trong bệnh bạch cầu tủy cấp tính và sau đó là trong các
khối u rắn, đóng vai trò quan trọng trong việc bắt đầu ung thư. Tế bào gốc ung
thư thường là các tế bào gốc đặc hiệu mô hoặc các tế bào tiền thân khuếch đại
chuyển hóa khác biệt. Trong nghiên cứu, điều trị và phát hiện tế bào gốc ung thư
dạ dày, có thể sử dụng các chỉ thị ALDH, CD33 và CD44 [57].
Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng Retinoic acid (RA) có khả năng
ức chế sự hình thành và sinh trưởng của khối u trong nhiều loại ung thư khác
nhau như ung thư vú, ung thư tuỵ và cả ung thư dạ dày, RA có thể tác dụng
bằng cách tham gia vào quá trình này thông qua hoạt hóa con đường
apoptosis, ức chế phân chia tế bào, cảm ứng sự lão hoá (senescence) và sự
biệt hoá (differentiation) tế bào. Đặc biệt đối với ung thư dạ dày, RA có khả
năng gây biệt hoá tế bào gốc ung thư dạ dày [40]. Nghiên cứu gần đây đã chỉ
ra được all trans retinoic có khả năng ức chế tế bào gốc ung thư dạ dày, gây
biệt hoá tế bào này. Tuy nhiên vẫn còn thiếu các phân tích về ảnh hưởng của
All trans retinoic acid lên các con đường tín hiệu phân tử.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên




2
2. Mục tiêu nghiên cứu
Tìm ra cơ chế phân tử của sự ức chế tế bào ung thư dạ dày dưới tác dụng
của All trans retinoic acid thông qua việc phân tích những thay đổi về mức độ
phiên mã của các gen trong con đường tín hiệu của sự lão hoá tế bào và con

đường tín hiệu Notch.
3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Nuôi cấy tăng sinh tế bào và nuôi cấy tạo các tumorsphere
trong điều kiện nuôi cấy 3D từ các tế bào ung thư dạ dày MKN45.
Nội dung 2: Phân tích sự biểu hiện của các gen trong con đường tín hiệu
lão hoá tế bào bằng Realtime PCR.
Nội dung 3: Phân tích sự biểu hiện của các gen chủ chốt trong con đường
tín hiệu Notch bằng Realtime PCR.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên




3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Dịch tễ học của ung thư dạ dày
Ung thư dạ dày là nguyên nhân phổ biến gây tử vong liên quan đến ung
thư trên thế giới. Hiện nay ung thư dạ dày chiếm 9,7% tổng số ca tử vong liên
quan đến ung thư. Tỷ lệ tử vong cao cũng được ghi nhận ở cả hai giới ở Trung
và Đông Âu, Trung và Nam Mỹ. Đáng chú ý là Hàn Quốc, Trung Quốc và
Nhật Bản là các quốc gia có tỷ lệ mắc ung thư dạ dày cao nhất trên thế giới.
Việt Nam là một trong 20 quốc gia có tỷ lệ mắc ung thư dạ dày cao nhất thế
giới [54].
Về mặt mô học, ung thư dạ dày được chia thành hai loại là ung thư biểu
mô tuyến thể ruột và ung thư biểu mô tuyến thể phân tán, ngoài ra là một số
dạng vô định. Loại ung thư biểu mô tuyến thể phân tán xảy ra ở tất cả các
nhóm tuổi có sự phân bố giới tính bằng nhau, không giống như loại ung thư
biểu mô tuyến thể ruột chiếm ưu thế ở nam giới và người già. Loại thể phân
tán có xu hướng xâm lấn vào thành dạ dày nhiều hơn và di căn tiến triển bệnh

nhanh hơn và tiên lượng xấu hơn [42], [56].
Ung thư dạ dày có thể phát triển ở bất cứ phần nào của dạ dày, có thể lan
ra khắp dạ dày và đến các cơ quan khác của cơ thể; đặc biệt là thực quản,
phổi, hạch bạch huyết và gan. Nguyên nhân phổ biến nhất là nhiễm vi
khuẩn Helicobacter pylori (H.polyri), chiếm hơn 60% các trường hợp.
Hút thuốc, chế độ ăn uống và béo phì là các yếu tố nguy cơ khác. 1% đến
3% trường hợp là do di truyền từ cha mẹ bị ung thư dạ dày, Nhật Bản và
Hàn Quốc là hai quốc gia có tỷ lệ mắc cao. Ở các nước phát triển và đang
phát triển tỉ lệ nhiễm H.polyri lần lượt là 35% và 85%. Ước tính rằng
khoảng 65% - 80% bệnh ung thư dạ dày không ở tâm vị là do nhiễm H.
pylori và có khả năng phòng ngừa được [61]. Ở Nhật Bản và các nước
khác, sử dụng dương xỉ diều hâu và bào tử làm thức ăn cũng có liên quan đến
tỉ lệ mắc bệnh ung thư dạ dày nhưng nguyên nhân chưa được làm rõ. Tỉ lệ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên




4
mắc bệnh ung thư dạ dày chiếm đa số ở đàn ông, có nơi tỉ lệ mắc ở đàn ông/phụ
nữ là 2/1. Hoóc môn estrogen có thể giúp bảo vệ phụ nữ khỏi căn bệnh này và
một tỉ lệ nhỏ ung thư dạ dày dạng phân tán có thể do di truyền [4], [6].
1.2. Retionic acid
1.2.1. Khái niệm
Retinoic acid (RA) là một phân tử lipophilic nhỏ có nguồn gốc từ
vitamin A. Đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển, biệt hóa của tế bào.
RA được dùng trong y học, có tác dụng điều tiết sự tăng trưởng tế bào biểu
mô [45].
Retinoids là những hóa chất có cấu trúc hoặc chức năng tương tự retinol,
hoặc vitamin A, thiết yếu cho sự phát triển phôi thai và cân bằng nội môi cơ

thể trưởng thành. Các retinoids giữ lại đuôi kỵ nước polyene gắn vào vòng 6
carbon tuần hoàn. Đuôi polyene được đặc trưng bởi các liên kết đôi carboncarbon liên hợp xen kẽ, làm cho retinoids nhạy cảm với ánh sáng. Ngược lại
với các protein tín hiệu khác, retinoids có trọng lượng phân tử thấp hơn nhiều
(300 Da). Retinoids có khả năng hòa tan trong dầu cao và có thể khuếch tán
qua màng tế bào. Hơn 4.000 phân tử tự nhiên và tổng hợp liên quan đến
vitamin A đã được báo cáo. Ba dạng hoạt động chính của retinoids tự nhiên
đã được nghiên cứu rộng rãi: All-trans, 9-cis và 13-cis với All-trans là dạng
sinh lý được quan tâm hơn cả. Retinoids liên quan đến tăng trưởng tế bào, đáp
ứng miễn dịch và tăng trưởng biểu mô thông qua tương tác với các thụ thể hạt
nhân, thụ thể retinoic acid và thụ thể X retinoid [45], [41].
Có ba thế hệ của retinoids:


Thế

hệ

đầu

tiên

gồm có:

retinol, retinal,

tretinoin

(retinoic

acid), isotretinoin, và alitretinoin.



Thế hệ thứ hai bao gồm: etretinate và acitretin - chất chuyển hóa của nó.



Thế hệ thứ ba gồm: adapalene, bexarotene, và tazarotene.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên




5

Hình 1.1. Cấu trúc thế hệ thứ nhất của retioids

Hình 1.2. Cấu trúc thế hệ thứ hai của retioids

Hình 1.3. Cấu trúc thế hệ thứ ba của retioids
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên




6
Retinoids có nhiều chức năng quan trọng đối với cơ thể như thị lực, sự
tăng sinh tế bào và sự biệt hóa tế bào, sự phát triển của tế bào xương, chức
năng miễn dịch và sự kích hoạt các gen ức chế khối u, sự phát triển của thai
nhi bao gồm xương, mắt, tai, tim, phổi và hocmon tăng trưởng, sự sinh tinh

trùng [25]. Sự tăng trưởng sau sinh [11], cân bằng nội môi [17].
1.2.2. Vai trò của Retinoic acid trong điều trị ung thư
Hiện nay tại Việt Nam Retinoic acid chưa được nghiên cứu rộng rãi,
tuy nhiên trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu tác dụng của Retinoic acid,
đặc biệt là ảnh hưởng của nó lên các tế bào ung thư.
Retinoic acid được sử dụng trong điều trị nhiều bệnh khác nhau, trong
đó có ung thư. Ung thư là một trong những căn bệnh thế kỷ chiếm tỷ lệ tử
vong cao. Có rất nhiều tác nhân gây ung thư, tất cả đều làm biến đổi và đột
biến các tế bào trong cơ thể dẫn đến sự tăng sinh mất kiểm soát của các tế bào
này. Cơ thể được cấu tạo bởi nhiều loại tế bào, các tế bào phát triển và phân
chia một cách có kiểm soát, các tế bào được “chết” theo chương trình đã được
lập sẵn (quá trình Apoptosis) và thay vào là các tế bào mới khỏe mạnh để duy
trì các chức năng của cơ thể.
Các tác nhân gây đột biến như hóa chất độc hại, tia phóng xạ, các virus
ung thư làm cho các tế bào bình thường bị đột biến gen hoặc nhiễm sắc thể,
nên tế bào mất khả năng kiểm soát sự phân chia và liên kết tế bào. Vật liệu di
truyền (DNA) của một tế bào bị thay đổi hoặc hư hỏng, làm tăng sinh vô tổ
chức các tế bào “lỗi”- tế bào ung thư. Các tế bào ung thư này không chết đi
theo chương trình được lập trình sẵn (quá trình Apoptosis) như các tế bào
bình thường mà tiếp tục tăng sinh và nhân lên mất kiểm soát. Các tế bào này
có thể tạo thành một khối lớn gọi là khối u.
Không phải khối u nào cũng là ung thư. Các khối u không lây lan ra các
phần khác của cơ thể là khối u lành tính-không phải ung thư. Các khối u lành
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên




7
tính được cắt bỏ, và đa số sẽ không quay trở lại. Các khối u có khả năng di

căn sang các phần khác gọi là u ác tính, được gọi là ung thư.
Cơ chế gây bệnh ung thư do đột biến gen làm mất kiểm soát chu kì tế
bào. Cơ thể có 2 nhóm gen kiểm soát chu kì tế bào là: Nhóm gen quy định
yếu tố sinh trưởng và nhóm gen ức chế khối u. Ở các tế bào bình thường, 2
nhóm gen này hoạt động nhịp nhàng và hài hòa với nhau. Tuy nhiên, khi có
đột biến, cơ chế hoạt động này bị phá hủy.

Hình 1.4. Cơ chế phân chia của tế bào ung thư [29]
Retinoic acid đã được nghiên cứu rộng rãi để sử dụng trong điều trị các
dạng ung thư khác nhau không chỉ trong phòng ngừa mà còn trong điều trị.
Trường hợp bình thường trong cơ thể, retinoic acid có tác dụng phòng ngừa
chống lại sự hình thành ung thư. Sau khi hình thành ung thư, RA trở thành kẻ
tấn công các tế bào ung thư, ngăn chặn sự phát triển và phân chia của chúng,
cũng kích hoạt sự biệt hóa và chết của chúng thông qua các con đường cụ thể.
RA cũng đã được chứng minh là hợp tác với các loại thuốc điều trị ung thư
hiệu quả khác chống lại sự tiến triển của ung thư. Các nhà khoa học đã tìm ra
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên




8
RA có tác dụng ức chế sự tăng trưởng của khối u ác tính và sự hình thành
khối u ác tính ở người [47]. Tác dụng của RA cũng đã được tìm thấy có liên
quan đến sự kích hoạt protein kinase phụ thuộc AMP và sialyltransferase tuần
hoàn [12]. Mặt khác, điều biến của sự kết dính tế bào khối u ác tính với các
thành phần màng đáy đã được chứng minh là bị ảnh hưởng bởi điều trị bằng
RA [58]. RA cũng đã được sử dụng để ức chế các tế bào u ác tính B16F10 di
căn cao bằng cách điều chỉnh các thụ thể integrin bề mặt tế bào chống lại các
protein ngoại bào, đặc biệt là laminin và vitronectin [48]. Sự hình thành của

khối u ác tính có liên quan đến bức xạ, RA đã được tìm thấy để sửa đổi độ
nhạy của sóng radio và phục hồi từ tổn thương tia X trong ống nghiệm [46].
Ngoài khả năng ức chế sự tăng trưởng, RA cũng có khả năng ức chế sự xâm
lấn tế bào khối u ác tính ở người [60].
Retinoic acid và ung thư gan: RA có thể trực tiếp gây ra sự gia tăng tổng
hợp protein của transferrin và albumin trong các tế bào Hep3B, RA đã được
chứng minh có thể điều chỉnh biểu hiện gen của kháng nguyên bề mặt virus
viêm gan B (HBsAg) trong tế bào gan. Đã có những nghiên cứu về ung thư
tập trung vào sự tham gia của topoisomerase trong tăng trưởng tế bào ung
thư, RA có thể ức chế sự biểu hiện của topoisomerase II trong các tế bào
Hep3B. Như vậy RA thực sự là một hợp chất tiềm năng để ngăn chặn sự
phát triển của ung thư gan hoặc kết hợp với một số loại thuốc để hỗ trợ
điều trị ung thư gan [19].
RA và ung thư phổi: Tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong của ung thư phổi làm cho
căn bệnh này trở thành một chủ đề quan trọng trong nghiên cứu ung thư. Sự
bắt giữ G1 qua trung gian RA có liên quan đến việc gây ra sự ức chế p27 và
Cdk3 trong các tế bào ung thư biểu mô vảy phổi. Syndecan-1 là một
proteoglycan làm trung gian sự kết dính của tế bào và ngăn chặn sự xâm lấn
trong các tế bào biểu mô. RA có thể làm tăng biểu hiện syndecan-1 để ngăn
chặn sự xâm lấn, di căn của ung thư phổi. RA còn được tìm thấy để làm giảm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên




9
bệnh thần kinh do hóa trị liệu trong một mô hình động vật cũng như bệnh
nhân ung thư phổi [2].
RA và ung thư vú: Năm 1970 lần đầu tiên ứng dụng của RA đã được đề
cặp và cho đến nay đã có rất nhiều nghiên cứu phát hiện tác dụng của RA đối

với điều trị ung thư vú theo các hướng khác nhau. Đáng chú ý, RA có thể gây
ra sự biệt hóa của các tế bào biểu mô vú biến đổi sớm [1], cho thấy RA có vai
trò phòng ngừa đối với bệnh ung thư vú. RA cũng làm giảm sự phát triển ung
thư vú và di căn phổi [7].
RA và ung thư tuyến tiền liệt: các tế bào ung thư tuyến tiền liệt mong
muốn bổ sung androgen trong giai đoạn đầu của bệnh, 5α-reductase trở nên
quan trọng để cung cấp androgen mạnh. RA đã được tìm thấy có khả năng ức
chế 5α-reductase và do đó trở thành phương pháp điều trị ung thư tuyến tiền
liệt. RA có thể làm chậm sự tiến triển của ung thư tuyến tiền liệt và thúc đẩy
quá trình “tự chết” của các tế bào ung thư. Ngoài ra, cũng giống như ung thư
vú, RA cũng có khả năng ức chế ung thư tiền liệt tuyến theo nhiều hướng
khác nhau [20].
1.2.3. Thụ thể của Retionic acid trong ung thư dạ dày
Retinoid đã được chứng minh là ức chế sự phát triển của nhiều tế bào
khối u ở người. Mặc dù cơ chế phân tử chính xác của ức chế tăng trưởng qua
trung gian retinoid vẫn chưa được biết đến, nhưng tầm quan trọng của thụ thể
acid retinoic (RARs) và thụ thể X retinoid (RXR) đã được nghiên cứu trên tế
bào khối u.
RA tác động đến sự tăng trưởng, biệt hóa và apoptosis của các tế bào
biểu mô bình thường, tiền ung thư và ác tính trong điều kiện in vivo và in
vitro [31]. Tác dụng của RA chủ yếu qua trung gian hai loại thụ thể là retinoic
acid (RARs) và thụ thể X retinoid (RXR) [71], thuộc về họ thụ thể
steroid/tuyến giáp và được mã hóa bởi ba gen khác nhau α, β và γ. Các RXR
tạo thành các bộ đồng phân (RXR/RXR) và các bộ dị vòng (RAR/RXR) với
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên




10

RAR, sau đó liên kết với các yếu tố phản ứng RA cụ thể (RARE), điều chỉnh
tích cực và ngăn chặn các hoạt động phiên mã của chúng đối với các gen đích
[72], [26]. Các thụ thể này phát huy các chức năng cụ thể và có tác dụng
chống ung thư khác nhau trong các dòng tế bào ung thư khác nhau.
Nghiên cứu của Su Liu và cộng sự đánh giá vai trò của gen RARα làm
thụ thể tác dụng của axit retinoic all-trans (ATRA) trong các tế bào ung thư dạ
dày. ATRA có thể làm cho RARα biểu hiện trong các tế bào MGC80-3,
BGC-823 và SGC-7901 một cách rõ ràng, dẫn đến ức chế tăng trưởng của các
dòng tế bào này. Sau khi gen RARα được chuyển vào các tế bào MKN-45
biểu hiện mức RARα khá thấp và không thể được tạo ra bởi ATRA, sự tăng
trưởng tế bào bị ức chế rõ rệt bởi ATRA. Ngược lại, khi gen RARα antisense
được chuyển vào các tế bào BGC-823, thấy có một ức chế nhỏ của ATRA, so
với các tế bào BGC-82. ATRA có thể tạo ra hoạt động phiên mã của βRARE
trong các dòng tế bào MGC80-3, BGC-823, SGC-7902 và MKN/RARα,
nhưng không phải trong các dòng tế bào MKN45 và BGC/aRARα. Như vậy,
ATRA ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư dạ dày bằng cách điều chỉnh
tăng mức độ RARα; RARα là chất trung gian chính trong hoạt động của ATRA
trong các tế bào ung thư dạ dày. Kết quả đã chỉ ra rằng RARα là cần thiết cho
ATRA để gây ức chế tăng trưởng trên các tế bào ung thư dạ dày [52].
1.3. Sự lão hóa tế bào
1.3.1. Khái niệm
Lão hóa tế bào là một trạng thái mà các tế bào bình thường ngừng phân
chia, do sự ngắn đi của các đoạn telomere ở đầu mút nhiễm sắc thể sau chu kỳ
DNA nhân đôi. Ngoài ra, một số thay đổi ở chức năng của ty thể, biến đổi của
DNA và một số tác động từ bên ngoài đều có thể gây ra sự lão hóa tế bào
[33]. Lão hóa là một đặc tính phổ biến của các sinh vật. Trong số các sinh vật
đa bào, lão hóa được đánh dấu bằng sự suy giảm dần dần chức năng của nhiều
tế bào và mô dẫn đến sự chết tế bào. Đặc điểm nổi bật nhất của lão hóa là mất
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên

11
dần chức năng và thoái hóa, xảy ra ở cấp độ phân tử, tế bào, mô và sinh vật. Ở
động vật có vú, thoái hóa liên quan đến tuổi làm phát sinh các bệnh lý như: xơ
vữa động mạch và suy tim, loãng xương, thoái hóa điểm vàng, suy phổi, suy
thận, thoái hóa thần kinh. Các tế bào phát triển và phân chia một cách có kiểm
soát, các tế bào được “chết” theo chương trình đã được lập sẵn và thay vào là
các tế bào mới khỏe mạnh để duy trì các chức năng của cơ thể. Các tác nhân
gây đột biến làm cho các tế bào bình thường bị đột biến gen hoặc nhiễm sắc
thể, hay một số thay đổi ở mức độ phân tử làm cho một số gen ức chế ung thư
bị bất hoạt làm cho tế bào mất khả năng kiểm soát sự phân chia và liên kết tế
bào, tăng sinh vô tổ chức và nhân lên mất kiểm soát, không có hiện tượng lão hóa hình
thành ung thư [3], [5].
1.3.2. Các gen trong con đường tín hiệu của sự lão hóa tế bào
Gen p53 không cho các gen bị tổn thương tự nhân lên. Khi có một thay
đổi lớn trong tế bào, protein p53 còn gọi là "vệ sĩ của bộ gen" sẽ phát đi một
hiệu lệnh để tế bào này tự hủy. Đây là một protein quan trọng nằm trong điều
hòa chu kỳ tế bào - gọi là gen áp chế khối u p53. Khi có tổn thương ở DNA,
p53 làm ngừng chu kỳ tế bào cho đến khi DNA bị tổn thương được sửa chữa
hoặc p53 có thể làm cho tế bào chết theo lập trình nếu không còn khả năng
sửa chữa DNA. Các yếu tố lối sống ảnh hưởng đến cơ chế hoạt động bình
thường của gen p53. Rb (retinoblastoma) là gen có chức năng ngăn cản diễn
tiến chu kỳ tế bào bằng cách gắn kết với E2F1 và ngăn cản sự sao chép các
gen cần thiết cho tế bào. Sở dĩ p53 ngăn cản được chu trình tế bào vì nó hoạt
hóa quá trình phiên mã tạo ra CKI, p21 để luân phiên ức chế sự hoạt hóa
của CDK. Một khi CDK bị hoạt hóa nó sẽ phosphoryl hóa Rb và làm mất tác
dụng của Rb. Protein p16INK4a là sản phẩm từ sự mã hóa của gen JNK4, còn
được gọi là protein ức chế ung thư p16JNK4a. Protein này có vai trò trong

sự điều hòa chu trình tế bào khi ở dạng liên kết. Sự biểu hiện p16JNK4a liên
quan đến quá trình lão hoá của tế bào và được thừa nhận là chi phối quá trình
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên




12
lão hóa. Khi càng lớn tuổi thì nồng độ p16JNK4a sẽ càng cao. Kết quả nghiên
cứu từ các tế bào có các nguồn gốc khác nhau như tủy xương, tuyến nội tiết ở
tụy. Cũng như não cho thấy là p16JNK4a đã chi phối quá trình lão hóa bằng
cách giới hạn sự tự làm mới của các tế bào có khả năng nhân đôi [50].
Chương trình lão hóa có vai trò quan trọng trong ức chế tế bào tự tăng sinh.
1.4. Con đường tín hiệu NOTCH
1.4.1. Vai trò của con đường tín hiệu NOTCH trong ung thư
Sự thay đổi của con đường tín hiệu Notch có thể dẫn đến các khối u ác
tính của con người, bao gồm cả ung thư dạ dày vì con đường này có vai trò
quan trọng trong điều hòa các quá trình của tế bào như sự phân chia, biệt hóa,
quá trình tự chết hay tự làm mới của tế bào. Con đường này có thể trở thành
một dấu hiệu tiên lượng của ung thư dạ dày và là mục tiêu mới trong điều trị
ung thư dạ dày. Notch có 4 thụ thể là: Notch1, 2, 3 và 4. Chúng được tổng
hợp như một dạng tiền chất bao gồm các miền ngoại bào, xuyên màng và nội
bào. Trong bộ máy Golgi, protein Notch tiền thân bị cắt tạo ra hai tiểu đơn vị.
Một tiểu đơn vị chứa hầu hết các miền ngoại bào và tiểu đơn vị thứ hai bao
gồm phần còn lại của miền ngoại bào và xuyên màng. Họ Notch có 5 thành
viên là Jagged1, Jagged2, Delta1, Delta2, và Delta3 là các protein xuyên
màng loại I. Miền ngoại bào của thụ thể Notch đã được chứng minh có chứa
36 lần lặp lại [27]. Ligand liên kết với vùng lặp lại, mở ra vùng điều hòa âm
tính (NRR) cho phép phân cắt tiếp bởi các metallprotease, giải phóng vùng
Notch nội bào (NICD) vào trong nhân tế bào, tại đó nó đóng vai trò như một

yếu tố đồng phiên mã [28]. Trong nhân tế bào, NICD liên kết với protein gắn
kết DNA RBP-J và các protein đồng hoạt hoá khác trước khi hoạt hoá sự
phiên mã các gen đích có vị trí gắn kết với protein RGP-J. Một số gen được
điều hoà bởi con đường tín hiệu Notch đã được xác định ở cả tế bào thường
và tế bào ung thư, đặc biệt, gen Hes và Hey mã hoá cho yếu tố phiên mã kẹp
tóc (Helix-loop-Helix) và gen CD25 của tế bào T [30].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên




13

Hình 1.5. Con đường tín hiệu Notch [36]
1.4.2. Vai trò của con đường tín hiệu NOTCH trong ung thư dạ dày
Các nghiên cứu mới nhất đã chỉ ra rằng trong niêm mạc dạ dày bình
thường, tín hiệu Notch có liên quan đến quá trình biệt hóa biểu mô dạ dày.
Kết quả của các nghiên cứu này đã chứng minh rằng biểu hiện của Notch1,
Notch3, Jagged1, Jagged2 và Hes1 đã được tìm thấy trong ung thư dạ dày ở
người [23]. Thụ thể Notch như Notch1, Notch2 và Notch3, Jagged1 và
Jagged2 cũng đã được phát hiện trong các mẫu mô ung thư dạ dày của con
người. Biểu hiện của Notch1 xuất hiện ở cả mô tiền ung thư và ung thư,
Notch1 có thể đóng một vai trò quan trọng trong cả việc thúc đẩy quá trình
chuyển hóa của các tế bào biểu mô dạ dày và trong việc duy trì sự tăng sinh
liên tục của các tế bào biểu mô đường ruột [53], [59].
Trong số các con đường tín hiệu khác liên quan đến ung thư dạ dày thì
con đường tín hiệu STAT3 và con đường Twist cũng được nghiên cứu. Thụ
thể Notch1 trong các tế bào ung thư dạ dày được kích hoạt sẽ thúc đẩy
tương tác giữa Twist và promoter STAT3, sự biểu hiện của Notch1 khởi
động sự photphorin hoá STAT3, cảm ứng sự hoạt hoá promoter Twist và

tăng cường sự hình thành các colony, sự di căn và xâm lấn của các tế bào
ung thư dạ dày [18].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên




14
Các tín hiệu Notch1 và Notch2 có thể khởi động quá trình phát sinh
ung thư dạ dày thông qua cảm ứng sự biểu hiện của cyclooxygenase-2 COX2. Murata và cộng sự đã chứng minh rằng sự biểu hiện quá mức COX-2 trong
ung thư dạ dày có mối tương quan cao với sự xâm lấn của khối u vào các
mạch bạch huyết trong thành dạ dày và di căn đến các hạch bạch huyết [39].
COX-2 có thể có tác động đến quá trình hình thành khối u. Do đó, có thể ức
chế COX-2 bằng cách bất hoạt gen COX-2 bởi quá trình methyl hóa từ đó làm
giảm sự phát triển của khối u [35].
Tóm lại, con đường tín hiệu Notch có liên quan đến sinh bệnh học của
các khối u đường tiêu hóa như ung thư dạ dày và ruột kết. Sự hiểu biết về con
đường tín hiệu Notch trong các mô ở điều kiện sinh lý ở những người có biến
đổi ác tính sẽ gợi ý đến một hướng điều trị ung thư mới.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên




15
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Dòng tế bào ung thư dạ dày MKN45 do phòng thí nghiệm Inserm U1053
- Viện Sức khỏe và nghiên cứu Y học Quốc gia Pháp tại Bordeaux cung cấp.

Dòng tế bào được bảo quản trong nitơ lỏng tại Phòng thí nghiệm Y sinh –
Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên.
All trans retionic acid được cung cấp bởi hãng Sigma Aldrick (Pháp).
Các hóa chất sử dụng trong nuôi cấy tế bào: môi trường nuôi cấy
DMEMF12 và RPMI1640 (Invitrogen cung cấp), huyết thanh bò, trypsin,
kháng sinh Penicillin/Streptomycin, DMSO (Sigma cung cấp).
Các hóa chất sử dụng trong tách chiết RNA và phản ứng Realtime PCR:
RNeasy Mini Kit (Qiagen), Quantitect Reverse Transcriptase (RT) Kit
(Qiagen), TOPreal qPCR 2X PreMix SYBR (Enzynomics).
Các primer dùng trong phân tích mức độ biểu hiện gen do hãng Qiagen
cung cấp.
Các đĩa nuôi cấy tế bào, ống pipette và một số dụng cụ nhỏ khác do
Thermo Fisher cung cấp.
Các thí nghiệm được triển khai trên các hệ thống trang thiết bị hiện đại
gồm máy Realtime PCR (Analytic gena) hệ thống nuôi cấy tế bào
(Memmert), buồng thao tác sinh học an toàn sinh học cấp 2 (Thermo Fisher)
và các trang thiết bị phụ trợ hiện đại khác tại Phòng thí nghiệm Y sinh –
Trường Đại học Khoa học.
2.2. Địa điểm và thời gian
Nghiên cứu được thực hiện tại các Phòng thí nghiệm Y sinh – Trường
Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên.
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 04/2018 đến tháng 05/2019.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên




16
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Nuôi cấy tăng sinh tế bào 2D

100.000 tế bào ung thư dạ dày dòng MKN45 được nuôi cấy trong hộp
nuôi cấy diện tích 75 cm2, trong môi trường nuôi cấy RPMI 1640 (Invitrogen)
bổ sung 10% Huyết thanh bò và kháng sinh 1% Penicilline/streptomycine.
Môi trường nuôi cấy được thay ngày một lần bằng một môi trường nuôi cấy
mới. Sau 5 ngày nuôi cấy, các tế bào được xử lý với trypsine 0,05% trong 3
phút. Tế bào được thu lại bằng ly tâm 1300 rpm/phút trong 5 phút và được
cấy chuyển sang một bình nuôi cấy mới. Tế bào sống, chết được đếm dưới
kính hiển vi đảo ngược, xử dụng trypan blue làm thuốc nhuộm cho tế bào
chết. Hình ảnh tế bào được chụp ảnh bằng kính hiển vi đảo ngược Nikon
Eclipse 2.
2.3.2. Nuôi cấy tế bào 3D và xử lý tế bào với ATRA
Nuôi cấy các tế bào ung thư dạ dày MKN45 với mật độ 2000 tế
bào/giếng nuôi cấy có diện tích 3,8 cm2, bề mặt không bám dính để hình
thành nên tumorsphere (khối tế bào ung thư hình cầu). Sử dụng môi trường
DMEMF12/Glutamax

(từ

Invitrogen)

có

bổ

sung

1%

ampinicillin/streptomycin, yếu tố tăng trưởng biểu mô EGF 20 ng/ml, yếu tố
tăng trưởng thượng bì FGF 20ng/ml, 0,3% glucose, 5µg/ml insulin ở 370C,

5% CO2. Mỗi 2 ngày của quá trình nuôi cấy, loại bỏ 1 ml môi trường nuôi cấy
cũ, đồng thời bổ sung 1 ml môi trường nuôi cấy mới.
Sau 5 ngày nuôi cấy, các tế bào được xử lý với ATRA ở nồng độ 5µM (
nồng độ ức chế sự tăng sinh tế bào được lựa chọn từ một sàng lọc trong giải
nồng độ từ 0 – 10µM trước khi tiến hành nghiên cứu) trong 48 giờ. Mẫu đối
chứng được xử lý bằng DMSO nồng độ 0,01% trong thời gian tương ứng với
mẫu xử lý ATRA. Thu nhận và phân tách các tumorsphere thành các tế bào
đơn bằng enzyme trypsine nồng độ 0,05% trước khi tách chiết RNA tổng số
(hóa chất được cung cấp bởi Sigma, Saint-Quentin Fallavier, France).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên