Nghiên cứu thu nhận enzym Endolysin tái tổ hợp LysSa và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus trong bảo quản sữa (Luận văn thạc sĩ)

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LÊ XUÂN CÔNG

NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME ENDOLYSIN TÁI TỔ HỢP
LYSSA VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN
STAPHYLOCOCCUS AUREUS TRONG BẢO QUẢN SỮA

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. KHUẤT HỮU TRUNG

HÀ NỘI – NĂM 2018


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
-----------------------------

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME ENDOLYSIN TÁI TỔ HỢP
LYSSA VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN
STAPHYLOCOCCUS AUREUS TRONG BẢO QUẢN SỮA

Người hướng dẫn

: PGS.TS. KHUẤT HỮU TRUNG

Học viên thực hiện

: LÊ XUÂN CÔNG

Lớp

: K20

Hà Nội - 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan bản luận văn này là kết quả nghiên cứu của cá nhân tôi
dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Khuất Hữu Trung. Các số liệu và tài liệu được
trích dẫn trong luận văn là trung thực. Kết quả nghiên cứu này không trùng với
bất cứ công trình nào đã được công bố trước đó.
Tôi xin chịu trách nhiệm với lời cam đoan của mình.
Hà Nội, 06 tháng 8 năm 2018
Học viên

Lê Xuân Công


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận này, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS
Khuất Hữu Trung, ThS. Nguyễn Thị Hồng Hải cùng toàn thể các cán bộ Bộ môn
Vi sinh – Viện Di truyền Nông nghiệp đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn

thành luận văn tốt nghiệp.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô trong khoa Công Nghệ sinh
học, Viện Sinh Thái và Tài Nguyên Sinh Vật đã tận tình truyền đạt kiến thức
trong hai năm tôi học tập. Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình học
không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu luận văn mà còn là hành trang
quí báu để tôi bước vào đời một cách vững chắc và tự tin.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, những người đã
luôn ở cạnh tôi, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Cuối cùng tôi kính chúc quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe và thành công
trong sự nghiệp cao quý. Đồng kính chúc các Cô, Chú, Anh, Chị trong Bộ môn
Vi sinh – Viện Di truyền Nông nghiệp luôn dồi dào sức khỏe, đạt được nhiều
thành công tốt đẹp trong công việc.
Hà Nội, ngày 6 tháng 8 năm 2018
Học viên

Lê Xuân Công


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 1
Chương 13: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3
1.1.Tình hình ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus .......................................3
1.1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus trên thế giới...............3
1.1.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus ở Việt Nam ................5
1.2. Vi khuẩn Staphylococcus aureus ...........................................................................6
1.2.1. Giới thiệu vê Staphylococcus ...............................................................................6
1.2.2. Hình thái và đặc điểm sinh hóa .........................................................................10
1.2.3. Điều kiện tăng trưởng và sự phân bố ................................................................ 14

1.2.4. Tính kháng thuốc kháng sinh .............................................................................15
1.3. Enzym tái tổ hợp .................................................................................................. 15
1.3.1. Hệ thống biểu hiện:........................................................................................... 15
1.3.2.18Các vector biểu hiện .......................................................................................18
1.4. Tổng quan về enzym endolysin ........................................................................... 21
1.4.1. Giới thiệu về enzym endolysin ...........................................................................21
1.4.2. Vai trò và ứng dụng ........................................................................................... 23
1.4.3. Tổng hợp nhân tạo endolysin kháng khuẩn .......................................................24
1.4.4. Ứng dụng của endolysin trong công nghệ sinh học thực phẩm ........................26
1.5. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh enzym endolysin ......27
1.5.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy .................................................................27
1.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy ......................................................................27
1.5.3. Ảnh hưởng của pH ............................................................................................. 28
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP28 NGHIÊN CỨU .............................. 28
2.1. Vật liệu ..................................................................................................................29
2.2. Hóa chất và thiết bị ............................................................................................... 29
2.3. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................30
2.3.1. Phương pháp biểu hiện gen LysSA trong vi khuẩn E.coli .................................30
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu tối ưu các điều kiện nuôi cấy chủng vi khuẩn E.coli
BL21 tái tổ hợp đến sinh trưởng và biểu hiện endolysin .............................................31
2.3.3. Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh của enzyme
endolysin LysSa tái tổ hợp ........................................................................................... 31
2.3.4. Phương pháp điện di SDS-PAGE .....................................................................32
2.3.5. Phương pháp tinh sạch enzyme endolysin bằng cột sắc ký ái lực ....................34
2.3.6. Xác định hoạt độ của enzym endolysin tái tổ hợp ............................................34


2.3.7. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng của endolysin LysSa với vi khuẩn gây
bệnh có trong sữa với các nồng độ endolysin và các thời gian bổ sung endolysin LysSa
khác nhau .....................................................................................................................35

2.3.8. Phương pháp đánh giá chất lượng sữa tươi nguyên liệu sau khi bổ sung enzyme
endolysin LysSa............................................................................................................35
2.3.9. Phương pháp đánh giá chất lượng sữa tươi thanh trùng sau khi bổ sung
enzyme endolysin LysSa ............................................................................................... 35
Chương 3: KẾT QUẢ ................................................................................................. 36
3.1. Nghiên cứu tối ưu các điều kiện nuôi cấy chủng vi khuẩn E.Coli BL21 tái tổ hợp
và biểu hiện ................................................................................................................. 36
3.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ ..................................................................36
3.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy ........................... 37
3.1.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng ...........................................39
3.1.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian cảm ứng và thu hồi sinh khối .................40
3.2. Nghiên cứu thu hồi enzym endolysin tái tổ hợp bằng phương pháp phá tế bào...41
3.3. Kết quả nghiên cứu tinh sạch enzyme endolysin tái tổ hợp. ................................ 42
3.4. Đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh Staphylococus aureus của enzym
endolysin LysSa tái tổ hợp........................................................................................... 44
3.4.1. Đánh giá hoạt tính kháng bằng phương pháp đếm khuẩn lạc .......................... 46
3.4.2. Phổ kháng khuẩn của enzym endolysin ............................................................. 47
3.5. HoNK \l "_Toc3793088"vi khuẩn gây bệnh của endolysin LysSapháp phá tế
bàodolysin LysSan LysSa với ..................................................................................... 49
3.6. Chất lượng sữa tươi nguyên liệu sau khi bổ sung enzyme endolysin LysSa .......51
3.7. Hoạt tính đối kháng vi khuẩn gây bệnh có trong sữa tươi thanh trùng của endolysin
LysSa ........................................................................................................................... 52
3.8. Chất lượng sữa tươi thanh trùng sau khi bổ sung enzyme endolysin LysSa ........53
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................... 55
1. KẾT LUẬN..............................................................................................................55
2. KIẾN NGHỊ .............................................................................................................55
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 56


M5AGER

Hiện nay ngộ độc thực phẩm đã và đang là mối lo ngại nghiêm trọng cho
sức khỏe cộng đồng trên toàn thế giới. Nguyên nhân là do con người sử dụng
các loại thực phẩm đã bị nhiễm các loài vi khuẩn gây bệnh hay độc tố của
chúng. Mặc dù đã có công nghệ hiện đại, các phương pháp thực hành sản xuất
tốt (GMP), kiểm soát chất lượng và vệ sinh cũng như an toàn sản xuất và đánh
giá rủi ro (HACCP), nhưng số lượng các trường hợp bị ngộ độc và bị bệnh do
thực phẩm vẫn tăng lên trong suốt thập kỷ qua. Ở châu Âu, mỗi năm ước tính
có hơn 380.000 người dân bị bệnh do sử dụng các sản phẩm thực phẩm nhiễm
vi khuẩn, các loại vi khuẩn gây bệnh như: Staphylococcus aureus, Salmonella,
Listeria.
Staphylococcus aureus là tác nhân phổ biến gây nhiễm trùng bệnh viện
cũng như trong cộng đồng dân cư với tỷ lệ mắc và tử vong cao trên toàn thế giới.
S. aureus khi nhiễm độc thức ăn, đồ uống do tiếp xúc giữa người mang mầm
bệnh sẽ có thể dẫn đến và viêm ruột cấp do các thức ăn có chứa độc tố ruột của S.
aureus, gây mất nước và điện giải có thể dẫn tới sốc. S. aureus là một trong những
nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm khuẩn bệnh viện. Những chủng S. aureus gây
nhiễm khuẩn bệnh viện thường có khả năng kháng lại nhiều kháng sinh. S.aureus
còn gây hội chứng sốc nhiễm độc do tiết ra độc tố gây sốc. Theo một số cơ quan
quản lý thực phẩm châu Âu, các vi sinh vật gây bệnh phổ biến có nguồn gốc từ
thực phẩm bao gồm Salmonella, Escherichia coli O157:H7, S. aureus và Listeria
cùng với một số loài khác. Sử dụng các chất hóa học để bảo quản thực phẩm ít
được chấp nhận vì nhiều chất bảo quản hóa học đã làm ảnh hưởng lâu dài tới sức
khỏe cộng đồng. Trong số các chất bảo quản sinh học được biết hiện nay, endolysin
hiện đang thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học do nó có khả năng diệt và ức
chế các vi sinh vật gây bệnh.
Endolysins (hay tên gọi khác là lysins) là các enzym thủy phân có nguồn
gốc từ thực khuẩn thể (bacteriophage) có tác dụng phá hủy peptidoglycan của
1

thành tế bào vi khuẩn trong giai đoạn cuối chu trình sinh sản của thực khuẩn thể.
Các enzyme này làm giảm độ mạnh cơ học của thành tế bào dẫn đến dung giải
tế bào và giải phóng ra các thực khuẩn thể thế hệ tiếp theo. Do đó khi có mặt
endolysins chúng có thể phân hủy lớp peptidoglycan của thành tế bào của mọi
vi sinh vật khi chúng tiếp xúc, dẫn đến vi sinh vật bị chết. Do vậy chúng được
coi như là một chất thay thế kháng sinh thực phẩm có tính tác động chọn lọc,
không thay đổi đặc điểm cảm quan, kết cấu của thực phẩm và rất an toàn cho
con người.
Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu thu nhận enzym Endolysin tái tổ hợp LysSa và đánh giá hoạt
tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus trong bảo quản sữa.”
1. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI:
Nghiên cứu tối ưu các điều kiện nhân nuôi chủng tái tổ hợp E.coli BL21,
thu nhận enzyme endolysin LysSa và đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn gây
bệnh Staphylococcus aureus của endolysin LysSa tái tổ hợp trong bảo quản
sữa.
2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU:
2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng, xác định các điều kiện tối ưu cho chủng E.coli
BL21 sinh trưởng và biểu hiện enzym endolysin LysSa:
- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy
- Ảnh hưởng của nhiệt độ
- Ảnh hưởng của pH
- Ảnh hưởng của chất cảm ứng IPTG
2.2. Nghiên cứu thu hồi và enzyme endolysin LysSa
- Nghiên cứu phương pháp thu hồi enzyme endolysin LysSa
- Nghiên cứu tinh sạch enzyme endolsin LysSa.
2.3. Đánh giá được hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus trong
bảo quản sữa

2

Chương 1
Thương 1N TÀI LIsữ
1.1.Tình hình ngu LIsữaus tính khánStaphylococcus aureus
1.1.1. Tình hình ngus aureusc ph hình ngus aureuscus aureus trên theusius
Theo WHO/FAO (tháng 5/2005), ngộ độc thực phẩm ảnh hưởng rất lớn
đến sức khỏe con người và kinh tế, làm 1,5 tỉ lượt người bệnh, ở các nước công
nghiệp 30% dân số bị ngộ độc thực phẩm hàng năm. Trên thế giới, vụ ngộ độc
lớn đầu tiên có liên quan đến tụ cầu xảy ra vào năm 1884 ở Michigan (Mỹ) do
phomai. Tiếp đến là ở Pháp vào năm 1894 do thịt từ bò bị bệnh. Khô bò bị nhiễm
tụ cầu cũng từng gây ngộ độc ở Kalamazoo, Michigan vào năm 1907. Năm 1914,
ở Philippines, Barbert xác định rằng sữa lấy từ bò bị viêm vú đã gây ra ngộ độc
ở người. Năm 1930, Dark lại xác định được vụ ngộ độc do S. aureus từ bánh
giáng sinh (Reginald Bennett, 2001). Ở Pháp, số vụ ngộ độc báo cáo từ năm
1999-2000 cho thấy: 32% số vụ là do sản phẩm sữa và đặc biệt là phô mai, 22%
do thịt, 15% do xúc xích, bánh pate; 11% do các và hải sản; 11% do trứng và sản
phẩm trứng; 9,5% do gia cầm (Haeghebaert và cs., 2002). Ngộ độc do S. aureus
đứng hàng thứ hai sau Salmonella (bảng 1.1). Những thực phẩm bị nhiễm tụ cầu
và gây ngộ độc thường gặp là thịt, cá, gà và sản phẩm của chúng, rau cải, trứng,
nấm, sữa và sản phẩm từ sữa, kem, phomai, thực phẩm lên men…(Normanno G.
và cs, 2004). Ở Đài Loan, S. aureus chiếm 30% trong số các vụ dịch từ năm 1986
đến năm 1995. Vào tháng 6 năm 2000, vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu tại một
trường trung học ở Taichung County làm 10 trong số 356 học sinh có biểu hiện
ngộ độc 2-3 giờ sau khi ăn sáng (Wei H.L. và Chiou C.S., 2001). Tại Brazil, vào
tháng 2 và tháng 5 năm 1999 đã xảy ra hai vụ dịch làm 378 người bị ngộ độc do
dùng phomai và sữa tươi có nhiễm tụ cầu (Simeão L.C và cs, 2001). Tại Pháp,
năm 1997 người ta tìm thấy S. aureus là tác nhân gây ra 569 trong tổng số 1142
vụ ngộ độc thực phẩm ( Rosec J.P. và Gigaud O., 2002). Ở Nhật, từ năm 1994
đến năm 1998, số trường hợp ngộ độc do tụ cầu chiếm 3,1-11,9% tổng số các vụ

3


ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn. Ngày 17/6/1999, 21 trong số 53 công nhân sau
khi ăn trưa tại căn tin công ty ở Shizuoka Prefecter thì có biểu hiện bệnh, trong
đó có 8 trường hợp phải nhập viện (Norinaga M. và cs, 2000).
Bảng 1.1. Các tác nhân vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm ở Pháp năm
Tác nhân

1999-2000 (%)
số vụ
số trường

Số nhập

Số chết

n=530

hợp n=6451

viện n=872

n=7

63,8

47,7

16,8

100

Staphylococcus aureus

16

25,6

17,1

0

Clostridium perfringens

5,1

12,3

0,5

0

Bacillus cereus

2,8

3,7

10,0

0

Histamin

3,8

1,4

30,4

0

Salmonella sp.
(Enteritidis,
Typhimurium, Heidelberg
và một số serotype khác)

Các loại thực phẩm liên quan đến ngộ độc thực phẩm do S.aureus cũng rất
khác nhau ở mỗi quốc gia. Chẳng hạn ở Mỹ, 50% số vụ ngộ độc được báo cáo từ
năm 1969-1990 là từ các sản phẩm thịt, các món ăn từ thịt và đặc biệt là thịt muối;
22% trường hợp là do gia cầm, các món ăn từ gia cầm, 8% từ sữa và sản phẩm
sữa; 7% do cá và tôm cua, ghẹ; 3,5% do trứng. Số vụ ngộ độc báo cáo từ năm
1975-1982 cho thấy: 36% do thịt; 12,3% do salad; 11,3% do gia cầm; 5,1% do
bánh nướng, bánh bao và chỉ có 1,4% do sữa và sản phẩm hải sản. 17,1% thực
phẩm liên quan vụ ngộ độc không được biết (Genigeorgis, 1989). Sự khác biệt này
là do thói quen ăn uống cũng rất khác nhau theo từng nước. Tụ cầu gây ra khoảng
14% trong các vụ ngộ độc thực phẩm; và hàng năm, Mỹ mất khoảng 1,5 tỉ đô la
cho những vụ ngộ độc do tụ cầu. Trong các loại độc tố gây ra các vụ ngộ độc thì

SEA là loại độc tố chiếm tỷ lệ cao nhất (77,8%), SED (37,5%) và SEB (10%)
(Normanno G.và ctv, 2004).
4


Hầu hết các vụ ngộ độc do tụ cầu là do quá trình chế biến hoặc bảo quản
thực phẩm không tốt. Tụ cầu thường nhiễm trực tiếp vào thực phẩm do tay người
chế biến bị trầy xước hay do ho, hắt hơi. Việc bảo quản thực phẩm ở nhiệt độ
không phù hợp cũng rất quan trọng, một khi thực phẩm đã nhiễm tụ cầu, chúng
sẽ tăng nhanh số lượng do tụ cầu phát triển được trong khoảng nhiệt độ rất lớn,
từ 7-48oC. Điều đáng lo ngại độc tố được tạo ra trong suốt quá trình phát triển
của tụ cầu nhưng lại không gây ảnh hưởng đến cảm quan của thực phẩm, do đó
ít được chú ý (Mary K. S. và cs, 2002).
1.1.2. Tình hình ng vn bị trầy xước hay do ho, hắt hơi. Việc bảo quản
Theo đánh giá của tổ chức Y tế thế giới, hàng năm Việt nam có khoảng trên 3
triệu ca ngộ độc thực phẩm, gây tổn hại trên 200 triệu USD. Trong những năm gần đây
số vụ ngộ độc thực phẩm ở nước ta ngày càng gia tăng. Năm 2000 có 213 vụ ngộ độc
thực phẩm với 4233 người mắc 59 người tử vong (Bùi Thế Hiền, Tô Thị Thu và cs,
2003). Theo số liệu từ cục Quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, trong những
vụ dịch được tổng kết từ năm 1997 đến 2002 thì ngộ độc thực phẩm do tác nhân vi sinh
vật chiếm tỷ lệ cao từ 40-45% trong các loại gây ngộ độc, trong số đó có nhiều vụ
được xác định tác nhân là Staphylococcus aureus (Nguyễn Đỗ Phúc và cs, 2003).
Từ năm 2002 đến 2004 theo số liệu của trung tâm y tế dự phòng đã có 77 vụ ngộ
độc thực phẩm mà phần lớn nguyên nhân là do thức ăn bị nhiễm khuẩn, chiếm
66% (Nguyễn Lý Hương và cs, 2005). Từ dữ liệu của Hội nghị tổng kết dự án bảo
đảm chất lượng vệ sinh an tòan thực phẩm của Cục vệ sinh an toàn thực phẩm
năm 2006, số vụ ngộ độc thực phẩm ở nước ta là 164 vụ (tăng 14,6% so với năm
2005), làm 7.135 người bị ngộ độc (tăng 65,8% so với năm 2005), trong đó có 64
vụ (38,8%) là do vi sinh vật gây ra (Hội nghị tổng kết dự án đảm bảo an tòan vệ
sinh thực phẩm, tháng 3/2007, Cục vệ sinh an tòan thực phẩm, Bộ Y tế) Qua các

cuộc khảo sát tình hình vệ sinh thức ăn đường phố và các thực phẩm chế biến sẵn
tại các chợ cho thấy mức độ nhiễm Staphylococcus aureus là rất cao, phù hợp với
các kết quả xét nghiệm trong các vụ ngộ độc tại thành phố Hồ Chí Minh trong

5


những năm qua. Đáng chú ý hơn cả là ở các mẫu bánh mì thịt nguội là 16/30 mẫu
(53%), các mẫu thịt quay là 18/20 mẫu (90%) (Nguyễn Đỗ Phúc và cs, 2003;
Nguyễn Lý Hương và cs, 2005.
Một số vụ ngộ độc thực phẩm ở nước ta liên quan đến S.aureus và độc tố
ruột của chúng đó là vụ ngộ độc thực phẩm của cán bộ, sinh viên khoa Địa chất
và Sinh học trường Đại học Khoa học tự nhiên TP.HCM vào ngày 27/7/2006
trong chuyến đi thực tế và đã ăn trưa tại Nha Trang (Khánh Hòa). Chiều cùng
ngày, nhiều cán bộ sinh viên đau đầu, tiêu chảy, ói mửa, tất cả 105 người phải
vào bệnh viện để cấp cứu. Nguyên nhân được xác định là do thức ăn chế biến
không hợp vệ sinh, để lâu nên đã nhiễm tụ cầu vàng và đã sinh độc tố enterotoxin.
Sau đó những vụ ngộ độ thức ăn do tụ cầu được phát hiện và nói đến nhiều
hơn (Đỗ Thị Hòa, 2006). Ở Thành phố Hồ Chí Minh vụ ngộ độc xảy ra tại Trường
Tiểu học Thanh Đa - Khu phố II Cư xá Thanh Đa, P.27, Q. Bình Thạnh ngày
03/5/2006, có khoảng 20 cháu bị ngộ độc. Sau khi ăn khoảng 30 phút các cháu
có triệu chứng đau bụng, nôn ói, nhức đầu. Qua xét nghiệm cho thấy trong mẫu
chất nôn đã có độc tố tụ cầu khuẩn nhóm A.
Vụ ngộ độc ở nhà trẻ Hồng Nhung, thị trấn Đông Dương - H. Phú Quốc,
Kiên Giang ngày 2/9/2006. Thức ăn gồm có yaourt, cơm, thịt xào. Các triệu
chứng cũng tương tự như nôn ói, đau bụng. Kết quả kiểm tra cho thấy phần lớn
các mẫu thực phẩm đầu nhiễm S.aureus từ 101 vi khuẩn/gam đến 107 vi khuẩn
/gam. Trong đó độc tố được phát hiện có trong mẫu yaourt, độc tố nhóm C
(Nguyễn Thị Kê, 2006).
1.2. Vi khuhu1Staphylococcus aureus

1.2.1. Gi. hylococcê Staphylococcus
Staphylococcus là lọai cầu khuẩn, bao gồm cả loài hiếu khí (Micrococcus,
Planococcus và Deinococcus), loài kị khí tuỳ nghi (Staphylococcus,
Stomacoccus, Streptococcus, Leuconostos, Pedio coccus, Aerococcus và
Gemella) và giống kị khí (Peptococcus, Peptostreptococcus, Ruminococcus,
6


Coprococcus và Sarcina). Họ Micrococcaceae gồm bốn giống: Micrococcus,
Stomacoccus, Planococcus và Staphylococcus. Những đặc tính khác nhau của
cầu khuẩn Gram (+) gồm: sự sắp xếp của tế bào, hiếu khí bắt buộc, kị khí tuỳ
nghi hay vi hiếu khí, kị khí bắt buộc, phản ứng catalase, sự hiện diện
cytochromes, sản phẩm lên men từ quá trình kị khí, peptidoglycan, axít teichoic
trong thành tế bào vi khuẩn (Scott E.M và cs, 2000).
Phân loại của vi khuẩn Staphylococcus như sau:
 Giới: Prokaryote
 Phân loại: Firmicute
 Lớp: Firmibacteria
 Họ: Micrococceae
 Giống: Staphylococcus
Hiện nay có 32 loài Staphylococcus (bảng 1.2). Hàm lượng G+C trong giống
từ 30-39 mol%. Một vài loài khác hiện nay đang được nghiên cứu.
Có thể chia Staphylococcus thành 3 nhóm:
- Nhóm cho phản ứng coagulase dương tính.
- Nhóm cho phản ứng coagulase âm tính và nhạy với Nobovicine.
- Nhóm cho phản ứng coagulase âm tính và kháng với Nobovicine.

7

Bảng 1.2. Các loài Staphylococcus
TT

Loài

TT

Loài

TT

Loài

1

S. aureus

12

S.pasteuri

23

S.simulans

2

S.capitis

13

S.equorum

24

S.intermedius

3

S.haemoliticus

14

S.felis

25

S.chromogens

4

S.sachatoliticus

15

S.schleiferi

26

S.lentus

5

S.saprophyticus

16

S.muscae

27

S.lugdenensis

6

S.cohnii

17

S.epidermis

28

S.caprae

7

S.xylosus

18

S.warneri

29

S.arlettae

8

S.carmosus

19

S.hominis

30

S.piscifermentans

9

S.hyicus

20

S.auriculari

31

S.delphini

10 S.sciuri

21

S.caseolyticus

32

S.vitulus

11 S.gallinarum

22

S.kloosii

Trong số các loài Staphylococcus thì Staphylococcus aureus là loài
thường gặp nhất, chúng thuộc nhóm cho phản ứng coagulase dương tính. Tên
Staphylococcus có nguồn gốc từ tiếng Latinh, staphylo (chùm nho) và coccus
(hạt).
Staphylococci là những tế bào hình cầu Gram (+), đường kính 0,5-1,5µm,
có thể đứng riêng rẽ, từng đôi, bốn con, chuỗi ngắn (3-4 tế bào) hoặc chùm không
theo một trật tự nào cả. Sự hình thành chùm thường xảy ra trong quá trình vi
khuẩn phát triển trên môi trường đặc, do kết quả của sự phân chia tế bào quá
nhiều. Staphylococci không di động, không sinh nha bào, nang thì có mặt trong
những tế bào còn non, nhưng biến mất khi tế bào ở giai đoạn pha ổn định. Màu
sắc khuẩn lạc trên môi trường không chọn lọc như tryptic soy agar (TSA) có thể
màu kem đến màu hồng sáng. Các loài Staphylococcal là hiếu khí hoặc kị khí
tuỳ nghi và có cả quá trình hô hấp và lên men. Staphylococci thu nhận năng

lượng thông qua sự chuyển hoá glycosis, hexose monophosphate và chu trình

8


axít tricarboxylic. Staphylococci có catalase dương và sử dụng nhiều loại
carbonhydrat khác nhau.
Năm 1871, Von Recklinghausen, nhà khoa học người Đức lần đầu tiên
theo dõi cầu khuẩn trong thận từ một bệnh nhân chết do nhiễm trùng máu. Năm
1880, Alexxander Ogston (bác sĩ phẫu thuật người Scốt-len) và Louis Pasteur đã
chứng minh áp xe viêm mủ là do cầu khuẩn gây ra. Ogston đã theo dõi hai loại
cầu khuẩn: một loại tạo thành chuỗi gọi là Streptococcus và một loại đứng thành
chùm gọi là Staphylococcus. Ogston tin tưởng vào sự khám phá của mình và đặt
tên cho cầu khuẩn đứng chùm là Staphylococcus. Ogston được công nhận là
người khám phá và đặt tên cho tụ cầu – Staphylococcus vào năm 1882. Năm
1884, Rosenbach là người phân lớp Staphylococci dựa trên cơ sở tên của nhà
khoa học Ogston và đặt tên cho cầu khuẩn tạo khuẩn lạc màu vàng là
Staphylococcus pyrogen aureus (Scott E.M và cs, 2000).
Phần lớn các loài Staphylococcus cư trú phổ biến ở da và màng nhầy. Một
vài loài tìm thấy một số vị trí cố định như loài S. apcapitis chỉ tìm thấy vùng đầu
và vùng trán. Các loài Staphylococcus tìm thấy ở người bao gồm: S.aureus,
S.epidermidis, S.hominis, S.haemoliticus, S.warneri, S.captis, S.saccharolyticus,
S.auricularis, S.simulans, S.saprophyticus, S.cohnii và S. xylosus. Staphylococci
cư trú trên da người chiếm tỷ lệ 65-90% các chủng phân lập được.
S.aureus là loài phổ biến nhất trong giống Staphylococcus. Trong điều
kiện kị khí sự phát triển của vi khuẩn cần có amino acid và vitamin, nhưng trong
điều kiện hiếu khí cần có thêm uracil và các nguồn carbon. S.aureus phát triển
tốt nhất ở điều kiện hiếu khí, nhiệt độ tối thích cho sự phát triển là 35 oC, nhưng
có thể phát triển được trong khoảng nhiệt độ từ 10 đến 45 oC, khoảng pH có thể
phát triển từ 4,5 đến 9,3, nhưng pH tối thích khoảng 7,0 đến 7,5.

 Phân lập và phát hiện Staphylococcus:

Kiểm tra trực tiếp trên kính hiển vi với những dịch lỏng vô trùng (máu,
dịch não tuỷ). Kết quả được xác nhận là cầu khuẩn Gram (+) có nghĩa tương
đồng là Staphylococci.
9


Nhiều môi trường đặc dùng để phát hiện Staphylococci, đặc biệt là
S.aureus.
Môi trường chọn lọc S.aureus sử dụng một số hoá chất độc hại để tăng khả
năng chọn lọc. Thành phần môi trường gồm có NaCl, tellurite, lithium chloride
và nhiều kháng sinh khác nhau. Một số môi trường dùng để phân lập và xác định
mức nhiễm S.aureus >100 vi khuẩn/g thực phẩm là môi trường staphylococcal
110, thạch VogelJohnson, thạch Egg yolk-sodium azide, thạch telluritepolymixin-egg yolk và BairdParker.
Phần lớn những môi trường chọn lọc thích hợp cho S.aureus bình thường
không bị tác động. Tuy nhiên do sự tác động của quá trình chế biến, bảo quản,
điều kiện bất lợi, bị tác động đến ngưỡng gần chết thì việc tăng sinh S.aureus cần
có những tác nhân chọn lọc. S. aureus có thể không phát triển trên những môi
trường tăng sinh chọn lọc truyền thống. Môi trường Baird-Parker là môi trường
thích hợp nhất cho việc tăng sinh những tế bào bị tổn thương.
Các loài Staphylococcal có thể xác định qua một vài đặc điểm như hình
thái khuẩn lạc, sự tạo thành coagulase, tan huyết, đề kháng novobiocin, sự tạo
thành acetoin, sử dụng nguồn carbonhydrat điều kiện hiếu khí. Trên môi trường
không chọn lọc như TSA (tryptic soy agar), thạch dinh dưỡng, phần lớn các loài
staphylococcal phát triển mạnh sau 18-24 giờ/35oC với đường kính khuẩn lạc 13 mm. Dựa vào hình thái và màu sắc khuẩn lạc có thể trợ giúp xác định các loài
Staphylococcal (Scott E.M và cs, 2000).
1.2.2. Hình thái và đ cs, 2000)c 1-3
Staphylococcus aureus thuộc giống Staphylococcus, do đó mang những
tính chất chung của Staphylococcus. S. aureus là những vi khuẩn hình cầu, không

di động, gram dương, đường kính 0,5-1,5 µm, tế bào xếp thành hình chùm nho,
không di động. Thành tế bào kháng với lysozyme và nhạy với lysotaphin, một
chất có thể phá hủy cầu nối pentaglycin của tụ cầu.

10


Hình 1.1. Hình thái

Hình 1.2. Tụ cầu Staphylococcus

Staphylococcus aureus

aureus gram dương dưới kính hiển vi

S.aureus là những vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy nghi, có enzyme
catalase phân giải oxy già giải phóng oxy và nước:
Cata
lase

H2O2

H2O + O2

S. aureus cho phản ứng đông huyết tương dương tính do chúng tiết ra
enzyme coagulase. Đây được xem là tính chất đặc trưng của S.aureus, là tiêu
chuẩn để phân biệt S.aureus với các tụ cầu khác. Có hai dạng coagulase:
coagulase ―cố định‖ (―bound‖ coagulase) gắn vào thành tế bào và coagulase
―tự do‖ (―free‖ coagulase) được phóng thích khỏi thành tế bào. Có hai phương
pháp để thực hiện thử nghiệm coagulase là thực hiện trên lam kính và trong ống

nghiệm. Phương pháp lam kính giúp phát hiện những coagulase ―cố định‖ bằng
cách phản ứng trực tiếp với fibrinogen, phương pháp ống nghiệm phát hiện
những coagulase ―tự do‖ bằng phản ứng gián tiếp với fibrinogen qua cộng hợp
với những yếu tố khác trong huyết tương tạo thành từng khối hay thành cục
(Collin C.H và cs, 1995) [9].

11


Huyết tương

Khối Fibrin

Cơ chế thông thường biểu diễn quá trình đông tụ huyết tương như sau:
Prothrombin
Ca2+

Thrombokinase enzym

Thrombin

Fibrinogen

Coa
gulase

Fibrin

Ngoài ra, chúng còn cho phản ứng DNAse, phosphatase dương tính, có
khả năng lên men và sinh acid từ manitol, trehalose, sucrose. Tất cả các dòng S.

aureus đều nhạy với Novobicine, có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa
đến 15% muối NaCl (Trần Linh Thước, 2002).
Một số dòng S. aureus có khả năng gây tan máu trên môi trường thạch
máu, vòng tan máu phụ thuộc vào từng chủng nhưng chúng đều có vòng tan máu
hẹp hơn so với đường kính khuẩn lạc. Hầu hết các dòng S.aureus đều tạo sắc tố
vàng, nhưng các sắc tố này ít thấy khi quá trình nuôi cấy còn non mà thường thấy
rõ sau 1-2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng. Sắc tố được tạo ra nhiều hơn trong
môi trường có hiện diện lactose hay các nguồn hidrocacbon khác mà vi sinh vật
này có thể bẻ gãy và sử dụng (Collin C.H và cs, 1995).
Trên môi trường BP (Baird Parker), khuẩn lạc đặc trưng của S. aureus có
màu đen nhánh, bóng, lồi, đường kính 1-1,5 mm, quanh khuẩn lạc có vòng sáng
rộng 2-5 mm (do khả năng khử potassium tellurite K2TeO3 và khả năng thủy
phân lòng đỏ trứng của lethinase) (Rosamund M B. và cs, 1995; Mary K. S. và
cs, 2002). Trên môi trường MSA (Manitol salt agar) hay còn gọi là môi trường
Chapman, khuẩn lạc tròn, bờ đều và lồi, màu vàng nhạt đến vàng đậm và làm
vàng môi trường xung quanh khuẩn lạc (do lên men đường manitol) (Mary K. S.
và cs, 2002).

12


Môi trường Chapman

Môi trường Baird parker

Hình 1.3. Hình thái khuẩn lạc S.aureus trên 2 môi trường nuôi cấy
Đa số các dòng S. aureus có thể tổng hợp một hay nhiều enterotoxin trong
môi trường có nhiệt độ trên 15oC, nhiều nhất khi chúng tăng trưởng ở nhiệt độ
35-37oC (Trần Linh Thước, 2002).
Bảng 1.3. Những đặc tính của S. aureus, S. epidermidis và Micrococci

Đặc tính

(Reginald W. B. và cs, 2001)
S. aureus
S. epidermidis

Micrococci

Catalase

+

+

+

Coagulase

+

-

-

Thermonuclease

+

-

-

Nhạy với Lysostaphin

+

+

-

Sử dụng glucose

+

+

-

13


Sử dụng manitol

+

-

-

1.2.3. Điginald W. B. và cs, 2001) [28]ng

Nhu cầu dinh dưỡng cho sự phát triển của Staphylococcus aureus thay đổi tùy
thuộc vào từng dòng. S. aureus có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ rất rộng,
từ 7- 48oC, với nhiệt độ cực thuận là 30-45oC; khoảng pH 4,2-9,3, với độ pH cực
thuận là 7-7,5; và trong môi trường chứa trên 15% NaCl. Tụ cầu bền vững khi có
nồng độ đường cao, nhưng bị ức chế bởi nồng độ 60%; nồng độ từ 33-55%, tụ cầu
vẫn phát triển, trong khi các vi khuẩn khác như Shigella và Salmonella bị ức chế.
Ngoài ra, chúng còn có khả năng bám dính tốt trên nhiều loại tế bào và máy móc
thiết bị giúp gia tăng tính kháng của tụ cầu với sự sấy khô và lọc thấm. Chính nhờ
những đặc điểm trên giúp S. aureus có sự phân bố rộng, chủ yếu được phân lập từ
da, màng nhày, tóc và mũi của người và động vật máu nóng. S. aureus được cho là
vi khuẩn khá mạnh có thể sống tốt bên ngoài kí chủ. Vi khuẩn này còn có mặt trong
không khí, bụi và trong nước dù chúng thiếu tính di động và rất nhạy với thuốc kháng
sinh và chất diệt khuẩn. Tuy nhiên, S. aureus cũng khá nhạy với nhiệt độ, bị diệt ở
60oC từ 2-50 phút tùy từng loại thực phẩm và là vi sinh vật cạnh tranh yếu, dễ bị các
vi sinh vật khác ức chế.
Có 10-50% dân số vẫn sống khỏe mạnh dù mang S. aureus. Tuy nhiên khả
năng nhiễm vào thực phẩm và gây bệnh của S. aureus cũng rất lớn do chúng phân
bố ở khắp nơi và có khả năng sinh độc tố. Tụ cầu nhiễm thực phẩm vào chủ yếu
qua con đường chế biến có các công đoạn tiếp xúc trực tiếp với người. Sự hiện diện
với mật độ cao của S. aureus trong thực phẩm cho thấy điều kiện vệ sinh của quá
trình chế biến kém, kiểm soát nhiệt độ trong các công đoạn chế biến không tốt. Tuy
nhiên, điều đó không đủ bằng chứng để cho rằng thực phẩm đó sẽ gây độc, điều đó
chỉ xảy ra khi S. aureus được phân lập tạo độc tố. Ngược lại, chỉ với một lượng nhỏ
S. aureus tạo độc tố cũng có thể gây ngộ độc.

14


1.2.4. Tính kháng thug có thể gây
Hầu hết các dòng S. aureus kháng với nhiều loại kháng sinh khác nhau.

Một vài dòng kháng với tất cả các loại kháng sinh ngoại trừ vancomycin, và
những dòng này ngày càng tăng. Những dòng MRSA (Methicilin resistant
Staphylococcusaureus) rất phổ biến và hầu hết các dòng này cũng kháng với
nhiều kháng sinh khác.Trong phòng thí nghiệm, người ta đã tìm thấy plasmid
kháng vancomycin ở Enterococcus faecalis có thể chuyển sang S. aureus, và
người ta nghĩ rằng việc chuyển này có thể xảy ra ngoài tự nhiên, trong đường
tiêu hóa chẳng hạn. Ngoài ra, S. aureus còn kháng với chất khử trùng và chất
tẩy uế (Kenneth Todar, 2005).Từ khi sử dụng penicillin vào những năm 1940,
tính kháng thuốc đã hình thành ở tụ cầu trong thời gian rất ngắn. Nhiều dòng
hiện nay đã kháng với hầu hết kháng sinh thông thường, và sắp tới sẽ kháng cả
những kháng sinh mới. Việc thay thế kháng sinh cũ bằng vancomycin đã dẫn
đến sự gia tăng các dòng kháng vancomycin VRSA (Vancomycin Resistant
Staphylococcusaureus) (Kenneth Todar, 2005).
Khảo sát tính chất chống đối kháng sinh tại Thành phố Hồ Chí Minh năm
2005 cho thấy các chủng S. aureus phân lập từ bệnh phẩm cho thấy có đến 94,1%
chủng kháng Penicillin, 52,9% kháng Ciprofloxacin, 52% kháng Amoxillin và
12,5% kháng Getamicin (Nguyễn Thị Kê và cs, 2006).
1.3. Enzym tái tbệnh
1.3.1. HệH thnzym tái tbệnh
Tùy theo mục đích sử dụng mà ta có thể sử dụng hệ thống biểu hiện gen thích
hợp. Để thu được protein ngoại lai với hàm lượng lớn và hoạt tính tốt thì việc lựa
chọn hệ biểu hiện và vector biểu hiện là rất quan trọng. Bởi mỗi loại protein đích có
các đặc điểm khác nhau phù hợp với các hệ thống biểu hiện khác nhau và mỗi hệ
biểu hiện đều có ưu nhược điểm khác nhau. Hiện nay có 2 hệ thống biều hiện gen
chính là tế bào sinh vật nhân sơ và tế bào sinh vật nhân chuẩn.
1.3.1.1 . Hệ thống biểu hiện gen ở sinh vật nhân sơ (vi khuẩn)

15

Hiện nay tế bào E.coli là hệ thống tế bào chủ được sử dụng rộng rãi nhất vì
rất dễ nuôi cấy, dễ giữ, nhân giống, cảm ứng dễ dàng bằng cách sử dụng IPTG.
Ngoài ra do đặc tính sinh trưởng nhanh nên rất nhanh chóng thu được protein mong
muốn, việc tinh chiết rất đơn giản nhờ sử dụng hệ thống sắc ký ái lực.
E.coli là vi khuẩn Gram âm, hình que, dài khoảng 1µm, không gây bệnh
thường gặp trong đường ruột của người. E.coli có nhiễm sắc thể dạng vòng nằm
trong vùng nhân. Kích thước của phân tử khoảng 4.106 bp. Các quá trình biểu
hiện gen như phiên mã, dịch mã được xảy ra đồng thời. Sau khi được phiên mã
thì mARN sẽ được sử dụng để dịch mã mà không qua quá trình sửa đổi sau phiên
mã do vậy hệ thống này rất thích hợp cho việc biểu hiện các gen khi các gen này
không có quá trình biến đổi sau dịch mã. Đặc biệt nhiều năm qua, các đặc điểm
về di truyền và sinh lý của E. coli đã được nghiên cứu rất cặn kẽ. Trên thị trường
đã thương mại nhiều chủng E. coli cùng nhiều loại vector cải tiến trở thành vật
chủ hữu hiệu trong kĩ thuật tách dòng và biểu hiện gen.
Tuy nhiên ở hệ biểu hiện E. coli cũng bộc lộ một số nhược điểm như E.
coli không có khả năng sản xuất hiệu quả các loại protein có kích thước quá lớn
hoặc quá nhỏ. Các gen của sinh vật nhân chuẩn không thể biều hiện được hoặc
có biểu hiện được nhưng không được cải biến chính xác. Đồng thời các protein
thường biểu hiện ở dạng thể vùi do việc tổng hợp protein một cách ồ ạt hay thiếu
các phân tử đặc hiệu giúp cuộn xoắn cấu trúc, điều này tuy có thuận lợi cho quá
trình tinh sạch protein nhưng sau đó protein rất khó phục hồi hoạt tính sinh học
(Yin et al., 2007). Ngoài ra, trong nghiên cứu sản xuất các protein trị liệu bằng
E. coli luôn tiềm ẩn nhiều nguy cơ gây ra phản ứng phụ trên người và động vật
bởi một số chất (nội độc tố) sinh ra trong quá trình biểu hiện.
Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đã cho thấy, hiệu suất tổng hợp một số protein
ngoại lai trong E. coli rất cao nếu sử dụng plasmid phù hợp. Chính vì vậy, E. coli
vẫn đang là hệ biểu hiện được sử dụng rồn rãi nhất trong việc tạo protein tái tổ
hợp.

16

1.3.1.2. Hệ thống tế bào chủ nhân chuẩn
Các tế bào chủ nhân chuẩn có phổ tồn tại rất rộng từ các vi sinh vật nhân
chuẩn bậc thấp như nấm men, nấm mốc, tảo cho đến các sinh vật đa bảo phức
tạp như động vật, thực vật. Hệ thống nay có mức độ biểu hiện cao, các protein
dễ tinh chiết bằng cách sử dụng các đuôi đặc biệt được gắn vào trong các vector
như His, Myc... Đồng thời rất thuận tiện trong việc thu protein mà không phải
phá vỡ tế bào. Ngoài ra các protein biểu hiện ở dạng tan, lại không bị ảnh hưởng
bởi các biến đổi hậu dịch mã nên rất thuận lợi cho các nghiên cứu tương tác
protein.
Nấm men (S.cerevisiae) được sử dụng rộng rãi trông công nghệ di truyền.
Chúng có thể nuôi cấy quy mô lớn để thu sinh khối tế bào. Một số nấm men có
promotor mạnh và plasmid YAC biều hiện gen. S.cervisiae có khả năng biến đổi
sau dịch mã như đường hóa, phosphoril hóa… để protein có đầy đủ hoạt tính sinh
học. Đặc biệt, S.cerevisiae bình thường tổng hợp ít loại protein của bản thân nó,
nếu đưa gen lạ tổng hợp protein mới thì sản phẩm dễ làm tinh sạch.Các vi nấm
khác cũng được sử dụng như A. nidulans, N. crassa hoặc P. pastoris.
Các tế bào chủ thực vật được sử dụng chủ yếu là các loài tảo đơn bào như
loài Chramydomonas Rainhardii. Loài này có đầy đủ các đặc tính ưu việt của vi
sinh vật cộng với cấu trúc và chức năng của tế bòa thực vật do vậy chúng ngày
càng được sử dụng rộng rãi trong thao tác di truyền.. Tuy nhiên người ta cũng
còn dùng các tế bào thực vật nuôi cấy trong những môi trường thích hợp để làm
tế bào chủ.
Đối với các tế bào động vật mặc dù việc nuôi khá phức tạp nhưng trong
những điều kiện cần thiết cho sự biểu hiện ra các protein có hoạt tính sinh học
người ta vẫn sử dụng. Ví dụ như: tế bào thận của khỉ xanh châu Phi, của chuột
đồng nhỏ, phôi người, tế bào tử cung chuột bạch, tế bào côn trùng để nuôi
Baculovirus biều hiện protein người, tế bào tuyến trùng Caenorhabditis elegans.

17


1.3.2.Các vector bis elega
Vector biểu hiện là vector có thể mang gen ngoại lai mong muốn, cho phép
thực hiện sự phiên mã của các bản sao được tạo dòng và sự dịch mã của các
mRNA của chúng trong hệ biểu hiện, từ đó tổng hợp protein mong muốn từ gen
ngoại lai. Vector có thể là các DNA plasmid, cosmid hay phage…đây là các
DNA có khả năng nhận đôi, phiên mã, dịch mã độc lập với DNA của vật chủ.
Vector phải chứa gen mã hóa cho protein chức năng dùng làm dấu hiệu chọn lọc
(thường là gen kháng kháng sinh).
Một trong những vector đang được sử dụng khá phổ biến và hiệu quả trong
việc biểu hiện protein trong E. coli hiện nay là pET nhờ khả năng sản xuất hàng
loạt protein, thao tác sinh học phân tử dễ dàng, chứa promoter T7 có đặc tính dựa
trên promoter mạnh và có tính đặc hiệu cao. Vector pET28a là thành viên đại
diện trong họ pET do Novagen cung cấp. Nó chứa các vùng cần thiết cho biểu
hiện gen trong vi khuẩn (hình 1.4): 1 gen kháng Kanamycin chọn lọc, 1 vùng
MCS chứa nhiều vị trí cắt phục vụ quá trình cắt nối gen, 1 vùng promoter T7
polymerase, 2 vùng chứa nhãn Histidin (Hig-tag) giúp cho quá trình tinh chiết
protein tái tổ hợp. Đặc biệt là trên vector này chứa 1 chuỗi lac operator sát đầu
3’ của T7 promoter, giúp ngăn cản sự biểu hiện của gen đích khi chưa cảm
ứng IPTG và rất có ý nghĩa khi protein biểu hiện là độc với tế bào.

18


Hình 1.4. Vector pET21b và các vùng chức năng quan trọng

1.3.3. Cơ chế cảm ứng biểu hiện bằng IPTG trong E.coli
Bộ gen của vi khuẩn E. coli được biến đổi để có thể chứa gen mã hóa T7

polymerase (T7 gen 1) và gen lacI (tạo lac repressor). T7 gen 1 bị kiểm soát bởi
lac promoter. Khi không có sự hiện diện của IPTG trong môi trường, lac
repressor sẽ liên kết với lac operator làm cho lac promoter bị bất hoạt và gen mã
hóa T7 polymerase không được biểu hiện.
Vector pET được thiết kế có T7 promoter và vùng MCS nằm sau T7
promoter. Gen mục tiêu được thiết kế chèn vào vector ở vùng MCS để được kiểm
soát biểu hiện bởi T7 promoter. Ngoài ra, trên vector pET cũng có vị trí lac
operator và gen lacI mã hóa cho lac repressor để kiểm soát sự biểu hiện của T7
promoter. Khi có IPTG, IPTG sẽ gắn vào lac repressor ở vị trí làm protein này
thay đổi cấu hình và không thể gắn vào lac operator. Nhờ đó promoter được hoạt
19