Ứng dụng mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn đánh giá ảnh hưởng của các phương thức quản lý khác nhau lên độ mẫn cảm đối với virus gây hội chứng đốm trắng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
****0O0****








ĐẶNG TRẦN QUÂN




ỨNG DỤNG MÔ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC
NGHIỆM CHUẨN ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG CỦA
β-1,3/1,6-GLUCAN VÀ VITAMIN C LÊN ĐỘ MẪN
CẢM ĐỐI VỚI VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM
TRẮNG (White spot syndrome virus-WSSV) CỦA
TÔM SÚ (Penaeus monodon)



LUẬN VĂN KỸ SƢ
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh
-Tháng 9/2006-
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
****0O0****












ỨNG DỤNG MÔ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC
NGHIỆM CHUẨN ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG CỦA
β-1,3/1,6-GLUCAN VÀ VITAMIN C LÊN ĐỘ MẪN
CẢM ĐỐI VỚI VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM
TRẮNG (White spot syndrome virus-WSSV) CỦA
TÔM SÚ (Penaeus monodon)

LUẬN VĂN KỸ SƢ
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC



Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện
TS. NGUYỄN VĂN HẢO ĐẶNG TRẦN QUÂN
ThS. NGÔ XUÂN TUYẾN KHÓA: 2002 – 2006



Thành phố Hồ Chí Minh
-Tháng 9/2006-




MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
NONG LAM UNIVERSITY, HCMC
FACULTY OF BIOTECHNOLOGY


APPLICATION OF STANDARDIZIED
CHALLENGE MODEL TO TEST THE EFFICACY
OF β-1,3/1,6-GLUCAN AND VITAMIN C ON THE
SUCCEPTIBILITY OF BLACK TIGER SHRIMP
(Penaeus monodon) TO WHITE SPOT SYNDROME
VIRUS (WSSV)



GRADUATION THESIS
MAJOR: BIOTECHNOLOGY



Professor Student
Dr. NGUYEN VAN HAO DANG TRAN QUAN
MSc. NGO XUAN TUYEN TERM: 2002 - 2006





HCMC, 09/2006





iv

LỜI CẢM TẠ


Tôi xin chân thành cám ơn quý thầy cô trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí
Minh đã truyền đạt cho tôi kiến thức trong những năm học vừa qua.
Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp này, tôi đã nhận sự giúp rất nhiều từ các thầy cô
và các anh chị công tác ở Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. Trong đó tôi xin
chân thành cảm ơn:
- TS. Nguyễn Văn Hảo đã tận tình giải đáp những vƣớng mắc trong quá trình
thực tập, giúp tôi hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp.
- ThS. Ngô Xuân Tuyến là ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn về phƣơng pháp nghiên
cứu, tài liệu khoa học, giúp tôi hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp.
- Kỹ sƣ Phạm Thị Tuyết Anh đã tận tình hƣớng dẫn tôi về mặt thao tác trong
phòng thí nghiệm, giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực tập.
- Các anh chị ở phòng Mô, các anh chị ở trại thực nghiệm Thủ Đức đã tạo mọi
điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập vừa qua.
Cuối cùng là cảm ơn các bạn lớp Công nghệ sinh học 28 thân mến đã cùng tôi
đồng hành trên suốt chặng đƣờng đại học.
Tp.Hồ Chí Minh, ngày…tháng…năm 2006
Sinh viên

Đặng Trần Quân

v
TÓM TẮT
Trong công nghệ nuôi tôm hiện nay, đặc biệt là các mô hình nuôi tôm mật độ
cao, việc áp dụng các giải pháp, phƣơng thức quản lý nhằm tăng cƣờng hiệu quả sản
xuất đóng góp đáng kể vào năng suất nuôi. Giải pháp quản lý sử sụng các sản phẩm
sinh học tăng cƣờng sức khỏe cho tôm thông qua việc tăng cƣờng hiệu quả đáp ứng
miễn dịch của tôm với mầm bệnh, nhất là với mầm bệnh virus, đƣợc xem là giải pháp
khá quan trọng. Trong thí nghiệm này, chúng tôi đánh giá sự thay đổi tính mẫn cảm
của tôm sú tiền trƣởng thành Penaeus monodon đối với virus đốm trắng (WSSV) sau
khi ứng dụng các giải pháp bổ sung các chất kích thích miễn dịch, vitamin C và β-
1,3/1,6-glucan vào thức ăn nuôi tôm trong khoảng thời gian nhất định. Sử dụng mô
hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn đƣợc xây dựng bởi Phòng thí nghiệm virus - Đại
học Gent, Vƣơng Quốc Bỉ, kỹ thuật xét nghiệm hóa mô miễn dịch và phƣơng pháp
tiêm mô dịch gốc virus đốm trắng dòng Việt Nam (WSSV-VN) đã đƣợc tinh sạch và
xác định độc lực thông qua chuẩn độ để xác định sự thay đổi độ mẫn cảm đối với virus
của tôm. Thí nghiệm đƣợc tiến hành với hai liều tiêm cao và thấp của độ chuẩn SID
50

của dịch gốc WSSV-VN cho tôm sú tiền trƣởng thành sau khi đã nuôi với 3 nghiệm
thức thức ăn có bổ sung β-1,3/1,6-glucan (10g/kg thức ăn), bổ sung vitamin C (5g/kg
thức ăn) và không bổ sung trong thời gian 15 ngày. Gây nhiễm thực nghiệm cho tôm ở
liều thấp (10
1,5
SID

50
) và liều cao (10
4
SID
50
) của dịch virus WSSV-VN cho 3 nhóm
tôm thuộc 3 nghiệm thức trên. Thu mẫu tôm ở các thời điểm khác nhau sau gây nhiễm:
0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120 giờ, để khảo sát sự thay đổi độ mẫn cảm
thông qua đánh giá sự biến đổi tình trạng sức khỏe tôm và tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV
trên tôm giữa các nghiệm thức. Kết quả thu đƣợc ở thí nghiệm gây nhiễm với liều
thấp, tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV của tôm ở 3 nghiệm thức β-1,3/1,6-glucan, vitamin C
và đối chứng lần lƣợt là 4,12, 3,49 và 4,94%. Sự khác biệt về tỷ lệ tế bào nhiễm giữa 3
nghiệm thức này không có ý nghĩa (P>0,05). Các dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm
trắng xuất hiện sớm hơn ở nghiệm thức đối chứng so với 2 nghiệm thức còn lại. Chƣa
thấy rõ sự khác biệt giữa nghiệm thức β-1,3/1,6-glucan và vitamin C. Thí nghiệm gây
nhiễm với liều cao, tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV của tôm ở 3 nghiệm thức β-1,3/1,6-
glucan, vitamin C và đối chứng lần lƣợt là 3,04, 3,69 và 4,49%. Chỉ có sự khác biệt có
ý nghĩa (P<0,05) về tỷ lệ này giữa nghiệm thức đối chứng với β-1,3/1,6-glucan. Các





vi
dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng xuất hiện sớm hơn ở nghiệm thức đối chứng so
với 2 nghiệm thức còn lại. β-1,3/1,6-glucan thể hiện rõ tác dụng làm giảm độ mẫn cảm
với WSSV của tôm sú. Trong từng phƣơng thức quản lý, tỷ lệ tế bào nhiễm ở 2 liều
tiêm không có sự khác biệt (P>0,05). Ở nhóm tiêm với liều cao, các dấu hiệu lâm sàng
của bệnh đốm trắng đến sớm hơn nhóm tiêm liều thấp.

vii
MỤC LỤC

Trang tựa .................................................................................................................... i
Lời cảm ơn ............................................................................................................... iii
Tóm tắt ..................................................................................................................... iv
Mục lục .................................................................................................................... vi
Danh sách các chữ viết tắt ...................................................................................... vii
Danh sách các bảng ................................................................................................. ix
Danh sách các hình ................................................................................................... x
PHẦN 1. MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1
1.1 Đặt vấn đề ..................................................................................................... 1
1.2 Nội dung ........................................................................................................ 1
1.3 Mục tiêu ........................................................................................................ 2
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3
2.1 Hệ miễn dịch của tôm sú ............................................................................... 3
2.2 Bệnh đốm trắng trên tôm sú .......................................................................... 5
2.2.1 Lịch sử và phân bố bệnh đốm trắng ..................................................... 5
2.2.2 Tác nhân gây bệnh ................................................................................ 5
2.2.3 Dấu hiệu bệnh lý ................................................................................... 6
2.2.4 Phƣơng thức lan truyền ........................................................................ 6
2.3 Các phƣơng thức quản lý nhằm tăng cƣờng sức chịu đựng của tôm đối với
bệnh đốm trắng ......................................................................................................... 7
2.3.1 Chất kích thích miễn dịch ..................................................................... 7
2.3.2 Vaccin ................................................................................................. 10
2.3.3 Vitamin ............................................................................................... 11
2.3.4 Fucoidan ............................................................................................. 12
2.4 Mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn WSSV trên tôm ........................... 13
2.4.1 Sơ lƣợc về mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn ........................... 13

2.4.2 Ứng dụng của mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn ...................... 14
2.5 Sơ lƣợc về hóa mô miễn dịch ..................................................................... 15
2.5.1 Nguyên lý ........................................................................................... 15
2.5.2 Các phƣơng pháp nhuộm .................................................................... 15
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIỆN CỨU ................................ 16
3.1 Thời gian và địa điểm ................................................................................. 16
3.2 Vật liệu nghiên cứu ..................................................................................... 16
3.2.1 Vật liệu sinh học ................................................................................. 16
3.2.2 Dụng cụ và hóa chất ........................................................................... 16
3.2.2.1 Dụng cụ ................................................................................... 16
3.2.2.2 Hoa chất .................................................................................. 17
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................ 19
3.3.1 Phƣơng pháp pha loãng dịch huyền phù virus ................................... 19
3.3.2 Phƣơng pháp gây nhiễm WSSV trên tôm sú ...................................... 19
3.3.3 Phƣơng pháp thu mẫu cho IHC .......................................................... 19
3.3.4 Phƣơng pháp xác định WSSV trên tôm bằng kỹ thuật IHC ............... 19
3.3.5 Phƣơng pháp tính tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) trên tôm thí nghiệm20
3.3.6 Phƣơng pháp đo một số yếu tố môi trƣờng nƣớc ............................... 20
3.3.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu .................................................................. 20





viii
3.4 Bố trí thí nghiệm ......................................................................................... 21
3.4.1 Chuẩn bị vật liệu cho thí nghiệm gây nhiễm chuẩn ........................... 21
3.4.2 Bố trí thí nghiệm gây nhiễm chuẩn cho tôm với dịch virus WSSV-VN
đã chuẩn độ (10
5,2

SID
50
/ml) ....................................................................... 21
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 23
4.1 Đáng giá vật liệu phục vụ cho thí nghiệm gây nhiễm chuẩn ...................... 23
4.2 Khảo sát ảnh hƣởng của các phƣơng thức quản lý khác nhau lên độ mẫn
cảm của tôm đối với WSSV .............................................................................. 24
4.2.1 Kết quả ở thí nghiệm gây nhiễm trên tôm sú với liều thấp
(10
1,5
SID
50
/ml) ............................................................................................ 24
4.2.2 Kết quả ở thí nghiệm gây nhiễm trên tôm sú với liều cao
(10
1,5
SID
50
/ml) ............................................................................................ 28
4.2.3 Kết quả so sánh độ mẫn cảm với 2 liều gây nhiễm của tôm
ở từng phƣơng thức quản lý ........................................................................ 32
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................... 35
5.1 Kết luận ....................................................................................................... 35
5.2 Đề nghị ........................................................................................................ 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. …37

ix
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

WSD: White spot disease.
WSSV: White spot syndrome Virus.
WSSV-VN: White spot syndrome virus Vietnam
IHC: Immunohistochemistry.
proPO: prophenoloxidase
LPS: Lipopolysaccharide
BGBP: Beta-glucan biding protein
VP19: envelope protein (19 kDa).
VP28: envelope protein (28 kDa).
DNA: Deoxiribonucleotide acid.
RNA: Ribonucleotide acid.
MBV: Monodon Baculovirus
YHV: Yellow Head Vius.

IHHNV: Infectious hypodermal hemotopoietic necrosis virus.
PCR: Polymerase chain reaction.
PAP: peroxidase anti peroxidase
ABC: avidin-biotin complex
LSAB: labelled streptavidin-biotin
BPS: Buffer phosphate saline
DAB: 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride.
SID
50
/ml:

Shrimp infectious dose 50% enpoint













x
DANH SÁCH CÁC BẢNG


BẢNG TRANG

Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm nuôi tôm sú với các phƣơng thức quản lý
khác nhau ......................................................................................................... 20
Bảng 3.2 Các thời điểm thu mẫu ở mỗi đợt thí nghiệm .................................. 21
Bảng 4.1 Kết quả theo dõi các chỉ tiêu môi trƣờng trong quá trình thí
nghiệm ............................................................................................................. 23
Bảng 4.2 Kết quả tăng trọng của tôm sau 15 ngày nuôi ................................. 23
Bảng 4.3 Kết quả theo dõi thực nghiệm dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm
trắng sau khi gây nhiễm liều thấp…………………………………………… 24
Bảng 4.4 Kết quả tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV của tôm kiểm tra bằng
IHC ở liều thấp ................................................................................................ 25
Bảng 4.5 Kết quả kiểm tra tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) trên tôm bằng
IHC theo thời gian thu mẫu ở liều thấp………………………………………26
Bảng 4.6 Kết quả theo dõi thực nghiệm dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm
trắng sau khi gây nhiễm liều cao .................................................................... 28
Bảng 4.7 Kết quả tỷ lệ nhiễm WSSV của tôm ở 3 nghiệm thức ở liều cao .... 30
Bảng 4.8 Kết quả kiểm tra tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV trên tôm bằng IHC ở
các thời điểm thu mẫu ở liều cao……..………………………………………30
Bảng 4.9 So sánh kết quả theo dõi thực nghiệm và phân tích tỷ lệ cảm
nhiễm (IHC) giữa 2 liều tiêm………………………………………………....32
Bảng 4.10 Tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) của tôm ở từng phƣơng thức quản lý
đƣợc gây nhiễm với 2 liều tiêm………………………………………………33

xi
DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG
Hình 2.1 Sơ đồ sự kích hoạt của β-glucan và Lipopolysaccharide lên các tế
bào máu cùa giáp xác ....................................................................................... 4
Hình 2.2 Virus hội chứng đốm trắng .............................................................. 6
Hình 2.3 Tôm nhiễm WSSV và tế bào nhiễm WSSV ..................................... 6
Hình 2.4 Cấu trúc hóa học của -1,3/1,6-glucan ............................................ 9
Hình 2.5 Cấu trúc hóa học của vitamin C ........................................................ 12
Hình 3.1 Gây nhiễm WSSV cho tôm bằng cách tiêm ..................................... 19
Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng quát chẩn đoán IHC ................................................. 20
Hình 3.2 Hình bố trí thí nghiệm cảm nhiễm WSSV cho tôm .......................... 21
Hình 4.1 Bể nuôi tôm với hệ thống lọc tuần hoàn ........................................... 23
Hình 4.2 Hình chụp mẫu mô mang ở tôm đƣợc nhuộm IHC (vật kính 40X)
thời điểm 24 giờ sau gây nhiễm WSSV ........................................................... 25
Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ nhiễm WSSV (%) của tôm ở liều thấp ................................ 26
Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) của tôm theo thời gian ở liều
thấp ................................................................................................................... 26
Hình 4.3 Tôm đối chứng chết thời điểm 38 giờ sau gây nhiễm WSSV ......... 29
Hình 4.4 Hình chụp mẫu mô mang ở tôm đƣợc nhuộm IHC (vật kính 40X)
thời điểm 12 giờ sau gây nhiễm WSSV ở liều cao .......................................... 29
Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ nhiễm WSSV (%) của tôm ở liều cao ................................. 30
Biểu đồ 4.4 Tỷ lệ nhiễm WSSV (%) của tôm theo thời gian thu mẫu ở liều
cao ..................................................................................................................... 31
Hình 4.5 Tôm đƣợc bổ sung β-1,3/1,6-glucan ở 120 giờ sau gây nhiễm ........ 32

1
PHẦN 1. MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề
Từ thực tế phải đối đầu với bệnh đốm trắng (White Spot Disease – WSD) do
virus gây hội chứng đốm trắng (White spot syndrome virus – WSSV) gây nhiều thiệt
hại nặng nề cho ngành nuôi tôm Việt Nam cũng nhƣ thế giới trong những năm qua,
nhiều biện pháp kỹ thuật đã đƣợc nghiên cứu và áp dụng ở hầu hết các giai đoạn của
một vụ nuôi tạo nên giải pháp “phòng ngừa tổng hợp” nhằm hạn chế tối đa dịch bệnh
đốm trắng xảy ra.
Mặc dù vậy, cho đến nay biện pháp hữu hiệu để phòng bệnh đốm trắng trên tôm
vẫn còn bỏ ngỏ. Đã có nhiều nghiên cứu về việc sử dụng các vaccine hay chất kích
thích miễn dịch (immunostimulants) nhằm nâng cao sức đề kháng của tôm đối với
WSSV. Tuy nhiên việc đánh giá một cách chính xác và khoa học hiệu quả của các biện
pháp này là rất khó.
Thông qua mô hình cảm nhiễm chuẩn, sẽ cho phép chúng ta đánh giá một cách
khoa học mức độ ảnh hƣởng của một số giải pháp kỹ thuật ứng dụng trong phòng bệnh
đốm trắng trên tôm nuôi, cụ thể là việc sử dụng các chất kích thích tăng cƣờng hệ miễn
dịch của tôm.
Đi từ cơ sở thực tiễn đó, đƣợc sự phân công của bộ môn Công Nghệ Sinh Học
trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh và sự chấp thuận của Viện
Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II, chúng tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp: “Ứng
dụng mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn đánh giá ảnh hưởng của các phương
thức quản lý khác nhau lên độ mẫn cảm đối với virus gây hội chứng đốm trắng
(White spot syndrome virus–WSSV) của tôm sú (Peneaus monodon)”.

1.2 Nội dung
Trong đề tài, chúng tôi bổ sung vào thức ăn cho tôm 2 hợp chất là Vitamin C và
-1,3/1,6-glucan, đƣợc xem nhƣ là các chất kích thích tăng cƣờng hoạt động của hệ
thống miễn dịch không đặc hiệu (insufficient immune system) của tôm, trong điều kiện
phòng thí nghiệm. Sau đó gây gây nhiễm các đàn tôm với 2 liều gây nhiễm 10
1,5
SID
50

và 10
4
SID
50
của dòng WSSV-VN đã đƣợc chuẩn độ trong cùng điều kiện. Thu mẫu và


2
tiến hành kiểm tra sự nhiễm WSSV trên tôm bằng kỹ thuật IHC
(Immunohistochemistry).
1.3 Mục tiêu
Đánh giá ảnh hƣởng của hai hợp chất vitamin C và -1,3/1,6-glucan lên độ mẫn
cảm đối với WSSV của tôm sú.

3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Hệ miễn dịch của tôm sú
Ngành nuôi tôm phát triển, tôm thƣờng đƣợc nuôi với mật độ cao trong môi
trƣờng tồn tại nhiều tác nhân gây bệnh. Tuy nhiên ở điều kiện bình thƣờng thì giữa
sinh vật (vật chủ), mầm bệnh và môi trƣờng giữ trạng thái cân bằng. Bản thân vật chủ
duy trì cho mình tình trạng khoẻ mạnh bằng cách chống lại sự tấn công của các tác
nhân gây bệnh.
Cơ chế kháng bệnh chủ yếu của tôm sú là miễn dịch không đặc hiệu , điều này
có hạn chế so với động vật có xƣơng sống do sự khác biệt tiến hoá biểu hiện ở chỗ
không có và không tạo ra đƣợc kháng thể đáp ứng lại kháng nguyên lạ xâm nhập (Văn
Thị Hạnh và ctv, 2003). Lớp biểu bì là hàng rào lý hoá hữu hiệu chống lại sự bám dính
và xâm nhập của mầm bệnh. Một khi hàng rào này bị hƣ hại, các vi sinh vật đi vào cơ
thể, vào máu chúng sẽ gặp những cơ chế phòng vệ bẩm sinh bao gồm các đáp ứng
miễn dịch tế bào và thể dịch. Đầu tiên, hệ thống hoạt hoá prophenoloxidase (proPO)
đƣợc kích hoạt dẫn đến sự tổng hợp melanin và tạo ra các yếu tố liên quan đến các
phản ứng miễn dịch khác nhƣ peroxinectin. Tiếp đến, các tế bào máu tham gia vào
việc dọn dẹp các mầm bệnh bằng các cơ chế thực bào vi sinh vật hay bẫy chúng trong
các khối tế bào máu, đóng gói (encapsulation) các vi sinh vật lớn hơn. Các phản ứng
độc tế bào cũng đƣợc kích hoạt. Cuối cùng các phân tử cảm ứng nhƣ các peptide
kháng khuẩn, các yếu tố cần cho quá trình Opsonin cũng đƣợc tạo ra (Cerenius và
Söderhäll, 2004).
Theo Lê Hồng Phƣớc (2002), trong nghiên cứu về phản ứng loại thải vi sinh vật

của tế bào máu trên tôm sú, từ máu tôm sú có thể tìm thấy 5 lọai tế bào máu:
hyalinocyte (chiếm 37%), small-granular semi-granulocyte (25%), large-granular
semi-granulocyte (15%), small-granular granulocyte (6%) và large-granular
granulocyte (17%). Trong thí nghiệm này, tôm với trọng lƣợng trung bình
3,28 ± 1,12 g đƣợc tiêm vi khuẩn Gram âm Vibrio anguillarum với liều 30 µl/g tôm
(mật độ vi khuẩn: 107 – 108 CFU/ml). Sau 7 ngày tiêm, hầu hết không thấy sự hiện


4
diện của vi khuẩn trên các cơ quan khảo sát: mô liên kết, tim, gan tụy, mô tạo máu, cơ
quan lympho. Khả năng loại thải vi sinh vật của các loại tế bào máu khác nhau cũng
khác nhau. Semi-granulocyte có chỉ số thực bào cao nhất so với các lọai tế bào khác.
Granulocyte và hyalinocyte có chỉ số thực bào thấp nhất.
Ở tôm cũng nhƣ hầu hết các loài giáp xác khác tồn tại những cơ chế để phát
hiện sự xâm nhập của các tác nhân lạ từ bên ngoài (vi khuẩn, nấm) thông qua sự nhận
diện những thành phần vách tế bào của chúng nhƣ lipopolysaccharides (LPS) và
β-glucan bởi các protein nhận biết trong huyết tƣơng nhƣ BGBP (Beta Glucan Biding
Protein). Phức hợp β-glucan - BGBP kích thích sự hoạt hóa prophenoloxidase (proPO)
thành phenoloxidse (PO), enzyme điều khiển quá trình tổng hợp melanin. Chất này
cùng với các tiền chất của nó có vai trò nhƣ các chất diệt khuẩn (Vargas-Albores và
ctv, 2000).Trong một nghiên cứu của mình, Chang và ctv (2002) đã chứng minh đƣợc
tác dụng của β-1,3-glucan giúp tăng cƣờng đáp ứng miễn dịch của tôm sú đối với virus
gây hội chứng đốm trắng.

Hình 2.1 Sơ đồ sự kích hoạt của β-glucan và Lipopolysaccharide lên các tế bào máu
cùa giáp xác (Vargas-Albores và ctv, 1998)
Theo Krimbrell và ctv (2001), ở tôm cũng nhƣ hầu hết các động vật không
xƣơng sống thiếu một hệ đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và chỉ dựa hoàn toàn vào các đáp
ứng miễn dịch tự nhiên. Tuy nhiên theo nhƣ Witteveldt và ctv (2003), những tôm sống
sót sau khi bị nhiễm WSSV có tỷ lệ sống cao hơn ở lần gây nhiễm WSSV tiếp theo. Sự
phát hiện này cùng với nghiên cứu thử nghiệm cấp vaccine tiểu đơn vị chứa protein vỏ
của WSSV (VP19, VP28) cho tôm sú (Penaeus monodon) thông qua đƣờng miệng đã
chứng minh đƣợc rằng một khả năng đáp ứng miễn dịch đặc hiệu có thể đƣợc kích
thích sau khi cấp vaccin. Trong nghiên cứu này, tỷ lệ tôm đƣợc cấp vaccine chứa


5
VP28 sống sau khi gây nhiễm WSSV bằng cách ngâm là 61%. Nhóm đối chứng không
đƣợc cấp vaccine có tỷ lệ chết 67%.
Hiện nay, còn hiếm các thông tin về các công trình nghiên cứu sự tồn tại các
peptide kháng khuẩn ở giáp xác. Tuy nhiên, gần đây đã xác định đƣợc từ tế bào máu
của tôm sú P.monodon các protein có hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn rộng, bao
gồm cả vi khuẩn Gram
-
và Gram
+
(Somboonwiwat và ctv, 2005)
Tóm lại, hệ miễn dịch của tôm sú nói riêng và các loài giáp xác nói chung còn ở
mức độ tiến hóa thấp, chủ yếu dựa trên các đáp ứng miễn dịch tự nhiên. Trong đó, vai
trò của các bạch cầu và hệ thống proPO hết sức quan trọng. Vì thế, việc tăng cƣờng
sức đề kháng cho các đối tƣợng nuôi thủy sản thuộc nhóm giáp xác không thể dựa vào
việc sử dụng các loại vaccine mà chủ yếu là các biện pháp tăng cƣờng hiệu quả đáp
ứng miễn dịch không đặc hiệu thông qua cải thiện điều kiện môi trƣờng nuôi và sử

dụng các chất kích thích miễn dịch (immunostimulant) (Đỗ Thị Hoà và ctv, 2000)
2.2 Bệnh đốm trắng trên tôm sú
2.2.1 Lịch sử và phân bố bệnh đốm trắng
Bệnh đốm trắng xuất hiện đầu tiên tại Bắc Á vào năm 1992 – 1993, đồng thời
nhanh chóng lan rộng khắp khu vực Châu Á và thế giới nhất là các nƣớc có hình thức
nuôi tôm công nghiệp thâm canh. Dịch bệnh đốm trắng phát hiện lận đầu tiên tại Đài
Loan – 1992, Trung Quốc – 1993, Nhật Bản – 1994, sau đó là các nƣớc Indonesia,
Thái Lan, Malaysia, Ấn Độ, Bangladesh, Texas (Hoa Kỳ, 1995) gây tổn thất nghiêm
trọng về sản lƣợng tôm nuôi.
2.2.2 Tác nhân gây bệnh:
Virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) thuộc một họ virus mới, Nimaviridae
(Vlak và ctv, 2002). Virus dạng hình trứng, kích thƣớc 120 x 275 nm, có một đôi phụ
bộ ở một đầu kích thƣớc 70 x 300 nm (Wang và ctv, 1995).
Hạt virus cấu trúc bao gồm 3 phần: bao màng (envelope), nucleocapside và vật
chất di truyền. Virion chứa 5 protein chính: VP28, VP26, VP24, VP19 và VP15 có
trọng lƣợng phân tử tƣơng ứng là 28, 26, 24, 19 và 15 kDa.
Hiện nay virus WSSV đã đƣợc giải mã trình tự hoàn chỉnh (Yang và ctv, 2001).
Genome của WSSV là DNA vòng kép lớn, kích thƣớc thay đổi từ 293 đến 308 kbp
(van Hulten và ctv, 2001) tùy theo các mẫu phân lập từ các vị trí địa lí khác nhau.


6







Hình 2.2. Virus gây hội chứng đốm trắng (Jo-ann Leong, 2005)

A. Mô hình cấu trúc WSSV
B. Ảnh hiển vi điện tử của WSSV
2.2.3 Dấu hiệu bênh lý
Tôm nhiễm bệnh có thể có màu hồng đến nâu đỏ. Bên trong vỏ giáp xuất hiện
những đốm trắng đƣờng kính từ 0,5 đến 2 mm, xuất hiện đầu tiên ở vỏ giáp (carapace)
và đốt bụng thứ V,VI. Gan tuỵ trƣơng có màu trắng hoặc hơi vàng. Tôm có các biểu
hiện bỏ ăn, lờ đờ, kém hoạt động, thƣờng có khuynh hƣớng cặp mé bờ, sau đó chết và
chìm xuống đáy Tôm có dấu hiệu trƣơng nhân trong tế bào bị nhiễm. Vài trƣờng hợp
tôm ở trạng thái hấp hối chuyển sang màu đỏ hoặc hồng, tỉ lệ chết tăng dần đến 80 hay
100% trong vòng 7 – 10 ngày (Bùi Quang Tề, 2003).






Hình 2.3 Tôm nhiễm WSSV và tế bào nhiễm WSSV. (Vlak., 2002)
(A) Tôm bị nhiễm WSSV
(B) Tế bào bị nhiễm WSSV trong mang của tôm sông
2.2.4 Phƣơng thức lan truyền bệnh
Mầm bệnh WSSV có thể lan truyền theo 2 trục:


7
Trục ngang: là con đƣờng chủ yếu. Từ nguồn nƣớc, từ thức ăn, từ các
loài giáp xác hoang dã trong ao hoặc ngoài ao xâm nhập trong quá trình thay nƣớc.
Đặc biệt, khi tôm ăn xác những con tôm chết do bệnh đốm trắng trong ao sẽ dẫn đến
sự lan truyền bệnh rất nhanh và gây chết hàng loạt (Tookwinas, 1998). Ngoài ra, chó,
mèo, các loài chim ăn thịt và con ngƣời cũng là trung gian mang mầm bệnh từ ao này
sang ao khác.

Trục dọc: biểu hiện sự truyền bệnh từ bố mẹ sang con. Tuy nhiên khả năng
truyền theo trục dọc vẫn chƣa đƣợc chứng minh mặc dù WSSV đã đƣợc phát hiện
trong một số giai đoạn trứng tôm khi quan sát dƣới kính hiển vi điện tử (Tookwinas,
1998).
2.3 Các phƣơng thức quản lý nhằm tăng cƣờng sức chịu đựng của tôm nuôi đối
với bệnh đốm trắng
Dịch bệnh bùng phát không phải chỉ do sự hiện diện của tác nhân gây bệnh mà
đó là kết quả của sự tƣơng tác rất phức tạp giữa mầm bệnh, vật chủ và môi trƣờng. Vật
chủ phải mẫn cảm với mầm bệnh và điều này chịu ảnh hƣởng của yếu tố di truyền, tình
trạng dinh dƣỡng, tuổi và sự hiện diện của virus ở các giai đoạn sớm của chu kỳ sống,
trạng thái sinh lý của vật chủ, sự hiện diện và ảnh hƣởng của các yếu tố gây stress lên
vật chủ cũng nhƣ chất lƣợng môi trƣờng nuôi (Newman, 1999).
Do đặc điểm cơ chế kháng bệnh của tôm chủ yếu dựa vào các đáp ứng miễn
dịch không đặc hiệu, cho đến nay việc phòng ngừa dịch bệnh virus trên tôm nói chung
và bệnh đốm trắng nói riêng còn rất hạn chế. Hiện không có biện pháp đáng tin cậy
nào để phòng ngừa dịch bệnh đốm trắng xảy ra mà biện pháp đang đƣợc sử dụng rộng
rãi trên thế giới là “Phòng ngừa tổng hợp”. Bƣớc đầu tiên trong việc quản lý sức khoẻ
tôm nuôi là tăng cƣờng các biện pháp an toàn nghiêm ngặt để ngăn chặn các mầm
bệnh lây lan đến hệ thống nuôi nhƣ:
- Loại bỏ mầm bệnh trong ao và nƣớc trƣớc khi thả giống.
- Sử dụng nguồn giống khoẻ mạnh, không mang mầm bệnh
- Loại trừ các con đƣờng truyền bệnh.
Tiếp đến, trong quá trình nuôi, một yếu tố quan trọng là giảm tối thiểu tình
trạng stress bởi sự thay đổi đột ngột của chất lƣợng nƣớc ao nuôi sẽ làm tôm bị sốc.
Đây là điều kiện để dịch bệnh bùng phát trong đó có bệnh đốm trắng. Các yếu tố đặc
biệt quan trọng là oxy hòa tan, nhiệt độ, độ mặn và pH. Vidal (2001) đã xác định đƣợc


8
mối liên hệ giữa bệnh đốm trắng và nhiệt độ của nƣớc. Nghiên cứu này chỉ ra rằng với

nhiệt độ 25
o
C, khả năng 100% tôm chết do bệnh đốm trắng; nếu nhiệt độ tăng lên 32
o
C
thì tỷ lệ chết của tôm chỉ khoảng 20%. Kết quả này đƣợc giải thích là do nhiệt độ của
nƣớc tăng lên làm giảm khả năng tái tạo của WSSV. Song song đó, việc bổ sung vào
khẩu phần ăn của tôm các chất chất kích thích miễn dịch, vitamin, vaccine… là cần
thiết nhằm tăng cƣờng đáp ứng miễn dịch của tôm chống lại mầm bệnh.
2.3.1 Chất kích thích miễn dịch
Chất kích thích miễn dịch là các hợp chất hóa học có khả năng làm tăng họat
tính của các tế bào bạch cầu và vì thế chúng có thể giúp tăng cƣờng tính kháng của vật
nuôi đối với sự xâm nhiễm của virus, vi khuẩn, nấm và các vật ký sinh khác. Bên cạnh
đó các chất này cũng giúp chống lại các tế bào ung thƣ ở ngƣời nhờ vào khả năng hoạt
hóa các tế bào bạch cầu nhận ra và tiêu diệt các tế bào khối u (Jan Raa, 2000).
Hầu hết các chất kích thích miễn dịch đƣợc tạo ra từ các phân tử cấu trúc của tế
bào vi khuẩn, nấm sợi và nấm men. Theo Raa (1996), các chất này có 7 nhóm:
Các phân tử cấu trúc của vi khuẩn (lipopolysaccharide , lipopeptide,
glycoprotein vỏ và muramylpeptide).
Các sản phẩm β-1,3-glucan từ vi khuẩn (Curdlan) và nấm sợi (Krestin,
Lentinen, Schizophyllan…).
Các β-1,3/1,6-glucan từ thành tế bào nấm men bánh mì (MacroGard,
Betafectin).
Các cấu trúc Carbohydrate (glycan) từ các nguồn sinh học khác nhƣ tảo
biển.
Các peptide từ các dịch chiết của động vật hay từ quá trình thủy phân
enzyme các protein từ cá.
Các nucleotide.
Các sản phẩm tổng hợp (Bestatin, FK-156, Levamisole…).
Chất kích thích miễn dịch có thể đƣợc cung cấp cho tôm bằng các cách nhƣ

tiêm (ít dùng), cho trực tiếp vào nƣớc, trộn với thức ăn (dễ nhất). Liều lƣợng và thời
gian bổ sung bao nhiêu là tùy thuộc vào nguồn gốc sản phẩm. Ví dụ β-1,3-glucan từ
Schizophyllum commune đƣợc sử dụng với lƣợng 2 – 10 g/kg thức ăn trong thời gian
20 ngày, thời gian giản cách 10 ngày là phù hợp cho tôm sú (Chang và ctv, 2002).


9
Việc sử dụng chất kích thích miễn dịch nhằm tăng cƣờng tính kháng của tôm sú
đối với virus WSSV đã đƣợc nghiên cứu trong những năm gần đây. Trong đó -glucan
đã đƣợc nghiên cứu khá kĩ. Đây là một loại hợp chất đƣờng thu đƣợc từ nhiều nguồn
khác nhau: nấm men, vi khuẩn, các loại nấm khác... Mỗi loại có cấu trúc đặc trƣng
riêng tùy theo liên kết giữa các phân tử glucose nhƣ ở nấm men -glucan có phân
nhánh -1,3 và -1,6.








Hình 2.4 Cấu trúc hóa học của -1,3/1,6-glucan
(
Song và ctv (1997) đã chứng minh đƣợc rằng β-1,3/1,6-glucan từ thành tế bào
nấm men Saccharomyces cerevisiae có khả năng tăng cƣờng tính kháng của
P.monodon đối với WSSV. Tỉ lệ sống của PL66 và PL113 lần lƣợt là 59% và 24% sau
khi cảm nhiễm tôm bằng cách ngâm với WSSV trong 6 giờ. Trong một nghiên cứu
gần đây, Chang và ctv (2002) đã bổ sung β-1,3-glucan từ vào thức ăn viên của tôm
với các liều 0, 1, 2, 10, và 20 g/kg thức ăn. Nghiên cứu này đƣợc tiến hành trên tôm ở
giai đoạn Juvenile (6,5 ± 0,4 g). Thời gian cho ăn là 20 ngày và sau đó sẽ tiến hành

gây nhiễm với WSSV. Kết quả cho thấy tôm ở các nghiệm thức có bổ sung β-1,3-
glucan với liều nhỏ hơn 1 g/kg thức ăn chết hết đến ngày 12 sau khi gây nhiễm. Trái
lại ở nghiệm thức 10 g/kg thức ăn, tỷ lệ tôm sống đến ngày thứ 12 sau gây nhiễm là
42,2%, cao hơn một cách có ý nghĩa so với các nghiệm thức khác (P<0,05). Những
tôm sống ở các nghiệm thức tiếp tục đƣợc quan sát đến ngày 60 sau cảm nhiễm. Kết
quả nhƣ sau:
Ở nghiệm thức 2 g/kg thức ăn, tỷ lệ tôm sống là 66,7% (20% quần thể ban đầu).
Ở nghiệm thức 10 g/kg thức ăn, tỷ lệ tôm sống là 75% (31% quần thể ban đầu).


10
Ở nghiệm thức 20 g/kg thức ăn, tỷ lệ tôm sống là 75% (18,3% quần thể ban
đầu).
Trọng lƣợng cơ thể của tôm tại thời điểm này là 10 – 15 g. So với nghiệm thức
đối chứng (không gây nhiễm virus), tỷ lệ tôm sống và trọng lƣợng cơ thể tôm là 77%
và 11 – 15 g. Song song với những kết quả trên, các tác giả cũng nghiên cứu sự biến
động các thành phần của hệ đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu nhƣ số lƣợng và khả
năng thực bào của tế bào máu, hoạt tính enzyme phenoloxidase, superoxide dismutase,
nồng độ ion superoxide. Nhận thấy rằng ở các nghiệm thức bổ sung 2, 10 và 20 g/kg
thức ăn, sau khi cảm nhiễm, các thành phần trên biến đổi theo chiều hƣớng suy giảm
nhƣng phục hồi và đạt cực đại một vài ngày sau đó. Sự biến đổi này có tác dụng làm
tăng cƣờng sức chịu đựng của tôm đối với WSSV.
2.3.2 Vaccine
Vaccine là một sản phẩm đƣợc tạo nên từ chính các tác nhân gây bệnh, hay các
độc tố do các tác nhân gây bệnh tiết ra, nhằm tác động vào hệ thống miễn dịch đặc
hiệu của động vật có xƣơng sống trong đó có cá để tạo ra các phản ứng miễn dịch (Lê
Thanh Hùng, 2000).
Hiện có 5 loại vaccine đang đƣợc dùng trong nuôi trồng thủy sản: Vaccine bất
hoạt hoá (Inactivate), Vaccine hoạt lực yếu (Live Attenuated), Vaccine tái tổ hợp
(Recombinant), Vaccine là DNA và Vaccine đƣợc sản xuất từ nội tạng của cá bị bệnh.

Các vaccine này đƣợc dùng để phòng các bệnh do virus (Viral vaccines), do vi khuẩn
(Bacterial vaccines) và do ký sinh trùng (parasite vaccines) cho động vật thủy sản (Lê
Thanh Hùng, 2000).
Việc sử dụng vaccine cho tôm hay các loài động vật giáp xác nói chung còn
đang trong giai đoạn nghiên cứu. Do đặc điểm cơ thể thiếu hệ đáp ứng miễn dịch đặc
hiệu và chỉ dựa hoàn toàn vào các đáp ứng miễn dịch tự nhiên nên có ý kiến cho rằng
việc sử dụng vaccine cho tôm là không thực tế. Tuy nhiên trong các nghiên cứu gần
đây trên tôm sú P.monodon, Witteveldt và ctv (2003) đã chứng minh đƣợc rằng một cơ
chế bảo hộ và đáp ứng miễn dịch chuyên biệt có thể đƣợc kích thích sau khi cấp
vaccine tiểu đơn vị. Bản chất của các vaccine này là các vi khuẩn đƣợc chuyển nạp
gen biểu hiện các protein cấu trúc vỏ VP19 và VP28 của WSSV. Đây là các protein
hiện diện nhiều trên vỏ của WSSV và tƣơng tác một cách mạnh mẽ với các kháng thể
đa dòng đƣợc tạo ra từ thỏ (Van Hulten và ctv, 2000b). Vaccine đƣợc trộn với thức ăn


11
và cung cấp cho tôm trong 7 ngày. Sau đó, tiến hành cảm nhiễm bằng cách ngâm tôm
trong nƣớc biển chứa WSSV trong 7 giờ. Kết quả cho thấy ở các nhóm tôm đƣợc cấp
vaccine chứa VP28 và hỗn hợp VP28 + VP19 cho tỷ lệ chết tích lũy (30% và 50%)
thấp hơn so với nhóm tôm đƣợc cấp vaccine là các vector rỗng (empty vector) và các
nhóm đối chứng dƣơng. Chọn ngẫu nhiên các cá thể còn sống để kiểm tra sự hiện diện
của WSSV, tất cả đều cho kết quả âm tính. Song song đó, các tác giả cũng nghiên cứu
thời điểm khởi đầu và thời gian bảo hộ của vaccine. Nhóm tôm đƣợc cấp vaccine chứa
VP28 (vaccine cho tỷ lệ tôm sống cao) đƣợc chia làm 3 nhóm nhỏ hơn để tiến hành
cảm nhiễm ở các thời điểm khác nhau 3, 7 và 21 ngày sau khi ngừng cấp vaccine. Tỷ
lệ tôm sống cao đáng kể ở các nghiệm thức 3 và 7 ngày sau khi cấp vaccine (64% và
77%). Trong khi đó, ở nghiệm thức 21 ngày, tôm sống với tỷ lệ thấp (21%). Điều này
chứng tỏ hiệu quả bảo hộ của vaccine đã giảm.
Qua nghiên cứu trên mặc dù chƣa hiểu rõ cơ chế tác động của các vaccine tiểu
đơn vị lên hệ miễn dịch của tôm nhƣng cũng cho thấy ở tôm có tồn tại một bộ nhớ

miễn dịch đặc hiệu. Chính vì vậy việc cấp vaccine qua đƣờng miệng cho tôm chống lại
WSSV là có thể. Nó mở ra một hƣớng đi mới trong việc thiết lập những phƣơng thức
quản lý thực tế nhằm ngăn ngừa WSSV cũng nhƣ các tác nhân gây bệnh khác cho tôm
nuôi.
2.3.3 Vitamin
Vitamin đƣợc định nghĩa nhƣ nhóm chất hữu cơ hiện diện trong thúc ăn với một
lƣợng rất nhỏ mà cơ thể sinh vật không tổng hợp đƣợc hay tổng hợp không đủ cho nhu
cầu cơ thể. Chất hữu cơ này không phải là các amino acid hay acid béo thiết yếu,
chúng giữ vai trò rất quan trọng trong dinh dƣỡng và sự thiếu hụt lâu dài các dƣỡng
thƣờng bị mất đi trong quá trình chế biến thức ăn cho động vật thủy sản. Do đó chất
này sẽ dẫn đến sự xuất hiện các triệu chứng bệnh cho động vật (Lê Thanh Hùng,
2000).
Hầu hết các vitamin có vai trò nhƣ một co-enzyme hay các tác nhân bổ trợ các
enzyme thực hiện các phản ứng sinh hoá trong cơ thể sinh vật. Vitamin C (acid
ascorbic) cũng không ngoại lệ. Chất này dễ bị phân huỷ ở nhiệt độ cao (60
o
C) nên
thƣờng đƣợc bổ sung vào thức ăn cho tôm với hàm lƣợng khá cao. Shiau và ctv (1994)
đã xác định đƣợc nhu cầu vitamin C cho tôm sú đạt mức tăng trƣởng tối đa vào khoảng
2000 mg/kg thức ăn. Do tan nhiều trong nƣớc, vitamin C đƣợc sử dụng trong thức ăn


12
tôm sú dƣới dạng các dẫn xuất: L-ascorbyl 2-monophosphate Mg (C2MP-Mg), L-
ascorbyl 2-monophosphate Na (C2MP-Na), L-ascorbyl 2-sulphate (C2PP)...

Hình 2.5 Cấu trúc hóa học của vitamin C
(www.chemistry.wustl.edu/.../ascorbic.htm)
Chƣa có nhiều nghiên cứu về cơ chế tăng cƣờng đáp ứng miễn dịch của tôm của
vitamin C. Tuy nhiên, Merchie (1998) thấy rằng lƣợng vitamin C tăng từ 100 lên
3400 mg/kg trong khẩu phần ăn sẽ làm giảm tức thời tỷ lệ chết của tôm sú postlarval
do bị sốc thấm lọc. López và ctv (2003) đã chứng đƣợc vitamin C có tác dụng cải thiện
tốc độ tăng trƣởng ở tôm. Hàm lƣợng protein máu, tổng lƣợng tế bào máu, lƣợng tế
bào hạt (granular cell) và hoạt tính Prophenoloxidase ở nhóm tôm đƣợc bổ sung
vitamin C trong 40 ngày cao hơn các nhóm khác.
Cơ chế tác động của vitamin C có giống nhƣ một chất kích thích miễn dịch hay
không vẫn chƣa đƣợc xác định rõ. Tuy nhiên nó có tác dụng nhƣ một chất chống oxy
hóa, có vai trò trong việc bảo vệ các tế bào máu, giúp tăng cƣờng hệ miễn dịch của
tôm (López và ctv, 2002).
2.3.4 Fucoidan
Wilaiwan Chotigeat và ctv (2003) đã chứng minh đƣợc rằng việc bổ sung
fucoidan thô ly trích đƣợc từ một loài tảo biển Sargassum polycystum có thể làm giảm
tác động của bệnh đốm trắng do WSSV gây ra trên tôm sú. Trong thí nghiệm này,
fucoidan đƣợc trộn vào thức ăn cho 2 nhóm tôm có khối lƣợng 5 – 8 và 12 – 15 g.
Tôm đƣợc cho ăn khoảng 4 ngày trƣớc khi gây nhiễm bằng cách ngâm tôm với dịch
WSSV trong 2,5 giờ. Sau đó tiếp tục cho ăn 15 ngày. Kết quả thu đƣợc ở thời điểm10
ngày sau khi gây nhiễm, nhóm tôm đƣợc cho ăn fucoidan, tỷ lê sống cao nhất là 46%
và 93% tƣơng ứng với từng khối lƣợng. Trong khi đó ở nhóm đối chứng, tôm chết
50% từ 3 – 5 ngày sau khi gây nhiễm. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy fucoidan


13
đóng vai trò nhƣ một chất kích thích miễn dịch giúp tăng cƣờng hoạt động thực bào so
với nhóm đối chứng.

Bên cạnh những phƣơng thức nêu trên việc sử dụng các chất diệt virus
(antiviral) để ngăn chặn sự tổng hợp DNA hay sự dịch mã RNA của WSSV, cung cấp
cho tôm những peptid diệt khuẩn giúp nâng cao sức sống của tôm nhiễm WSSV cũng
đƣợc xem là các hƣớng đi có khả năng (Bonilla và ctv, 2005). Tuy nhiên, để ứng dụng
vào thực tiễn sản xuất tôm thƣơng phẩm thì cần có những công trình nghiên cứu nhằm
đánh giá một cách chính xác và khoa học hiệu quả của tất cả các phƣơng đánh thức
này.
2.4 Mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn WSSV trên tôm:
2.4.1 Sơ lƣợc về mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn:
WSSV nhiễm trên một vài loài tôm nuôi và gây ra thiệt hại nghiêm trọng do tỷ
lệ tôm chết có thể đến 100% trong 10 ngày sau khi bệnh phát (Karanusagar và ctv,
1997). Để giảm tác động của WSSV, một vài phƣơng thức quản lý sức khoẻ tôm đã
đƣợc đề xuất và thử nghiệm. Tuy nhiên việc giá hiệu quả các phƣơng thức này là rất
khó. Nguyên nhân là do trong các thí nghiệm này, việc gây nhiễm virus cho tôm đƣợc
mô phỏng theo các con đƣờng truyền nhiễm của WSSV trong tự nhiên. Cụ thể, tôm thí
nghiệm đƣợc ngâm trong nƣớc có chứa dịch dịch huyền phù WSSV vô bào, nuôi
chung với các vật chủ đã bị nhiễm WSSV, cho tôm ăn những mô đã bị nhiễm WSSV.
Trong đó, nhiễm virus qua đƣờng miệng đƣợc xem là quan trọng nhất trong điều kiện
tự nhiên và nuôi thƣơng phẩm. Tuy nhiên, những phƣơng pháp này tồn tại một hạn chế
rất lớn là lƣợng virus gây nhiễm cho mỗi tôm thì không đƣợc biết. Hơn nữa phƣơng
thức này thì không đảm bảo đƣợc mỗi tôm đều nhận đƣợc một lƣợng virus nhƣ nhau.
Theo Bonilla và ctv (2005) mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn sử dụng một
dịch huyền phù virus đã đƣợc chuẩn độ để đánh giá hiệu quả các chiến lƣợc nhằm làm
giảm tác động của WSSV. Theo đó, một mô hình gây nhiễm chuẩn cần 2 yếu tố chính:
Động vật thí nghiệm có tính biến dị di truyền thấp, có tính mẫn cảm cao với
virus và không mang các mầm bệnh đặc biệt. Trong các thí nghiệm gây nhiễm chuẩn
thực hiện trong đề tài này, tôm sẽ đƣợc kiểm tra không mang các mầm bệnh nhƣ
WSSV, MBV (Monodon Baculovirus), YHV (Yellow Head Vius), IHHNV (Infectious
hypodermal hemotopoietic necrosis virus)… bằng các phƣơng pháp mô học truyền
thống (Histopathology), PCR (Polymerase chain reaction)…

14
Một dịch stock virus WSSV đã đƣợc chuẩn độ để xác định số đơn vị gây
nhiễm 50% tôm thí nghiệm SID
50
(Shrimp infectious dose 50% endpoint)/ml dung
dịch. Một đơn vị SID
50
là lƣợng virus sẽ gây nhiễm cho 50% tôm thí nghiệm. Cho đến
nay, trên thế giới vẫn chƣa tìm ra môi trƣờng nuôi cấy tế bào tôm do đó việc chuẩn độ
chỉ đƣợc thực hiện trên môi trƣờng in vivo. Một dãy các độ pha loãng theo cơ số 10
của dịch WSSV gốc đƣợc gây nhiễm cho tôm thí nghiệm bằng cách tiêm vào cơ hay
qua đƣờng miệng. Dựa vào tỷ lệ tôm nhiễm ở mỗi độ pha loãng sẽ tính đƣợc hiệu giá
gây nhiễm SID
50
/ml của dịch virus theo công thức của Reed – Muench (1938).
2.4.2 Ứng dụng của mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn:
Với những đặc điểm nêu trên, mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn có nhiều
ứng dụng quan trọng:
Đánh giá sự khác nhau về độ mẫn cảm của vật chủ ở các giai đoạn sống
khác nhau hay giữa các loài có quan hệ gần gũi với cùng một tác nhân gây bệnh
(Plumb và Zilberg, 1999). Cụ thể ở tôm, có sự khác biệt về tính mẫn cảm với WSSV ở
các giai đoạn sống khác nhau (Yoganandhan và ctv, 2003) hay giữa các loài tôm
(Lightner và ctv, 1998).
Độc tính hay khả năng gây bệnh của mầm bệnh là một đặc tính có thể đo
lƣờng đƣợc (Shapiro-Ilan và ctv, 2005). Do đó ứng dụng mô hình cảm nhiễm chuẩn, ta
có thể so sánh độc lực của các chủng WSSV khác nhau.
Mô hình cảm nhiễm chuẩn còn giúp ta đánh giá hiệu quả của các phƣơng
thức quản lý sức khỏe tôm nhƣ dùng các chất kích thích miễn dịch, các chất diệt virus

(antivirals), vaccine… nhằm mục đích giảm tác động của bệnh đốm trắng.
Nhằm hỗ trợ trong việc thiết lập các phƣơng thức quản lý mới trong phòng
ngừa bệnh đốm trắng có thể áp dụng trong thực tiễn, các nghiên cứu về quá trình phát
sinh bệnh của WSSV có vai trò rất quan trọng. Bonilla và ctv (2005) đã sử dụng mô
hình cảm nhiễm chuẩn để nghiên cứu quá trình phát sinh bệnh của WSSV trên
Litopenaeus vannamei. Tôm đƣợc chủng WSSV qua đƣờng miệng với liều thấp
(10
1,5
SID
50
) và liều cao (10
4
SID
50
). Ở mỗi liều cảm nhiễm, mẫu tôm đƣợc thu ở 0, 6,
12, 18, 24, 36, 48 và 60 giờ sau gây nhiễm. Vị trí của các tế bào bị nhiễm WSSV trên
mô đƣợc xác định bằng kỹ thuật Hóa mô miễn dịch (immunohistochemistry – IHC) và
trong huyết tƣơng bằng kỹ thuật Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (Indirect