Khả năng kháng khuẩn của nấm linh chi

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN............................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN................................................................................................................ ii
MỤC LỤC....................................................................................................................iii
DANH MỤC HÌNH........................................................................................................v
DANH MỤC BẢNG......................................................................................................vi
PHẦN THỨ NHẤT: MỞ ĐẦU.......................................................................................1

1.1. Đặt vấn đề.......................................................................................................1
1.2. Mục tiêu..........................................................................................................2
1.2.1. Mục tiêu chung..............................................................................................2
1.2.2. Mục tiêu cụ thể..............................................................................................2
PHẦN HAI: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...........................................................................3

2.1. Giới thiệu về nấm linh chi...............................................................................3
2.1.1. Giới thiệu chung.............................................................................................3
2.1.2. Thành phần hóa học của nấm linh chi..............................................................3
2.1.3. Tác dụng đối với sức khỏe con người..............................................................5
2.2. Vi sinh vật gây bệnh........................................................................................6
2.2.1. Escherichia coli.............................................................................................6
2.2.2. Salmonella enterica........................................................................................6
2.2.3. Bacillus cereus...............................................................................................6
2.2.4. Staphylococcus epidermidis............................................................................7
2.2.5. Listeria monocytogenes..................................................................................7
PHẦN BA: VẬT LIỆU - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................8

3.1. Vật liệu............................................................................................................8
3.1.1. Cuống nấm linh chi........................................................................................8

3.1.2. Vi sinh vật......................................................................................................8
3.1.3. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật.......................................................................8
3.2. Nội dung nghiên cứu.......................................................................................8
3.3. Phương pháp nghiên cứu................................................................................9
3.3.1. Phương pháp công nghệ..................................................................................9
3.3.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm......................................................................11
3.3.3. Phương pháp phân tích.................................................................................12
3.3.4. Phương pháp xử lí số liệu.............................................................................13
PHẦN BỐN: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN......................................................................14

4.1. Đánh giáchất lượng cuống nấm linh chi nguyên liệu.....................................14
4.2. ....Kết quả xác định điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly polysaccharide
trong cuống nấm linh chi.....................................................................................15
4.2.1. Kết quả xác định tỉlệ nguyên liệu thích hợp cho quá trình trích ly polysaccharide
trong cuống nấm linh chi........................................................................................15
4.2.2....................... Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến quá trình trích ly
polysaccharide trong cuống nấm linh chi................................................................16
4.3. Kết quả xác định khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh
của dịch cuống nấm linh chi ................................................................18
PHẦN NĂM: KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ.........................................................................21

5.1. Kết luận.........................................................................................................21
5.2. Đề nghị..........................................................................................................21
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................22
PHỤ LỤC..................................................................................................................... 25


DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1. Nấm linh chi...................................................................................................3

Hình 3.1. Cuống nấm linh chi........................................................................................8
Hình 3.2. Sơ đồ quy trình dự kiến xác định khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh của
dịch cuống nấm linh chi.................................................................................................9
Hình 4.1. Khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh của dịch chiết cuống nấm linh chi....20

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Thành phần nấm linh chi...........................................................................4
Bảng 4.1. Một số chỉ tiêu chất lượng của cuống nấm linh chi nguyên liệu.................14
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu đến quá trình trích ly polysaccharide trong
cuống nấm linh chi................................................................................................15
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến quá trình trích ly polysaccharide
trong cuống nấm linh chi........................................................................................17
Bảng 4.4. Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) của dịch chiết cuống nấm linh chi...18


PHẦN THỨ NHẤT: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Nấm linh chi (Ganoderma lucidum) phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận
nhiệt đới trong đó có Việt Nam, được trồng chủ yếu ở khu vực Tây Nguyên mang lại
thu nhập đáng kể cho người nuôi trồng. Tuy nhiên lĩnh vực chế biến nấm linh chi chưa
được phát triển phù hợp với tiềm năng về nguyên liệu, đặc biệt là phần cuống nấm
chưa được sử dụng một cách hiệu quả. Một số thành phần hóa học trong nấm linh chi
có tác dụng chữa bệnh rất tốt. Các kết quả nghiên cứu dược lý trên lâm sàng đã chứng
minh linh chi có tác dụng an thần, giảm đau, bảo vệ gan, giải độc, hạ đường huyết, thải
trừ chất phóng xạ, chống xơ vữa động mạch, giúp cho cơ tim chịu được trạng thái
thiếu máu. Polysaccharide trong linh chi có tác dụng ức chế tế bào ung thư, tăng miễn
dịch cho cơ thể (Trần Văn Mão, 2014). Nhiều nghiên cứu chứng minh nấm linh chi có
chứa các thành phần kháng khuẩn có khả năng ức chế một số loại vi khuẩn.
Polysaccharide và triterpenoid được xem là những hoạt chất quan trọng nhất trong

nấm linh chi có khả năng ức chế sự nhân bản của HIV, virus viêm gan siêu vi B, virus
Herpes...(Skalicka-Wozniak et al., 2012; Wasser, 2010).
Hiện nay trên thế giới tồn tại rất nhiều vi sinh vật gây bệnh chúng phân bố ở
khắp nơi trong tự nhiên, đặc biệt là trong thực phẩm, Escherichia coli, Samonella
enterica, Baccillus cereus, Staphylococcus epidermidis, Listeria monocytogenes, đây
là những vi sinh vật rất dễ gây bệnh cho con người thông qua thực phẩm. Ngoài cơ chế
gây bệnh do ăn vào một lượng bào tử vi khuẩn (nhiễm khuẩn), thực phẩm có thể bị ô
nhiễm bởi độc tố có nguồn gốc từ vi khuẩn. Chúng có thể sinh nội độc tố, ngoại độc tố
hoặc cả hai. Ngoài ra,có thể sinh bào tử hoặc không sinh bào tử, di động hoặc không di
động được, hiếu khí, kị khí hoặc kị khí tùy nghi...Vi khuẩn phát triển trong thực phẩm
đến một số lượng đủ lớn rồi mới sinh độc tố: gồm có Bacillus cereus, Staphylococcus
aureus và Clostridium botulinum.Vi khuẩn sinh nội độc tố trong ruột nhưng không gây
nhiễm tế bào ruột: gồm có Bacillus cereus, Clostridium perfringens.Vi khuẩn sinh nội
độc tố sau khi bám dính vào tế bào biểu mô nhưng không xâm nhập vào trong tế bào:
gồm có các chủng E. coli gây tiêu chảy xuất huyết (Quản Lê Hà, 2006; Nguyễn Đức
Lượng, 2005). Polysaccharide, trierpennoid trong nấm linh chi có tác dụng ức chế tế
bào ung thư có thể chúng có khả năng kháng các vi sinh vật gây bệnh kể trên. Trên
thực tế, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện nông nghiệp Việt Nam đã nghiên cứu và
nuôi trồng thành công loại nấm linh chi này. Tùy thuộc vào giống mà nấm linh chi có
cuống hoặc không có cuống, loài không có cuống là loài lâu năm, hóa gỗ. Trên thị


trường các sản phẩm từ nấm linh chi rất đa dạng nhưng thường chỉ có phần mũ nấm vì
trên mũ nấm còn lớp bào tử có chứa hàm lượng hoạt tính cao. Phần cuống nấm không
có lông và không có lớp bào tử như mũ nấm nên chưa được tận dụng triệt để trong quá
trình chế biến nấm linh chi. Nhiều nghiên cứu cho thấy, hoạt chất trong cuống nấm tuy
không bằng mũ nấm nhưng vẫn có một lượng đáng kể.
Xuất phát từ những thực tế trên và để tận dụng tối đa nguồn nguyên liệu sẵn có
đề tài: “Xác định khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh của dịch cuống nấm linh
chi” được chúng tôi quan tâm nghiên cứu.

Các thành phần hoạt chất trong nấm linh chi đặc biệt là triterpenoid và
polysaccharide đã được các nhà khoa học chứng minh lợi ích của nó đối với sức khỏe.
Hơn nữa người ta vẫn chưa tìm thấy bất kì tác hại nào của nấm linh chi đối với cơ thể.
Vì vậy việc bổ sung nước uống có chứa linh chi vào thực đơn hàng ngày là một cách
rất tốt để tăng cường sức khỏe và phòng ngừa bệnh tật hiệu quả.
1.2. Mục tiêu
1.2.1. Mục tiêu chung
Xác định được khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh của dịch cuống nấm linh chi
với nồng độ dịch chiết được xác định.
1.2.2. Mục tiêu cụ thể
- Xác định một số chỉ tiêu chất lượng của nguyên liệu;
- Xác định điều kiện trích ly để thu được dịch có hàm lượng hoạt chất cao;
- Xác định nồng độ dịch chiết của cuống nấm linh chi để kháng được các vi sinh
vật gây bệnh Escherichia coli, Salmonella enterica, Bacillus cereus, Staphylococcus
epidermidis, Listeria monocytogenes.


PHẦN HAI: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về nấm linh chi
Phần 2.1 sẽ giới thiệu chung về nấm linh chi, thành phần hóa học và tác dụng của
nấm linh chi đối với sức khỏe con người.
2.1.1. Giới thiệu chung
Nấm linh chi, tên khoa học là Ganoderma
lucidum, thuộc họ nấm lim (Ganodermataceae).
Nấm linh chi còn có tên gọi khác như tiên
thảo, nấm trường thọ, vạn niên nhung.
Nấm linh chi là loại nấm hóa gỗ, sống một
năm hay lâu năm. Mũ nấm có dạng thận, tròn hoặc
dạng quạt, dày có đường kính 3 - 10cm, cuống
nấm dài đính lệch, hình trụ tròn hay dẹt, có khi

phân nhánh; mặt trên có mũ có những vòng đồng
mép lượn sóng. Nấm linh chi gồm 2 phần: cuống

Hình 2.1. Nấm linh chi

tâm,
nấm

và mũ nấm.
- Cuống có thể dài hoặc ngắn tùy theo chủng loại, đính bên, hình trụ, có đường
kính 0,5 - 3cm, lớp vỏ cuống màu nâu, nâu đỏ, nâu đen, không có lông, bóng. Cuống
nấm ít phân nhánh, đôi khi có uốn khúc cong queo.
- Mũ nấm có hình rẻ quạt hay hình bán nguyệt, hình thận, kích thước thay đổi:
rộng 2 - 25cm, dài 3 - 30cm, dày 0,5 - 2cm. Mặt trên bóng, màu từ vàng chanh, vàng
nghệ đến vàng nâu, vàng cam, đỏ nâu - nâu tím, có đường vân đồng tâm, lượn sóng và
vân tán xạ. Phần có cuống đính hơi gồ lên hoặc lõm xuống. Mặt dưới màu nâu nhạt,
mang các ống rất nhỏ, chứa bào tử, khi chín bào tử có màu nâu. Khi nấm trưởng thành
thì phát tán bào tử (Trần Văn Mão, 2014).
2.1.2. Thành phần hóa học của nấm linh chi
Thành phần hóa học quyết định đến tính dược liệu của nấm linh chi. Không như
nhiều loài nấm khác có hàm lượng nước đến 90%, nấm linh chi tươi chỉ khoảng 75%
nước. Thành phần chủ yếu của nấm linh chi được thể hiện ở bảng 2.1.


Bảng 2.1. Thành phần nấm linh chi
Thành phần
Chất xơ
Carbonhydrate

Tỉ lệ (%)

59
26 - 28

Protein

7-8

Chất béo thô

3-5

Tro

1,8
(Mau et al.,2001; Wasser, 2010)

Trong nấm linh chi chứa hàm lượng chất xơ cao (59%).Carbonhydrate trong nấm
linh chi chiếm hàm lượng cao (26 - 28%). Hàm lượng protein trong nấm linh chi là 7 8 %, thấp hơn nhiều các loài nấm khác nhưng protein của nấm linh chi lại có hầu hết
các amino acid thiết yếu đặc biệt là lysine và leusine. Hàm lượng chất béo thấp và tỉ lệ
acid béo không no cao là một trong những tính chất quan trọng tạo nên giá trị cho nấm
linh chi (Sanodiya et al., 2009; Wachtel-Galor et al., 2011).
Theo Mizuno (1995), chiết xuất nấm linh chi chứa các nguyên tố khoáng như
kali, magie, natri, sắt, kẽm, mangan, canxi, đồng, selenium và germanium; trong đó
canxi, kali, magie là những thành phần kim loại chính, và germanium đứng thứ 5 trong
số các nguyên tố khoáng có hàm lượng cao nhất (489µg/g). Germanium có tác dụng
tăng cường khả năng mang oxygen, giảm nguy cơ xuất hiện ung thư, giảm nguy hiểm
từ kết quả trị liệu phóng xạ và ngăn chặn bệnh thiếu máu cục bộ.
Bên cạnh đó, nấm linh chi chứa rất nhiều những phân tử có hoạt tính sinh học
như các terpenoid, các steroid, các phenol, các nucleotide và những dẫn xuất của
chúng. Hoạt tính sinh học của nấm linh chi có được chủ yếu là do các polysaccharide,

peptidoglycan và các triterpene mang lại (Boh et al., 2007; Zhou et al., 2007). Về mặt
định lượng trong một thí nghiệm của Chan et al., (2008) đã phân tích thành phần của
11 mẫu nấm linh chi thương mại (được mua tại Châu Âu) và nhận thấy có sự khác biệt
về hàm lượng polysaccharide giữa các mẫu và giao động trong khoảng từ 1,1 - 5,8%.
Nguyên nhân dẫn đến sự khác biệt này là do giống loài, ngoài ra điều kiện môi trường
trong quá trình nấm phát triển cũng ảnh hưởng khá lớn đến thành phần hoạt chất của nấm.
Polysaccharide là một phân tử carbonhydrate cao phân tử gồm chuỗi dài các
phân tử monosaccharide liên kết với nhau bằng mối liên kết glycosidic. Tùy thuộc vào


cấu trúc, các đại phân tử có thể có những tính chất khác biệt với các khối cấu trúc
monosaccharide của chúng. Trong nấm linh chi chứa rất nhiều polysaccharide có khối
lượng phân tử lớn, các hợp chất này mang hoạt tính sinh học và được tìm thấy ở tất cả
các bộ phận của nấm linh chi (Bao et al., 2001; Wachtel-Galor et al, 2004). Theo kết
quả phân tích, thành phần chủ yếu trong polysaccharide của nấm linh chi là đường
glucose (Bao et al., 2001; Wang et al., 2002).
Nhờ những thành phần hóa học quan trọng nên nấm linh chi là loại thảo dược
được sử dụng trong Đông y từ lâu đời. Các tác dụng đối với sức khỏe của nấm linh chi
được trình bày ở phần tiếp theo.
2.1.3. Tác dụng đối với sức khỏe con người
Nấm linh chi có nhiều tác dụng trong việc hỗ trợ sức khỏe con người:
- Tác dụng của nấm linh chi với hệ miễn dịch: Nhiều kết quả nghiên cứu cho
thấy khả năng kích thích hệ miễn dịch của nấm linh chi. Theo Roy (2006) linh chi
được dùng như thuốc bổ, đặc biệt là như chất điều biến miễn dịch. Linh chi được dùng
để tăng cường chức năng miễn dịch và đề phòng nhiễm trùng cơ hội trong các phác đồ
điều trị cho bệnh nhân nhiễn HIV. Nhờ khả năng điều biến miễn dịch và ức chế sự sản
sinh histamine, linh chi cũng có thể được dùng như tác nhân chống viêm trong điều trị
hen suyễn và dị ứng. Linh chi cũng dược dùng trong điều trị viêm khớp, viêm phế
quản dị ứng,…(Nguyễn Hữu Đống,2000; Wasser, 2010).
-

Tác dụng chữa trị ung thư: Triterpeniod trong nấm linh chi có tác dụng chống

ung thư trong in vivo và các hiệu ứng ức chế các dòng tế bào ung thư, bao gồm ung
thư vú, ung thư tụy, ung thư phổi, ung thư ruột kết, ung thư da và ung thư tuyến tiền
liệt (Boh, 2013; Wachtel-Galor et al.,2011). Một số ít nghiên cứu lâm sàng chứng
minh vai trò của linh chi trong điều trị ung thư tuyến tiền liệt bằng cách sử dụng hỗn
hợp các thảo dược chứa linh chi làm giảm rõ rệt lượng kháng nguyên đặc hiệu trong
tuyến tiền liệt (Gao et al., 2003).
-

Hỗ trợ chức năng tim mạch và hệ tuần hoàn: Nấm linh chi có tác dụng tích cực

đến chức năng của hệ tuần hoàn và tim mạch: giảm cholesterol thừa trong máu, chống
tình trạng mỡ máu cao, làm giãn mạch và tăng cường lưu thông máu, chống xơ vữa động
mạch, tăng tần số và biên độ co tim và có tác dụng nhất định trong điều trị bệnh tim, điều
hòa huyết áp, giảm lượng đường trong máu, chống sự kết tụ của tiểu cầu,...(Wasser, 2010).


-

Chống oxy hóa: Polysaccharide và triterpenoid trong nấm linh chi thể hiện khả

năng chống oxy hóa in vitro. Các hoạt chất trong linh chi giúp cơ thể tiêu diệt các gốc
tự do, chống oxy hóa, từ đó ngăn ngừa ung thư và các bệnh mãn tính khác(WhachtelGalor et al., 2011; Wasser, 2010).
-

Tăng khả năng cung cấp oxy cho tim, não: Vì germanium trong linh chi có thể

tăng cường khả năng cung cấp oxy cho tế bào, linh chi được dùng để giải tỏa căng

thẳng, chữa đau đầu, chóng mặt, buồn nôn, mất ngủ, giảm tình trạng thiếu oxy do động
mạch vành bị tắc nghẽn; giúp cơ thể chịu được tình trạng huyết áp thấp(Wasser, 2010).
2.2. Vi sinh vật gây bệnh
Vi sinh vật phân bố khắp nơi trong tự nhiên, khi xâm nhập vào cơ thể người
chúng có thể gây nên các bệnh khác nhau như: sốt thương hàn, viêm ruột non, nhiễm
trùng cơ thể… Dưới đây sẽ giới thiệu một số vi sinh vật gây bệnh thông qua thực
phẩm.
2.2.1. Escherichia coli
Escherichia coli thuộc họ Enterobacteriaceae, có kích thước 1,2 - 1,5 x 2,0- 6,0
µm, là loài trực khuẩn, Gram âm, hiếu khí hoặc kị khí tùy nghi, có thể phát triển tốt ở
môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ thích hợp nhất là 37 oC, pH thích hợp từ
7,0 - 7,2. Nhạy cảm với thanh trùng Pasteur.
Escherichia coli là vi khuẩn gây bệnh quan trọng, nó đứng đầu trong các vi
khuẩn gây ỉa chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật; đứng hàng đầu trong các
căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết. E. coli có thể gây nhiều bệnh khác như viêm phổi,
viêm màng não, nhiễm khuẩn vết thương (Nguyễn Thị Thanh Thuỷ, 2017).
2.2.2. Salmonella enterica
Thuộc họ Enterobacteriaceae; là trực khuẩn Gram âm, yếm khí tùy tiện, kích
thước 0,7 - 1,5 x 2,0 - 5,0µm; có khả năng tự dưỡng và lên men đường glucose,
thường không sử dụng đường lactose và đường saccharose. pH thích hợp là từ 6,0- 9,0;
phát triển tốt nhất ở pH = 7,2. Đây là loại vi khuẩn có thể sống trong các ống ruột của
người, động vật và gây nên hiện tượng ngộ độc thực phẩm trong điều kiện không đảm
bảo vệ sinh an toàn thực phẩm.
Salmonellosis là sự nhiễm trùng thực phẩm gây nên bởi vi khuẩn Salmonella.
Các triệu chứng bao gồm đột ngột đau bụng, tiêu chảy, sốt, buồn nôn và ói mửa. Tình


trạng cơ thể bị mất nước nghiêm trọng, nhất là ở những nhóm người có nhiều rủi ro
như người già, trẻ nhỏ và những người có hệ miễn dịch yếu. Triệu chứng thường xảy
ra trong vòng từ 6 đến 72 tiếng và kéo dài từ 4 đến 7 ngày. Bệnh gây ra từ Salmonella

trên người có thể là bệnh thương hàn hoặc một số các bệnh khác như nhiễm trùng
đường tiêu hóa và nhiễm trùng một số tổ chức khác (não, phổi...) (Nguyễn Thị Thanh
Thuỷ, 2017).
2.2.3. Bacillus cereus
Bacillus cereuslà loài trực khuẩn hiếu khí, bào tử dạng hình ovan, có khả năng
sinh nha bào, thuộc họ Bacillaceae, kích thước 3-5 x 1-1,2µm. Bacillus cereus,
Bacillus thuringiensis có khả năng chuyển động nhờ có vành lông rung. pH thích hợp
để sinh trưởng tốt là từ 7,0 - 7,2. Các dòng Bacillus cereus không thể nhân bản được
khi độ pH dưới 4,8. Chúng phát triển trong khoảng 10 đến 50 oC, phát triển mạnh trong
khoảng từ 30 đến 40oC. Tuy nhiên các chủng chịu lạnh cũng có thể nhân bản ở nhiệt
độ từ 4 đến 6oC nhưng thời gian nhân bản thường dài hơn đáng kể.
Bacillus cereus sản sinh hai loại độc tố. Độc tố gây tiêu chảy (diarrhoed toxin) và
độc tố gây nôn mửa (emetic toxin). Ngoài ra vi khuẩn còn có enzyme hemolyzin là
một protein gây độc mạnh có thể gây chết người. Độc tố này có thể trung hòa bởi
cholesterol trong huyết thanh nhưng lại góp phần cho sự phát triển của vi khuẩn.
Lượng gây ngộ độc tiêu chảy xảy ra khi số lượng tế bào tối thiểu từ 10 5/g, gây nôn
mửa khi số lượng tế bào tối thiểu từ 106/g cộng thêm lượng lớn của độc tố ruột phải
được hình thành để chống chịu được với pH của dạ dày và enzyme proteolytic của tá
tràng. Những nhân tố này sẽ làm giảm nhiều độ hoạt động của độc tố đường ruột so
với mức độ ban đầu (Nguyễn Thị Thanh Thuỷ, 2017).
2.2.4. Staphylococcus epidermidis
Cầu khuẩn Staphylococcus epidermidis thuộc họMicrococceae, Gram dương, là
loại vi khuẩn da phổ biến nhất. Nó ưa sống ở những nơi nhiều mồ hôi, như nách, màng
mũi, cùng với các vi sinh vật khác, chúng tạo ra các chất từ mồ hôi, mang lại mùi cơ
thể liên quan đến mồ hôi. Những vi khuẩn nàygiống như các nhóm Staphylococcus
khác chúng sắp xếp với nhau như chùm nho. Kích thước 1 - 2µm, chúng phát triển tốt
ở pH từ 7,0 - 7,2.
Tụ cầu chỉ gây bệnh khi hình thành độc tố. Tụ cầu gây ngộ độc thức ăn chủ yếu
là độc tố ruột. Nếu chỉ toàn vi khuẩn sống mà không có độc tố ruột thì cũng không thể

gây ngộ độc được. Staphylococcus epidermidis gây ra nhiều bệnh nhiễm trùng da, tạo
mủ, gây độc ở người. Thường xảy ra ở những chỗ xây xước trên bề mặt da như nhọt,
gây ra nhiều bệnh nhiễm nghiêm trọng như viêm phổi, viêm vú, viêm tĩnh mạch, viêm
màng não, nhiễm trùng tiểu và những bệnh nguy hiểm khác như viêm xương tủy, viêm
màng trong tim (Nguyễn Thị Thanh Thuỷ, 2017).
2.2.5. Listeria monocytogenes
Là vi khuẩn Gram dương, không bào tử, yếm khí, có thể phát triển trong tế bào.
Trong số bảy loại Listeria được biết đến, chỉ có Listeria monocytogenes mới là tác
nhân thật sự của những ca nhiễm khuẩn từ thực phẩm (infection alimentaire). Ở 20oC
chúng di chuyển bằng lông mọc xung quanh thân. Chúng phát triển tốt với pH từ 6 - 8,
kích thước ngắn 0,4 - 0,5 x 0,5 - 2,0µm.
Listeria monocytogenes gây bệnh viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết, viêm kết
mạc, nhiễm trùng tiết niệu... Phụ nữ có mang thì thường biểu hiện là sốt, hội chứng giả
cúm, hoặc nhiễm khuẩn tiết niệu. Bệnh có thể hoàn toàn tĩnh lặng nhưng lại nhiễm
khuẩn cho thai nhi qua đưòng rau thai và dẫn tới sẩy thai hay đẻ non, trẻ khi sinh ra bị
mắc bệnh (Nguyễn Thị Thanh Thuỷ, 2017).


PHẦN BA: VẬT LIỆU - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu
Trong nghiên cứu sử dụng các vật liệu bao gồm cuống nấm linh chi, vi sinh vật
và môi trường nuôi cấy vi sinh vật.
3.1.1. Cuống nấm linh chi
Cuống nấm linh chi có nguồn gốc từ Trung
tâm đào tạo, nghiên cứu và phát triển nấm ăn,
nấm dược liệu Khoa Công nghệ sinh học, Học
viện Nông nghiệp Việt Nam. Sử dụng phần cuống
nấm khô để tiến hành thí nghiệm. Cuống nấm
linh chi có màu nâu đỏ, không có lông, dài 3cm

có đường kính là 1,3cm.
3.1.2. Vi sinh vật
Vi sinh vật sử dụng cho nghiên cứu được lấy giống ở phòng thí nghiệm vi sinh
vật của đại học Louvain La Neuve gồm có: Esherichia coli LMG 2093, Samonella
enterica HT00007, Bacillus cereus ATCC 24579, Staphylococcus epidermidis ATCC
35984, Listeria monocytogenes.
3.1.3. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật
Sử dụng môi trường Luria-Bertani (LB) để nuôi cấy vi sinh vật.
- Thành phần môi trường LB lỏng gồm: Pepton 10 (g/l); NaCl 5 (g/l); Cao nấm
men 5 (g/l).
- Thành phần môi trường LB rắn tương tự môi trường lỏng và thêm Agar 15 (g/l).
3.2. Nội dung nghiên cứu
-Xác định một số chỉ tiêu chất lượng của cuống nấm linh chi;
- Xác định điều kiện trích ly thích hợp (tỉ lệ nguyên liệu, nhiệt độ, thời gian) đến
hiệu suất trích ly polysaccharide trong cuống nấm linh chi;

Hình 3.1. Cuống nấm linh
chi


Xác định nồng độ dịch chiết của cuống nấm linh chi để kháng được Esherichia
coli LMG 2093, Samonella enterica HT00007, Bacillus cereus ATCC 24579,
Staphylococcus epidermidis ATCC 35984, Listeria monocytogenes.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp công nghệ
3.3.1.1. Sơ đồ quy trình
Cuống nấm

Nghiền

Vi sinh vật

Nhân sinh khối

Trích ly

Lọc

Cấy trang vi sinh
vật nồng độ 106
(CFU/ml)

Xác định hoạt
chất (%)
Dịch cốt

Pha dịch chiết

Xác đinh khả năng kháng
VSV Đục
bằnglỗđường
thạchkính
kháng
khuẩn
Nhỏ
dịch
chiết


Hình 3.2. Sơ đồ quy trình dự kiến xác định khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh

của dịch cuống nấm linh chi
3.3.1.2. Thuyết minh quy trình
 Xử lí nguyên liệu
- Nghiền: Cuống nấm linh chi khô được kiểm tra và lựa chọn để loại bỏ mốc
hỏng, và sấy khô đến khối lượng không đổi bằng tủ sấy sau đó sử dụng máy xay làm
nhỏ, đem sàng với kích thước lỗ sàng là 5 mm. Công đoạn này để loại bỏ các tạp chất
không mong muốn, tăng diện tích tiếp xúc bề mặt của nguyên liệu và dung môi chiết,
phá vỡ cấu trúc tế bào, thuận lợi cho các công đoạn sau.
- Trích ly: Sau khi được xử lí nguyên liệu được trích ly bằng dung môi là nước,
trích ly với tỉ lệ nguyên liệu, nhiệt độ và thời gian trích ly thích hợp.Công đoạn này giúp
tách tối đa các hoạt chất sinh học và các hợp chất hòa tan có trong cuống nấm linh chi.
- Lọc dịch chiết:Dịch sau trích ly được lọc bằng vải lọc để tách các tạp chất thô
và lần 2 bằng giấy lọc thu để được dịch chiết trong. Công đoạn này giúp loại bỏ cặn bã
ra khỏi dịch chiết nhằm thu được dịch trong chỉ chứa các chất hòa tan.
- Xác định hàm lượng polysaccharide trong dịch cuống nấm linh chi bằng
phương pháp UV - VIS.
- Pha dịch chiết: Dịch cốt sau khi chiết sẽ được pha loãng để được các nồng độ
khác nhau đểthử nghiệm khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh.
 Nuôi cấy vi sinh
- Nhân sinh khối vi sinh vật lên môi trường: Từ nguồn giống ban đầu tiến hành
nhân sinh khối vi sinh vật bằng cách cấy ria tạo khuẩn lạc trên môi trường LB rắn, sau
24 giờ chọn khuẩn lạc điển hình cho vào môi trường LB lỏng, sau 18 - 24 giờ thu được
dịch vi khuẩn.Dịch vi khuẩn được xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo OD ở
bước sóng 600nm.
- Phương pháp đục lỗ thạch:Dùng đầu côn đã khử trùng có đường kính là 6mm,
ấn sâu vào mặt thạch rồi lấy phần thạch để tạo lỗ thạch bằng que cấy. Từ độ dày của


môi trường thạch và đường kính lỗ thạch xác định được thể tích lỗ thạch để cho dịch
cuống nấm vào môi trường đã có vi sinh vật gây bệnh.

- Xác định vi sinh vật có bị kháng bởi dịch cuống nấm linh chi hay không.
Tính kháng khuẩn được biểu hiện bằng đường kính vòng kháng khuẩn (D – d)
quanh miệng lỗ thạch:
+ 0mm <(D –d)< 5mm:Tính kháng yếu;
+ 5mm < (D –d)<10mm:Tính kháng trung bình;
+ (D –d) > 10mm:Tính kháng mạnh.
Trong đó: D đường kính ngoài vòng kháng khuẩn,d là đường kính lỗ thạch.
3.3.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm

 Thí nghiệm 1: Xác định tỉ lệ nguyên liệu thích hợp cho quá trình trích ly
polysaccharide trong cuống nấm linh chi
- Yếu tố phi thí nghiệm: kích thước nguyên liệu <0,5mm, nhiệt độ trích ly 100 oC,
thời gian trích ly 60 phút.
- Yếu tố thí nghiệm: Tỉ lệ nguyên liệu 10; 15; 20; 25 và 30 g/l
- Các chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng polysaccharidetrong dịch chiết.

 Thí nghiệm 2: Xác định thời gian và nhiệt độ thích hợp cho quá trình trích ly
polysaccharide trong cuống nấm linh chi
- Yếu tố phi thí nghiệm: kích thước nguyên liệu<0,5mm, tỉ lệ nguyên liệu đã xác
định được từ thí nghiệm 1.
- Yếu tố thí nghiệm: Nhiệt độ trích lần lượt là 70, 80, 90, 100 và 110oC kết hợp
với các khoảng thời gian trích ly 20, 40, 60, 80 và 100 phút. Trích ly ở các nhiệt độ ≤
100oC dùng bể ủ nhiệt, với các chế độ trích ly ở 110oC dùng nồi áp suất.
- Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng polysaccharide trong dịch chiết.

 Thí nghiệm 3: Xác định khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh của dịch cuống nấm
linh chi.
- Yếu tố phi thí nghiệm: Môi trường nuôi cấy LB, giống vi sinh vật;
- Yếu tố thí nghiệm: Nồng độ dịch chiết: 100, 80, 60, 40 và 20 % (v/v);
- Các chỉ tiêu theo dõi: Kích thước đường kính vòng kháng khuẩn.

- Cách tiến hành:
Vật liệu
+ Esherichia coli LMG 2093, Samonella enterica HT00007, Bacillus cereus
ATCC 24579, Staphylococcus epidermidis ATCC 35984, Listeria monocytogenes được
nuôi cấy trong môi trường LB có pH = 7,0, nhiệt độ tủ nuôi là 37oC
+ Dịch chiết cuống nấm linh chi được trích ly vớitỉ lệ nguyên liệu, nhiệt
độ,thời gianđược xác định ở các thí nghiệm trước.
Chuẩn bị môi trường:
+ Cân chính xác 3g môi trường LB dạng lỏng, cho vào bình tam giác rồi thêm
200ml nước cất vô trùng rồi lắc đều, điều chỉnh pH = 7,0 và đưa đi hấp khử trùng ở
121oC trong 15 phút.
+ Cân 12g môi trường LB dạng rắn cho vào bình tam giác, thêm 400ml nước
cất vô trùng rồi lắc đều, điều chỉnh pH = 7,0. Hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút rồi
để nguội đến 50 - 60oC trong tủ cấy, môi trường trong bình tam giác được rót vào phần
đáy của đĩa trong phạm vi vô trùng của ngọn lửa đèn cồn, đổ khoảng 15 đĩa.
Chuẩn bị dịch vi khuẩn:
+ Cấy ria tạo khuẩn lạc trên môi trường thạch LB, vi khuẩn được tồn trữ trong
đĩa thạch và bảo quản lạnh ở 4oC. Từ đĩa tồn trữ, chọn 2-3 khuẩn lạc đưa vào ống
nghiệm chứa 5ml môi trường LB đã khử trùng, nuôi lắc ở 37 oC. Sau 18 - 24 giờ, môi
trường bắt đầu vẩn đục thì mang đi đo mật độ vi khuẩn.
+ Mật độ vi khuẩn sau khi nuôi cấy trong môi trường LB được xác định theo
phương pháp đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 600nm. Điều chỉnh mật độ vi khuẩn
của các vi sinh vật đến khi đạt mật độ bằng 10 6CFU/ml thì tiến hành thử nghiệm khả
năng kháng khuẩn.
Tiến hành thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của dịch cuống nấm:
+ Dùng pipet men hút 100µl vi khuẩn mỗi loại (mật độ tế bào 10 6 CFU/ml),
sau đó trang đều trên mặt thạch LB đến khi mặt thạch khô, mỗi loài 3 đĩa. Sau đó dùng
đầu côn đã khử trùng đục lỗ trên mặt thạch với đường kính 6mm/lỗ, đục cách nhau

khoảng 20mm, mỗi đĩa đục 5 lỗ thạch. Nhỏ đầy mỗi lỗ thạch bằng các dịch chiết có
nồng độ 4g/l, 8g/l, 12g/l, 16g/l, 20g/l. Chuyển các đĩa petri vào tủ lạnh (6 oC) trong 30
phút để dịch chiết cuống nấm linh chi khuếch tán ra thạch. Sau đó đem nuôi ở 37 oC
trong 18 - 24 giờ. Đọc kết quả và ghi nhận đường kính vòng kháng khuẩn. Đường kính


vòng kháng khuẩn (D – d) được xác định bằng đường kính vòng kháng ngoài trừ đi
đường kính lỗ thạch.
3.3.3. Phương pháp phân tích



Xác định độ ấm bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi theo TCVN

2620 : 2014
- Nguyên tắc: Sấy mẫu ở nhiệt độ cao (105ºC) tới khối lượng không đổi từ đó
tính độ ẩm của mẫu.
- Tính kết quả: Độ ẩm W, tính bằng phần trăm khối lượng theo công thức sau:
W = x 100
Trong đó

m1: khối lượng mẫu và chén trước khi sấy (g)
m2: khối lượng mẫu và chén sau khi sấy (g)
m: khối lượng mẫu phân tích (g)



Phương pháp định lượng polysaccharide trong cuống nấm linh chi theophương

pháp UV – VIS(Foster and Cornelia, 1961)

- Nguyên tắc:Phương pháp quang phổ UV - VIS là phương pháp phân tích dựa
trên việc đo độ hấp thụ bức xạ đơn sắc của dung dịch nghiên cứu ở bước sóng trong
vùng tử ngoại - khả kiến. Định lượng polysaccharide dựa vào đặc tính tạo màu đặc
trưng của các hợp chất thuộc polysaccharide với phenol trong môi trường H 2SO4 đậm
đặc sẽ cho ra màu vàng đặc trưng. Phương pháp thường được sử dụng để khảo sát các
hợp chất polysacharide trong các trường hợp chất thiên nhiên.
- Cách tiến hành:
+ Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,4g chuẩn D-glucose vào bình
định mức 100ml, thêmnước cất, lắc cho tan, bổ sung vừa đủ thể tích bằng nước cất, lắc
đềuđược dung dịch chuẩn glucose có nồng độ 4mg/ml. Xây dựng đường chuẩn bằng
dung dịch chuẩn vừa pha có nồng độ làn lượt là: 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1mg/ml.
+ Tiến hành: Hút 1ml dung dịch chuẩncho vào bình tam giác có nút nhám,
thêm 1 ml phenol 5% và lắc đều; thêm từ từ 5ml axit sulfuric đặc vào bình, lắc đều , để
khoảng 30 phút cho màu ổn định.
+ Mẫu trắng và mẫu thử chuẩn được tiến hành tương tự mẫu thử.
+ Tiến hành đo độ hấp thụ quang của các dung dịch thử ở bước sóng 490 nm.


- Từ kết quả đo chất chuẩn ta có phương trình đường chuẩn có dạng y = ax + b
trong đó y là độ hấp thụ quang dung dịch, x là nồng độ D-glucose(mg/ml) trong dung
dịch đo ở bước sóng 490nm. Khi đó ta có mật độ quang của dung dịch thử thay vào
phương trình ta được nồng độ polysaccharide của dung dịch thử.
3.3.4.Phương pháp xử lí số liệu
Số liệu thí nghiệm sẽ được phân tích trên phần mềm Microsoft Excel và
Minitab 16. Sự khác biệt của giá trị trung bình giữa các công thức được đánh giá nhờ
phép so sánh Tukey với mức tin cậy 95%.


PHẦN BỐN: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN
4.1.

Đánh giá chất lượng cuống nấm linh chi nguyên liệu
Cuống nấm linh chi được thu nhận từ Trung tâm đào tạo, nghiên cứu và phát

triển nấm ăn, nấm dược liệu Khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Sử dụng phần cuống nấm để tiến hành thí nghiệm, cuống nấm có màu nâu đỏ, không
có lông, dài 3cm có đường kính là 1,3cm.
Phân tích một số chỉ tiêu về độ ẩm và hàm lượng polysaccharide dùng làm
nguyên liệu trong nghiên cứu, kết quả được thể hiện trong bảng 4.1 dưới đây.
Bảng 4.1. Một số chỉ tiêu chất lượng của cuống nấm linh chi nguyên liệu
Chỉ tiêu

Hàm lượng
(% chất khô)

Độ ẩm

12,37 ± 0,05

Kết quả bảng 4.1 cho thấy:
Độ ẩm của cuống nấm linh chi thấp, đạt 12,37%, thuận lợi cho quá trình bảo
quản, vì theo Nguyễn Duy Công (2005) độ ẩm an toàn cho các loại dược liệu và rễ
trước khi nhập kho bảo quản nên nằm trong khoảng 12-15%.
Hàm lượng polysaccharide trong cuống nấm nguyên liệu đạt 2,10%, hàm lượng
này cao hơn hàm lượng polysaccharide trong nấm linh chi được nghiên cứu bởi Ping
(2009), trong nghiên cứu này nấm linh chi vàng có hàm lượng polysaccharide chỉ từ 1
- 1,2%. Tuy nhiên, hàm lượng polysaccharide trong cuống nấm nguyên liệu lại thấp
hơn khi so sánh với hàm lượng polysaccharide trong một sản phẩm nấm linh chi được
bán trên thị trường Châu Âu khi hàm lượng chất này trong sản phẩm đạt 5,8% (Chang
et al., 2008). Có thể nhận thấy rằng hàm lượng polysaccharide là không giống nhau ở

các giống loài, bộ phận và điều kiện nuôi trồng khác nhau. Theo Dược điển Trung
Quốc, hàm lượng polysaccharide trong dược liệu từ nấm linh chi khô không được nhỏ
hơn 0,5% và nó cũng được xem như là tiêu chuẩn để đánh giá chất lượng của sản
phẩm dược liệu từ nấm linh chi. Như vậy, có thể nhận thấy rằng nguyên liệu cuống
nấm linh chi được dùng trong nghiên cứu vẫn còn có rất nhiều hoạt chất cần được tận
dụng một cách có hiệu quả.


Cuống nấm linh chi sẽ được dùng để trích ly thu dịch chiết chứa hàm lượng
polysaccharide cao, sau đó dịch chiết sẽ được sử dụng để xác định khả năng kháng
một số vi sinh vật gây bệnh thực phẩm. Kết quả được trình bày trong các phần tiếp
dưới đây.
4.2.

Kết quả xác định điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly polysaccharide

trong cuống nấm linh chi
Chất có hoạt tính sinh học polysaccharide trong cuống nấm linh chi nguyên liệu
được xem là nhóm chất quan trọng bởi vì chúng có khả năng chống lại tế bào ung thư
(Nahata, 2013) và có khả năng kháng một số vi khuẩn gây bệnh (Arpitaet al., 2011).
Việc trích ly các hoạt chất có hoạt chất sinh học trong cuống nấm linh chi nguyên liệu
phụ thuộc vào nhiều yếu tố như loại dung môi, tỉ lệ nguyên liệu, nhiệt độ và thời gian
trích ly,...trong tất cả các loại dung môi thì nước được xem là loại dung môi tốt nhất
cho quá trình trích ly bởi vì nước không độc hại, không dễ cháy, giá thành rẻ và có thể
ứng dụng trong sản xuất thực phẩm một các dễ dàng. Trong nghiên cứu này để thu
được dịch chiết giàu polysaccharide xác định khả năng kháng khuẩn, chúng tôi tiến
hành xác định tỉ lệ nguyên liệu, nhiệt độ và thời gian thích hợp cho quá trình trích ly.
4.2.1. Kết quả xác định tỉ lệ nguyên liệu thích hợp cho quá trình trích ly
polysaccharide trong cuống nấm linh chi
Tỉ lệ nguyên liệu ảnh hưởng đến quá trình trích ly do ảnh hưởng đến khả năng

khuếch tán triệt để của chất cần trích ly vào dung môi. Dùng cuống nấm linh sấy khô,
nghiền mịn kích thước <0,5mm để trích ly polysaccharide, khảo sát ở các tỉ lệ nguyên
liệu khác nhau. Kết quả được thể hiện trên bảng 4.2.
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu đến quá trình trích ly polysaccharide
trong cuống nấm linh chi

10

Hàm lượng polysaccharide trong
dịch trích ly (mg/l)
127,43c ± 5,49

15

216,81b ± 6,38

20

313,21a ± 2,58

25

313,77a ± 1,29

30

312,93a ±1,76

Tỉ lệ nguyên liệu (g/l)

Chú thích: Các chữ cái giống nhau thể hiện sự khác biệt không ý nghĩa dưới mức α= 5%


Qua kết quả bảng 4.2 cho thấy ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu đến quá trình trích
li polysaccharide trong cuống nấm linh chi: tỉ lệ nguyên liệu tăng từ 10 - 20 g/l thì hàm
lượng polysaccharide trong dịch chiết cũng tăng dần, cụ thể, khi trích ly với tỉ lệ nguyên
liệu là 10g/l thì hàm lượng polysaccharide trong dịch chiết xác định được là 127,81 mg/l
hàm lượng này tăng lên 313,21 mg/l khi trích ly với tỉ lệ nguyên liệu là 20g/l. Kết quả
xử lý thống kê cho thấy không có sự khác biệt về hàm lượng polysaccharide trong dịch
chiết khi trích ly với các tỉ lệ nguyên liệu 20, 25 và 30 g/l. Có thể thấy rằng khi tỉ lệ
nguyên liệu tăng lên quá nhiều, dung môi sẽ không thể khuếch tán triệt để vào tất cả
lượng nguyên liệu để hòa tan được polysaccharide vào dịch chiết. Do đó, chúng tôi lựa
chọn tỉ lệ nguyên liệu là 20g/l để tiếp tục sử dụng khảo sát đến thời gian và nhiệt độ
trích ly.
4.2.2. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến quá trình trích ly
polysaccharide trong cuống nấm linh chi
Tùy thuộc vào điều kiện nhiệt độ có thể trích ly được các nhóm chất khác nhau
bao gồm các hợp chất phân cực được trích ly ở nhiệt độ thấp và các hợp chất không
phân cựu được trích ly ở nhiệt độ cao (trên 100 oC). Trích ly ở nhiệt độ dưới 100 oC sẽ
xảy ra quá trình hòa tan các phân tử polysaccharide mạch ngắn, ngược lại trích ly trên
100oC sẽ xảy ra quá trình hòa tan các phân tử hemicellulose (Sattler et al., 2008). Thời
gian trích ly cũng có mối tương quan tỉ lệ thuận với hiệu quả của quá trình trích ly, tuy
nhiên nếu thời gian quá dài thì hiệu quả trích ly sẽ đạt tới mức bão hòa. Cuống nấm
linh chi được trích ly polysaccharide nhờ dung môi nước với tỉ lệ nguyên liệu là 20g/l
ở nhiệt độ và thời gian khác nhau để lựa chọn điều kiện trích ly phù hợp. Kết quả khảo
sát nhiệt độ và thời gian trích ly thích hợp được thể hiện trên bảng 4.3.
Kết quả bảng 4.3 cho thấy rằng khi thời gian trích ly kéo dài từ 20 - 60 phút thì
hàm lượng polysaccharide tăng ít. Tuy nhiên, hàm lượng polysaccharide lại tăng mạnh
khi trích ly ở nhiệt độ 110oC khi thời gian trích ly tăng từ 20 đến 40 phút. Nguyên
nhân tăng cao hàm lượng này có thể do nhiệt độ cao đã tạo điều kiện tốt cho quá trình

trích ly thêm phần lớn các phân tử hemicellulose (Sattler et al., 2008). Những phân tử
này có cấu trúc phân nhánh nên có thể bị thủy phân thành các phan tử có khối lượng
nhỏ hơn (Yu el al., 2008) khi xử lý ở nhiệt độ cao. Do vậy ở nhiệt độ 110 oC, ngoài
trích ly các phân tử hòa tan như polysaccharide-peptide, còn có thể trích ly thêm


hemicellulose trong thành tế bào. Đồng thời quá trình trích ly ở nhiệt độ cao sẽ làm
cho kích thước phân tử của các hợp chất polysaccharide nhỏ hơn.
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến quá trình trích ly
polysaccharide trong cuống nấm linh chi
Nhiệt độ (oC)

Hàm lượng
Polysaccharide
trong dịch trích ly
(mg/l)

Nhiệt độ (oC)

(phút)

Hàm lượng
Polysaccharide trong
dịch trích ly (mg/l)

70-20

226,36o± 4,24

100-60

313,21e± 2,58

80-20

228,33no± 5,06

110-60

401,18b± 4,69

90-20

234,23lmn± 2,53

70-80

245,19ghijkl± 0,84

100-20

238,17jklm± 1,76

80-80

251,94fghi± 0,84

110-20

324,17d± 3,09

90-80

257,00f± 0,84

70-40

237,61klmn± 0,84

100-80

338,22c± 2,12

80-40

244,63hijkl± 2,58

110-80

316,30de± 7,27

90-40

248,29fghijk± 1,95

70-100

241,26jklm± 1,76

100-40

310,12e± 6,95

80-100

247,72fghijkl± 1,46

110-40

412,42a± 5,98

90-100

250,82fghij± 1,29

70-60

242,10ijklm± 2,12

100-100

253,63fgh± 0,84

80-60

249,97fghij± 1,29

90 - 60

fg

110-100

250,25fghij± 1,69

- Thời gian

255,03 ± 1,29

- Thời gian
(phút)

Chú thích: Các chữ cái giống nhauthể hiện sự khác biệt không ý nghĩa dưới mức α= 5%

Theo như nghiên cứu của Matsunaga et al., (2013) cho rằng ở nhiệt độ 135 oC
kích thước của polysaccharide trong khoảng 0,5-6 µm. Thành phần polysaccharide
hoàn tan vào trong dịch trích ly nấm linh chi ở nhiệt độ cao phần lớn là β- glucan với
cấu trúc phân tử rất nhỏ (Askin, 2007). Tuy nhiên, việc gia tăng nhiệt độ sẽ xảy ra quá
trình phân hủy các hợp chất hữu cơ, trong đó có cả polysaccharide. Kết quả nghiên
cứu của Askin et al. (2007) cho rằng khi tăng nhiệt độ trên 200 oC và giữ nhiệt trên 30
phút, hàm lượng các chất hữu cơ (polysaccharide) giảm mạnh. Kết quả thực nghiệm
cho thấy hàm lượng polysaccharide cao nhất (412,42 ± 5,98 mg/l) khi thực hiện quá
trình trích ly ở 110oC trong thời gian 40 phút sẽ được lựa chọn cho quá trình trích ly
polysacchride trong cuống nấm linh chi. Như vậy, để hàm lượng polysaccharide trong


dịch chiết cuống nấm linh chi đạt cao nhất chúng tôi sẽ lựa chọn trích ly với các điều
kiện sau đây: tỉ lệ nguyên liệu 20g/l, nhiệt độ và thời gian trích ly là 110oC - 40 phút.
Dịch chiết thu được từ điều kiện trích ly này sẽ được dùng để kiểm tra khả năng
kháng các vi khuẩn Esherichia coli LMG 2093, Samonella enterica HT00007, Bacillus

cereus ATCC 24579, Staphylococcus epidermidis ATCC 35984, Listeria
monocytogenes, kết quả được trình bày trong phần dưới đây.
4.3. Kết quả xác định khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh của dịch cuống nấm
linh chi
Một số hợp chất có trong nấm linh chi như terpen, profin, polysaccharide,… đã
được chứng minh là có tác động lên màng tế bào chất của vi khuẩn (Yang et al., 2002).
Dịch chiết từ các loại nấm linh chi khác nhau cũng đã được thử nghiệm khả năng
kháng một số loại vi sinh vật gây bệnh và và kết quả cho thấy rằng nó có hiệu quả
tương đương với gentamycin sulphate (một loại thuốc được dùng trong điều trị các
bệnh nhiễm khuẩn) (Dulger et al., 2004).
Dịch chiết từ cuống nấm linh chi trong điều kiện thích hợp có chứa hàm lượng
polysaccharide cao, sẽ được thử khả năng kháng các vi khuẩn Esherichia coli LMG
2093, Samonella enterica HT00007, Bacillus cereus ATCC 24579, Staphylococcus
epidermidis ATCC 35984, Listeria monocytogenes ở các nồng độ dịch chiết khác
nhau, kết quả theo dõi đường kính vòng kháng khuẩn các vi sinh vật gây bệnh của dịch
chiết cuống nấm linh chi được thể hiện trong bảng 4.4.
Bảng 4.4. Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) của dịch chiết cuống nấm linh chi
Hàm lượng
polysacchride
(mg/l)

E. coli LMG
2093

Samonella
enterica
HT00007

Bacillus
Staphylococcus

cereus ATCC
epidermidis
24579
ATCC 35984

412,42

9,10a± 0,36

0

9,63a± 0,60

8,23a±0,25

0

329,94

8,40b± 0,20

0

7,57b± 0,60

4,43b± 0,15

0

247,452

6,27c± 0,12

0

3,23c± 0,25

1,60c± 0,36

0

164,97

3,33d± 0,25

0

2,27c± 0,31

0

0

82,49

0

0

0

0

0

Listeria
monecytogenes

Chú thích: Các chữ cái giống nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt không ý nghĩa dưới mức α= 5%

Theo kết quả từ bảng 4.4 khi đánh giá sơ bộ về khả năng kháng khuẩn của dịch chiết
cuống nấm linh chi trên từng chủng vi khuẩn chúng tôi đưa ra một số nhận xét như sau:
Dịch chiết giàu polysaccharide từ cuống nấm linh chi không có khả năng kháng
hai chủng vi khuẩn Samonella enterica HT00007 và Listeria monecytogenes. Tuy


nhiên lại có khả năng kháng ba chủng vi khuẩn E. coli LMG 2093, Bacillus cereus
ATCC 24579 và Staphylococcus epidermidis ATCC 35984. Khả năng kháng khuẩn tỉ
lệ thuận với hàm lượng polysaccharide trong dịch chiết cuống nấm linh chi, cao nhất
với dịch chiết có hàm lượng polysaccharide 412,42 mg/l và 82,49 mg/l dịch chiết
không cho khả năng kháng khuẩn ở tất cả các chủng vi khuẩn.
Cụ thể đối với từng chủng:
- Trên chủng E.coli LMG 2093 khi khảo sát với các nồng độ khác nhau nhận
thấy rằng dịch chiết thể hiện khả năng kháng ở mức trung bình khi hàm lượng
polysaccharide là 247,452; 329,94 và 412,42 mg/l tương ứng với đường kính vòng
kháng khuẩn lần lượt là 6,27; 8,40 và 9,10 mm. Dịch chiết cóhàm lượng
polysaccharide 164,97 mg/l tính kháng khuẩn yếu với đường kính vòng kháng khuẩn
chỉ đạt 3,33 mm.
- Đối với chủng Bacillus cereus ATCC 24579, khả năng kháng khuẩn ở mức
trung bình, thể hiện ở các dịch chiết có hàm lượng polysaccharide 329,94 và 412,42

mg/l tương đương với đường kính vòng kháng khuẩn lần lượt là 7,57 và 9,63 mm. Với
dịch chiết có hàm lượng polysaccharide 164,97; 247,452 mg/l thì khả năng kháng
khuẩn yếu, đường kính vòng kháng khuẩn chỉ đạt 2,27 mm khi hàm lượng
polysaccharide là 164,97 mg/l.
- Chủng Staphylococcus epidermidis ATCC 35984 có khả năng kháng khuẩn
cũng giảm dần từ nồng độ dịch chiết cao xuống nồng độ dịch chiết thấp, tại hàm lượng
polysaccharide 412,42 mg/l khả năng kháng khuẩn đạt mức trung bình với đường kính
vòng kháng khuẩn là 8,23 mm. Ở hai hàm lượng tiếp theo 329,94 và 247,452mg/l khả
năng kháng khuẩn chỉ đạt mức yếu, tại hai hàm lượng polysaccharide là 82,49 và
164,97 mg/l thì khả năng kháng khuẩn không còn được biểu hiện.
Hình 4.1 dưới đây thể hiện khả năng kháng các vi sinh vật gây bệnh của dịch
chiết cuống nấm linh chi.


A
1

B

5
3

1

2

1

2

C

5
4

4

D
1

5
3

4

3

E
2

1

5
4

2

2
5

3

4

3

Hình 4.1. Khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh của dịch chiết cuống nấm linh chi
Chú thích: Hàm lượng polysaccharide trong dịch cuống nấm linh chi (1): 412,42; (2):
329,94; (3): 247,452; (4): 164,97; (5): 82,49 mg/l; (A): E. coli LMG 2093; (B): Bacillus
cereus ATCC 24579; (C): Staphylococus epidermidis ATCC 35984; (D): Samonella enterica
HT00007; (E): Listeria monecytogenes.

Như vậy, có thể kết luận rằng dịch chiết giàu polysaccharide từ cuống nấm linh
chi có khả năng kháng một số vi sinh vật gây bệnh, kết quả trên sẽ là nghiên cứu tiền
đề khi triển khai ứng dụng dịch chiết của cuống nấm linh chi vào sản xuất chế biến
một số thực phẩm có hoạt tính kháng khuẩn hay bảo quản thực phẩm theo hướng dùng
các hợp chất sinh học tự nhiên và an toàn.