Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc diclofenac của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC2 SƯ PHẠM HÀ NỘI
KHOA 2SINH –
KTNN
KHOA SINH –
KTNN
--------------------

NGÔ DIỆU LINH
NGÔ DIỆU
LINH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ
NGHIÊN
KHẢ NĂNG HẤP
THỤ
THUỐC
THUỐCCỨU
DICLOFENAC
CỦA
MÀNG
DICLOFENAC
CELLULOSE
VI
CELLULOSECỦA
VI MÀNG
KHUẨN
LÊN MEN
LÊN MEN TỪ
MÔI TRƯỜNG
TỪKHUẨN

MÔI TRƯỜNG
NƯỚC
VO GẠO
NƯỚC VO GẠO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI
HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động
KHÓA LUẬN TỐT
NGHIỆP ĐẠI
vật

HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động
vật

Người hướng dẫn khoa
học

TS. NGUYỄN THỊ BÍCH
NGỌC

HÀ NỘI, 2018


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI
2
KHOA SINH –
KTNN

NGÔ DIỆU LINH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ
THUỐC DICLOFENAC CỦA MÀNG
CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN
TỪ MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI
HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động
vật
Người hướng dẫn khoa
học

TS. NGUYỄN THỊ BÍCH
NGỌC


HÀ NỘI, 2018


LỜI CẢM ƠN

Trong thực tế không có sự thành công nào mà không gắn liền với
sự hỗ trợ của người khác. Trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp của
mình, do bước đầu còn nhiều bỡ ngỡ nên em đã gặp không ít những khó
khăn. Tuy nhiên dưới sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô hướng dẫn nên
em đã hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp của mình.
Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban Giám hiệu Trường
ĐHSP Hà Nội 2; các thầy, cô trong khoa Sinh-KTNN; các thầy, cô ở
Viện NCKH & ƯD Trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện và giúp đỡ
em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp của mình.

Đặc biệt, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Bích
Ngọc
là người đã theo sát và hướng dẫn em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp
của mình.
Do là lần đầu tiên đi vào làm nghiên cứu khoa học, về mặt kiến
thức của em còn nhiều hạn chế. Do vậy, sự thiếu sót là điều không thể
tránh khỏi, vì vậy em rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô và các
bạn sinh viên để đề tài khóa luận tốt nghiệp của em được hoàn thiện hơn
nữa. Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô.
Hà Nội, ngày 18 tháng 5 năm
2018
Sinh viên

Ngô Diệu
Linh


LỜI CAM
ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và
được sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Thị Bích Ngọc. Những số
liệu kết quả trong khóa luận này là trung thực, không có sự trùng lặp hoặc
sao chép của một đề tài khác. Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Hà Nội, Ngày 18 tháng 5 năm
2018
Sinh viên

Ngô Diệu
Linh

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT


A.

A

l

xylinu

c

l

m:

e

u

CVk:

t

l

CMN

o

o

ĐHSP

b

s

:

a

e

KTN

c

N:

t

PBS:

e

NCK

H&Ư
D:

r

Nxb:
mht:

x
y
l

C
a
o
n
ấ
m

y

m

n

e

u

n

m

Đại học
sư phạm

B

Kỹ thuật
nông
nghiệp

a
c
t
e
r
i
a
l
c
e

Phosphate
buffered
saline
Nghiên
cứu Khoa
học và
Ứng dụng

Nhà xuất
bản

Khối lượng
thuốc hấp thụ


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU.............................................................................................................................1
1. Lí do chọn đề tài
...........................................................................................................1

2. Mục đích nghiên cứu
...................................................................................................3

3. Phạm vi nghiên
cứu......................................................................................................3
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực
tiễn ....................................................................3
5. Kết quả nghiên cứu
.....................................................................................................4

NỘI DUNG .........................................................................................................................5
Chương 1. Tổng quan tài
liệu.........................................................................................5
1. Tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên
cứu.......................................................5
1.1 Tổng quan về
CVK ....................................................................................................5
1.1.1 Vị trí phân loại của Acetobacter

xylinum .........................................................5
1.1.2 Đặc điểm của A.
Xylinum ...................................................................................5
1.1.3 Môi trường nuôi cấy A. xylinum
........................................................................6

1.1.4 Đặc điểm cấu trúc màng CVK tạo bởi A.
xylinum.......................................6
1.1.5 Tính chất độc đáo của màng CVK
.....................................................................7

1.1.6 Các phương pháp sản màng CVK từ A.
xylinum...........................................8
1.1.7 Ứng dụng của màng
CVK ...................................................................................9
1.2 Tổng quan về Diclofenac
......................................................................................10


1.2.1 Sơ lược về thuốc
Diclofenac ..............................................................................10
2. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
......................................11

2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài
nước: .......................................................................11
2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước
:.......................................................................12
Chương 2. Đối tượng - Phương pháp nghiên
cứu...................................................13

1. Đối tượng nghiên
cứu ................................................................................................13
2.Vật liệu nghiên cứu
.....................................................................................................14


2.2. Thiết bị và dụng
cụ .................................................................................................14
2.2.1. Thiết bị được sử dụng trong nghiên
cứu........................................................14
2.2.2. Dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu..
....................................................14

3. Nội dung nghiên cứu
................................................................................................15

4. Phương pháp nghiên
cứu ..........................................................................................15
4.2 Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của màng
CVK......................................17
4.3 Đo bề dày màng
CVK .............................................................................................17
4.4. Xây dựng đường chuẩn
Diclofenac ....................................................................17
4.5 Phương pháp xác định lượng thuốc được hấp thu vào màng
CVK. ............18
4.6. Phương pháp xử lý thống kê
................................................................................19

5. Địa điểm tiến hành nghiên cứu

...............................................................................19

Chương 3. Kết quả và thảo luận
..................................................................................19

3.1. Màng CVk được nuôi cấy từ môi trường chuẩn
.............................................19

3.2. Phương trình đường chuẩn
Diclofenac..............................................................23
3.3. Khối lượng Diclofenac hấp thu vào màng
CVk ..............................................27
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
....................................................................................29

TÀI LIỆU THAM KHẢO
...........................................................................................30


DANH MỤC HÌNH
ẢNH
Hình 1.1: Cấu trúc hóa học cơ bản của
CVk................................................. 7
Hình 2.1. Quy trình tinh chế màng CVK ....................................................
16
Hình 3.1. Màng CVk dày 0,5cm ................................................................
20
Hình 3.2. Màng CVk được nuôi cấy trong môi trường gạo..........................
21
Hình 3.3. Màng CVk dày 1cm...................................................................

21
Hình 3.4.Màng CVk tinh chế.....................................................................
22
Hình 3.5: Màng gạo tinh khiết 0,5cm, d= 1,5cm.........................................
23
Hình 3.6: Đường chuẩn diclofenac ............................................................
24
Hình 3.7. Rút mẫu đo 1 giờ .......................................................................
25


DANH MỤC
BẢNG
Bảng 2.1. Môi trường lên men tạo màng CVK
....................................................................15
Bảng 3.1. Bảng nồng độ Diclofenac và giá trị OD278 nm (n = 3)
......................................23
Bảng 3.2 : Bảng đo giá trị OD sau các khoảng thời
gian.....................................................26
Bảng 3.3: Lượng thuốc hấp thụ vào màng gạo sau 2
giờ.....................................................27
Bảng 3.4: Hiệu suất hấp thụ vào màng gạo trong 2 giờ
.......................................................27


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Bacterial cellulose (viết tắt là CVk) là sản phẩm của một loài vi
khuẩn, đặc biệt là chủng Acetobacter xylinum. Màng sinh học (CVk) có
đặc tính và cấu trúc rất giống với cellulose của thực vật (gồm các phân tử

glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 glucozit), cellulose vi
khuẩn khác với cellulose thực vật ở chỗ: cellulose vi khuẩn không chứa
các hợp chất cao phân tử như ligin, hemicellulose, peptin và sáp nến do
vậy chúng có những đặc tính vượt trội hơn về độ dẻo dai, bền chắc [1].
Trên thế giới, màng CVk đã được ứng dụng trong nhiều trong các lĩnh
vực công nghệ khác nhau: dùng màng CVK làm môi trường cơ chất trong
sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm, thiết kế hệ thống vận tải phân
phối thuốc và nhiều ứng dụng khác [9].
Trong lĩnh vực y học, màng CVk đã được ứng dụng làm da tạm thời
thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân
tạo, điều trị các bệnh tim mạch, làm mặt nạ dưỡng da trong thẩm mĩ. [5,
9].
Amin et al. [8] đã báo cáo việc sử dụng màng CVk làm màng bọc
cho paracetamol bằng cách sử dụng kĩ thuật phun phủ. Kết quả cho thấy
màng CVk có khả năng giữ thuốc và giải phóng thuốc chậm lại, làm tăng
hiệu quả sử dụng của thuốc. Ở Việt Nam việc nghiên cứu và ứng dụng
màng CVk mới được quan tâm gần đây và đã đạt được kết quả bước đầu.
Đề tài của Nguyễn Văn Thanh – Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh 2006
[2] đã “Nghiên cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ Acetobacter
xylinum”. Theo kết quả nghiên cứu cho thấy màng CVk được tạo nên từ

1


các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm, có thể sản xuất trên quy mô công
nghiệp.
Về mặt tính chất, CVk có độ tinh sạch lớn hơn nhiều so với các
loại cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn
toàn. Ngoài

2


ra CVk còn có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, khả
năng thấm hút lớn, đường kính sợi nhỏ, ... Đồng thời chất ở trong tế bào và
ngăn cản tác động của UV, ổn định về kích thước và hướng, màng CVk
còn có ý nghĩa giữ thuốc và giải phóng thuốc kéo dài [7, 11], … Bên cạnh
đó, các sợi cellulose có cấu trúc mạng sẽ là hệ thống vận chuyển và phân
phối thuốc làm tăng sinh khả dụng của thuốc, nó có thể giúp thuốc không
bị phá hủy trong môi trường
acid.
Diclofenac là thuốc chống viêm không steroid. Thuốc có tác dụng
chống viêm, giảm đau và hạ sốt mạnh, do nó ức chế mạnh hoạt tính của
cyclogenase, do đó làm giảm đáng kể sự tạo thành prostaglandin,
prostacyclin và thromboxan là những chất trung gian của quá trình
viêm. Diclofenac cũng điều hòa con đường lipoxygenase và sự kết tụ
tiểu cầu.
Giống như các thuốc chống viêm không steroid khác, diclofenac
gây hại đường tiêu hóa do giảm tổng hợp prostaglandin dẫn đến ức chế tạo
mucin (chất có tác dụng bảo vệ đường tiêu hóa). Prostaglandin có vai trò
duy trì tưới máu thận. Các thuốc chống viêm không steroid ức chế tổng
hợp prostaglandin nên có thể gây viêm thận kẽ, viêm cầu thận, hoại tử
nhú và hội chứng thận hư đặc biệt ở những người bị bệnh thận hoặc suy
tim mạn tính. Với những người bệnh này, các thuốc chống viêm không
steroid có thể làm tăng suy thận cấp và suy tim cấp.
Từ các nghiên cứu về màng

CVK

và một số hạn chế của

diclofenac trong quá trình điều trị, xét thấy cần có hướng nghiên cứu
mới với mục đích tạo ra màng CVK dựa trên loài vi khuẩn thuộc chủng
Acetobacter xylium, từ đó chế tạo màng sinh học để khắc phục được
những tác dụng phụ của thuốc diclofenac, đồng thời để khảo sát sự hấp
3


thụ thuốc qua màng , hạn chế tác dụng phụ và khả dụng sinh học của CVK
trong việc điều trị bệnh. Đó là lý do chúng

4


tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc diclofenac của
màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo”.
2. Mục đích nghiên cứu
- Nghiên cứu quy trình nuôi và thu sản phẩm màng CVK từ
chủng
Acetobacter xylium.
-. Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc diclofenac của màng
cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo.
3. Phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: khả năng hấp thụ thuốc diclofenac của
màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo
- Vật liệu nghiên cứu: Màng CVK làm từ môi trường nước vo gạo.
- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng
thí nghiệm
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm sinh lý người và động vật
khoa Sinh học-Trường ĐHSP Hà Nội. Viện nghiên cứu khoa học và

ứng dụng Trường ĐHSP Hà Nội 2.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
4.1 Ý nghĩa khoa học
+ Tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của màng CVK.
+ Việc nghiên cứu ứng dụng màng CVK vào việc khắc phục hạn chế
của thuốc diclofenac sẽ mở ra một hướng nghiên cứu mới không chỉ dừng
lại ở việc khắc phục hạn chế của thuốc này mà còn có thể ứng dụng trên
nhiều các loại thuốc khác nữa giúp cho ngành y học ngày một phát triển
hơn.
+ Bên cạnh đó ta cũng có thể tìm ra được những ưu nhược điểm
của màng CVK để từ đó có những hướng nghiên cứu làm tăng các đặc tính
5


cả màng CVK, hạn chế các yếu điểm của màng để ứng dụng màng trên
nhiều các lĩnh vực khác nhau.

6


4.2 Ý nghĩa thực tiễn
+ Xây dựng được quy trình tạo màng CVK từ chủng
Acetobacter xylinum.
+ Từ màng CVK đã được tạo ra ở môi trường nước vo gạo để nghiên
cứu khả năng hấp thụ của thuốc diclofenac và làm giảm tác dụng phụ có
hại của
thuốc.
+ Từ kết quả nghiên cứu được có thể áp dụng vào thực tiễn.
5. Kết quả nghiên cứu
- Tạo màng CVK từ vi khuẩn A.xylinum.

- Xử lý màng thô, thu được CVK tinh chế.
- Nạp thuốc vào màng CVK.
- Màng CVK được nuôi dưỡng trong môi trường nước vo gạo.

7


NỘI DUNG
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI
LIỆU
1. Tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu
1.1 Tổng quan về CVK
1.1.1 Vị trí phân loại của Acetobacter xylinum
- Acetobacter xylinum (A. xylinum) thuộc nhóm vi khuẩn Acetic,
chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, là loại hiếu khí bắt buộc, có nhu
mao và sản xuất cellulose ngoại bào.
- Theo khóa phân loại của Bergey thì A.xylinum thuộc:
+ Lớp: Schizomycetes.
+ Bộ: Pseudomonadales.
+ Bộ phụ :Pseudomonadieae.
+ Họ: Pseudomonadaceae.
1.1.2 Đặc điểm của A. Xylinum
- Đặc điểm hình thái: A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi
cong, kích thước ngang khoảng 0,6–0,8 µm, dài khoảng 2–3 µm, vi khuẩn
không sinh bào tử, gram âm, không di động, sắp xếp riêng rẽ đôi khi
xếp thành chuỗi, nhưng khi tế bào già hay do điều kiện môi trường nuôi
cấy, hình dạng có thể bị biển đổi: tế bào dài hơn, phình to ra, phân nhánh
hoặc không phân nhánh.
- Đặc điểm sinh lí và sinh hóa của A. xylinum: Vi khuẩn có khả năng
oxy hóa ethanol thành acid acetic, phản ứng catalase dương tính, không

tăng trưởng trên môi trường Hoyer, không tạo sắc tố nâu, có khả năng
tổng hợp cellulose, chuyển hóa glucose thành acid, chuyển hóa glycerol
thành dihydroaceton. A. xylinum có thể sử dụng nhiều nguồn đường khác
nhau và tùy thuộc vào chủng mà nguồn đường nào được sử dụng tốt nhất.
8


Nhiệt độ tối ưu để A. xylinum phát triển là từ 25 - 30°C; vi khuẩn tăng
trưởng trong khoảng pH từ 3 – 8, pH tối ưu để sản xuất cellulose là 5,5.

9


1.1.3 Môi trường nuôi cấy A. xylinum
- Môi trường nuôi cấy A. xylinum là môi trường tổng hợp từ các
nguồn dinh dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nitơ, nguồn sulfur và
phospho, các yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng. A. xylinum là loài
có khả năng tổng hợp cellulose từ nguồn cacbonhydrat. Nguồn
cacbonhydrat mà A. xylinum sử dụng là glucose, fructose, maninol,
sorbitol nếu sử dụng glycerol, galactose, lactose, sucrose cho hiệu suất
thập hơn, không nên sử dụng mannose, cellobiose, erythriol, acetate.
Việc sử dụng các loại đường cũng như nồng độ các loại đường trong
môi trường còn phụ thuộc vào những chủng A. xylinum khác nhau. Nhu cầu
sử dụng đường ở A. xylinum rất lớn và giữ vai trò quan trọng trong quá
trình tổng hợp CVK nên có rất nhiều nghiên cứu và đề nghị sử dụng
- Các sản phẩm: rỉ đường, chất thải trong công nghiệp sản xuất khoai
tây và pho mát, nước dừa già và nước mía... để làm nguyên liêu nuôi
cấy A. xylinum.
Trong đó môi trường chuẩn trong nuôi cấy A. xylinum gồm: 2%
(wt) glucose, 0,5% (wt) cao nấm men, 0,5% (wt) peptone, 0,27% (wt)

disodium phosphate, và 0,15% (wt ) axit citric.
1.1.4 Đặc điểm cấu trúc màng CVK tạo bởi A. xylinum
- Cellulose vi khuẩn (màng CVK) là một chuỗi polymer không
phân nhánh bao gồm những gốc glucopyranose nối với nhau bởi liên
kết β-1,4- glucan. Những chuỗi glucan được vi khuẩn tổng hợp nối lại với
nhau thành thớ sợi thứ cấp, có bề rộng 1,5nm . Đây là những thớ sợi tự
nhiên mảnh nhất khi so sánh với sợi cellulose sơ cấp trong thượng tầng ở
một vài loài thực vật. Các sợi thứ cấp kết lại thành những vi sợi, những vi
sợi tạo thành bó sợi, những bó sợi tạo thành dải. Dải có chiều dày 3-4nm,
chiều dài 130-177nm (Yamanaka et al.,
10


2000). Các dải siêu mịn của cellulose vi khuẩn có chiều dài từ 1µm -9 µm
tạo

11


thành cấu trúc mắt lưới dày dặc, được ổn định nhờ các liên kết hydro, đó
là lớp màng film (Bielecki et al., 2001) 1.
- Cho đến nay, Acetobacter xylium đưc đánh giá là loài vi khuẩn có
khả
năng sinh màng CV hiệu quả nhất trong tự nhiên
Cấu trúc hóa học cơ bản của CVk giống với cellulose có nguồn gốc
thực vật (plant cellulose - PC ), tuy nhiên chúng khác nhau về cấu trúc đại
thể. Các sợi mới sinh ra của CVk kết lại với nhau để hình thành nên
các sợi sơ cấp (subfibril), có chiều rộng khoảng 1,5nm. Các sợi sơ cấp
này kết lại thành các vi sợi, các vi sợi nằm trong các bó, cuối cùng hình
thành các dải. Các dải có chiều dày 3 - 4nm, chiều rộng 70 - 80nm;

3,2x133nm. Cấu trúc của CVk phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy
[12]. Cấu trúc hóa học trình bày trên hình
1.1:

Hình 1.1: Cấu trúc hóa học cơ bản của CVk
1.1.5 Tính chất độc đáo của màng CVK
- Cellulose vi khuẩn là cellulose rất trong suốt, cấu trúc mạng tinh thể
mịn.
- Kích thước ổn định, sức căng và độ bền sinh học cao.

12


- Khả năng giữ nước và hấp thụ nước cực tốt, tính xốp chọn lọc. Có
độ tinh sạch cao so với các loại cellulose khác, không chứa ligin và
hemicellulose.

13