Nghiên cứu so sánh khả năng giải phóng thuốc diclofenac của màng cellulose vi khuẩn lên men từ một số môi trường

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======
PHÙNG THỊ NHƯ QUỲNH

NGHIÊN CỨU SO SÁNH KHẢ NĂNG
GIẢI PHÓNG THUỐC DICLOFENAC
CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN
LÊN MEN TỪ MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật
Người hướng dẫn khoa học:
ThS. Phạm Thị Kim Dung

HÀ NỘI - 2018
Trần Thị Hoài Giang

Page 1


Lời cảm ơn!
Trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận với đề tài: “ Nghiên cứu so
sánh khả năng giải phóng thuốc Diclofenac của màng Cellulose vi khuẩn
lên men từ một số môi trường”, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới:
Trước hết tôi xin gửi đến tới ThS, Phạm Thị Kim Dung - Người đã
hướng dẫn, quan tậm, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận
này. Cô là người đã định hướng và tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình học tập, nghiên cứu khoa học và hoàn thiện luận văn tốt nghiệp của
mình.

Đồng thời, qua đây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu
Trường ĐHSP Hà Nội 2, cùng các thầy giáo, cô giáo làm việc tại Viện
Nghiên cứu khoa học và Ứng dụng- Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 2, các
thầy cô và các bạn sinh viên đang học tập và làm việc tại Bộ môn Sinh lý
người và động vật, khoa Sinh- KTNN- Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 2,
những người đã truyền đạt kiến thức và tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình hoàn thành khoá luận tốt nghiệp của mình.
Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã động
viên và là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu
khoa học.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2018
Sinh viên

Phùng Thị Như Quỳnh


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những gì viết trong khóa luận này đều là sự thật. Đề
tài nghiên cứu không sao chép bất cứ tài liệu nào có sẵn và không trùng lặp
với một đề tài nào khác. Các kết quả nghiên cứu, các số liệu trình bày trong
luận văn tất cả đều được nghiên cứu,thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống
kê, thực tiễn đảm bảo tính trung thực và chưa được công bố trong bất cứ
công trình khoa học, trong các tạp chí chuyên ngành và các hội thảo khoa học,
sách chuyên khảo,… nào khác. Trong tài liệu này tôi có sử dụng một số tài
liệu của một số tác giả, tôi xin phép tác giả để bổ sung cho khóa luận của
mình.
Nếu sai tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Hà Nội, ngày tháng năm 2018
Sinh viên

Phùng Thị Như Quỳnh


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
STT

Từ viết tắt

Từ đầy đủ

1

A. xylinum

Acetobacter xylinum

2

CVK

Cellulose vi khuẩn

3

ĐHSP

Đại học Sư phạm

4

MT1

Môi trường 1

5

MT2

Môi trường 2

6

MT3

Môi trường 3

7

OD

Optical density

8

UV – vis

Ultraviolet visible

9

Nxb

Nhà xuất bản

10

Rpm

Tốc độ quay 100 vòng/
phút

11

Cs

Cộng sự

12

H

Giờ


DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ SƠ ĐỒ
Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của môi trường chuẩn................................ 6
Bảng 1.2. Thành phần dinh dưỡng của nước vo gạo ........................................ 6
Bảng 1.3. Thành phần của nước dừa già........................................................... 7
Bảng 1.4. Các ứng dụng của CVK.................................................................. 10

Bảng 2.1. Thành phần các môi trường lên men tạo màng CVK..................... 19
Bảng 2.2. Giá trị OD của dung dịch diclofenac ở các nồng độ ( mg/ml) khác
nhau(n=3) ở bước sóng 276 nm ...................................................................... 23
Bảng 2.3. Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng
độ(mg/ml) khác nhau (n=3) ở bước sóng 278nm ........................................... 24
Bảng 2.4. Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng
độ(mg/ml) khác nhau (n=3) ở bước sóng 281nm ........................................... 25
Bảng 3.1. Mật độ quang tiến hành giải phóng thuốc Diclofenac từ màng
chuẩn chưa ép tại các thời điểm lấy mẫu với môi trường pH khác nhau( n =3)
......................................................................................................................... 34
Bảng 3.2. Mật độ quang tiến hành giải phóng thuốc Diclofenac từ màng
chuẩn ép 50% tại các thời điểm lấy mẫu với môi trường pH khác nhau( n =3)
......................................................................................................................... 36
Bảng 3.3. Tỉ lệ giải phóng thuốc của các màng chưa ép ở các môi trường pH
khác nhau trong các khoảng thời gian khác nhau (n = 3) ............................... 37
Bảng 3.4. Tỉ lệ giải phóng thuốc của các màng ép 50% ở các môi trường pH
khác nhau trong các khoảng thời gian khác nhau (n = 3) ............................... 38
Bảng 3.3. Tỉ lệ thuốc Diclofenac được giải phóng từ môi trường nước vo gạo
không ép tại các thời điểm lấy mẫu ( n =........................................................ 40
Bảng 3.4. Tỉ lệ thuốc Diclofenac được giải phóng từ môi trường nước vo gạo
ép 50% tại các thời điểm lấy mẫu ( n =3) ....................................................... 41
Bảng 3.5. Tỉ lệ thuốc Diclofenac được giải phóng từ môi trường nước dừa già
không ép tại các thời điểm lấy mẫu ( n =3) .................................................... 43
Bảng 3.6. Tỉ lệ thuốc Diclofenac được giải phóng từ môi trường nước vo gạo
ép 50% tại các thời điểm lấy mẫu ( n =3) ....................................................... 44
Bảng 3.7. Tỷ lệ giải phóng thuốc ra các màng CVK ở các độ dày khác nhau
không ép trong cùng 24 giờ tại pH = 6.8 ........................................................ 46


Bảng 3.8. Tỷ lệ giải phóng thuốc ra các màng CVK ở các độ dày khác nhau

ép 50% trong cùng 24 giờ tại pH = 6.8 ........................................................... 47
DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 2.1. Công thức cấu tạo của Diclotenac................................................... 12
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình tinh chế CVK......................................................... 21
Hình 2.3. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 276nm ... 23
Hình 2.4. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 278 nm .. 24
Hình 2.5. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 281......... 25
Hình 3.1. Màng CVK được nuôi cấy trong các môi trường khác nhau.......... 32
Hình 3.2. Màng CVK thu được sau khi nuôi cấy............................................ 33
Hình 3.3. Mẫu được rút ra để đo quang phổ lúc 8 giờ.................................... 34
Hình 3.9. Biểu đồ biếu diễn tỉ lệ giải phóng thuốc Diclofenac của các màng
chưa ép ở các pH và thời gian khác nhau ....................................................... 45
Hình 3.10. Biểu đồ biếu diễn tỉ lệ giải phóng thuốc Diclofenac của các màng
đã ép 50% ở các pH và thời gian khác nhau ................................................... 45
Hình 3.11. Tỷ lệ giải phóng thuốc ra các màng CVK ở các độ dày khác nhau
không ép trong cùng 24 giờ tại pH = 6.8 ........................................................ 47
Hình 3.12. Tỷ lệ giải phóng thuốc ra các màng CVK ở các độ dày khác nhau
ép 50% trong cùng 24 giờ tại pH = 6.8 ........................................................... 48


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU........................................................................................................... 1
1.Lí do chọn đề tài............................................................................................. 1
2. Mục đích nghiên cứu..................................................................................... 2
Nghiên cứu so sánh khả năng giải phóng thuốc Diclofenac từ màng CVK đã
nạp thuốc trong một số môi trường pH khác nhau. .......................................... 2
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu................................................................. 2
4. Nhiệm vụ nghiên cứu .................................................................................... 2
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn.......................................................... 3
NỘI DUNG ....................................................................................................... 4

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 4
1.1. Tổng quan về CVK .................................................................................... 4
1.1.1. Vị trí phân loại của A. xylinum............................................................... 4
1.1.2. Đặc điểm của A. Xylinum...................................................................... 4
1.1.3. Môi trường nuôi cấy A. xylinum ............................................................ 5
1.1.4. Đặc điểm cấu trúc màng CVK tạo bởi A. xylinum................................ 8
1.1.5. Tính chất độc đáo của màng CVK .......................................................... 8
1.1.6. Các phương pháp sản xuất màng CVK từ A. xylinum ......................... 10
1.1.7. Ứng dụng màng CVK ........................................................................... 10
1.2. Giới thiệu về thuốc Diclofenac ................................................................ 11
1.2.1. Công thức hóa học................................................................................. 11
1.2.2. Dược động học và cơ chế tác dụng ....................................................... 12
1.2.3. Công dụng của thuốc............................................................................. 13
1.2.4.Tác dụng không mong muốn của thuốc................................................. 13
1.3.Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam ................................... 14
1.3.1. Tình hình nghiên cứu thuốc .................................................................. 14
1.3.1.1. Trên thế giới ....................................................................................... 14
1.3.1.2. Ở Việt Nam ........................................................................................ 15
1.3.2. Tình hình nghiên cứu màng CVK......................................................... 15
1.3.2.1. Trên thế giới ....................................................................................... 15


1.3.2.2. Ở Việt Nam ........................................................................................ 16
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................... 16
2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 16
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................ 17
2.1.2. Giống vi khuẩn...................................................................................... 17
2.1.3. Nguyên liệu và hóa chất........................................................................ 17
2.1.4. Thiết bị và dụng cụ................................................................................ 17
2.1.4.1. Thiết bị ............................................................................................... 17

2.1.4.2. Dụng cụ .............................................................................................. 18
2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 18
2.2.1. Chuẩn bị màng CVK............................................................................. 18
2.2.1.1. Lên men thu màng CVK thô .............................................................. 18
2.2.1.2. Phương pháp xử lý màng CVK trước khi hấp thụ thuốc ................... 20
2.2.1.3. Đánh giá độ tinh khiết của màng ....................................................... 21
2.2.2. Phương pháp xây dựng đường chuẩn.................................................... 22
2.2.3. Phương pháp xác định khối lượng CVK tạo thành............................... 26
2.2.4. Phương pháp xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng CVK ............... 26
2.2.5. Phương pháp pha môi trường đệm PBS................................................ 27
2.2.6. Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng thông qua hệ thống được
thiết kế. ............................................................................................................ 27
2.2.7. Phương pháp phân tích động lực học giải phóng của diclofenac ......... 29
2.2.8. Phương pháp xử lí thống kê .................................................................. 29
2.3. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 30
2.4. Cách bố trí thì nghiệm.............................................................................. 30
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................. 31
3.1. Kết quả tạo màng và xử lý màng CVK của A. Xylinum từ một số môi
trường khác nhau............................................................................................. 31
3.2. Màng CVK thu được sau khi nuôi cấy..................................................... 32
3.4.1. Xác định lượng thuốc diclofenac giải phòng từ màng môi trường chuẩn
......................................................................................................................... 34


3.4.2. Xác định lượng thuốc diclofenac giải phòng từ màng môi trường nước
vo gạo .............................................................................................................. 39
3.4.3. Xác định lượng thuốc diclofenac giải phòng từ màng môi trường nước
dừa già ............................................................................................................. 42
3.5. So sánh tỉ lệ giải phóng thuốc ra các màng CVK ở các độ dày khác nhau
trong cùng 24 giờ tại pH=2 ............................................................................. 46

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 51


MỞ ĐẦU
1.Lí do chọn đề tài
Diclofenace là chất không steroid, đây là một trong những thuốc đầu tiên
được khám phá bằng cách tiếp cận phương pháp nghiên cứu thuốc hợp lí . Tác
dụng chủ yếu của diclofenac là hạ sốt và tác dụng chống viêm, giảm đau, do
nó ức chế mạnh hoạt tính của cyclogenase, do đó làm giảm đáng kể sự tạo
thành prostaglandin, prostacyclin và thromboxan là những chất trung gian của
quá trình viêm. Diclofenac cũng điều hòa con đường lipoxygenase và sự kết tụ
tiểu cầu.[1]
Tuy nhiên trong quá trình dùng thuốc, người bệnh có thể gặp những triệu
chứng bất thường do thuốc gây nên như: tiêu chảy, đau đầu, chóng mặt, ngủ
gà, lú lẫn, trầm cảm, kích động... hay chứng to vú ở đàn ông, bất lực ở đàn
ông, tăng men gan. Viêm gan mạn tính, vàng da, rối loạn chức năng gan,
viêm tụy có thể xảy ra. Các phản ứng này cũng sẽ khỏi khi ngừng thuốc... Đây
là những tác dụng phụ của thuốc, những triệu chứng này có thể gặp ngay cả ở
liều điều trị. Ngoài ra, thuốc này còn gây tương tác với rất nhiều thuốc khác.
Cellulose vi khuẩn (CVK) là sản phẩm của một loài vi khuẩn, đặc biệt là
chủng Acetobacter xylinum( A. xylium). Màng sinh học (CVK) có cấu trúc và
đặc tính rất giống với cellulose của thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết
với nhau bằng liên kết β-1,4 glucozit) cellulose vi khuẩn khác với
cellulose thực vật ở chỗ: không chứa các hợp chất cao phân tử như ligin,
hemicellulose, peptin và sáp nến do vậy chúng có những đặc tính vượt trội với
độ dẻo dai, bề chắc [4], [15]. Màng CVK được coi là một nguồn polymer mới,
là một giải pháp trên con đường tìm nguồn nguyên liệu mới hiện nay.
Trên thế giới màng cellulose vi khuẩn đã được ứng dụng rất nhiều trong
các lĩnh vực công nghệ khác nhau: như dùng làm màng phân tách cho quá

trình xử lí nước, chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào,
dùng làm
1


chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi trường cơ
chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm [13]. Đặc biệt trong
lĩnh vực y học, màng CVK đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da
trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điều trị các bệnh
tim mạch; làm mặt nạ dưỡng da cho con người [13]. Ở Việt Nam, việc nghiên
cứu và ứng dụng màng CVK còn ở mức độ khiêm tốn, các nghiên cứu ứng
dụng mới chỉ dừng lại bước đầu nghiên cứu.
Với mục đích tạo ra màng CVK dựa trên loài vi khuẩn thuộc chủng A.
xylium, từ đó chế tạo màng sinh học để khảo sát sự giải phóng thuốc qua màng
nhằm kéo dài thời gian giải phóng, hạn chế tác dụng phụ, khắc phục tính ít tan
trong nước và khả dụng sinh học của CVK trong việc điều trị bệnh. Đó là lý do
tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu so sánh khả năng giải phóng thuốc diclofenac
của màng cellulose vi khuẩn lên men từ một số môi trường”
2. Mục đích nghiên cứu
-

Nghiên cứu quy trình chế tạo và màng cellulose từ chủng

Acetobacter xylinum từ một số môi trường.
Nghiên cứu so sánh khả năng giải phóng thuốc Diclofenac từ màng
CVK đã nạp thuốc trong một số môi trường pH khác nhau.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
-

Đối tượng nghiên cứu: So sánh khả năng giải phóng thuốc

diclofenac của màng cellulose vi khuẩn lên men từ một số môi trường.
-

Vật liệu nghiên cứu: Màng CVK làm từ môi trường nước dừa già,

nước vo gạo, môi trường chuẩn,…
-

Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng

thí nghiệm.
- Địa điểm nghiên cứu : Viện nghiên cứu khoa học và ứng dụng
Trường ĐHSP Hà Nội 2.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu


-

Tạo màng CVK từ vi khuẩn A. xylinum từ một số môi trường: môi

trường chuẩn, nước dừa già, nước vo gạo.
-

Thiết kế hệ thống giải phóng thuốc qua màng CVK.

-

Khảo sát, đánh giá khả năng giải phóng thuốc Diclofenac từ màng

CVK đã nạp thuốc trong môi trường pH khác nhau.
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
5.1. Ý nghĩa khoa học
-

Tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của màng CVK.

-

Việc nghiên cứu ứng dụng màng CVK vào việc khắc phục hạn chế

của thuốc diclofenac sẽ mở ra một hướng nghiên cứu mới không chỉ dừng lại
ở việc khắc phục hạn chế của thuốc này mà còn có thể ứng dụng trên nhiều
các loại thuốc khác nữa giúp cho ngành y học ngày một phát triển hơn.
-

Bên cạnh đó ta cũng có thể tìm ra được những ưu nhược điểm của

màng CVK để từ đó có những hướng nghiên cứu làm tăng các đặc tính cả
màng CVK, hạn chế các yếu điểm của màng để ứng dụng màng trên nhiều các
lĩnh vực khác nhau.Nghiên cứu về màng CVK để tăng thêm hiểu biết về ứng
dụng của màng CVK, tìm ra được môi trường tạo ra màng CVK có khả năng
nạp thuốc và giải phóng kéo dài.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
-

Xây dựng được quy trình tạo màng CVK từ chủng A. xylinum

-

Từ màng CVK đã được tạo ra ở một số môi trường được dùng để so

sánh khả năng giải phóng thuốc nhằm xây dựng hệ thống giải phóng thuốc
kéo dài, có thể làm tăng khả dụng sinh học của thuốc.
-

Kết quả nghiên cứu của đề tài có thể định hướng tạo hệ thống hấp

thụ thuốc để tăng khả năng sinh học cả thuốc, từ đó có thể áp dụng trong điều
trị một số bệnh ở Việt Nam.


NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về CVK
1.1.1. Vị trí phân loại của A. xylinum
-

A. xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi Acetobacter, họ

Pseudomonadaceae, là loại hiếu khí bắt buộc, có nhu mao và sản xuất
cellulose ngoại bào.
-

Theo khóa phân loại của Bergey thì A. xylinum thuộc:
+ Lớp: Schizomycetes.
+ Bộ: Pseudomonadales.
+ Bộ phụ: Pseudomonadieae.
+ Họ: Pseudomonadaceae.

1.1.2. Đặc điểm của A. Xylinum
-

Đặc điểm hình thái: A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi

cong, kích thước ngang khoảng 0,6 – 0,8µm, dài khoảng 2 – 3µm, vi khuẩn
không sinh bào tử, gram âm, hiếu khí bắt buộc, không sinh bào tử, không có
khả năng di động, sắp xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi, nhưng khi tế bào
già hay do điều kiện môi trường nuôi cấy, hình dạng có thể bị biển đổi: tế bào
dài hơn, phình to ra, phân nhánh hoặc không phân nhánh.
-

Đặc điểm sinh lí và sinh hóa của A. xylinum: Vi khuẩn có khả năng

oxy hóa ethanol thành acid acetic, phản ứng catalase dương tính, không tăng
trưởng trên môi trường Hoyer, không tạo sắc tố nâu, có khả năng tổng hợp
cellulose, chuyển hóa glucose thành acid, chuyển hóa glycerol thành
dihydroaceton. A. xylinum có thể sử dụng nhiều nguồn đường khác nhau và
tùy thuộc vào chủng mà nguồn đường nào được sử dụng tốt nhất. Nhiệt độ tối
ưu để A. xylinum phát triển là từ 25 - 30°C; vi khuẩn tăng trưởng trong


khoảng pH từ 3 – 8, pH tối ưu để sản xuất cellulose là 5,5.
-

A. xylinum thường sống chung với nấm chè trong một loại nước

giải khát dân gian làm từ chè loãng gọi là “ Thủy hoài sâm”, người Trung
Quốc gọi là “ Hải bảo” hay “Vị bảo”, người Nga gọi là “ Nấm chè”, người
Pháp gọi là “ Champignon De Longue Vie – nấm trường sinh”, người Nhật

gọi chúng
là “ Kombucha” [5].
1.1.3. Môi trường nuôi cấy A. xylinum
-

Môi trường nuôi cấy A. xylinum là môi trường tổng hợp từ các

nguồn dinh dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nitơ, nguồn sulfur và
phospho, các yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng. A. xylinum là loài có
khả năng tổng hợp cellulose từ nguồn cacbonhydrat. Nguồn cacbonhydrat mà
A. xylinum sử dụng là glucose, fructose, maninol, sorbitol nếu sử dụng
glycerol, galactose, lactose, sucrose cho hiệu suất thập hơn, không nên sử
dụng mannose, cellobiose, erythriol, acetate. Việc sử dụng các loại đường
cũng như nồng độ các loại đường trong môi trường còn phụ thuộc vào những
chủng A. xylinum khác nhau. Nhu cầu sử dụng đường ở A. xylinum rất lớn và
giữ vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp CVK nên có rất nhiều nghiên
cứu và đề nghị sử dụng
-

Các sản phẩm: rỉ đường, chất thải trong công nghiệp sản xuất

khoai tây và pho mát, nước dừa già và nước mía... để làm nguyên liêu nuôi
cấy A. xylinum.
-

Môi trường chuẩn


Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của môi trường chuẩn
Thành phần

Khối lượng

D – Glucose

20g

Pepton

5g

Disodium phosphate hydro

2,7g

Cao nấm men

5g

Axid citric

15g

Axid acetic

2%

Nước cất 2 lần

1000ml

Dịch giống A. xylium

10%

-

Trong đó, nước vo gạo được xem là môi trường thích hợp trong nuôi

cấy A. xylinum. Thành phần dinh dưỡng của nước vo gạo được trình bày như
trong bảng 1.2 [6].
Bảng 1.2. Thành phần dinh dưỡng của nước vo gạo
Thành phần

Hàm lượng

Vitamin nhsom B (B1, B2, B5, B6)

30% - 60%

Protein

15,7%

Đường

2%

Khoáng chất

Fe (7& - 8%), Zn (12% - 13%)

Acid amin

Leucine, valine, lysine

-

Nước vo gạo là môi trường thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn vì trong

nước vo gạo chứa rất nhiều chất dinh dưỡng và các chất kích thích tố tăng
trưởng như nhóm vitamin B1, B3, B5; nhóm khoáng chất như sắt, đồng, kẽm
và các acid amin.
-

Nước vo gạo sau khi vo được sử dụng không quá 3 giờ, tránh để cho


nước bị chua làm cho đường, vitamin và các chất dinh dưỡng khác giảm đi
dẫn đến cho hiệu suất kém.
-

Trong quá trình tăng trưởng, nitơ là một trong những nguồn dinh

dưỡng
để sinh tổng hợp các cấu tử của tế bào. Vì vậy, pepton có ảnh hưởng rõ rệt
đến sự tăng trưởng của vi khuẩn trong khi cao nấm men không ảnh hưởng
nhiều đến sự tăng trưởng của A. xylinum [6], [7].
-

Ngoài ra, môi trường nước dừa già được xem là môi trường kinh

điển trong nuôi cấy A. xylinum. Thành phần môi trường của nước dừa già [3]
được trình bày ở bảng 1.1.
Bảng 1.3. Thành phần của nước dừa già.
Thành phần

Hàm lượng

Thành phần

Hàm lượng

Nước

94,99 (%)

Đồng

0,04 (mg/100g

Protein

0,72 (%)

Mangan

0,142 (mg/100g)

Chất béo toàn phần

0,2 (%)

Selen

1 (µg/100g)

Cacbohydrat

3,17(%)

Vitamin C

2,4 (mg/100g)

Đường

2,16 (%)

Vitamin B1

0,03(mg/100g)

Canxi

24 (mg/100g)

Vitamin B2

0,057 (mg/100g)

Magiê

25 (mg/100g)

Vitamin B5

0,043 (mg/100g)

Photpho

20 (mg/100g)

Vitamin B6

0,032 (mg/100g)

Kali

250 (mg/100g)

Vitamin B9

3 (µg/100g)

Natri

105 (mg/100g)

Kẽm

0,1 (mg/100g)

-

Nước dừa già là môi trường thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn vì trong

nước dừa chứa nhiều chất dinh dưỡng và chất kích thích tố tăng trưởng như
1,3 - diphenyllurea, hexitol, cytolunin, myoinositol, sorbitol,… Vì vậy, A.


xylinum thích hợp phát triển trong môi trường này [3].
-

Nước dừa sau khi thu hoạch được sử dụng không quá 3 ngày, tránh

để lâu làm cho đường và các chất dinh dưỡng khác giảm đi dẫn đến cho hiệu
suất kém [3], [6].
1.1.4. Đặc điểm cấu trúc màng CVK tạo bởi A. xylinum
-

Cellulose vi khuẩn (màng CVK) là một chuỗi polymer không

phân nhánh bao gồm những gốc glucopyranose nối với nhau bởi liên kết β1,4- glucan. Những chuỗi glucan được vi khuẩn tổng hợp nối lại với nhau
thành thớ sợi thứ cấp, có bề rộng 1,5nm[2], [18] . Đây là những thớ sợi tự
nhiên mảnh nhất khi so sánh với sợi cellulose sơ cấp trong thượng tầng ở
một vài loài thực vật. Các sợi thứ cấp kết lại thành những vi sợi, những vi
sợi tạo thành bó sợi, những bó sợi tạo thành dải. Dải có chiều dày 3-4nm,
chiều dài
130-177nm (Yamanaka et al., 2000). Các dải siêu mịn của cellulose vi khuẩn

có chiều dài từ 1µm -9 µm tạo thành cấu trúc mắt lưới dày dặc, được ổn định
nhờ các liên kết hydro, đó là lớp màng film (Bielecki et al., 2001)
-

Cho đến nay, A. xylinum được đánh giá là loài vi khuẩn có khả

năng sinh màng CVK hiệu quả nhất trong tự nhiên. Loài vi khuẩn gram âm
sống hiếu khí bắt buộc, không sinh bào tử và là một trong những loài tiến hóa
nhất của nhóm vi khuẩn tía. Mỗi tế bào A. xylinum có thể chuyển hóa tới 108
phân tử glucose và phân tử cellulose trong 1 giờ nên khả năng tổng hợp
cellulose là rất lớn[12].
1.1.5. Tính chất độc đáo của màng CVK
-

Cellulose vi khuẩn là cellulose rất trong suốt, cấu trúc mạng tinh thể

-

Kích thước ổn định, sức căng và độ bền sinh học cao.

mịn.


-

Khả năng giữ nước và hấp thụ nước cực tốt, tính xốp chọn lọc.

Có độ tinh sạch cao so với các loại cellulose khác, không chứa ligin và
hemicellulose.
-

Có thể bị phân hủy hoàn toàn bởi một số vi sinh vật, là nguồn

tài nguyên có thể phục hồi.
-

Khả năng kết sợi, tạo tinh thể tốt. Tính bền cơ tốt, khả năng chịu

nhiệt tốt: tinh thể cellulose vi khuẩn có độ bền cao, ứng suất dài lớn, trọng
lượng nhẹ, tính bền rất cao.
-

Màng CVK được định hướng trong quá trình tổng hợp: Có khả năng

hình thành các sợi biến động, tạo các bền theo một trục. Theo Brown và
White (1989) [23] có thể hình thành một gang tay cellulose không cần khâu
bằng cách sử dụng một khối đất xốp mà không khí thấm qua được và dìm
xuống không khí bên trong môi trường lỏng nuôi cấy A. xylinum, tế bào vi
khuẩn sẽ tập hợp xung quanh đất xốp và hình thành cellulose theo hình dạng
mong muốn.
-

Màng CVK được biến đổi trực tiếp trong quá trình tổng hợp: Khi

thêm chất phụ gia hay cơ chất nhất định vào trong quá trình tổng hợp CVK thì
có thể làm thay đổi những thuộc tính của CVK. Nếu cho thuốc nhuộm vào
môi trường nuôi cấy có thể kiểm soát các tính chất vật lý của cellulose trong
quá trình tổng hợp.
-

Tổng hợp trực tiếp các dẫn xuất của cellulose nhờ vào sự tác động

gen liên quan đến quá trình tổng hợp cellulose từ đó giúp kiểm soát hình dạng
cellulose, kiểm soát trọng lượng phân tử cellulose.
-

Màng CVK được tổng hợp một cách trực tiếp, vì vậy việc sản

xuất một số sản phẩm từ cellulose vi khuẩn không cần qua bước trung gian.
-

Đặc biệt vi khuẩn có thể tổng hợp được cellulose dưới dạng màng


mỏng hoặc dưới dạng các sợi chỉ cực nhỏ[2].
1.1.6. Các phương pháp sản xuất màng CVK từ A. xylinum
-

Lên men tĩnh: Môi trường dinh dưỡng để lên men A. xylinum được

cho vào các khay lên men có bề mặt thoáng rộng. Trong quá trình lên men các
khay được đậy bằng giấy báo có độ xốp, giúp tạo độ thông khí giữa môi
trường lên men và môi trường bên ngoài nhưng vẫn tránh được khả năng
nhiễm khuẩn. Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men 28 - 30ᴼC. Sợi
cellulose mới được tổng hợp sẽ di chuyển lên bề mặt của môi trường nuôi cấy
tạo thành lớp màng cellulose nằm ở mặt phân cách giữa môi trường lỏng và
không khí. Cellulose tiếp tục được tổng hợp bám lên màng cellulose bên trên.
Sau 7-10 ngày có thể thu CVK.
-

Lên men động: Vi khuẩn A. xylinum thường được nuôi cấy trong

môi trường nuôi cấy lắc. Cấy dịch huyền phù vi khuẩn đã được hoạt hóa vào
môi trường nuôi cấy đã chuẩn bị sẵn trong các bình erlen rồi đem đi lắc trong
các máy lắc ổn nhiệt ở 28-30ᴼC, 180-200 vòng/phút. CVK được tạo ra từ môi
trường lắc có dạng hạt nhỏ, hạt hình sao và các sợi dài, chúng phân tán rất tốt
trong môi trường. Lượng O2 hòa tan trong môi trường ảnh hưởng lớn đến sự
sinh trưởng và khả năng tổng hợp CVK của vi khuẩn A. xylinum. Do đó, quá
trình lên men đạt hiệu quả cao, các reactor có sục khí thường xuyên được sử
dụng để lên men.
1.1.7. Ứng dụng màng CVK
Với những ưu điểm nổi bật, CVK ngày càng được nghiên cứu nhiều và
có nhiều ứng dụng rộng rãi và được thể hiện ở bảng dưới đây:
Bảng 1.4. Các ứng dụng của CVK
Lĩnh vực ứng dụng

Sản phẩm


Thực phẩm

Tráng miệng ( thạch dừa)
Ăn kiêng ( kem, salad)
Thịt nhân tạo
Vỏ bao xúc xích
Nước uống siro không có cholesterol
Trà Kobucha hay manchurian

Y dược

Lớp màng trị bỏng
Tác nhân vận chuyển thuốc
Da nhân tạo
Chất làm co mạch

Mỹ phẩm

Móng nhân tạo
Đánh mỏng dày và mỏng hơn

Môi trường

Miếng xốp làm sạch vết dầu tràn
Hấp thu chất độc
Quần áo, giày dép tự phân hủy

Dầu mỏ

Thu hồi dầu

Trang phục

Sản xuất sợi nhân tạo
Y phục quân đội

Thể thao

Lều lắp ráp

Sản phẩm rừng

Gỗ nhân tạo
Giấy, giấy đặc biệt để lưu trữ hồ sơ
Thùng hàng có độ bền cao

Lĩnh vực khác

Làm màng lọc

1.2. Giới thiệu về thuốc Diclofenac
1.2.1. Công thức hóa học


Hình 2.1. Công thức cấu tạo của Diclotenac
-

Tên IUPAC: -[2-(2,6-dicloro amino)phenyl] acetic acid

-

Công thức phân tử: C14H11Cl2NO2

-

Phân tử khối: 296,149 g / mol.

1.2.2. Dược động học và cơ chế tác dụng
- Dược động học :
Diclofenac được hấp thụ dễ dàng qua đường tiêu hóa sau khi uống.
Thuốc được hấp thu nhanh hơn nếu uống lúc đói. Diclofenac gắn rất nhiều với

protein huyết tương, chủ yếu với albumin. Khoảng 50% liều uống được
chuyển hóa qua gan lần đầu và sinh khả dụng trong máu tuần hoàn xấp xỉ
50% sinh khả dung trong mũi tiêm tĩnh mạch. Nồng độ thuốc tối đa trong
huyết tương xuất hiện 2 giờ sau khi uống, nồng độ trong dịch bao hoạt dịch
xuất hiện mức tối đa khoảng 4-6 giờ sau khi uống. Tác dụng của thuốc xuất
hiện sau khi tiêm bắp từ 20-30 phút, 30-60 phút sau khi đặt thuốc vào trực
tràng và 60-120 phút sau khi uống.
Nửa đời trong huyết tương khoảng 1-2 giờ. Nửa đời thải trừ khỏi dịch
bao hoạt dịch là 3-6 giờ. Xấp xỉ 60% liều dung được thải qua thận dưới dạng
các chất chuyển hóa còn một phần dưới dạng hoạt tính và dưới 1% ở dạng
thuốc nguyên vẹn, phần còn lại thải qua mật và phân. Hấp thụ, chuyển hóa và
đào thải hình như không phụ thuộc vào tuổi. Nếu liều lượng và khoảng cách


giữa các lần dung thuốc được tuân thủ theo chỉ dẫn thì thuốc không bị tích lũy
ngay cả khi chức năng thận và gan bị giảm
Cơ chế tác dụng của thuốc Diclofena
Do công thức gần giống histamin nên các thuốc kháng H2histamin tranh chấp với histamin tại receptor H2 ở tế bào thành dạ dày, làm
ngăn cản tiết dịch vị bởi các nguyên nhân gây tăng tiết histamin ở dạ dày.
Thuốc làm giảm tiết cả số lượng và nồng độ HCl của dịch vị.
1.2.3. Công dụng của thuốc
-

Diclofenac được dùng để giảm đau, sưng (viêm), và cứng khớp

do viêm khớp. Diclofenac là một thuốc kháng viêm không steroid
(NSAID).
-

Công dụng khác: Diclofenac cũng có thể được sử dụng để điều trị

các tình trạng đau khác (chẳng hạn như đau răng, đau nhức cơ bắp, đau sau
phẫu thuật hoặc sau khi sinh). Tuy nhiên, nếu bạn bị các cơn đau nghiêm trọng
bất ngờ nên sử dụng các thuốc giảm đau có tác dụng nhanh hơn diclofenac.
1.2.4.Tác dụng không mong muốn của thuốc
-

Hầu hết các tác dụng phụ thường gặp của diclofenac là rối loạn tiêu

hóa: đau thượng vị, các rối loạn tiêu hóa khác như buồn nôn, nôn mửa, tiêu
chảy, co thắt ruột, khó tiêu, trướng bụng, chán ăn; ( hiếm) xuất huyết tiêu hóa(
nôn ra máu, tiêu chảy có máu), loét dạ dày hay ruột có hay không có xuất
huyết hay thủng; ( cá biệt) viêm niêm miệng, viêm lưỡi, sang thương thực
quản, hẹp ruôt dạng biểu đồ, bệnh ở phần đại tràng như viêm kết tràng xuất
huyết không đặc hiệu và viêm kết tràng có loét tăng nặng hơn hay bệnh
Crohn, táo bón,
viêm tụy.


-

Hệ thần kinh trung ương:( đôi khi) đau đầu, chóng mặt, ( hiếm)

buồn ngủ, ( cá biệt) rối loạn cảm giác, bao gồm dị cảm, rối loạn trí nhớ, mất
ngủ, co


giật, trầm cảm, bồn chồn, ngủ có ác mộng, run rẩy, phản ứng loạn tâm
thần, viêm màng não vô khuẩn.
-

Giác quan: (cá biệt) rối loan thị giác ( nhìn mờ , song thị), giảm thính

giác, ù tai, rối loạn vị giác.
-

Da: (đôi khi) nổi ban hay phát ban đỏ: (hiếm) nổi mề đay; (cá

biệt) nổi ban có mụn nước, ban đỏ đa dạng, chứng đỏ da (viêm da tróc vảy),
rụng tóc, phản ứng nhạy cảm ánh sáng, ban xuất huyết, bao gồm ban xuất
huyết dị
ứng.
-

Gan: (đôi khi) tăng aminitransferase huyết thanh; (hiếm) viêm gan;

(cá biệt) viêm gan kịch phát
-

Thận: (hiếm) phù nề; (cá biệt) suy thận cấp, bất thường tiết niệu như

tiểu ra máu và protein niệu, viêm kẽ thận, hội chứng thận
hư.
-

Máu: (cá biệt) giảm tiểu cầu, giảm bạch cầu, thiếu máu tan huyết,

thiếu máu bất sản, mất bạch cầu hạt.
-

Quá mẫn: (hiếm) phản ứng quá mẫn như hen suyễn, phản ứng

phản vệ hay giống phản vệ toàn thân bao gồm hạ huyết áp; (cá biệt) viêm
mạch, viêm phổi.
-

Hệ tim mạch: (cá biệt) đánh trống ngực, đau ngực, cao huyết áp, suy

tim sung huyết.
1.3.Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam
1.3.1. Tình hình nghiên cứu thuốc
1.3.1.1. Trên thế giới
-

Nghiên cứu về màng CVK từ vi khuẩn A. xylinum và những

ứng dụng của nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới. Tác giả
Brown,


1989, dùng màng CVK làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước,
dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào. Brown
(1989) và cộng sự, dùng màng như là một chất để biến đổi độ nhớt, để làm ra