Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc captopril của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

NGUYỄN QUỲNH NGA

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ
THUỐC CAPTOPRIL CỦA MÀNG
CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN
TỪ MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật
Người hướng dẫn khoa học

ThS. Hà Thị Minh Tâm

HÀ NỘI, 2018


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên e xin được bảy tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban Giám hiệu
Trường ĐHSP Hà Nội 2, các thầy, cô trong khoa Sinh kỹ thuật Nông nghiệp
và Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng Trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo
điều kiện và giúp đỡ em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp của mình.
Đặc biệt, em xin được gửi lời biết ơn sâu sắc tới ThS. Hà Thị Minh Tâm,
người đã luôn theo sát và hướng dẫn tận tình giúp em hoàn thành tốt khóa
luận tốt nghiệp của mình.
Đây là những bước đi đầu tiên của em trong nghiên cứu khoa học nên em
chưa có nhiều kinh nghiệm và bỡ ngỡ. Do đó sẽ không tránh khỏi những thiếu
sót, nên em rất mong nhận được sự đóng góp quý báu của các thầy cô cũng

như các bạn sinh viên để đề tài khóa luận tốt nghiệp của em được hoàn thiện
một cách đầy đủ nhất.
Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô!
Hà Nội, Ngày 24 tháng 04 năm 2018
Sinh viên

Nguyễn Quỳnh Nga


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những gì viết trong khóa luận này đều là sự thật. Đây là
công trình nghiên cứu riêng của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của ThS. Hà
Thị Minh Tâm. Tất cả số liệu trong đề tài đều được thu thập từ thực nghiệm,
qua xử lí thống kê, không sao chép hay bịa đặt, không trùng với kết quả đã
được công bố. Trong khóa luận này tôi có sử dụng một số tài liệu của một số
tác giả, tôi xin phép tác giả để bổ sung cho luận văn của mình.
Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Hà Nội, Ngày 24 tháng 04 năm 2018
Sinh viên

Nguyễn Quỳnh Nga


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU........................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài............................................................................................ 1
2. Mục đích nghiên cứu..................................................................................... 2
3. Phạm vi nghiên cứu....................................................................................... 2
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn.......................................................... 3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................... 4

1.1. Giới thiệu về chủng Acetobacter xylinum................................................. 4
1.1.1. Vị trí phân loại ........................................................................................ 4
1.1.2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn A. xylinum ......................................... 4
1.1.3 Đặc điểm sinh lí và sinh hóa của A.xylinum ........................................... 5
1.2. Giới thiệu về màng Cellulose vi khuẩn (CVK).......................................... 5
1.2.1 Cấu trúc màng CVK................................................................................. 5
1.2.2. Đặc tính của màng CVK ......................................................................... 6
1.2.3. Sinh tổng hợp CVK................................................................................. 6
1.2.4. Chức năng sinh lí của CVK .................................................................... 6
1.2.5. Môi trường nuôi cấy A. xylinum ............................................................. 7
1.3. Sơ lược về thuốc Captopril ........................................................................ 8
1.3.1. Tên thuốc................................................................................................. 8
1.3.2. Tính chất.................................................................................................. 8
1.3.3. Tác dụng của thuốc ................................................................................. 8
1.3.4. Đặc điểm dược động học ........................................................................ 8
1.3.5. Tác dụng phụ của Captopril .................................................................... 9
1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước................................................ 9
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới.......................................................... 9
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước.......................................................... 10
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 11


2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 11
2.2. Vật liệu nghiên cứu. ................................................................................. 11
2.2.1. Giống vi khuẩn...................................................................................... 11
2.2.2. Nguyên liệu và hóa chất........................................................................ 11
2.2.3. Thiết bị và dụng cụ sử dụng trong quá trình nghiên cứu ...................... 11
2.2.4. Môi trường lên men thu màng CVK ..................................................... 12
2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 12
2.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 12

 2.4.1. Lên men thu màng CVK từ môi trường nước vo gạo................. 12
 2.4.2. Xử lý màng trước khi hấp thụ thuốc........................................... 13
2.4.3. Đánh giá độ tinh khiết của màng ......................................................... 14
2.4.4. Quét phổ và xây dựng đường chuẩn của thuốc Captopril..................... 14
2.4.5. Xác định lượng Captopril vào màng CVK .......................................... 17
2.4.6. Phương pháp xử lí thống kê .................................................................. 18
2.5. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 18
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................. 19
3.1. Tạo màng CVK của A. xylinum trong môi trường nước vo gạo .............. 19
3.2. Thu màng CVK thô từ môi trường........................................................... 20
3.3. Tinh chế màng CVK ................................................................................ 21
3.4. Khảo sát khối lượng thuốc hấp thụ vào màng ......................................... 22
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 27
1. Kết luận ....................................................................................................... 27
2. Kiến nghị ..................................................................................................... 27
Tài liệu tham khảo...........................................................................................28



DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Acetobacter xylinum

A. xylinum

CVK

Cellulose vi khuẩn

OD

Optical denity

UV – vis

Ultraviolet visible

Cs

Cộng sự

CT

Công thức


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng có trong nước gạo................................... 7,8
Bảng 2.1. Thành phần của môi trường lên men từ nước vo gạo thu màng CVK
......................................................................................................................... 12
Bảng 2.2. Bước sóng hấp thụ cực đại của thuốc Captopril.............................14
Bảng 2.3. Bảng nồng độ Captopril và giá trị OD 200nm (n=3) ..................... 16
Bảng 3.1. Giá trị OD của dung dịch thuốc Captopril sau hấp thụ (n=3) ........ 23
Bảng 3.2. Kết quả lượng thuốc Captopril hấp thụ vào màng CVK (Kích thước
d1,5cm) lên men từ môi trường nước vo gạo.................................................. 24


DANH MỤC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ
Hình 1.1. Tế bào Acetobacter xylinum.............................................................. 4
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của captopril........................................................ 8
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình nuôi cấy thu nhận CVK......................................... 13

Hình 2.2. Phổ hấp thụ của thuốc Captopril với dung môi là nước cất............15
Hình 2.3. Đồ thị đường chuẩn Captopril OD 200nm...................................... 16
Hình 3.1. Màng CVK sau khi nuôi cấy tĩnh ở ngày thứ 4 .............................. 19
Hình 3.2a. Màng CVK khi nuôi cấy tĩnh ở ngày thứ 7................................... 20
Hình 3.2b. Màng CVK khi nuôi cấy tĩnh ở ngày thứ 12................................. 21
Hình 3.3. Màng CVK sau khi được tinh chế................................................... 22
Hình 3.4. Hiệu suất hấp thụ của thuốc Captopril ở 2 độ dày màng trong điều
kiện thường......................................................................................................25
Hình 3.5. Hiệu suất hấp thụ của thuốc Captopril ở 2 độ dày màng trong điều
0

kiện nhiệt độ 80 C...........................................................................................25


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Ước tính vào năm 2016, có khoảng 48% người bị mắc bệnh tăng huyết
áp. Đáng lo ngại tăng huyết áp là bệnh dễ dẫn đến biến chứng nguy hiểm và là
nguyên nhân khiến cho 7 triệu người trên Thế giới tử vong mỗi năm. Đồng
thời tăng huyết áp cũng là nguyên nhân gây suy tim và đột quỵ não, là nguyên
nhân thứ hai dẫn đến nhồi máu cơ tim. Tỉ lệ người tăng huyết áp càng ngày
càng tăng và tuổi bị mắc mới cũng ngày một trẻ hóa. Chính vì thế mà các nhà
khoa khọc đã nghiên cứu và sản xuất ra thuốc captopril.
Captopril là chất ức chế enzim chuyển dạng angiotensin I. Tác dụng hạ
huyết áp liên quan đến ức chế hệ ren- angiotensin- aldosteron. Renin khi vào
máu tác dụng trên cơ chất globulin huyết tương sản xuất ra angiotensin, là
chất decapeptid có ít hoạt tính. Nhờ vai trò của enzym chuyển dạng,
angiotensin I chuyển hóa thành angiotensin II. Chất sau làm co mạch nội sinh
rất mạnh, đồng thời lại kích thích vỏ thượng thận tiết aldosteron, có tác dụng
giữ natri và nước ngăn chặn hình thành angiotensin II. Nhờ đó làm giãn động

mạch, giảm huyết áp cải thiện hiệu quả bơm máu của tim và cải thiện hiệu
suất tim ở bệnh nhân suy tim.
Tuy nhiên, khả năng hòa tan trong nước của captopril không cao do đó
đã làm giảm hiệu quả điều trị, sinh khả dụng đường uống chỉ khoảng 65%,
nửa đời sinh học trong huyết tương khoảng 2 giờ. Do đó cần thiết kế hệ thống
vận tải và phân phối thuốc captopril để giúp thuốc giải phóng một cách kéo
dài.
Uống là một trong những đường dễ dàng, được ưa thích và truyền thống
để phân phối thuốc. Khác với đường tiêm, ưu việt của nó là an toàn, không
phức tạp, tiện lợi và dễ có sự tuân thủ của bệnh nhân nên làm tăng hiệu quả
điều trị.

1


Một vài năm gần đây, người ta đã có sự quan tâm nhiều về việc sử dụng
các vật liệu sinh học trong các sản phẩm chăm sóc sức khỏe cho con người vì
khả năng tái tạo, tương thích sinh học và phân hủy sinh học của chúng. Trong
những vật liệu sinh học, nổi bật nhất và mang những đặc tính trên được chú ý
là màng cellulose [17]. Màng cellulese được biết đến như là một bộ khung
xương quan trọng trong cơ thể thực vật. Màng cellulose ngoài được tạo ra từ
thực vật nó còn được tạo ra bởi vi khuẩn. Acetobacter xylinum là vi khuẩn tạo
ra màng cellulose, nó có cấu trúc hóa học rất giống với cellulose thực vật
nhưng có một số tính chất chất đặc biệt như: độ bền cao, khả năng hút nước
mạnh, sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, độ polymer hóa lớn, dễ dàng phục hồi lại độ
ẩm ban đầu,…Chính vì lí do đó mà CVK được sử dụng hầu hết trong tất cả
các lĩnh vực như: thực phẩm, công nghệ dệt, công nghệ giấy, mỹ phẩm, y học
[4],…
Từ những đặc tính độc đáo mà CVK mang lại cũng như một số hạn chế
của thuốc captopril trong điều trị tăng huyết áp, chúng tôi thấy đây là hướng

nghiên cứu mới và phát triển. Đó là lí do chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu
khả năng hấp thụ thuốc captopril của màng cellulose vi khuẩn lên men từ
môi trường nước vo gạo”.
2. Mục đích nghiên cứu
- Tìm hiểu khả năng hấp thụ thuốc captopril của màng Cellulose vi khuẩn lên
men từ môi trường nước vo gạo.
- Tìm được độ dày màng cũng như điều kiện thích hợp để giúp thuốc hấp thụ
vào màng CVK được tối đa.
3. Phạm vi nghiên cứu
Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu trên quy mô phòng thí nghiệm.


4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa học
Làm tăng thêm sự hiểu biết của màng CVK về mặt ứng dụng. Chúng ta
có thể khắc phục được các mặt hạn chế của thuốc Captopril thông qua việc
nghiên cứu ứng dụng của màng CVK. Không chỉ dừng lại ở việc khắc phục
hạn chế của thuốc này mà còn có thể ứng dụng trên nhiều loại thuốc khác
nhau giúp cho ngành y học ngày một phát triển hơn.
Bên cạnh đó cũng mở rộng ra thêm những đặc tính mới của màng CVK
từ đó có những hướng nghiên cứu mới làm tăng các đặc tính tốt cũng như
khắc phục những hạn chế của màng.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
 Xây dựng được quy trình tạo màng CVK từ chủng Acetobacter
xylinum.


Màng CVK được tạo ra dùng làm hệ thống vận tải phân phối thuốc
Captopril nhằm xác định lượng khả năng hấp thụ của thuốc Captopril.
Chọn ra được lượng hấp thụ tốt nhất để cải thiện nhược điểm của

thuốc.



Ứng dụng vào thực tiễn từ kết quả thu được.


Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu về chủng Acetobacter xylinum
1.1.1. Vị trí phân loại
A. xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi Acetobacter, họ
Pseudomonadaceae
Là loại hiếu khí bắt buộc, có chu mao và sản xuất cellulose ngoại bào [2].
Theo khóa phân loại của Bergey [9], A. xylinum thuộc:
 Lớp : Schizomycetes
 Bộ : Pseudomonadales
 Bộ Phụ : Pseudomonadieae
 Họ :Pseudomonadaceae
1.1.2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn A. xylinum
A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước ngang
khoảng 0,6 - 0,8 µm, dài khoảng 2 - 3 µm, vi khuẩn không sinh bào tử,
không di động, sắp xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi [2]. Chúng là vi
khuẩn gram âm nhưng gram của chúng có thể bị biến đổi do tế bào già đi
hay do môi trường. A. xylinum thuộc loại vi khuẩn hiếu khí bắt buộc vì
chúng tăng trưởng ở bề mặt tiếp xúc giữ môi trường lỏng và môi trường
khí và có khả năng tạo cellulose trên môi trường nuôi cấy. Hình ảnh tế
bào Acetobacter xylinum được thể hiện ở hình 1.1:

Hình 1.1. Tế bào Acetobacter xylinum

Sau khoảng từ 3 - 7 ngày nuôi cấy trên môi trường rắn, chúng phát triển
dần, lúc này chúng có dạng nhỏ, nhày, có màu kem, hơi trong nhưng đến
khoảng một tuần thì khuẩn lạc to, đục, màu cà phê sữa, khô dần [10].
Trên môi trường lỏng sau khoảng 24 giờ nuôi cấy thì xuất hiện một lớp
màng dày đục, sau khoảng 36- 38 giờ hình thành một lớp màng trong và ngáy
càng dày lên.
1.1.3. Đặc điểm sinh lí và sinh hóa của A. xylinum
- Phản ứng catalase dương tính
- Oxi hóa ethanol thành CO2 và H20
- Không tăng trưởng trên môi trường Hoyer
- Không tạo sắc tố nâu
- Vi khuẩn hiếu khí hòa toàn
- Chuyển hóa glucose thành acid
- Chuyển hóa glycerol thành dihydroxyaceton
- Tổng hợp cellulose
- A. xylinum sử dụng rất nhiều nguồn đường khác nhau và tùy thuộc
chúng mà nguồn đường nào được sử dụng tốt nhất. Chúng có thể chuyển hóa
glucose thành acid gluconic, điều này làm cho pH môi trường giảm từ 1- 2
đơn vị.
0

0

- Nhiệt độ tối ưu để A. xylinum phát triển từ 25 C- 30 C và pH từ 5,4- 6,3
0

A.xylinum có thể phát triển trong phạm vi pH từ 3- 8, nhiệt độ từ 12- 35 C và
nồng độ ethanol có thể tới 10% [2, 9].
1.2. Giới thiệu về màng Cellulose vi khuẩn (CVK)

1.2.1. Cấu trúc màng CVK
Cellulose là một polymer không phân nhánh bao gồm những gốc
glucopyranose nối với nhau bởi liên kết β- 1,4- gluzcozit. Các nghiên cứu cho


thấy CVK có cấu trúc hóa học rất giống PC (cellulose thực vật). Tuy nhiên nó
khác với PC về cấu trúc đa phân và thuộc tính [11, 12].
Theo AJ. Brown (1986) [7], CVK gồm những sợi siêu nhỏ có bản chất
là hemicellulose, đường kính 1,5nm, kết hợp với nhau thành bó, nhiều bó hợp
thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100nm, rộng khoảng 3 - 8nm [8].
1.2.2. Đặc tính của màng CVK
Trong nuôi cấy tĩnh, CVK tích lũy trên bề mặt môi trường dinh dưỡng
lỏng thành lớp màng mỏng như da, sau khi tinh chế và làm khô tạo thành sản
phẩm tương tự như giấy da với độ dày 0,01- 0,5nm. Sản phẩm này có những
tính chất đặc biệt như: độ tinh sạch cao, khả năng đàn hồi tốt, độ kết tinh và
độ bền cơ học cao, có thể bị phân hủy sinh học, bề mặt tiếp xúc lớn hơn gỗ
thường, không độc và không dị ứng, có khả năng chịu nhiệt tốt, đặc biệt là
khả năng cản khuẩn.Với các tính chất này CVK được ứng dụng rất nhiều
trong các ngành công nghiệp khác nhau trong đó có y học [14].
1.2.3. Sinh tổng hợp CVK
 Qúa trình lên men: Pha sinh trưởng
Pha tích tụ sản phẩm
 Qúa trình tổng hợp cellulose của A. xylinum
1.2.4. Chức năng sinh lí của CVK
A. xylinum là vi khuẩn tổng hợp polysaccharide ngoại bào, những tế bào
vi khuẩn này nằm trong mạng lưới polymer giúp tế bào bám chặt vào bề mặt
môi trường và thu nhận chất dinh dưỡng dễ dàng hơn so với tế bào vi khuẩn
không nằm trong mạng lưới polymer.
Cellulose có đặc tính như độ bền cơ học cao, tính thấm và hút cao, trạng
thái kết tinh giúp A. xylinum kháng lại sự thay đổi của môi trường như việc

thay đổi xuống 1 hoặc 2 đơn vị pH trong thời gian nuôi cấy hay do lượng nước
bị giảm đi, các chất chuyển hóa được sinh ra.


1.2.5. Môi trường nuôi cấy A. xylinum
Môi trường nuôi cấy A. xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn
dinh dưỡng cần thiết như cacbon, nito, nguồn sulfua và phospho, các yếu tố
tăng trưởng và các yếu tố vi lượng [2].
Nhu cầu sử dụng đường của A. xylinum là rất lớn và giữ vai trò quan
trọng trong quá trình tổng hợp CVK nên có rất nhiều nghiên cứu thế giới và
đề nghị sử dụng các sản phẩm thứ cấp trong các ngành sản xuất công nghiệp
như: rỉ đường, nước dừa già, nước mía,… để làm nguyên liệu nuôi cấy A.
xylinum. Trong đó nước vo gạo được xem là môi trường kinh điển trong nuôi
cấy A. xylinum [6].
Nước vo gạo là môi trường thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn vì trong
nước gạo có chứa rất nhiều chất dinh dưỡng và các vitamin như cacbonhydrat,
sắt, vitamin C, vitamin B,… Vì vậy A. xylinum rất thích hợp phát triển trong
môi trường nước vo gạo [1] được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng có trong nước gạo
Thành phần

Khối lượng

Calori

316 KJ

Tổng số lipit

22g

Chất béo bão hòa

4g

Chất xơ tiêu hóa được

21g

Carbohydrat

28g

Đường

0.9g

Prôtein

12g

Vitamin E

5mg

Vitamin B6

4mg

Vitamin B1

0.96mg


Canxi

57mg

Thành phần khác
1.3. Sơ lược về thuốc Captopril
1.3.1. Tên thuốc
- Tên quốc tế: Captopril
- Công thức hóa học: C9H15NO3S
- Khối lượng phân tử: 217,285 g/mol
- Công thức cấu tạo được trình bày ở hình 1.2:

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của captopril
Tên IUPAC: 1- [(2S)- 3- merkapto- 2- metylpropiony]- L- proline.
1.3.2. Tính chất
0

Nhiệt độ nóng chảy: 106 C
1.3.3. Tác dụng của thuốc
Thuốc captopril được dùng trong việc điều trị những bệnh liên quan đến
vấn đề tim mạch, chứng tăng huyết áp. Thuốc được sử dụng cho việc ngăn
ngừa tình trạng đột quỵ, các bệnh về thận, đau tim. Ngoài ra thuốc còn được
dùng để điều trị suy tim và bảo vệ thận khỏi những tổn thương do bệnh tiểu
đường, giúp tăng cường đề kháng khỏi cơn đau tim.
1.3.4. Đặc điểm dược động học
- Hấp thu: Captopril được hấp thụ nhanh qua đường uống. Tỉ lệ hấp thu

chiếm 75% liều dùng và giảm 30- 35% khi dùng chung với thức ăn, tuy nhiên
không ảnh hưởng gì đến tác dụng điều trị.


- Phân bố: Có 30% gắn với albumin huyết tương. Thời gian bán hủy đào
thải của phần captopril không bị biến đổi khoảng 2 giờ.
Có 95% captopril bị đào thải qua nước tiểu( trong đó có khoảng 4050% không bị biến đổi).
Ở bệnh nhân suy thận, nồng độ captopril trong huyết tương tăng đáng kể
ở bệnh nhân có thanh thải creatinin nhỏ hơn hoặc bằng 40ml/phút, thời gian
bán hủy có thể tăng đến 30 giờ.
- Thải trừ: chủ yếu qua thận dưới dạng đã chuyển hóa khoảng 30- 40%.
1.3.5. Tác dụng phụ của Captopril
- Về phương diện lâm sàng:
Nhức đầu, suy nhược, cảm giác chóng mặt
Hạ huyết áp theo tư thế hoặc không
Phát ban ngoài da
Đau bao tử, chán ăn, buồn nôn, đau bụng, thay đổi vị giác
Ho khan
- Về phương diện sinh học:
Tăng vừa phải urê và creatinin huyết tương, hồi phục khi ngưng điều trị.
Việc tăng này thường gặp hơn ở bệnh nhân bị hẹp động mạch thận, cao huyết
áp được điều trị bằng thuốc lợi tiểu, bệnh nhân suy thận. Trường hợp bị bệnh
cầu thận, dùng thuốc ức chế men chuyển có thể gây protein niệu.
Tăng kali huyết, thường là thoáng qua.
1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới màng CVK được nuôi cấy từ vi khuẩn A. xylinum và những
ứng dụng của nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới với các lĩnh
vực công nghệ khác nhau như: lĩnh vực thực phẩm (màng bảo quản trái cây,
chất ổn định thực phẩm,..) lĩnh vực y học, màng CVK đã được ứng dụng làm

da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu
nhân tạo điều trị các bệnh tim mạch, làm mặt nạ dưỡng da cho con người [5,
13]. Ở Brazil, màng CVK ướt tinh sạch được sản xuất và bán ra thị trường
như một loại da nhân tạo dùng đắp vết thương.
Một số nghiên cứu trên thế giới về việc ứng dụng màng CVK làm hệ
thống phân phối và vận chuyển thuốc qua da với một số loại thuốc đã cho
thấy hiệu quả rõ rệt, khắc phục được nhược điểm của thuốc ở dạng thông
thường. Tuy nhiên trong lĩnh vực y học việc nghiên cứu về màng CVK còn ít,
những ứng dụng thường thấy trên thế giới của màng CVK thường dùng trong
lĩnh vực thực phẩm và mỹ phẩm .
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng CVK còn ở mức độ
khiêm tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu nghiên cứu.
Các kết qủa ứng dụng của màng CVK hầu như mới chỉ dừng lại ở điều kiện
thí nghiệm. Trong những năm gần đây phòng thí nghiệm Thực vật - Vi sinh
của Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã phân lập tuyển chọn được chủng A.
xylinum BHN2, có khả năng tạo màng CVK và nghiên cứu bước đầu cho thấy
màng CVK từ chủng A. xylinum BHN2 có khả năng ứng dụng cho trị bỏng
cho thỏ,là cơ sở để tạo ra màng trị bỏng cho con người.
Tại Đại học Y dược Thành Phố Hồ Chí Minh, Nguyễn Văn Thanh [2]
cùng nhóm nghiên cứu đã thành công với đề tài: “Nghiên cứu chế tạo màng
Cellulose trị bỏng từ A. xylinum”.


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Khả năng hấp thụ thuốc captopril của màng cellulose vi khuẩn lên men
từ nước vo gạo.

2.2. Vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Giống vi khuẩn
Giống vi khuẩn A. xylinum thuần chủng được cung cấp bởi phòng thí
nghiệm Vi sinh Trường ĐHSP Hà Nội 2.
2.2.2. Nguyên liệu và hóa chất
Nguyên liệu: Nước vo gạo, nước cất 2 lần, vải xô.
Hóa chất : Sử dụng các hóa chất đặc biệt và các hóa chất thông thường có
nguồn gốc từ Ấn Độ và Việt Nam.
- Captopril
- Dung môi etanol (96%)
- Đường glucose
- Pepton
- Diamoni photphat
- Amoni sunfat (NH4)2SO4
- Acid acetic
- NaOH, HCl
- Nước cất
2.2.3. Thiết bị và dụng cụ sử dụng trong quá trình nghiên cứu
- Máy đo quang phổ UV- 2450 (Shimadzu- Nhật Bản)
- Cân phân tích (Sartorius- Thụy Sỹ)
- Nồi hấp khử trùng HV- 110/HIRAIAMA
- Buồng cấy vô trùng (Haraeus)
- Tủ sấy, tủ ấm (Binder- Đức)


- Khuấy từ gia nhiệt (IKA- Đức)
Và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.
2.2.4. Môi trường lên men thu màng CVK
Môi trường lên men từ nước vo gạo thu màng CVK có các thành phần được
thể hiện trong bảng 2.1

Bảng 2.1. Thành phần của môi trường lên men từ nước vo gạo thu màng
CVK
Thành phần

MT

Glucose

20g

Pepton

10g

Diamoni photphat

0.3g

Amoni sunfat

0.5g

Nước vo gạo

1000ml

2.3. Nội dung nghiên cứu
+ Tạo được màng CVK lên men từ môi trường nước vo gạo.
+ Thiết kế hệ thống vận tải và phân phối thuốc Captopril dựa trên màng
CVK.

+ Khảo sát, đánh giá khả năng hấp thụ của thuốc thông qua hệ thống
được thiết kế.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Lên men thu màng CVK từ môi trường nước vo gạo
- Bước 1: Chuẩn bị môi trường theo bảng 2.1
0

- Bước 2: Hấp khử trùng các môi trường trong 15 phút ở 113 C
-

Bước 3: Tiếp tục khử trùng các môi trường bằng tia UV trong thời gian

15 phút rồi chờ cho môi trường nguội.


-

Bước 4: Bổ sung 10% dịch giống và 2% acid acetic, lắc đều tay để dịch

giống phân bố đều trong dung dịch.
-

Bước 5: Bịt miệng lọ (bình) bằng vải mỏng và thưa để tránh nhiễm

khuẩn, sau đó ủ tĩnh khoảng 4 - 14 ngày ở nhiệt độ phòng.
- Bước 6: Thu màng CVK thô, rửa sạch chúng dưới vòi nước.
2.4.2. Xử lý màng trước khi hấp thụ thuốc
Mục đích: Màng CVK thô khi mới thu được sẽ chứa 1 lượng lớn môi
trường lên men và các sản phẩm của quá trình trao đổi acid acetic. Vì vậy
trước khi cho màng vào hấp thụ thuốc thì màng cần phải xử lý màng để loại

bỏ các tạp chất trong môi trường nuôi cấy, đồng thời phá hủy và trung hòa
độc tố của vi khuẩn [2]. Qúa trình xử lí màng được thể hiện qua hình 2.1:
Tách màng CVK thô
Ép loại nước
Ngâm trong NaOH 3%
48h, rửa và ép
Ngâm trong HCl 3%
48h, rửa và ép
Ngâm trong nước
48h, kiểm tra tạp chất
CVK tnh chế
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình nuôi cấy thu nhận CVK


2.4.3. Đánh giá độ tinh khiết của màng
- Mục đích: Kiểm tra sự hiện diện của đường glucose trong màng CVK.
- Nguyên tắc: Dùng thuốc thử Fehling mới pha để phát hiện sự hiện diện của
đường D – glucose, nếu trong màng CVK có glucose thì sẽ xuất hiện kết tủa
nâu đỏ.
- Tiến hành:
+

Dịch thử của màng CVK các loại sau khi đã được tinh chế.

+

Mẫu đối chứng: là nước cất và dung dịch D – glucose.

+

Cho vào các ống nghiệm chứa mẫu thử mỗi ống nghiệm 1ml thuốc thử

Fehling. Đun dưới ngọn lửa đèn cồn 10 – 15 phút.
+

Quan sát tủa xuất hiện trong ống nghiệm.

2.4.4. Quét phổ và xây dựng đường chuẩn của thuốc Captopril
- Quét phổ
+ Tiến hành quét phổ của thuốc Captopril trong khoảng bước sóng từ 190nm
đến 250nm bằng cách sử dụng máy đo quang phổ UV – Vis 2450 ta thu được
phổ hấp thụ cực đại của thuốc Captopril.
Bảng 2.2. Bước sóng hấp thụ cực đại của thuốc Captopril
Nồng độ

Bước sóng (nm)

OD

25mg/900ml

200

1.081


OD
1.103

Abs.

1.000

0.500

0.000
-0.107
190.00

200.00

2 20.00
nm.

240.00

250.00

Bước sóng (nm)

Hình 2.2. Phổ hấp thụ của Captopril với dung môi là nước cất
- Nguyên tắc xây dựng đường chuẩn CAP
Sử dụng máy đo quang phổ UV – 2450 để xác định mật độ quang phổ (OD)
của các dung dịch chứa thuốc Captopril ở bước sóng 200nm [12].
+ Pha thuốc Captopril ở các nồng độ là: 10%, 20%, 40%, 60%, 80%,
100%.
+ Dùng máy đo quang phổ tử ngoại UV – Vis 2450 để đo cường độ quang
phổ của các dung dịch đã pha ở bước sóng 200nm trong các dung dịch mẫu
chuẩn.
+ Dựng đồ thị đường chuẩn và lập phương trình chuẩn bằng phần mềm

Excel 2010.
+ Để kết quả đo có độ chính xác cao ta tiền hành đo dung dịch chuẩn ba lần
và đo quang phổ ba lần, lấy giá trị trung bình để dựng đường chuẩn.
Giá trị mật độ quang phổ của dung dịch thuốc ở các nồng độ khác nhau được
thể hiện ở bảng 2.2


Bảng 2.3. Bảng nồng độ Captopril và giá trị OD 200nm (n=3)
STT

Nồng độ Giá trị OD 200nm (n=3)

Giá trị trung

(mg/ml)

Lần 1

Lần 2

Lần 3

bình

1

0,1

0,114

0,115

0,117

0,115 ± 0,0045

2

0,2

0,227

0,224

0,229

0,227 ± 0,0049

3

0,4

0,458

0,460

0,395

0,438 ± 0,0083

4

0,6

0,666

0,584

0,624

0,625 ± 0,0078

5

0,8

0,887

0,782

0.816

0,828 ± 0,0089

6

1

1,08

1, 09

1,04

1,07 ± 0,0034

OD 200nm
1.2

Giá trị OD

1

y = 1.0784x + 0.0148
R² = 0.9993

0.8
0.6
0.4

OD 200nm
Linear (OD 200nm)

0.2
0
0

0.5

1

1.5

Nồng độ dung dịch Captopril
Hình 2.3. Đồ thị đường chuẩn Captopril OD 200nm
Phương trình đường chuẩn:
2

y= 1,0784x + 0,0148 (R = 0,9993)
Trong đó:

x : nồng độ Captopril (mg/ml).
y : giá trị OD tương ứng.
2

R : hệ số tương quan.