Phát hiện người lành mang gen bệnh và chẩn đoán trước làm tổ bệnh hemophilia A bằng kỹ thuật microsatellite DNA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BÙI THỊ MINH PHƯỢNG

PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH VÀ
CHẨN ĐOÁN TRƯỚC LÀM TỔ BỆNH HEMOPHILIA A
BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE DNA

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BÙI THỊ MINH PHƯỢNG

PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH VÀ
CHẨN ĐOÁN TRƯỚC LÀM TỔ BỆNH HEMOPHILIA A
BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE DNA
Chuyên ngành: Hóa sinh
Mã số: 62720112
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
1. GS.TS. Tạ Thành Văn
2. PGS.TS. Trần Vân Khánh

HÀ NỘI - 2019


LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Bùi Thị Minh Phượng, nghiên cứu sinh khóa 34, Trường Đại học
Y Hà Nội, chuyên ngành Hóa sinh, xin cam đoan:
1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn
của Thầy GS.TS. Tạ Thành Văn và Cô PGS.TS. Trần Vân Khánh.
2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã
được công bố tại Việt Nam.
3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác,
trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi
nghiên cứu.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này./.
Hà Nội, ngày tháng
năm 2018
NGƯỜI VIẾT CAM ĐOAN

Bùi Thị Minh Phượng


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
BMD

Becker Muscular Dystrophy

BVSKTE

Bảo vệ sức khoẻ trẻ em

CK

Creatine Kinase

DMD

Duchenne Muscular Dystrophy

DNA

Deoxyribo Nucleic Acid

FISH

Fluorescent In Situ Hybridization

ICSI

Intracytoplasmic Sperm Injection

IVF

In Vitro Fertilization

KB

Kilo Base

MLPA

Multiplex Ligation Probe Amplification

NST X

Nhiễm sắc thể X

NST Y

Nhiễm sắc thể Y

PCR

Polymerase Chain Reaction

PGD

Preimplantation Genetic Diagnosis

RNA

Ribo Nucleic Acid

RT – RCR

Reverse Transcription PCR

STR

Short Tandem Repeat


MỤC LỤC
CÁC DANH MỤC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC BẢNG


DANH MỤC HÌNH


8

ĐẶT VẤN ĐỀ
Cùng với sự phát triển của nền kinh tế xã hội, tỷ lệ vô sinh ngày càng gia
tăng và là nỗi lo cho nhiều cặp vợ chồng. Ra đời vào những năm 1970 của thế
kỷ trước, có thể nói phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm “in vitro
fertilization - IVF” đã trở thành cứu cánh cho nhiều cặp vợ chồng vô sinh
mong muốn có đứa con [1]. Vào năm 2010 bác sỹ Robert G.Edwards đã vinh
dự trao giải thưởng Nobel về sinh lý và Y khoa cho những cống hiến to lớn và
hiệu quả mà phương pháp này mang lại [2]. Phương pháp này đã mang lại

niềm vui, niềm hạnh phúc cho bao cặp vợ chồng khắp nơi trên thế giới, tuy
nhiên không phải cặp vợ chồng nào cũng may mắn sinh được những đứa con
mong muốn bằng phương pháp này. Tỷ lệ thành công của phương pháp này chỉ
đạt hơn 35% tùy theo từng quốc gia [3]. Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự
thành công của phương pháp này như: tuổi bố mẹ, tình trạng sức khỏe, tinh
thần tâm lý, chất lượng tinh trùng và trứng… và đặc biệt chất lượng phôi sau
khi thụ tinh. Các phôi có thể bất thường nhiễm sắc thể (NST) thường hay NST
giới tính đều làm giảm khả năng mang thai sau khi cấy phôi vào buồng tử cung,
có thể gây sảy thai hoặc sinh ra những đứa con không khỏe mạnh [4], [5], [6],
[7]. Để làm giảm tỷ lệ sinh ra những đứa con không khỏe mạnh và làm tăng tỷ
lệ thành công của phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm, thời gian gần đây
các nhà khoa học đã áp dụng quy trình sàng lọc phôi “Pre-Implantion Genetic
Diagnosis, PGD” còn gọi là “chẩn đoán di truyền trước làm tổ” nhằm có được
những phôi tốt nhất cho quá trình chuyển phôi [8],[9],[10].


9

Cùng với sự phát triển của kỹ thuật chọc hút phôi và ứng dụng những
tiến bộ mới nhất của sinh học phân tử vào chẩn đoán, cho đến nay có rất
nhiều bệnh lý di truyền và hầu hết các bất thường trên NST, cả các đột biến
gen quan trọng gây ung thư đều có thể được sàng lọc bằng kỹ thuật PGD [11],
[12],[13],[14-15]. Trong số đó, bệnh hemophilia A (bệnh ưa chảy máu) là loại
bệnh có tỷ lệ mắc cao, bệnh cảnh lâm sàng nặng nề và thường gây ra những
sang chấn lớn về tâm lý cho gia đình và cho người bệnh. Vì vậy vấn đề đặt ra
là chúng ta phải làm sao giúp cho các cặp vợ chồng mang gen bệnh
hemophilia A sinh được những đứa con hoàn toàn khỏe mạnh.
Hemophilia A là bệnh di truyền do thiếu hụt hoặc bất thường chức năng
của các yếu tố đông máu VIII [16],[17]. Hemophilia A là bệnh di truyền alen
lặn trên NST X không có alen trên NST Y, nên người mẹ mang gen bệnh sẽ di

truyền cho con trai và biểu hiện bệnh trên lâm sàng [18]. Theo thống kê của tổ
chức hemophilia A thế giới, hiện nay có khoảng 250.000 bệnh nhân mắc bệnh
hemophilia A và chỉ có khoảng 50.000 được điều trị đặc hiệu [19]. Tại Việt
Nam, ước tính có khoảng 6000 người bị bệnh hemophilia A và khoảng 30.000
người mang gen bệnh hemophilia A [20]. Biểu hiện lâm sàng chủ yếu là chảy
máu ở bất kỳ nơi nào trên cơ thể, và chảy máu kéo dài: chảy máu khớp, chảy
máu trong cơ, chảy máu não, chảy máu trong cổ và ngực… Mức độ biểu hiện
trên lâm sàng liên quan trực tiếp nồng độ yếu tố VIII trong huyết tương.


10

Việc tầm soát trước sinh bệnh hemophilia A là việc làm hết sức quan
trọng giúp cho việc sinh ra những đứa trẻ hoàn toàn khỏe mạnh. Việc xác định
đột biến gen gây bệnh, sàng lọc người lành mang gen bệnh và chẩn đoán
trước sinh bệnh hemophilia A đã được nghiên cứu khá nhiều ở Việt Nam.Việc
quản lý bệnh nhân và người mang gen của bệnh lý này là tiền đề vững chắc để
triển khai thành công quy trình chẩn đoán trước làm tổ trong sàng lọc phôi.
Phương pháp này sẽ giúp giảm biến chứng và di chứng cho người mẹ khi
mang thai bệnh lý, giảm chấm dứt thai kỳ do phát hiện bệnh ở thai nhi khi
chẩn đoán tiền sản, mang lại niềm vui hạnh phúc cho các cặp vợ chồng mang
gen bệnh, đồng thời giảm tỷ lệ mắc bệnh ở cộng đồng. Cùng với sự phát triển
của sinh học phân tử phát hiện các đột biến gây bệnh hemophilia A, kỹ thuật
microsatellite DNA là kỹ thuật sử dụng các primer gắn huỳnh quang để
khuếch đại vùng trình tự lặp lại ngắn (short tandem repeat-STR) và phân tích
kích thước của chúng thông qua điện di mao quản trên máy giải trình tự gen
để xác định các alen đột biến. Kỹ thuật này có nhiều ưu điểm là dễ dàng phát
hiện alen đột biến mà không cần xác định các đột biến trực tiếp, vì vậy sẽ
giảm được chi phí cho gia đình bệnh nhân. Hiện nay kỹ thuật này còn khá
mới mẻ ở Việt Nam ứng dụng trong chẩn đoán các bệnh lý di truyền. Xuất

phát từ thực tế đó đề tài: “Phát hiện người lành mang gen bệnh và chẩn
đoán trước làm tổ bệnh hemophilia A bằng kỹ thuật microsatellite DNA”
được đưa vào nghiên cứu với mục tiêu:
1. Xác định người lành mang gen bệnh hemophilia A bằng kỹ thuật
microsatellite DNA.
2. Chẩn đoán trước làm tổ cho những người mẹ mang gen bệnh
hemophilia A bằng kỹ thuật microsatellite DNA.


11


12

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG BỆNH HEMOPHILIA A
1.1.1. Định nghĩa
Bệnh hemophilia A là một bệnh di truyền do thiếu hụt hoặc bất thường
chức năng của các yếu tố đông máu trong huyết tương - thiếu hụt yếu tố VIII
gây bệnh hemophilia A, thiếu hụt yếu tố IX gây bệnh hemophilia B, thiếu hụt
yếu tố XI gây bệnh hemophilia C. Bệnh hemophilia A là bệnh rối loạn đông
máu di truyền hay gặp nhất [21-22].
1.1.2. Lịch sử nghiên cứu
Sự di truyền của bệnh máu khó đông liên kết với giới tính được phát
hiện từ những năm 80 của thế kỷ 19. Vào thời điểm này, các nhà khoa học
nhận thấy chỉ có nam giới mắc bệnh và không có khả năng truyền bệnh cho
con trai nhưng truyền gen bệnh cho con gái và người con gái này có thể
truyền gen bệnh cho con trai mình. Bệnh hemophilia A còn được biết đến như
căn bệnh của Hoàng Gia vì nữ hoàng Anh Victoria 1838-1901 mang gen bệnh

này và truyền nó cho nhiều thế hệ sau.
1.1.3. Dịch tễ bệnh học
Theo thống kê của tổ chức hemophilia thế giới (WFH), hiện nay có
khoảng 500.000 bệnh nhân mắc bệnh hemophilia và chỉ có khoảng 1/3 được
chẩn đoán [23]. Tỷ lệ mắc bệnh hemophilia A gần giống nhau ở các vùng địa
lý, các nước, các chủng tộc, tần suất mắc bệnh chung khoảng 30-100/1.000.000
dân.Tần suất mắc bệnh hemophilia A là 1/4000 ÷ 1/5.000 trẻ trai [24]. Tại
Việt Nam, theo những thống kê không đầy đủ hiện tại có khoảng 6000 bệnh
nhân hemophilia. Số liệu điều tra những năm 1994 ÷ 1996 về tình hình bệnh
hemophilia ở miền Bắc Việt Nam cho thấy tỷ lệ bệnh hemophilia là


13

25 ÷ 60/1.000.000 dân. Tại mít tinh hưởng ứng ngày hemophilia thế giới (174-2016), hội rối loạn đông máu Việt Nam và Viện Huyết học - Truyền máu
Trung ương đã công bố có 6000 người bị bệnh chảy máu di truyền [25].
1.1.4. Đặc điểm lâm sàng và chẩn đoán bệnh hemophilia A
1.1.4.1. Đặc điểm chảy máu trong bệnh hemophilia A
Bệnh đặc trưng bởi thời gian đông máu kéo dài và tăng nguy cơ chảy
máu. Biểu hiện lâm sàng chủ yếu là xuất huyết. Xuất huyết có thể tự nhiên
hoặc sau chấn thương nhẹ. Đặc điểm xuất huyết là các đám bầm máu dưới da,
tụ máu trong cơ, chảy máu ở các khớp.
Chảy máu khớp thường gặp nhất ở bệnh nhân hemophilia A. Đây là loại
chảy máu nguy hiểm vì khi tái phát nhiều lần gây ra viêm khớp, biến dạng khớp
[26]. Chảy máu khớp có thể xuất hiện tự nhiên hoặc sau chấn thương. Nếu điều
trị muộn sau 4 giờ thì cảm giác đau có thể tăng lên, khớp sẽ sưng và việc điều trị
bị kéo dài tới vài ngày. Trẻ lớn có thể nhận biết được chảy máu khớp trước khi
đau và sưng xảy ra với cảm giác gai châm hoặc kiến bò trong khớp. Điều trị sớm
sẽ dự phòng được tình trạng đau mạn tính và biến dạng khớp.

Hình 1.1. Hình ảnh chảy máu khớp gối ở bệnh nhân hemophilia A
(Nguồn: )
Chảy máu trong cơ bao gồm 10-25% các trường hợp xuất huyết nặng
trong hemoglobin. Huyết khối cơ được coi là nguyên nhân chính gây ra tình
trạng khuyết tật trong chứng chảy máu. Chảy máu trong cơ cũng thường gặp


14

và xuất hiện tự nhiên hoặc sau chấn thương. Những cơ hay bị chảy máu là:
cơ cẳng chân, cơ đùi, cơ cánh tay. Chảy máu cơ gây ra sưng đau trong vài
ngày. Một dấu hiệu quan trọng và kín đáo trong chảy máu cơ là cảm giác
đau, nóng, ngứa ran hoặc tê bì. Nếu không được điều trị sớm cơ sẽ bị phá
huỷ và có thể gây liệt [23].

Hình 1.2. Hình ảnh chảy máu trong cơ ở bệnh nhân hemophilia A
(Nguồn: )
Ngoài ra bệnh nhân có thể bị chảy máu não, chảy máu ở các vị trí khác
nhưng hiếm gặp xuất huyết dưới da. Chảy máu từ vết cắt sâu hoặc xước da có
thể kéo dài và hồi phục sau vài ngày mà không cần điều trị. Chảy máu miệng,
lợi và mũi cũng hay gặp. Có thể xuất huyết tiêu hoá và đái máu.
1.1.4.2. Các xét nghiệm cận lâm sàng để chẩn đoán bệnh
Những thay đổi về huyết học ở bệnh nhân hemophilia A:
- Thời gian máu chảy kéo dài, thời gian đông máu kéo dài có thể hơn 1
giờ; chất lượng cục máu đông kém; thời gian Howell kéo dài…
+ Hoạt tính yếu tố VIII huyết tương giảm hoặc không có.
+ Yếu tố Von - Willebrand trong máu bình thường.
+ Số lượng tiểu cầu trong máu bình thường.

15

1.1.4.3. Chẩn đoán bệnh
Chẩn đoán xác định [21]
- Dựa vào lâm sàng: Có vết bầm tím, tụ máu, chảy máu.
- Dựa vào tiền sử gia đình
- Dựa vào xét nghiệm máu:
+ Số lượng tiểu cầu bình thường, PT (Prothrombin Time: thời gian
prothrombin) bình thường, fibrinogen bình thường, APTT (Activated Partial
Thromboplastin Time: thời gian thromboplastin một phần hoạt hóa) kéo dài
> 1,5 giá trị bình thường.
+ Hoạt tính yếu tố VIII huyết tương giảm dưới 40%.
+ Yếu tố Von Willebrand bình thường
+ Các xét nghiệm khác: Mixtest xác định kháng thể kháng yếu tố VIII.
Chẩn đoán mức độ bệnh
Nồng độ yếu tố VIII
Mức độ

(%) (hoạt tính

Biểu hiện chảy máu

(UI/ml))
Nặng
(Chiếm 70%)

Trung bình
(Chiếm 15%)
Nhẹ
(Chiếm 15%)

Chảy máu tự nhiên không liên
<1% (<0,01)

quan đến chấn thương, thường
chảy máu ở khớp và cơ.
Chảy máu tự nhiên hoặc liên

1-5% (0,01-0,05)

> 5-40% (0,04-0,4)

quan đến chấn thương nhỏ.
Chảy máu nặng sau chấn
thương, phẫu thuật.
Chảy máu sau chấn thương
lớn hoặc phẫu thuật.

1.2. ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ CƠ SỞ PHÂN TỬ HEMOPHILIA A
1.2.1. Cơ chế di truyền bệnh hemophilia A


16

Đây là một bệnh di truyền liên kết với giới tính: Ở nam chỉ có một NST
giới tính X nên nếu NST giới tính X mang gen bệnh thì lượng yếu tố VIII tạo
ra không đủ và người đó bị bệnh hemophilia A [27]. Đối với nữ giới nhờ có
hai NST giới tính X nên nếu một NST giới tính X mang gen bệnh thì gen bình
thường trên NST còn lại vẫn tổng hợp yếu tố VIII bình thường. Người phụ nữ
không bị bệnh nhưng mang một gen bị bệnh sẽ truyền cho con trai và người

con trai sẽ bị bệnh, nếu truyền cho con gái thì người con gái sẽ trở thành
người mang gen bệnh.

Hình 1.3. Kiểu gen và kiểu hình của bố mẹ và thế hệ sau
1/ Bố bị bệnh, mẹ bình thường: 100% con gái là người mang gen bệnh
(XHXh) và 100% con trai bình thường (XHY).
2/ Mẹ mang gen bệnh, bố bình thường: trong một gia đình có bố bình
thường (XHY), mẹ mang gen bệnh (XHXh) (người truyền bệnh) thì 50% số con
gái sẽ là người mang gen bệnh (XHXh), 50% con gái bình thường (XX), 50%
con trai bị bệnh (XhY) và 50% con trai bình thường (XHY).
3/ Bố bị bệnh, mẹ mang gen bệnh: 50% con gái bị bệnh (X hXh) đồng
hợp tử, 50% con gái mang gen bệnh (XHXh), 50% con trai bị bệnh và 50% con
trai bình thường (XHY). Như vậy nữ mắc bệnh khi mang đồng hợp tử gen


17

bệnh (cả 2 thể nhiễm sắc X bị thương tổn: XhXh), nữ mang gen bệnh khi mang
dị hợp tử gen bệnh (một thể nhiễm sắc X bị thương tổn: XHXh).
4/ Do đột biến mới phát sinh trong quá trình tạo giao tử từ người bố hoặc
từ người mẹ: thường chiếm khoảng 1/3 các trường hợp hemophilia A. Tỉ lệ đột
biến gây bệnh hemophilia xẩy ra là 3 x 106 trên gen và trên một giao tử trong
một thế hệ [31]. Tỷ lệ đột biến mới xảy ra ở tế bào mầm sinh dục của nam cao
hơn 5 lần so với ở tế bào mầm sinh dục của nữ. Gần đây, người ta đã chứng
minh rằng tần suất đột biến theo giới tùy thuộc vào loại đột biến. Đột biến đảo
đoạn intron 22 ở tế bào mầm sinh dục nam nhiều hơn 15 lần so với ở tế bào
mầm sinh dục nữ. Hiện tượng này giải thích cho sự vắng mặt nhiễm sắc thể
thứ hai tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình đảo đoạn trong giai đoạn phân
bào giảm nhiễm ở nam.
1.2.2. Cơ sở phân tử học bệnh hemophilia A

Từ năm 1984, nghiên cứu của Vehar và cộng sự đã cho thấy những hiểu
biết đầy đủ về cấu trúc phân tử gen F8 tổng hợp protein FVIII, mở đường cho
các nghiên cứu về cơ chế phân tử bệnh hemophilia A và các dạng đột biến gen
F8 gây bệnh.
Trong con đường đông máu nội sinh, yếu tố VIII đóng vai trò là đồng
yếu tố với yếu tố IX hoạt hóa (IXa) với sự có mặt của Ca 2+ và phospholipid
tiểu cầu hoạt hóa yếu tố X thành Xa, từ đó tác động nên sự hình thành
thrombin từ prothrombin, giúp cho quá trình tạo và cố định fibrin từ
fibrinogen, hoàn thiện quá trình tạo cục máu đông cùng với tiểu cầu và yếu tố
thành mạch. Việc thiếu hụt hoặc bất thường chức năng yếu tố VIII làm ngừng
trệ dòng thác đông máu theo con đường nội sinh, dẫn đến tình trạng chảy máu
kéo dài, không cầm ở bệnh nhân hemophilia A.


18

Hình 1.4. Vai trò của yếu tố VIII trong quá trình đông máu huyết tương
1.2.2.1. Vị trí và cấu trúc của gen mã hóa yếu tố VIII
Gen quy định tổng hợp yếu tố VIII nằm ở vị trí Xq28 trên NST giới tính
X, là một trong những gen lớn nhất của người, có kích thước 186 Kb gồm 26
exon, trong đó 24 exon có kích thước từ 62bp đến 262bp và 2 exon lớn nhất là
exon 14 (3106 bp) và exon 26 (1958 bp), mã hóa 9 Kb mRNA. Người đột biến
gen F8 gây thiếu hoặc không tổng hợp được yếu tố VIII, làm rối loạn quá trình
đông máu biểu hiện thành triệu chứng lâm sàng của bệnh hemophilia A [28].

Hình 1.5. Vị trí của gen mã hóa yếu tố VIII trên NST X
(Nguồn: www.hemophilia.com)


19

Gen mã hóa yếu tố VIII có chuỗi nặng với đầu cuối là N, gồm các
domain A1-A2-B, chuỗi nhẹ có đầu cuối là C, gồm các domain A 3-C1-C2 và
vùng B. Khi thủy phân hoàn toàn domain B tạo thành asparagin, serin và
threonin. Vùng B không cần cho chức năng của yếu tố VIII và sau quá trình
dịch mã, domain B bị cắt khỏi chuỗi nặng của yếu tố VIII.
1.2.2.2. Protein yếu tố VIII

Hình 1.6. Cấu trúc gen và protein FVIII [29]
Bản chất yếu tố VIII là polypeptid có cấu trúc A1-A2-B-A3-Cl-C2,
gồm hai chuỗi: chuỗi nặng là đoạn A1-A2-B có kích thước 200 kD, chuỗi nhẹ
là đoạn A3-C1-C2 có kích thước 80 kD. Cấu trúc của phức hợp này được giữ
ổn định nhờ sự tương tác giữa các liên kết ưa nước và kỵ nước với yếu tố von
Willebrand (vWF - là một kháng nguyên liên quan đến yếu tố VIII) và Ca 2+.
Chuỗi nặng có đầu cuối là N, gồm các vùng A 1-A2-B, chuỗi nhẹ có đầu cuối là


20

C, gồm các vùng A3-C1-C2. Vùng B được mã hóa bởi một exon lớn và không
có sự tương đồng với bất kỳ gen nào đã biết. Khi thủy phân hoàn toàn domain
B tạo thành asparagin, serin và threonin. Vùng B không cần cho chức năng
của yếu tố VIII và sau quá trình dịch mã, domain B bị cắt khỏi chuỗi nặng của
yếu tố VIII.

Hình 1.7. Protein yếu tố VIII với các vùng chức năng
(Nguồn w.w.w. nature.com/revieus/genetics)
Vùng A (A1, A2, A3) là nơi bám của các ion Ca2+, Cu2+ và các yếu tố IX, X
trong quá trình đông máu. Vùng C (C1, C2) là vị trí bám cho yếu tố vWF, X
và của các phân tử phospholipid một khi FVIII được hoạt hóa. Vùng B chứa

vị trí cắt của thrombin đã được loại bỏ trong phân tử FVIII trong quá trình
hoạt hóa FVIII
1.2.2.3. Các dạng đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A
Có nhiều dạng đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A. Nghiên cứu
của Oldenburg và cộng sự đã chỉ ra rằng các dạng đột biến điểm (thay thế
nucleotid gây đột biến sai nghĩa hoặc vô nghĩa) chiếm tỷ lệ cao nhất (47,5%)
tiếp đến là dạng đột biến đảo đoạn gồm đảo đoạn intron 1 và intron 22
(36,7%), còn lại là đột biến xóa đoạn gen chiếm khoảng 10 – 15%. Tùy
thuộc vào kiểu và vị trí đột biến trên gen F8 mà gây ra các thể bệnh nặng
nhẹ khác nhau nhau [16].


21

Đột biến điểm
Đột biến điểm gen F8 khi có sự thay đổi nucleotid trên gen. Nghiên
cứu của Shima và cộng sự chỉ ra rằng đột biến thay thế Arginin thành
Histidin tại vị trí 372 gây biến đổi vị trí cắt của thrombin và làm quá trình
hoạt hóa yếu tố VIII bị rối loạn, hoạt tính yếu tố VIII giảm mạnh còn 3 ÷ 5%
[30]. Năm 2000, Jacquemin và cộng sự đã chứng minh đột biến thay thế
Serin thành Tyrosin tại vị trí 2119 (vùng C 2) làm giảm đột ngột khả năng
tương tác giữa yếu tố VIII và yếu tố vWF, dạng đột biến này thường gặp ở
thể nhẹ và trung bình [31].
Theo thống kê, khoảng gần 60% các đột biến điểm ảnh hưởng tới acid
amin arginin, phần lớn các bệnh nhân mang đột biến này đều ở thể nặng [16-19].
Đột biến đảo đoạn
Mặc dù không có vai trò trong việc mã hóa hay tham gia vào quá trình
hoạt hóa yếu tố VIII nhưng các vùng intron của gen F8 lại là tác nhân chính gây
ra các dạng đột biến đảo đoạn ở bệnh nhân hemophilia A thể nặng [32].
Dạng đột biến đảo đoạn phổ biến nhất là đảo đoạn intron 22, chiếm hơn

50% các thể bệnh nặng. Cách gen F8 một đoạn 500kb về phía đầu mút
telomere, nhiễm sắc thể X tồn tại hai vùng int22h2 và int22h3 có trình tự
tương đồng đến 99,9% với một đoạn thuộc intron 22 gen F8 (vùng int22h1).
Quá trình tái tổ hợp tương đồng giữa vùng int22h1 và một trong hai vùng
int22h2 và int22h3 chia cắt gen F8 thành 2 đoạn (exon 1-22 và exon 23-26)
cách nhau 400kb gây bất hoạt hoàn toàn gen mã hóa yếu tố VIII [32].
Đột biến mất đoạn và thêm đoạn của gen yếu tố VIII
Đột biến mất đoạn lớn chiếm 2-5% bệnh nhân hemophilia A thể nặng.
Có thể mất 1 exon hoặc mất toàn bộ gen. Cơ chế phân tử của dạng đột biến
này đã được kết luận là do quá trình tái tổ hợp dẫn đến hiện tượng lặp lại Alu
[17]. Đột biến chèn đoạn lớn và hiện tượng Alu làm đứt gãy gen F8 và gây


22

bệnh hemophilia A thể nặng. Xóa đoạn và thêm đoạn nhỏ cũng thường thấy
trong hemophilia A thể nặng, trong đó thay đổi 1-55 nucleotid. Phổ biến nhất
là xóa hoặc thêm nucleotid Adenin vào exon 14, thường xảy ra trong vùng từ
c.3637 đến c.4379 [33].
1.3. NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH HEMOPHILIA A
Hemophilia A là bệnh rối loạn di truyền do gen lặn nằm trên nhiễm sắc
thể giới tính X, gây nên do đột biến yếu tố VIII. Việc chẩn đoán người lành
mang gen bệnh là rất quan trọng để ngằn ngừa sự ra đời của những đứa trẻ bị
bệnh hemophilia A [34].
1.3.1. Đặc điểm chung người mang gen bệnh
Người lành mang gen bệnh là người mang một nhiễm sắc thể X có đột
biến gen F8 và một nhiễm sắc thể X bình thường. Biểu hiện lâm sàng có thể
nặng hoặc nhẹ.
Người lành mang gen bệnh có triệu chứng như một người bị hemophilia A
thể nhẹ. Những người mang gen bệnh hemophilia A có hoạt tính yếu tố VIII

huyết tương thấp hơn bình thường, tuy nhiên cũng có những người mang gen
bệnh có hoạt tính yếu tố VIII rất thấp dưới 4% gây chảy máu như thể nặng.
Khoảng 20% người lành mang gen bệnh biểu hiện triệu chứng chảy máu với
các mức độ khác nhau, bao gồm cả những người có hoạt tính yếu tố VIII
huyết tương trong giới hạn bình thường (40 đến 60%) [35].
1.3.2. Cơ chế di truyền của người mang gen bệnh hemophilia A
Nếu người mẹ mang gen bệnh kết hôn với một người bố bình thường
thì xác suất mỗi lần sinh con của họ là: 25% con trai bình thường, 25% con
trai bị bệnh, 25% con gái bình thường, 25% con gái mang gen bệnh.


23

Hình 1.8. Sơ đồ di truyền của người mẹ mang gen kết hôn với bố bình thường
Nếu một người bố bị bệnh hemophilia A kết hôn với người mẹ bình
thường thì có khả năng sinh 100% con gái mang gen bệnh hemophilia A,
100% con trai bình thường.

Hình 1.9. Sơ đồ di truyền của người mẹ bình thường kết hôn với bố bị bệnh
Tất cả những người phụ nữ mang gen và những người có khả năng mang
gen bệnh đều cần làm xét nghiệm tình trạng mang gen.


24

1.3.3. Triệu chứng của người mang gen
- Chảy máu sản, phụ khoa:
+ Kinh nguyệt kéo dài (hơn bảy ngày), rong kinh là một trong những
triệu chứng phụ khoa phổ biến nhất. Có thể nặng nề với số lượng máu mất
trong khoảng thời gian dài. Theo thống kê, có đến 1/3 số phụ nữ bỏ lỡ đáng

kể thời gian học hoặc làm việc do rong kinh. Đó cũng có thể là nguyên nhân
của tình trạng thiếu sắt, thiếu máu và làm giảm chất lượng cuộc sống ở phụ nữ
mang gen bệnh. Chảy máu nặng trong kỳ kinh nguyệt đầu tiên của một người
lành mang gen bệnh có thể dẫn đến phải nhập viện [35].
+ Chảy máu bất thường âm đạo (băng huyết)
Băng huyết liên quan đến chảy máu bất thường xảy ra ngoài chu kỳ
kinh nguyệt bình thường. Chảy máu bất thường xảy ra đôi khi trong khoảng
thời gian giữa phần cuối của một chu kỳ kinh nguyệt với kỳ kinh bắt đầu tiếp
theo. Nếu chảy máu nặng nề cần nghỉ ngơi tại chỗ hoặc nhập viện để theo dõi.
+ Đau bụng kinh
Người mang gen bệnh hemophilia A có nhiều khả năng có đau bụng
giữa chu kỳ kinh nguyệt hơn những người không mang gen bệnh (đau bụng
do xuất huyết lúc rụng trứng).
+ U nang buồng trứng
Trong quá trình rụng trứng, một lượng nhỏ máu bị chảy có thể xảy ra
khi trứng được giải phóng khỏi nang (túi chứa đầy dịch, trong đó một quả
trứng phát triển). Chảy máu này có thể gây ra một loại u hình thành trên
buồng trứng, gọi là u nang thể vàng. Người mang gen bệnh hemophilia A có
nhiều khả năng bị chảy máu đáng kể và kéo dài lúc rụng trứng, gây ra đau
bụng vùng hạ vị. Hơn nữa, một u nang buồng trứng có nguy cơ bị vỡ vào kỳ
kinh nguyệt, gây ra chảy máu trong và đau đột ngột ở vùng bụng dưới, trường
hợp này gọi là u nang buồng trứng xuất huyết.


25

+ Chảy máu ổ bụng (hemoperitoneum)
Máu có thể chảy vào các mô xương chậu và dây chằng, đôi khi vào ổ
bụng và vùng chậu, gọi là chảy máu ổ bụng, là một cấp cứu ngoại khoa có thể
đe dọa đến tính mạng.

+ Chảy máu sau khi sinh:
Người mang gen bệnh hemophilia A có nguy cơ bị xuất huyết trong thai
kỳ. Tuy nhiên, trong thực tế, do ảnh hưởng của hormon làm tăng hoạt tính yếu
tố VIII trong huyết tương nên nguy cơ này giảm xuống.
- Các chảy máu khác:


Dễ bầm tím



Chảy máu kéo dài từ vết thương nhỏ



Chảy máu cam



Chảy máu kéo dài sau khi nhổ răng



Chảy máu nặng sau khi chấn thương hoặc phẫu thuật
Chảy máu khớp và cơ bắp không phải là triệu chứng hay gặp ở những
người mang bệnh hemophilia A trừ trường hợp hoạt tính yếu tố VIII huyết tương
rất thấp (dưới 4%). Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng nguy cơ chảy máu kéo dài
(nhiều hơn năm phút) từ vết thương nhỏ hoặc sau khi phẫu thuật ở người mang
gen bệnh hemophilia A có triệu chứng có thể cao gấp đôi so với những người
mang gen bệnh không biểu hiện triệu chứng trong cùng một gia đình.

1.3.4. Các phương pháp phát hiện người lành mang gen bệnh
Người phụ nữ mang gen bệnh ngoài việc sinh ra những đứa trẻ bị bệnh
và những đứa con mang gen bệnh, những đứa con mang gen bệnh này lại có
khả năng sinh ra những đứa con bị bệnh. Vì vậy, nếu không quản lý hay phát
hiện được những người phụ nữ mang gen bệnh thì thế hệ tiếp theo sẽ gia tăng
tỷ lệ những đứa con mang bệnh và mang gen bệnh. Vì vậy, việc xác định sớm
những người phụ nữ mang gen bệnh sẽ giúp cho họ có định hướng, chủ động
trong việc kết hôn và sinh ra những đứa con khỏe mạnh.