Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc berberin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ một số môi trường

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
===o0o===

LÝ THỊ HUỆ

NGHIÊN CỨU SO SÁNH KHẢ NĂNG
GIẢI PHÓNG THUỐC BERBERIN
CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN
LÊN MEN TỪ MỘT SỐ MÔI TRƢỜNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
ThS. Cao Bá Cƣờng
ThS. CAO BÁ CƢỜNG

HÀ NỘI, 2017


LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS. Cao Bá Cƣờng đã hƣớng dẫn,
chỉ bảo tận tình, giúp đỡ tạo điều kiện cho em thực hiện và hoàn thành tốt
khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trƣờng ĐHSP Hà Nội 2, khoa
Sinh - KTNN, Viện NCKH & ƢD Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2, phòng thí nghiệm
Sinh lý ngƣời và động vật, cùng các thầy cô trong tổ bộ môn Động vật, ban
bảo vệ đã tạo điều kiện giúp đỡ em.
Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quan tâm động viên của bạn bè,
gia đình trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 20 tháng 04 năm 2017

Sinh viên

Lý Thị Huệ


LỜI CAM ĐOAN
Để đảm bảo tính trung thực của đề tài, tôi xin cam đoan:
1. Đề tài của tôi không sao chép bất cứ tài liệu nào có sẵn.
2. Đề tài của tôi không trùng lặp với một đề tài nào khác.
3. Kết quả thu đƣợc trong đề tài do tự bản thân tôi nghiên cứu thực tiễn
đảm bảo tính chính xác và trung thực.
Hà Nội, ngày 20 tháng 04 năm 2017
Sinh viên

Lý Thị Huệ


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tẳt
A. xylinum

Từ đầy đủ
Acetobacter xylinum

CNM

Cao nấm men

CVK

Cellulose vi khuẩn

ĐHSP

Đại học Sƣ phạm

MT1

Môi trƣờng 1

MT2

Môi trƣờng 2

MT3

Môi trƣờng 3

NCKH & ƢD

Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng

OD

Optical density

UV - vis

Ultraviolet visible

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ...................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ............................................................................ 3
3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ........................................................ 3
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ................................................. 3
4.1. Ý nghĩa khoa học ......................................................................... 3
4.2. Ý nghĩa thực tiễn .......................................................................... 3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 4
1.1. Đặc điểm, tính chất và ứng dụng của màng CVK ............................. 4
1.1.1. Đặc điểm cấu trúc..................................................................... 4
1.1.2. Tính chất độc đáo của màng CVK............................................ 5
1.1.3. Ứng dụng màng CVK................................................................ 5
1.2. Giới thiệu về thuốc berberin .............................................................. 6
1.2.1. Nguồn gốc ................................................................................. 6
1.2.2. Cấu trúc .................................................................................... 7
1.2.3. Tác dụng dược lý và ứng dụng ................................................. 7
1.2.4. Chỉ định và chống chỉ định của thuốc berberin ....................... 8
1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam............................ 9
1.3.1. Tình hình nghiên cứu thuốc ...................................................... 9
1.3.2. Tình hình nghiên cứu màng CVK ............................................. 9
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 11
2.1. Vật liệu nghiên cứu .......................................................................... 11
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................. 11
2.1.2. Nội dung nghiên cứu............................................................... 11
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ ................................................................. 11
2.1.4. Nguyên liệu và hóa chất ......................................................... 12

2.1.5. Môi trường lên men thu màng CVK ....................................... 12
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................. 13
2.2.1. Phương pháp lên men thu màng CVK từ một số môi trường . 13
2.2.2. Phương pháp xử lý màng CVK trước khi hấp thụ thuốc ........ 13
2.2.3. Đánh giá độ tinh khiết của màng ........................................... 14
2.2.4. Phương pháp xác định đường chuẩn...................................... 15
2.2.5. Phương pháp xác định lượng thuốc được hấp thụ vào màng
CVK......................................................................................... 16
2.2.6. Phương pháp pha môi trường đệm PBS ................................. 17
2.2.7. Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng thông qua hệ
thống được thiết kế ................................................................. 18
2.2.8. Phương pháp đánh giá động học giải phóng của thuốc
berberin từ màng CVK ........................................................... 19
2.2.9. Phương pháp xử lý thống kê ................................................... 19
2.2.10. Địa điểm nghiên cứu............................................................. 19
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 20
3.1. Kết quả tạo màng và xử lý màng CVK từ các môi trƣờng khác nhau...20
3.1.1. Thu màng CVK từ các môi trường lên men ............................ 20
3.1.2. Quá trính xử lý màng CVK trước khi hấp thu thuốc .............. 21
3.1.3. Xác định điều kiện nuôi cấy để có độ dày màng CVK
thích hợp ................................................................................. 22
3.1.4. Kiểm tra độ tinh khiết của màng CVK ................................... 23
3.2. Khả năng hấp thụ thuốc berberin của màng CVK trong các môi
trƣờng khác nhau ............................................................................. 24
3.3. Tỷ lệ giải phóng thuốc của các màng CVK ..................................... 25
3.3.1. Tỉ lệ giải phóng thuốc của màng cao nấm men ...................... 25
3.2.2. Tỉ lệ giải phóng thuốc của màng nước dừa già...................... 27

3.2.3. Tỉ lệ giải phóng thuốc của màng nước vo gạo ....................... 29
3.2.4. So sánh tỷ lệ giải phóng thuốc ra các màng CVK ở các độ dày
khác nhau trong cùng 24h tại pH = 2 .................................... 30
3.2.5. So sánh tỷ lệ giải phóng thuốc ra các màng CVK ở các độ dày
khác nhau trong cùng 24h tại pH = 12 .................................. 32
3.4. Đánh giá động dƣợc học giải phóng của thuốc berberin từ
màng CVK ....................................................................................... 33
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 38
KẾT LUẬN............................................................................................. 38
KIẾN NGHỊ ............................................................................................ 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 39


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Môi trƣờng lên men tạo màng CVK ............................................... 12
Bảng 2.2. Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch Berberin ở các nồng độ
(mg/ml) khác nhau (n = 3) .............................................................................. 15
Bảng 2.3. Môi trƣờng đệm PBS ...................................................................... 17
Bảng 3.1. Kết quả thu màng CVK tƣơi ở các độ dày khác nhau .................... 23
Bảng 3.2. Lƣợng thuốc hấp thụ vào các màng CVK với độ dày khác nhau tại
thời điểm 2 giờ ................................................................................................ 25
Bảng 3.3. Hiệu suất thuốc hấp thụ vào các màng CVK khác nhau với độ dày
màng khác nhau trong 2 giờ ............................................................................ 25
Bảng 3.4. Tỷ lệ giải phóng thuốc berberin (%) từ màng CVK lên men từ môi
trƣờng cao nấm men (màng CNM) (n=3) ....................................................... 26
Bảng 3.5. Tỉ lệ giải phóng thuốc berberin (%) từ màng CVK lên men từ môi
trƣờng nƣớc dừa già (n=3) .............................................................................. 27
Bảng 3.6. Tỉ lệ giải phóng thuốc berberin (%) từ màng CVK lên men từ môi
trƣờng nƣớc vo gạo (n=3) ............................................................................... 29
Bảng 3.7. Tỷ lệ giải phóng thuốc ra các màng CVK ở các độ dày khác nhau

trong cùng 24 giờ tại pH = 2 ........................................................................... 31
Bảng 3.8. Tỷ lệ giải phóng thuốc ra các màng CVK ở các độ dày khác nhau
trong cùng 24 giờ tại pH = 12 ......................................................................... 32
Bảng 3.9. Hệ số tƣơng quan (R2), tốc độ giải phóng thuốc (k) và trị số mũ giải
phóng (n) đối với các môi trƣờng pH khác nhau của màng CNM (n = 3) .......... 34
Bảng 3.10. Hệ số tƣơng quan (R2), tốc độ giải phóng thuốc (k) và trị số mũ
giải phóng (n) đối với các môi trƣờng pH khác nhau của màng nƣớc dừa già
(n = 3) .............................................................................................................. 35
Bảng 3.11. Hệ số tƣơng quan (R2), tốc độ giải phóng thuốc (k) và trị số mũ
giải phóng (n) đối với các môi trƣờng pH khác nhau của màng nƣớc vo gạo
(n = 3) .............................................................................................................. 36


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của berberin......................................................... 7
Hình 2.1. Quy trình tinh chế màng CVK ........................................................ 14
Hình 2.2. Đồ thị biểu diễn đƣờng chuẩn berberin .......................................... 16
Hình 3.1. Hình ảnh màng CVK lên men từ môi trƣờng CNM ....................... 20
Hình 3.2. Hình ảnh màng CVK lên men từ môi trƣờng nƣớc dừa già ........... 20
Hình 3.3. Hình ảnh màng CVK lên men từ môi trƣờng nƣớc vo gạo ............ 21
Hình 3.4. Các quy trình xử lý màng CVK ...................................................... 21
Hình 3.5. Kết quả thử sự hiện diện của đƣờng glucose .................................. 24
Hình 3.6. Tỷ lệ giải phóng thuốc từ màng CNM với độ dày 0.3cm và 0.7cm 26
Hình 3.7. Tỷ lệ giải phóng thuốc từ màng dừa với độ dày 0.3cm và 0.7cm .. 28
Hình 3.8. Tỷ lệ giải phóng thuốc từ màng gạo với độ dày 0.3cm và 0.7cm... 30
Hình 3.9. Tỷ lệ giải phóng thuốc ra các màng CVK ở các độ dày khác nhau
trong cùng 24 giờ tại pH = 2 ........................................................................... 31
Hình 3.10. Tỷ lệ giải phóng thuốc ra các màng CVK ở các độ dày khác nhau
trong cùng 24 giờ tại pH = 12 ......................................................................... 32

MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Trong thời kì công nghiệp hóa, hiện đại hóa con ngƣời trở nên bận rộn
hơn với công việc không có nhiều thời gian nấu nƣớng bếp núc nên nhiều các
loại thức ăn nhanh, đồ ăn đóng hộp ra đời và kèm theo đó chứng tiêu chảy,
viêm đƣờng tiêu hóa cũng ngày một xuất hiện nhiều hơn. Các bệnh rối loạn
đƣờng tiêu hóa không chỉ do ăn uống mà còn do nhiều các nguyên nhân khác
nhƣ do quá căng thẳng, stress, hay do thức khuya không ngủ đủ giấc, sử dụng
chất kích thích nhƣ rƣợu, cà phê, ....Với sự phát triển của ngành y học hiện
nay có rất nhiều các loại thuốc nhằm chữa trị, hạn chế bệnh rối loạn đƣờng
tiêu hóa, ...trong đó có thuốc berberin [1].
Berberin đã đƣợc biết đến nhƣ một chất kháng khuẩn tự nhiên trong
việc điều trị các bệnh lý liên quan đến rối loạn đƣờng tiêu hóa do vi khuẩn tả,
E. coli, amip đƣờng ruột [20]. Theo một vài nghiên cứu gần đây, berberin còn
có tác dụng tốt trong việc điều trị một số bệnh mãn tính nhƣ tiểu đƣờng, viêm
khớp, hạ lipid, cholesterol máu, đặc biệt là bệnh viêm đại tràng. Berberin sở
hữu tính chất dƣợc khác nhau bao gồm cả tác dụng chống ung thƣ [20].
Trong quá trình dùng thuốc berberin chữ trị bệnh nhiễm trùng đƣờng
ruột, tiêu chảy, viêm đƣờng tiêu hóa ngƣời dùng cần lƣu ý một số tác dụng
phụ của thuốc có thể gây ra cho ngƣời dùng nhƣ: bị dị ứng, bị táo bón, …
Màng cellulose vi khuẩn (CVK) cấu tạo bởi những chuỗi polymer 1,4
glucopyranose mạch thẳng đƣợc tổng hợp từ một số loài vi khuẩn, chủ yếu là
Acetobacter xylinum (A. xylinum). Màng CVK do A. xylinum tạo ra có cấu trúc
hóa học đồng nhất với cellulose thực vật nhƣng lại có một số tính chất hóa lí
nhƣ: độ bền cơ học và khả năng thấm hút nƣớc cao, đƣờng kính sợi nhỏ, độ
tinh khiết cao, khả năng polymer hóa lớn [2], [6],... Hiện nay màng CVK đƣợc
xem là nguồn nguyên liệu mới có tiềm năng ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực

1

khác nhau nhƣ công nghiệp thực phẩm, công nghệ giấy, công nghệ sản xuất
pin,… Trong lĩnh vực y học, màng CVK đã đƣợc một số nƣớc trên thế giới
nghiên cứu ứng dụng làm màng trị bỏng, mặt nạ dƣỡng da, mạch máu nhân tạo
[13], [19]. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng CVK còn ở mức độ
khiêm tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bƣớc đầu nghiên cứu. Đề
tài của Nguyễn Văn Thanh [6] - Đại học Y Dƣợc TP. Hồ Chí Minh 2006 đã
“Nghiên cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ Acetobacter xylinum”. Theo
kết quả nghiên cứu cho thấy màng CVK đƣợc tạo nên từ các nguyên liệu rẻ tiền,
dễ kiếm, có thể sản xuất trên quy mô công nghiệp [6]. Về mặt tính chất CVK
có độ tinh sạch lớn hơn rất nhiều so với các loại cellulose khác, có thể phân hủy
sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn [6]. Ngoài ra CVK còn có độ bền tinh
thể cao, sức căng lớn, trọng lƣợng thấp, khả năng thấm hút lớn, đƣờng kính sợi
nhỏ, chứa nhiều dƣỡng chất. Đồng thời là một hàng rào cản oxi và các sinh vật
khác, ngăn cản sự phân hủy các cơ chất ở trong tế bào và ngăn cản tác động của
UV, ổn định về kích thƣớc và hƣớng, màng CVK còn có ý nghĩa giữ thuốc và
giải phóng thuốc từ từ [17], [21]. Bên cạnh đó, các sợi cellulose có cấu trúc
mạng sẽ là hệ thống vận chuyển và phân phối thuốc làm tăng sinh khả dụng của
thuốc, nó có thể giúp thuốc không bị phá hủy trong môi trƣờng axít. Do đó, cần
thiết kế một loại thuốc có khả năng hấp thụ và giải phóng thuốc để làm tăng độ
hòa tan và khả dụng sinh học của CVK [20].
Với mục đích tạo ra màng CVK dựa trên loài vi khuẩn thuộc chủng
Acetobacter xylinum, từ đó chế tạo màng sinh học để khắc phục đƣợc những
tác dụng phụ của thuốc berberin trong chữa trị bệnh nhiễm trùng đƣờng ruột,
tiêu chảy,… ở môi trƣờng thích hợp nhất. Đồng thời, để hạn chế sự đào thải
thuốc, giúp cho lƣợng thuốc giải phóng ra khỏi cơ thể từ từ làm tăng hiệu quả
chữa trị. Đó là lí do chúng tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu so sánh khả năng
giải phóng thuốc berberin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ một số
môi trường”.

2


2. Mục đích nghiên cứu
- Nghiên cứu chế tạo màng cellulose từ chủng Acetobacter xylinum từ
một số môi trƣờng.
- Nghiên cứu so sánh khả năng giải phóng thuốc berberin từ màng CVK
đã nạp thuốc trong một số môi trƣờng pH khác nhau.
3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tƣợng nghiên cứu: so sánh khả năng giải phóng thuốc berberin của
màng cellulose vi khuẩn lên men từ một số môi trƣờng.
- Vật liệu nghiên cứu: màng CVK làm từ môi trƣờng nƣớc dừa già; nƣớc
vo gạo, môi trƣờng chuẩn, môi trƣờng cao nấm men, …
- Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu đƣợc thực hiện ở quy mô phòng thí
nghiệm.
- Địa điểm nghiên cứu: phòng thí nghiệm Sinh lý ngƣời và động vật
khoa Sinh - KTNN, Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2. Viện NCKH & ƢD trƣờng
ĐHSP Hà Nội 2.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa học
Nghiên cứu về màng CVK để tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của màng
CVK, tìm ra đƣợc môi trƣờng tạo ra màng CVK có khả năng nạp thuốc và
giải phóng kéo dài.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Đề tài định hƣớng khắc phục đƣợc nhƣợc điểm berberin thông thƣờng:
nâng cao tác dụng của thuốc, rút ngắn thời gian điều trị và giảm chi phí điều
trị cho con ngƣời, …

3

NỘI DUNG
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm, tính chất và ứng dụng của màng CVK
1.1.1. Đặc điểm cấu trúc
Cho đến nay, Acetobacter xylinum đƣợc đánh giá là loài vi khuẩn có khả
năng sinh màng CVK hiệu quả nhất trong tự nhiên [5]. A. xylinum có dạng
hình que, thẳng hay hơi cong, kích thƣớc ngang khoảng 0.6 - 0.8µm, dài
khoảng 2 - 3µm, vi khuẩn gram âm sống hiếu khí bắt buộc, không sinh bào tử,
không di động, sắp xếp riêng rẽ đôi khi thành chuỗi, nhƣng khi tế bào già hay
do điều kiện môi trƣờng nuôi cấy, hình dạng có thể bị biến đổi: tế bào dài
hơn, phình to ra, phân nhánh hoặc không phân nhánh và là một trong những
loài tiến hóa nhất của nhóm vi khuẩn tía. Mỗi tế bào A. xylinum có thể chuyển
hóa tới 108 phân tử glucose và phân tử cellulose trong 1 giờ nên khả năng
tổng hợp cellulose là rất lớn.
Trên môi trƣờng dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn A.
xylinum hình thành nên một lớp màng có bản chất là cellulose, đƣợc tập hợp
bởi những bó sợi cellulose liên kết với nhau đƣợc gọi là màng CVK [26].
Cellulose vi khuẩn (màng CVK) là một chuỗi polymer không phân
nhánh bao gồm những gốc glucopyranose nối với nhau bởi liên kết β - 1,4 glucan. Những chuỗi glucan đƣợc vi khuẩn tổng hợp nối lại với nhau thành
thớ sợi thứ cấp, có bề rộng 1.5nm [2], [19]. Đây là những thớ sợi tự nhiên
mảnh nhất khi so sánh với sợi cellulose sơ cấp trong tƣợng tầng ở một vài loài
thực vật. Các sợi thứ cấp kết lại thành những vi sợi, những vi sợi tạo thành bó
sợi, những bó sợi tạo thành dải. Dải có chiều dày 3 - 4nm, chiều dài 130 177nm (Yamanaka et al., 2000). Các dải siêu mịn của cellulose vi khuẩn có
chiều dài từ 1 - 9µm tạo thành cấu trúc mắt lƣới dày dặc, đƣợc ổn định nhờ
các liên kết hydro, đó là lớp màng film (Bielecki et al., 2001) [6], [19].

4

1.1.2. Tính chất độc đáo của màng CVK
- Cellulose vi khuẩn là cellulose rất trong suốt, cấu trúc mạng tinh thể mịn.
- Kích thƣớc ổn định, sức căng và độ bền sinh học cao.
- Khả năng giữ nƣớc và hấp thụ nƣớc cực tốt, tính xốp chọn lọc
- Có thể bị phân hủy hoàn toàn bởi một số vi sinh vật, là nguồn tài
nguyên có thể phục hồi.
- Khả năng kết sợi, tạo tinh thể tốt. Tính bền cơ tốt, khả năng chịu nhiệt
tốt: tinh thể cellulose vi khuẩn có độ bền cao, ứng suất dài lớn, trọng lƣợng
nhẹ, tính bền rất cao.
- Màng CVK đƣợc định hƣớng trong quá trình tổng hợp: Có khả năng hình
thành các sợi biến động, tạo các bền theo một trục. Theo Brown và White (1989)
[29] có thể hình thành một gang tay cellulose không cần khâu bằng cách sử dụng
một khối đất xốp mà không khí thấm qua đƣợc và dìm xuống không khí bên
trong môi trƣờng lỏng nuôi cấy A. xylinum, tế bào vi khuẩn sẽ tập hợp xung
quanh đất xốp và hình thành cellulose theo hình dạng mong muốn.
- Lớp màng cellulose đƣợc tổng hợp một cách trực tiếp, vì vậy việc sản
xuất một số sản phẩm từ cellulose vi khuẩn không cần qua bƣớc trung gian.
- Đặc biệt vi khuẩn có thể tổng hợp đƣợc cellulose dƣới dạng màng
mỏng hoặc dƣới dạng các sợi chỉ cực nhỏ.
1.1.3. Ứng dụng màng CVK
Với những ƣu điểm nổi bật, CVK ngày càng đƣợc nghiên cứu nhiều và
có nhiều ứng dụng rộng rãi.

5


Lĩnh vực ứng dụng

Sản phẩm

Thực phẩm

Tráng miệng ( thạch dừa)
Ăn kiêng ( kem, salad)
Thịt nhân tạo
Vỏ bao xúc xích
Nƣớc uống siro không có cholesterol
Trà Kobucha hay manchurian

Y dƣợc

Lớp màng trị bỏng
Tác nhân vận chuyển thuốc
Da nhân tạo
Chất làm co mạch

Mỹ phẩm

Móng nhân tạo
Đánh mỏng dày và mỏng hơn

Môi trƣờng

Miếng xốp làm sạch vết dầu tràn
Hấp thu chất độc
Quần áo, giày dép tự phân hủy

Dầu mỏ

Thu hồi dầu

Trang phục

Sản xuất sợi nhân tạo
Y phục quân đội

Thể thao

Lều lắp ráp

Sản phẩm rừng

Gỗ nhân tạo
Giấy, giấy đặc biệt để lƣu trữ hồ sơ
Thùng hàng có độ bền cao

Lĩnh vực khác

Làm màng lọc

1.2. Giới thiệu về thuốc berberin
1.2.1. Nguồn gốc
Berberin thƣờng có trong rễ, thân rễ, thân, vỏ cây những cây thuộc chi
Berberis, Hydrastis candensis, Coptis chinensis [5], [14]. Berberin có

6


nhiều trong thân và rễ cây vàng đắng với tỷ lệ 1.5 - 3%, berberin chiếm ít nhất

là 82% so với alkaloid toàn phần [5], [8], [14].
Berberin thƣờng có lẫn các tạp chất alcaloid khác nhƣ: palmatin,
jatrorrhizin. Giới hạn tạp chất palmatin không quá 2%, jatrorrhizin không quá
5% [1], [8], [5].
1.2.2. Cấu trúc
Berberin là một alkaloid thực vật thuộc nhóm isoquinol có khung
protoberberin [1]. Isoquinolin còn đƣợc gọi là benzo pyridin hay 2 - benzamin
là một hợp chất hữu cơ thơm heterocyclic.
Công thức cấu tạo

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của berberin
Công thức phân tử: C20H18NO4Cl.2H2 O
Khối lƣợng phân tử: 371.82
Tên khoa học: 5,6-đihydro-8,9-đimethoxy-1,3-đioxa-6a-azoniaindeno
(5,6-a) anthracen clorid dihydrat [1].
1.2.3. Tác dụng dược lý và ứng dụng
Berberin có tác dụng kháng khuẩn đƣợc dùng chủ yếu trong các bệnh rối
loạn đƣờng tiêu hóa [22]. Ngoài ra, berberin với liều nhỏ có tác dụng kích
thích tim, làm giãn động mạch vành, với liều lƣợng lớn ức chế hô hấp làm tê

7


liệt trung khu hô hấp trong khi tim vẫn đập. Berberin còn có tác dụng hạ
nhiệt, gây tê, lợi mật, kháng lợi niệu, đối với đƣờng huyết lúc đầu có tác dụng
tăng cao và sau đó thì hạ [22]. Berberin đem khử hóa cho tetrahydroberberin
có tác dụng an thần và mềm cơ, hạ huyết áp nhẹ [22].
Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng: berberin có khả năng hạ
đƣờng huyết nhƣ hiệu quả nhƣ metformin, cơ chế hoạt động bao gồm việc ức
chế aldosereductase, làm giảm đƣờng và ngăn ngừa sự kháng insulin [16].

Berberin làm giảm mạnh lƣợng cholesterol, LD cholesterol, triglycerid xơ vữa
nhƣng cơ chế hoạt động khác biệt với statin làm cho berberin không gây ra tác
dụng phụ điển hình nhƣ statin. Ngoài ra berberin còn có tác dụng chống co giật
nên có thể dùng tronng bệnh động kinh, bảo vệ các tế bào thần kinh trong các
trƣờng hợp tổn thƣơng não do tắc mạch máu não gây ra, có tác dụng chống
trầm cảm. Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra tác dụng chống ung thƣ của berberin,
nó có thể ngăn chặn sự phát triển của nhiều loại tế bào ung thƣ, bao gồm ung
thƣ vú, ung thƣ biểu mô, ung thƣ tụy, ung thƣ dạ dày mà không làm ảnh hƣởng
đến sự phát triển của các tế bào bình thƣờng ở nồng độ nhất định [22].
1.2.4. Chỉ định và chống chỉ định của thuốc berberin
Chỉ định: nhiễm trùng đƣờng ruột, tiêu chảy, lỵ trực trùng, hội chứng lỵ,
viêm ống mật, đau mắt đỏ, đau mắt hột, nhức mỏi mắt, viêm kết mạc, các
trƣờng hợp ngứa mắt do dị ứng [7].
Chống chỉ định: quá mẫn cảm, phụ nữ có thai. Phụ nữ mang thai và cho
con bú: không uống berberin nếu bạn đang mang thai. Các nhà nghiên cứu cho
rằng berberin có thể đi qua nhau thai và có thể gây hại cho thai nhi. Vàng da
nhân (kernicterus), một loại tổn thƣơng não, đã phát triển ở trẻ sơ sinh tiếp xúc
với berberin. Không uống berberin nếu bạn đang cho con bú. Berberin có thể đi
vào cơ thể trẻ sơ sinh qua sữa mẹ, và có thể gây ra hại cho trẻ sơ sinh [1, 7].

8


1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam
1.3.1. Tình hình nghiên cứu thuốc
1.3.1.1. Trên thế giới
Đã có những công trình nghiên cứu về thuốc berberin trên thế giới nhƣ:
Huilixing và Jianping Ye đã xác định hiệu quả và tính an toàn của
berberin trong điều trị bệnh nhân tiểu đƣờng loại 2 [23].
Ryan Bradley, ND, MPH, và Bill Walter, ND đã nghiên cứu về berberin

trong bệnh tiểu đƣờng [25].
Jianping Ye, Weiping Jia đã tìm hiểu về tác dụng và cơ chế của berberin
trong điều trị bệnh tiểu đƣờng [24].
1.3.1.2. Ở Việt Nam
Việc nghiên cứu thuốc berberin ở Việt Nam có một số công trình nghiên
cứu sau:
Phan Quốc Kinh đã nghiên cứu những Alkaloid chiết xuất từ các cây
thuốc Việt Nam [4].
Nguyễn Liêm - chiết xuất berberin bằng áp lực nóng [7].
Phạm Viết Trang, Nguyễn Liêm - góp phần nghiên cứu cải tiến quy trình
sản xuất berberin từ cây vàng đắng [7].
Hồ Đắc Trinh - chiết berberin clorid trong vàng đắng bằng dung dịch
acid sulfuric loãng [15].
Trần Công Khánh - góp phần nghiên cứu phƣơng pháp sản xuất berberin
từ cây vàng đắng Coscinium usitatum Pierre [3].
1.3.2. Tình hình nghiên cứu màng CVK
1.3.1.3. Trên thế giới
Nghiên cứu về màng CVK từ vi khuẩn A. xylinum và những ứng dụng
của nó đã đƣợc tiến hành ở nhiều nƣớc trên thế giới. Tác giả Brown [19],
1989, dùng màng CVK làm môi trƣờng phân tách cho quá trình xử lý nƣớc,

9


dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lƣợng cho tế bào. Brown
(1989) và cộng sự [19], dùng màng nhƣ là một chất để biến đổi độ nhớt, để
làm ra các sợi truyền quang, làm môi trƣờng cơ chất trong sinh học, thực
phẩm hoặc thay thế thực phẩm. Đặc biệt Brown (1989) [19], đã dùng CVK
làm vải đặc biệt, để sản xuất giấy chất lƣợng cao, làm cơ chất để cố định
protein hay cho sắc kí.

1.3.1.4. Ở Việt Nam
Tại Việt Nam tình hình điều trị bỏng trong nƣớc ngày càng đƣợc cải
tiến. Công tác điều trị bỏng bao gồm việc cấy ghép, phẫu thuật, tạo ra một số
màng trị bỏng nhƣ màng ối, trung bì da lợn, da ếch, màng chitosan, sử dụng
các chất có nguồn gốc từ tự nhiên có tác dụng điều trị bỏng,… Từ năm 2000
nhóm nghiên cứu các tác giả Nguyễn Văn Thanh [6] và cộng sự đã có một số
công trình nghiên cứu về màng CVK thu đƣợc là cơ sở để chế tạo màng sinh
học dùng trong trị bỏng ở Việt Nam [6].

10


Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Nghiên cứu so sánh khả năng giải phóng thuốc berberin của màng
cellulose vi khuẩn lên men từ một số môi trƣờng.
2.1.2. Nội dung nghiên cứu.
- Tạo màng CVK từ 3 môi trƣờng: nƣớc dừa già, nƣớc vo gạo, môi
trƣờng chuẩn.
- Cho màng CVK nạp thuốc berberin.
- Nghiên cứu giải phóng ở các môi trƣờng pH khác nhau.
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ
 Thiết bị
- Máy đo quang phổ UV - 2450 (Shimadzu - Nhật Bản)
- Cân phân tích (Sartorius - Đức)
- Cân kỹ thuật - Sartorius TE 3102 S
- Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAIAMA
- Buồng cấy vô trùng (Haraeus)
- Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức)

- Máy khuấy từ gia nhiệt (IKA - Đức)
- Máy nƣớc cất 2 lần (Hamilton - Anh)
- Bể ổn nhiệt (Đức)
- Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu
Và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác
 Dụng cụ
Hộp nhựa để lên men tạo màng CVK, ống nghiệm, cốc đong thủy tinh,
đũa thủy tinh, bình thủy tinh (500ml) có nút xoáy, lọ penicilin, đèn cồn, kẹp
gỗ, bình hút ẩm, giấy lọc, giấy quỳ tím, bình định mức loại 100ml, 500ml,
1000ml, pipet chính xác 1ml, 5ml, 10ml, thƣớc kẹp panme,... và nhiều dụng
cụ hóa sinh khác.

11


2.1.4. Nguyên liệu và hóa chất
2.1.4.1. Nguyên liệu
Nƣớc dừa, nƣớc vo gạo, nƣớc cất 2 lần, gạc vô trùng.
2.1.4.2. Hóa chất
- Thuốc berberin dạng tinh khiết 99.6%, nguồn gốc Trung Quốc
- Sử dụng hóa chất đặc biệt: cao nấm men
- Các hóa chất thông thƣờng: amoni sunfat, diamoni phosphate hydro,
Na2HPO4, acid acetic, NaOH, HCl, đƣờng glucose, pepton
- Hóa chất dùng pha môi trƣờng pH: HClđđ, KCl, acid citric,
Na2HPO4.12H2O, ethanol 960, thuốc thử fehling
- Các hóa chất trên đều có nguồn gốc từ Việt Nam và Trung Quốc.
2.1.5. Môi trường lên men thu màng CVK
A. xylinum đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng cải biến từ môi trƣờng chuẩn
và đƣợc trình bày ở bảng 2.1
Bảng 2.1. Môi trƣờng lên men tạo màng CVK

Thành phần
Glucose
Pepton
Diamoni photphat hydro
Disodium phosphate hydro
Amoni sulfat
Cao nấm men
Acid citric
Acid acetic
Nƣớc dừa già
Nƣớc vo gạo
Nƣớc cất 2 lần
Dịch giống A. xylium

Môi trƣờng
MT1
MT2
20g
30g
5g
10g
0.3g
2.7g
0.5g
5g
1.5g
2%
2%
1000ml

MT3
30g
10g
0.3g
0.5g

2%
1000ml

1000ml
10%

12

10%

10%


2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp lên men thu màng CVK từ một số môi trường
- Bƣớc 1: Chuẩn bị môi trƣờng nhƣ bảng 2.1.
- Bƣớc 2: Hấp khử trùng các môi trƣờng đó ở 113°C trong 15 phút.
- Bƣớc 3: Lấy các môi trƣờng ra khử trùng bằng tia UV trong 15 phút rồi
để nguội môi trƣờng.
- Bƣớc 4: Bổ sung 10% dịch giống và 2% acid acetic, lắc đều tay cho
giống phân bố đều trong dung dịch.
- Bƣớc 5: Dùng gạc vô trùng bịt miệng lọ, ủ tĩnh trong khoảng 4 - 14
ngày ở 26°C.
- Bƣớc 6: Thu màng CVK thô, rửa sạch chúng dƣới vòi nƣớc.

2.2.2. Phương pháp xử lý màng CVK trước khi hấp thụ thuốc
Mục đích: loại bỏ đƣợc các tạp chất trong môi trƣờng nuôi cấy, đồng
thời phá hủy và trung hòa độc tố của vi khuẩn. Vì vậy, trƣớc khi hấp thu
thuốc cần phải xử lý màng, quy trình xử lý màng CVK đƣợc thể hiện qua sơ
đồ ở hình 2.1

13


Thu màng CVK thô

Ép loại nƣớc

Ngâm trong NaOH 3%

48 giờ, rửa và ép

Ngâm trong HCl 3%

48 giờ, rửa và ép

Ngâm trong nƣớc

48 giờ, kiểm tra tạp chất

Thu CVK tinh khiết

Hình 2.1. Quy trình tinh chế màng CVK
2.2.3. Đánh giá độ tinh khiết của màng
 Mục đích: Kiểm tra sự hiện diện của đƣờng glucose trong màng CVK.

 Nguyên tắc: Dùng thuốc thử Fehling mới pha để phát hiện sự hiện
diện của đƣờng D - glucose, nếu có sẽ xuất hiện kết tủa nâu đỏ.

14


 Tiến hành:
- Dịch thử của màng CVK các loại sau khi đã xử lý hóa học.
- Mẫu đối chứng: là nƣớc cất và dung dịch D - glucose.
- Cho vào các ống nghiệm chứa mẫu thử mỗi ống nghiệm 1ml thuốc thử
Fehling. Đun dƣới ngọn lửa đèn cồn 10 - 15 phút.
- Quan sát tủa xuất hiện trong ống nghiệm
2.2.4. Phương pháp xác định đường chuẩn
Mẫu dung dịch chuẩn (6 mẫu) [11].
Chuẩn bị dung dịch chứa thuốc Berberin ở các nồng độ (mg/ml) khác
nhau là: 5%; 10%; 20%; 30%; 40%; 50%.
Dùng máy đo quang phổ UV-Vis [11] để đo cƣờng độ quang phổ của các
dung dịch đã pha ở bƣớc sóng 345nm [20].
Dựng đồ thị đƣờng chuẩn và lập phƣơng trình đƣờng chuẩn berberin
bằng phần mềm Excel 2010
Tiến hành pha thuốc và đo quang phổ 3 lần rồi lấy kết quả trung bình.
Kết quả trung bình giá trị OD 345nm của các nồng độ thuốc khác nhau
đƣợc thể hiện ở bảng 2.2
Bảng 2.2. Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch berberin ở các nồng độ
(mg/ml) khác nhau (n = 3)
STT

Nồng độ

Giá trị OD 345nm (n = 3)

Giá trị trung

(mg/ml)

Lần 1

Lần 2

Lần 3

bình

1

5

0.353

0.355

0.354

0.354 ± 0.003

2

10

0.712

0.714

0.710

0.712 ± 0.002

3

20

1.523

1.522

1.532

1.526 ± 0.006

4

30

2.031

2.299

2.286

2.205 ± 0.151

5

40

2.966

3.004

3.046

3.005 ± 0.040

6

50

3.703

3.641

3.504

3.616 ± 0.102

15


Dựng đồ thị biểu diễn và lập đƣờng chuẩn berberin bằng phần mềm
Excel 2010 [20], [27], kết quả đƣợc đồ thị nhƣ hình 2.2.

Hình 2.2. Đồ thị biểu diễn đƣờng chuẩn berberin
Phƣơng trình đƣờng chuẩn (I)
y = 0.0734x + 0.007 4 (R2 = 0.999)
Trong đó: x - nồng độ berberin (mg/ml);
y - giá trị OD tƣơng ứng;
R2: hệ số tƣơng quan.
2.2.5. Phương pháp xác định lượng thuốc được hấp thụ vào màng CVK
Cho màng CVK vào 100ml dung dịch berberin 10% (dung môi là etanol
96°). Sau khoảng thời gian 2 giờ, lấy màng CVK ra xác định lƣợng thuốc
đƣợc hấp thụ vào màng CVK.
Từ phƣơng trình đƣờng chuẩn (I), xác định đƣợc khối lƣợng thuốc hấp
thụ vào màng CVK theo công thức (01).
mhấp thụ = mtrƣớc - msau
Trong đó:
mtrƣớc: khối lƣợng thuốc trƣớc khi hấp thụ vào màng CVK (mg);

16

(01)