Nghiên cứu tìm kiếm các hoạt chất gây độc tế bào ung thư từ loài san hô mềm menella woodin ở vùng biển cô tô tt

viện HàN LÂM khoa học và công nghệ việt nam
Viện công nghệ sinh học

CHU NGC IP

NGHIấN CU TèM KIM CC HOT CHT
GY C T BO UNG TH T LOI SAN
Hễ MM MENELLA WOODIN VNG BIN
Cễ Tễ

Chuyờn ngnh: Húa sinh hc
Mó s: 9420116

Luận án tiến sĩ sinh học

H Ni, 2019


Công trình được hoàn thành tại:
Viện Hóa sinh biển, Viện Công nghệ sinh học,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương (PIBOC),
Liên Bang Nga
Người hướng dẫn khoa học:
1. TS. Nguyễn Hoài Nam
Viện Hóa sinh biển
2. PGS.TS. Đỗ Thị Thảo
Viện Công nghệ sinh học
Phản biện 1:

Phản biện 2:

Phản biện 3:
Luận án được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ phiên
chính thức tại: Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội.
Vào hồi ... giờ..., ngày ... tháng ... năm 2019
Có thể tìm hiểu luận án tại:
* Thư viện Quốc gia Việt Nam
* Viện Công nghệ sinh học


* Trang web của Bộ GDĐTDANH MỤC CÁC
CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN
LUẬN ÁN

1. Chau

Ngoc Diep, Ekaterina G. Lyakhova, Dmitrii V. Berdyshev, Anatoly I.

Kalinovsky, Vu Anh Tu, Nguyen Xuan Cuong , Nguyen Hoai Nam, Chau Van
Minh, Valentin A. Stonik. (2015). Structures and absolute stereochemistry of
guaiane sesquiterpenoids from the gorgonian Menella woodin. Tetrahedron
Letters 56: 7001-7004.

2. Vu A. Tu, Ekaterina G. Lyakhova, Chau N. Diep, Anatoly I. Kalinovsky, Pavel S.
Dmitrenok, Nguyen X. Cuong, Nguyen V. Thanh, Ekaterina S. Menchinskaya,
Evgeny A. Pislyagin, Nguyen H. Nam, Phan V. Kiem, Valentin A. Stonik, Chau V.
Minh (2015). Polyoxygenated steroids from the gorgonian Menella woodin with
capabilities to modulate ROS levels in macrophages at response to LPS. Steroids
104: 246–251.

3. Ekaterina

G. Lyakhova, Chau Ngoc Diep, Dmitrii V. Berdyshev, Sophia A.

Kolesnikova, Anatoly I. Kalinovsky, Pavel S. Dmitrenok, Vu Anh Tu, Nguyen
Xuan Cuong, Nguyen Van Thanh, Nguyen Hoai Nam, Phan Van Kiem, Valentin
A. Stonik and Chau Van Minh (2016). Guaiane Sesquiterpenoids from the
Gorgonian Menella woodin. Natural Product Communications 11(7): 913-916.


4
MỞ ĐẦU
Các hợp chất tự nhiên đã được chứng minh là một nguồn nguyên liệu vô cùng
tuyệt vời cho sự khám phá và phát triển các loại thuốc mới. Từ năm 1981 đến năm
2014, có tới 73% thuốc chống ung thư có mặt trên thị trường hiện nay có nguồn ngốc
thiên nhiên hoặc được tổng hợp theo mẫu hình cấu trúc của hợp chất tự nhiên. Từ năm
1940 đến 2014 đã có 246 loại thuốc chống ung thư đã được phê duyệt và trong số này
có 207 loại được thiết kế dựa trên những dạng có cấu trúc phân tử nhỏ, loại trừ các
thuốc có kích thước phân tử lớn và vacxin. Hơn nữa 77,3% (160 trong 207) những loại
thuốc chống ung thư này có nguồn gốc từ tự nhiên, cho thấy rằng các hợp chất tự nhiên
là nguồn nguyên liệu đóng góp chính cho nghiên cứu các loại thuốc chống ung thư.
Trong hơn 30 năm qua, các nghiên cứu về các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ sinh vật
biển đã được nghiên cứu rộng rãi, đã tìm ra rất nhiều hợp chất có cấu trúc và hoạt tính
sinh học tốt. Cho đến nay đã có rất nhiều thuốc mới điều trị ung thư có nguồn gốc sinh
vật biển đã được FDA Hoa Kỳ chứng nhận và bán trên thị trường do các hãng lớn trên
thế giới cung cấp như thuốc điều trị ung thư có tên thương mại như Prialt® (Ziconotide),
Halaven® (Eribulin mesylate), Yondelis® (Trabectedin). Việt Nam nằm trong khu vực
biển Thái Bình Dương, với bờ biển dài trên 3.260 km từ Bắc xuống Nam, đứng thứ 27
trong số 157 quốc gia ven biển, các quốc đảo và các lãnh thổ trên thế giới. Kết quả thống

kê đến nay đã thông báo có trên 12.000 loài động thực vật biển ở Việt Nam, trong đó có
rất nhiều loài có độc tố hoặc có hoạt tính sinh học tiềm năng. Do vậy, hướng nghiên cứu
các công nghệ chiết xuất, phân lập các hoạt chất theo định hướng hoạt tính sinh học từ
các nguồn dược liệu biển có trữ lượng lớn như rong biển, hải sâm, san hô mềm được
quan tâm đặc biệt.
Do vậy, chúng tôi quyết định lựa chọn đề tài trong khuôn khổ luận án Tiến sỹ:
“Nghiên cứu tìm kiếm các hoạt chất gây độc tế bào ung thư từ loài san hô mềm
Menella woodin ở vùng biển Cô Tô”
Mục tiêu nghiên cứu chính của đề tài luận án:

-

Đánh giá một số hoạt tính sinh học của dịch chiết tổng nhằm định hướng
cho các nghiên cứu tiếp theo.

-

Nghiên cứu tách chiết, xác định cấu trúc hóa học và hoạt tính gây độc tế bào
ung thư của một số hợp chất sạch phân lập được từ loài san hô mềm Menella
woodin thu thập ở vùng biển Cô Tô - Quảng Ninh.


5

Những đóng góp mới của luận án
Từ loài san hô mềm Menella woodin phân lập, xác định cấu trúc hóa học của
17 hợp chất (MW1-MW17) gồm có 08 hợp chất mới và 09 hợp chất đã, được chia
thành 2 lớp chất là sesquiterpenoid và steroid. Trong đó có 4 hợp chất steroid mới là
Menellsteroid E (MW1), Menellsteroid F (MW2), Menellsteroid G (MW3),
Menellsteroid H (MW4) và 4 hợp chất sesquiterpenoid mới là (1S,2R,8S,10R)-1,8epoxy-2-hydroxy-guaian-3,5,7-trien-12,8-olide

(MW8),
(1R,2S,8S,10R)-1,2
dihydroxy-8-methoxy-guaian-3,5,7-trien-12,8-olide (MW9), Menelloide F (MW10) và
Menelloide G (MW11).
Hợp chất MW1 có mức hoạt tính tốt nhất với giá trị IC 50 = 3,02 - 4,69 µg/ml
trên cả 7 dòng tế bào ung thư thử nghiệm. MW4 có mức hoạt động với giá trị IC 50 =
6,72 – 12,65 µg/ml và MW6 có giá trị IC50 = 8,05 – 14,40 µg/ml.
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
Phần tổng quan tài liệu tổng hợp các nghiên cứu trong nước và ngoài nước đề
cập đến các vấn đề sau
1.1. Đặc điểm chung về san hô mềm
1.2. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào
ung thư của giống Menella
1.2.1.

Tình hình nghiên cứu trên thế giới

1.2.2.

Tình hình nghiên cứu về một số loài san hô mềm ở Việt Nam

1.3. Giới thiệu về loài san hô mềm Menella woodin
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu
- Mẫu san hô mềm Menella woodin thu thập ở vùng biển thuộc quần đảo Cô Tô, tỉnh
Quảng Ninh vào tháng 04/2014
- Tổng số 17 chất sạch phân lập từ loài san hô mềm Menella woodin
- 07 dòng tế bào ung thư thử nghiệm HepG2 (ung thư gan), HL60 (ung thư máu), KB
(ung thư biêt mô), SKMel2 (ung thư da), LU-1 (ung thư phổi), MCF7 (ung thư vú),

LNCaP (ung thư tuyến tiền liệt) và 1 dòng tế bào lành (NIH/3T3) do GS.TS. J.M.
Pezzuto, Trường Đại học Long Island, Hoa kỳ và GS. Maier J, trường Đại học Milan, Ý
cung cấp


6
- Dòng tế bào RAW 264.7 thu được từ môi trường chọn lọc (Manassas, VA). Tế bào
được nuôi cấy trong môi trường DMEM bổ sung 10% huyết thanh nhau thai bò
(BioloT, St.Peterburg, Russia), gentamicin (50 µg/ml), ở 37°C với 5% CO 2 trong tủ
nuôi cấy (MCO-18AIC, Sanyo, Japan)
2.2.2. Hóa chất: Các hóa chất dùng cho nghiên cứu tách chiết các hợp chất thứ cấp và
đánh giá hoạt tính sinh học được mua của các hãng uy tín của Đức, Mỹ, Ấn Độ như
Sigma, GIBCO, Invitrogen v.v.
2.2.3. Thiết bị: Máy móc thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu phân lập hợp chất: Sắc
ký lớp mỏng (TLC), Sắc ký lớp mỏng điều chế, Sắc ký cột (CC). Hệ thống sắc ký lỏng
trung áp (MPLC), Hệ thống sắc ký lỏng điều chế (Preparative HPLC-Agilent 1100
series) - tại Viện Hóa sinh hữu cơ Thái Bình Dương (PIBOC), Liên Bang Nga. Hệ
thống sắc ký lỏng phân tích (HPLC-Agilent 1200 series) - tại Viện Hóa sinh biển, Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Hệ thống lấy mẫu tự động (Fraction
collector - DC1200), máy đo điểm nóng chảy (Kofler micro-hotstage), máy đo độ quay
cực [α]D (Perkin-Elmer 343 digital polarimeter), đo phổ hồng ngoại (Bruker Tensor 37
FT-IR infrared spectrophotometer), thiết bị đo phổ khối lượng (ESI-MS) (Agilent 1100
HPLCD Trap), máy đo phổ khối lượng phân giải cao (HRESIMS) (Agilent 6510 QTOF LC/MS mass spectrometer) - Viện Hóa sinh hữu cơ Thái Bình Dương (PIBOC),
Liên Bang Nga. Thiết bị đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Bruker AM500 FTNMR Spectrometer tại Viện Hóa học và Avance III 700 Bruker spectrometer của Viện
Hóa sinh hữu cơ Thái Bình Dương (PIBOC), Liên Bang Nga. Phổ CD (Jasco J-500A
spectropolarimeter). Cân phân tích, hệ thống máy đo sinh hóa tự động AU680 của
Beckman Coulter
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp xử lý mẫu, tạo dịch chiết
2.2.2. Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hoá học

2.2.3. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư thử nghiệm
2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính ức chế sản sinh ROS
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả thu mẫu, xử lý, tạo dịch chiết
Kết quả khảo sát tại cồn ngầm Bắc Hồng Vàn san hô mềm giống Menella phân
bố có độ phủ cao ở độ sâu 8-15 m nước và giống Dendronephthya ở dải đá ngầm Vàn
Chảy ở độ sâu 6-12 m nước (Hình 3.1)


7
Kết quả phân loại từ mẫu san hô mềm thu từ chuyến khảo sát tại Bắc Hồng Vàn
ở quần đảo Cô Tô đã xác định được 1 loài san hô mềm thuộc họ Plexauridae là loài
Menella woodin (Hình 3.2).

Hình 3.1. Sơ đồ phân bố san hô mềm theo độ sâu tại cồn ngầm Bắc Hồng
Vàn và dải đá ngầm Vàn Chảy ở vùng biển Cô Tô
(Nguồn: Đậu Văn Thảo, 2014)
- Tập đoàn: Tập đoàn dạng cây, phân
nhánh, nhiều nốt sần sùi, có màu đỏ
thẫm. Nhánh thường ngắn. Đường
kính thân từ 2-5 mm, nhánh từ 1-3
mm. . Có màu đỏ tươi, tua không màu.
Ảnh mẫu lưu
- Polip: đơn polip, phân bố khắp thân
và các nhánh

- Vi xương: Vi xương ở lớp bề mặt
thân và nhánh có nhiều dạng không
đều, dạng hình chùy có chiều dài 0,01
- 0,05 mm

Ảnh vi xương
Hình 3.2. Mô tả loài Menella woodin
(Nguồn: Grasshoff M, 1999; Đậu Văn Thảo, 2014)
Xử lý mẫu: mẫu tươi san hô mềm Menella woodrin (5kg tươi) đã được thu
thập ở vùng biển thuộc quần đảo Cô Tô, tiến hành xử lý mẫu tươi, được làm khô, tạo


8
bột mịn và loại cơ bản thành phần muối vô cơ. Lấy 100 g bột khô của 2 mẫu san hô
mềm tiến hành tạo dịch chiết phục vụ sàng lọc hoạt tính sinh học
3.2. Kết quả sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào mẫu dịch chiết thô
Bảng 3.1. Kết quả xác định giá trị IC50 mẫu MW
Giá trị IC50
Dòng tế
bào

MW

Ellipticin
e

SKLU-

HepG

1
15,5

2

5
±
2,53
0,45

MCF

LNCa

KB
14,1

7

P

12,50

8

13,15

±

±

±

1,59

0,52

1,62
0,47

1.85
0,42

SKMel

NIH/3T

HL60

2

3

17,42

10,03

11,31

16,11

±

±

±

±

2,06
0,38

1,95
0,46

1,65
0,39

2,06
0,38

±

±

±

±

±

±

±

±

0,02

0,08

0,09

0,02

0,07

0,03

0,05

0,02

Từ kết quả trên, có thể nhận thấy rằng mẫu san hô mềm Menella woodrin có
hoạt tính diệt tế bào ung thư thử nghiệm ở các nồng độ khác nhau ở mức khá. Mẫu cặn
chiết MeOH của MW đã ức chế được hơn 50% sự phát triển của các dòng tế bào ung
thư thử nghiệm và tiếp tục xác định giá trị IC 50 của mẫu dịch chiết, kết quả cho thấy
mẫu MW có hoạt tính ở mức tương đối tốt với giá trị IC 50 = 10,03 - 17,42 µg/ml (Bảng
3.1). Do vậy, mẫu dịch chiết được sử dụng để phân lập, tìm kiếm hoạt chất tiềm năng.
3.3. Kết quả phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ loài san hô
mềm Menella woodin
Bằng cách kết hơp các phương pháp sắc ký kết hợp, chúng tôi đã phân lập và xác định
cấu trúc được 17 hợp chất từ loài san hô mềm Menella woodin chia thành 2 lớp chất là
steroid và sesquiterpenoid bao gồm:
- 07 Steroid (MW1, MW2, MW3, MW4, MW5, MW6, MW7)

- 10 Sesquiterpenoid (MW8, MW9, MW10, MW11, MW12, MW13, MW14, MW15,
MW16, MW17)
Trong đó có 8 chất mới: MW1, MW2, MW3, MW4, MW8, MW9, MW10, MW11
(Hình 3.3)


9

MW1 (chất mới)

MW8 (chất mới)

MW7
MW2, MW3, MW4
(chất mới)

MW9 (chất mới)

MW13

MW14

MW12

MW10 (chất mới)

MW11 (chất mới)

MW15

MW16
MW17
Hình 3.3. Cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được từ loài Menella woodin
3.4. Thông số vật lý của các hợp chất phân lập được
3.4.1. Hợp chất MW1 (Menellsteroid E): 1β,3β,5α,11β-Tetrahydroxycholestan-6-one
(chất mới)
Chất bột màu trắng, [α]D27 -4,0 (c 0,10, MeOH); (+) ESI-MS m/z: 473 [M+Na]+,
455 [M+Na-H2O]+, 437 [M+Na-2H2O]+, 413, 397, 374, 301, 149; phổ khối lượng phân
giải cao HR-ESI-MS m/z 473.3237 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức
C22H46O5Na: m/z 473,3232). CTPT: C27H46O5, M = 450
3.4.2. Hợp chất MW2 (Menellsteroid F): Cholest-24-ene-3β,5α,6β,11β-tetraol (chất
mới)
Chất bột màu trắng, [α]D27 +12,0 (c 0,05, MeOH); (+) ESI-MS m/z: 457
[M+Na]+, 413, 399, 381, 363, 301, 261, 219; phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS
m/z 457,3299 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C 27H46O4Na: 457,3288).
CTPT: C27H46O4, M = 434.


10
3.4.3. Hợp chất MW3 (Menellsteroid G): 24-methylcholest-24(28)-ene-3β,5α,6β,11βtetraol (chất mới)
Chất bột màu trắng, [α]D27 +4,0 (c 0,15, MeOH); (+) ESI-MS m/z: 471 [M+Na]
+

, 457, 441, 408, 360, 338, 301, 250; phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS m/z:

471,3450 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C 28H48O4Na, 471,3450); CTPT:
C28H48O4, M = 448.
3.4.4. Hợp chất MW4 (Menellsteroid H): 24-Norcholest-22(E)-ene-3β,5α,6β,11βtetraol (chất mới)
Chất bột màu trắng, [α]D27 +5,8 (c 0,12, MeOH); phổ khối lượng phân giải cao
HR-ESI-MS m/z: 443,3124 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C26H44O4Cl

443,3137). CTPT: C26H44O4, M = 420.
3.4.5. Hợp chất MW5: cholest-3β,5α,6β,11β-tetraol
Chất bột màu trắng, [α]D27 -11,3 (c 0,35, MeOH); phổ khối lượng phân giải cao
HR-ESI-MS m/z: 435,3319 [M-H]- (tính toán lý thuyết cho công thức C 27H47O4
435,3317); CTPT: C27H48O4, M = 436.
3.4.6. Hợp chất MW6: Menellsteroid B
Chất bột màu trắng, [α]D27 -18,5 (c 0,12, MeOH); ESI-MS m/z: 459 [M+Na]+,
phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS m/z: 437,3552 [M+H] + (tính toán lý thuyết
cho công thức C27H49O4: 437,3553); CTPT: C27H46O4, M = 434.
3.4.7. Hợp chất MW7: (22E,24S)-24-methyl-5α-cholesta-7,22-diene-3β,5,6β,9-tetraol
Chất bột màu trắng, CTPT: C28H46O4, M = 446.
3.4.8. Hợp chất MW8: (1S,2R,8S,10R)-1,8-epoxy-2-hydroxy-guaian-3,5,7-trien-12,8olide (chất mới)
Chất dầu không màu, [α]D26 +217,3 (c 0,15, CHCl3); phổ khối lượng phân giải
cao HR-ESI-MS tại m/z 283,0938 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức
C15H16O4Na+: 283,0941) CTPT: C15H16O4, M = 260.
3.4.9. Hợp chất MW9: (1R,2S,8S,10R)-1,2-dihydroxy-8-methoxy-guaian-3,5,7-trien12,8-olide (chất mới)
Chất dầu không màu, [α]D26 +217,3 (c 0,15, CHCl3); phổ khối lượng phân giải
cao HR-ESI-MS tại 315,1202 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C 16H20O5Na+:
315,1205); CTPT: C16H20O5, M = 292.
3.4.10. Hợp chất MW10: Menelloide F (chất mới)
Chất dầu không màu, [α]D26 +76,0 (c 0,10, CD3OD); UV (MeOH) λmax (log
ε) 221 (3,60) nm; CD (c 2,3 × 10-3 M, MeOH): λmax ([θ]): 204 (+17086), 226 (−12304)


11
và 249 (+12087) nm. Phổ khối lượng phân giải cao (+)-HR-ESI-MS m/z 285,1098
[M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C 15H18O4Na+: 285,1097) và (−)-HR-ESIMS m/z 297,0911 [M+Cl]- (tính toán lý thuyết cho công thức C15H18O4Cl: 297,0899).
3.4.11. Hợp chất MW11: Menelloide G (chất mới)
Chất dạng bột màu trắng, [α] D26 +18,0 (c 0,20, CDCl3); UV (MeOH) λmax
(log ε) 216 (3,69) nm. CD (c 1,2 × 10-3 M, MeOH) λmax ([θ]): 205 (+13750), 224

(−9833), 245 (+12333); phổ khối lượng phân giải cao (+)-HR-ESI-MS m/z 301,1044
[M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C15H18O5Na: 301,1046); CTPT: C15H18O5,
M = 278.
3.4.12. Hợp chất MW12: Menverin A
Chất dạng dầu không màu, [α]D20 -160 (c 0,09, CDCl3); UV (MeOH): 273
(4,06), EI-MS: 246 [M+], 231, 228, 217, 203, 185, 167, 149, 97, 57 (100), phổ khối
lượng phân giải cao HR-EI-MS: 246,1270 (tính toán lý thuyết cho công thức
C15H18O3+ : 246,1256); CTPT: C15H18O3, M = 246.
3.4.13. Hợp chất MW13: Menverin B
Chất dạng dầu không màu, [α]D20 -53 (c 0,08, CDCl3); UV (MeOH): 273 (3,69);
EI-MS: 246 [M+], 231 (100), 228, 217, 203, 185, 167, 149, 97, 57. Phổ khối lượng phân
giải cao HR-EI-MS: 246,1241 (tính toán lý thuyết cho công thức C 15H18O3+ : 246.1256);
CTPT: C15H18O3, M = 246.
3.4.14. Hợp chất MW14: Menverin C
Chất dầu không màu, [α]D20 -152 (c 0,375, CDCl3); UV (MeOH): 275,5 (4,35);
EI-MS: 262 [M]+, 244, 229, 201, 187, 167, 124 (100), 96. Phổ khối lượng phân giải cao
HR-EI-MS: 262,1199 (tính toán lý thuyết cho công thức C 15H18O4+ : 262,1205). CTPT:
C15H18O4, M = 262.
3.4.15. Hợp chất MW15: Menverin F
Chất dầu không màu, [α]D22 +12 (c 0,13, CDCl3); UV (MeOH): 214 (3,9); CD
(MeOH, c = 0.6): 203 (+4849,02), 224 (- 3437.94). ESI-MS: 579 [2M + Na] +. Phổ khối
lượng phân giải cao HR-ESI-MS: 579,2189 [2M + Na]+ (tính toán lý thuyết cho công
thức C30H36O10+Na: 579.2206). CTPT: C15H18O5, M = 278.
3.4.16. Hợp chất MW16: Menelloide B
Chất dầu không màu, [α]D25 -30 (c 0,1, CDCl3); ESI-MS: m/z 269 [M+Na]+;
HR-ESI-MS: m/z 269,1152 (tính toán lý thuyết cho công thức C 15H18O3+Na: 269,1154).
CTPT: C15H18O3, M = 246
3.4.17. Hợp chất MW17: 1S*,4S*,5S*,10R*-4,10-Guaianediol

12
Chất rắn màu trắng; [α]D25 +45o (c=0,10, CHCl3); ESI-MS: m/z 237 [M−H]−
CTPT: C15H26O2, M = 238.
3.5. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được
Bảng 3.2. Kết quả xác định giá trị IC50 của các hợp chất được lựa chọn
Giá trị IC50 (µg/ml)

Hoạt
chất
MW1
MW4
MW6
MW10
Elliptic
ine

SK

HepG2

HL60

KB

3,80

3,02

4,46

Mel2
4,42

± 0,46
9,07

± 0,24
6,72

± 0,67
10,31

± 0,79
10,89

± 1,18
8,05

± 2,16
49,57

NIH/

LU-1

MCF7

LNCaP

4,30

4,69

4,00

3T3
4,09

± 0,68
8,39

± 0,26
8,04

±0,46
11,3

± 0,52
12,65

± 0,52
7,24

± 2,21
13,05

± 0,36
12,10

± 0,79

9,15

± 0,73
14,40

± 1,98
10,97

± 1,76
10,67

± 0,56
25,49

± 2,67
51,44

± 2,49
55,63

± 1,62
46,10

± 2,54
46,26

± 1,50
33,16

± 2,28

49,55

± 1,40
0,42

± 2,52
0,46

± 1,45
0,52

± 4,52
0,39

± 3,77
0,45

± 3,62
0,47

± 6,60
0,38

± 3,01
0,38

± 0,08

± 0,03

± 0,09

± 0,05

± 0,02

± 0,02

± 0,07

± 0,02

Kết quả xác định giá trị IC50 của 17 chất sạch trên 07 dòng tế bào ung thư:
HepG2, HL60, KB, SKMel2, LU-1, MCF7, LNCaP và 01 dòng tế bào lành NIH/3T3
cho thấy MW1, MW4, MW6 và MW10 có mức hoạt tính tốt. Hợp chất MW1 có mức
hoạt tính tốt nhất với giá trị IC 50 = 3,02 - 4,69 µg/ml trên tất cả các dòng tế bào ung thư
khác nhau, MW4 có mức hoạt động với giá trị IC 50 = 6,72 - 12,65 µg/ml và MW6 có
giá trị IC50 = 8,05 - 14,40 µg/ml, còn hợp chất MW10 thể hiện hoạt tính trung bình trên
các dòng tế bào ung thư với giá trị IC 50 trong khoảng 25,49 - 55,63 µg/ml (Bảng 3.2)
3.6. Kết quả xác định hoạt tính ức chế sản sinh ROS
Đặc tính ức chế sản sinh ROS của các hợp chất steroid (MW1-MW7) trong
đại thực bào đã được thực hiện để sơ bộ tìm hiểu cơ chế ức chế tế bào ung thư của các
hợp chất thu được. Bằng phương pháp MTT, chúng tôi đã chứng minh được các hợp
chất này không thể hiện độc tính trong đại thực bào RAW 264.7 ở khoảng nồng độ
0,001 – 50 µM. Ở nồng độ 10 µM, các hợp chất MW1, MW4 và MW6 cho thấy tác
dụng giảm mức độ biểu hiện của ROS ở mức có ý nghĩa thống kê trong đại thực bào
được cảm ứng bởi lipopolysaccharide (LPS) từ E.coli.
Cụ thể, hợp chất MW1 và MW4 làm giảm sự hình thành ROS trong đại thực
bào với giá trị lần lượt là 34.03 ± 4,2% (p < 0,05) và 27,97 ± 1,7% (p < 0,05). Hợp chất
MW6 thể hiện tác dụng hiệu quả nhất là giảm ROS trong tế bào Raw 264.7 ở mức

39,16 ± 7,3% (p < 0,05), khi so sánh với LPS. Ngược lại, các hợp chất MW3 và MW5


13
lại làm tăng mức độ biểu hiện của ROS trong đại thực bào, tuy nhiên chưa ở mức có ý
nghĩa (p > 0,05) (Hình 3.4).
Hình 3.4. Mức độ biểu hiện của ROS trong đại thực bào được kích thích bởi LPS
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.1. Hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết thô
Từ kết quả trên, có thể nhận thấy rằng mẫu san hô mềm Menella woodrin có hoạt tính
gây độc tế bào ung thư thử nghiệm ở các nồng độ khác nhau ở mức tương đối tốt. Tuy
nhiên, tại thời điểm chúng tôi bắt đầu nghiên cứu từ tháng 04/2014 ở Việt Nam và trên
thế giới, chưa có bất cứ công trình nghiên cứu nào công bố về thành phần hóa học và
hoạt tính sinh học từ loài này nên chúng tôi ưu tiên tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh
học nhằm phát hiện và tạo cơ sở dữ liệu cho các nghiên cứu của loài này. Mặt khác, cho
tới thời điểm hiện tại thì vẫn chưa có thêm công trình nghiên cứu nào của các nhóm tác
giả khác công bố, vậy nên việc chúng tôi phát hiện được các hợp chất và đánh giá hoạt
tính sinh học từ loài Menella woodin vẫn còn nguyên tính thời sự và tính mới.
4.2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ loài Menella woodin
4.1.1. Hợp chất MW1: Menellsteroid E (1β,3β,5α,11β-Tetrahydroxycholestan-6-one)
(chất mới)

Hình 4.1. Cấu trúc hóa học của hợp chất MW1
Hợp chất MW1 được phân lập từ loài Menella woodin dưới dạng chất bột màu
trắng. Công thức phân tử của nó được xác định là C 27H46O5 dựa trên phổ HR-ESI-MS
với pic ion giả phân tử tại m/z 473,3232 [M+Na]+ và phổ 13C-NMR. Trên phổ 13C-NMR
xuất hiện 27 tín hiệu cacbon bao gồm năm metyl, chín metilen, chín metin và bốn
cacbon gắn với nhóm oximetin xuất hiện tại δC 71,9, 65,3, 71,1, 82,1 và có một nhóm
nhóm keton tại δC 213,2. Phổ 1H-NMR và HSQC cho phép xác định sự có mặt của 2
nhóm metyl bậc ba [δC 14,0 (C-18) và 12,4 (C-19)/δH 0,87 (H-18) và 0,93 (H-19), mỗi

tín hiệu 3H, s] và ba nhóm metyl bậc hai [δC 14,0 (C-21), 22,9 (C-26) và 23,2 (C-27)/δH
0,97 (H-21), 0,87 (H-26) và 0,88 (H-27), mỗi tín hiệu 3H, d, J = 6,7 Hz]. Các tín hiệu
proton tại δH 3,90 (m, H-3), 4,10 (dd, J =11,3; 5,2 Hz, H-1) và 4,37 (br dd, J =6,1; 4,7


14
Hz, H-11) gợi ý cho một hợp chất polyhydroxysterol dạng khung cholestan với 3 nhóm
CH-O, một nhóm >CSo sánh số liệu phổ NMR của MW1 với các số liệu tương ứng của
menellsteroid D (Chai XY, 2010) cho thấy hợp chất MW1 chỉ khác so với menellsteroid
D là sự xuất hiện thêm một nhóm hydroxyl tại C-11. Vị trí của nhóm hydroxyl này
được xác định bằng phổ COSY và HMBC: Proton H-11 tại δH 4,37 có tương tác với H9 và H2-12 trên phổ 1H-1H COSY và có tương tác xa với C-8, C-9 và C-13 trên phổ
HMBC. Cấu hình tương đối của MW1 được xác định bằng phổ ROESY. Tín hiệu tương
tác NOE của СH3-19 (δH 0,93, s) với Hβ-2 (δH 1,50, m), Hβ-4 (δH 1,61, dd, J =13,8; 11,7
Hz) và H-8 (δH 2,01, qd, J =11,1; 5,0 Hz) cùng với tương tác của H α-4 (δH 1,83, ddd, J
=13,8; 4,6; 2,0 Hz) với H-3 (δH 3,90, tt, J =11,8; 4,9 Hz) và của H-1 (δH 4,10, dd, J
=11,3; 5,2 Hz) với cả H-3 (δH 3,90, tt, J =11,8; 4,9 Hz) và H-11 (δH 4,37, br dd, J =6,1;
4,7 Hz) chứng minh cấu hình β của các nhóm hydroxyl tại C-1, C-3 và C-11. Cấu hình
α của nhóm hydroxyl tại C-5 được xác định bằng cách so sánh số liệu phổ 1H và 13CNMR với các hợp chất tương tự đã được công bố có cấu hình 5α và 5β. Thực tế, dạng
píc và độ dịch chuyển hóa học của các tín hiệu H-3 và H 2-4 tương tự như các tín hiệu
của 1β,3β,5α-trihydroxycholestan-6-one (Chai XY, 2010) và topsentisterol C1 (Luo X,
2006), hai hợp chất đều có cấu trúc 3β,5α-diol-6-one và khác so với các tín hiệu tương
ứng của 1α,3β,5β,11α-tetrahydroxycholestan-6-one (Chao CH, 2005). Từ các phân tích
đã nêu, cấu trúc hóa học của hợp chất MW1 được xác định là 1 β,3β,5α,11βtetrahydroxycholestan-6-one. Đây là một chất mới.
4.1.2. Hợp chất MW2: Menellsteroid F (Cholest-24-ene-3β,5α,6β,11β-tetraol) (chất
mới)

Hình 4.2. Cấu trúc hóa học của hợp chất MW2
Hợp chất MW2 cũng được phân lập từ loài M. woodin, có công thức phân tử là
C27H46O4 được xác định bằng phổ HR-ESI-MS với píc ion giả phân tử tại m/z 457,3299

[M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C27H46O4Na, 457,3288) và phổ 13C-NMR.
Các số liệu phổ 1H và 13C-NMR tương tự như các số liệu đã được công bố của các hợp


15
chất cholest-3β,5α,6β,11β-tetraol (Chao CH, 2005; Zhang W, 2006b) và cholest-22-ene3β,5α,6β,11β-tetraol (Zhang W, 2006b), cho thấy sự trùng lặp về các tín hiệu của vòng
A, B và C. Sự khác biệt đáng kể chỉ được ghi nhận ở các tín hiệu của mạch nhánh
Sự xuất hiện các tín hiệu của hai nhóm metyl gắn với nối đôi (δH 1,59 và 1,66,
mỗi tín hiệu 3H s; δC 17,7 và 25,9), một nhóm metin olefin (δH 5,08, br t, J =7,3 Hz; δC
126,2), một carbon bậc bốn (δC 131,7) và secondary methyl (δH 0.96, d, J =6.7 Hz; δC
19,1) chứng minh sự trùng nhau về cấu trúc mạch nhánh của MW2 với lanosterol, một
tiền chất sinh tổng hợp của các polyoxysterol (Knight SA, 1974). Nhận định này được
chứng minh bằng các tương tác HMBC của Me-26, Me-27 với C-24, C-25, của Me-21
với C-17, C-20, C-22 và của H-24 với C-22, C-23, Me-26 và Me-27. Ngoài ra, phân
tích chi tiết các phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều như HSQC, HMBC, COSY và
NOESY chứng minh cấu trúc hóa học của MW2 là cholest-24-ene-3β,5α,6β,11β-tetraol,
đây là một chất mới lần đầu tiên được phát hiện từ hợp chất thiên nhiên.
4.1.3. Hợp chất MW3: Menellsteroid G (24-methylcholest-24(28)-ene-3β,5α,6β,11βtetraol) (chất mới)
Hợp chất MW3 được phân lập từ loài M. woodin dưới dạng chất bột màu trắng.
Công thức phân tử của nó được xác định là C 28H48O4 bằng phổ HR-ESI-MS với pic ion
giả phân tử tại m/z 471,3450 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C28H48O4Na:
471,3450) và phổ 13C-NMR.

Hình 4.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất MW3
So sánh số liệu phổ 1H và 13C-NMR của MW3 với các số liệu tương ứng của
MW2 cho thấy các tín hiệu tại δH 3,98 (tt, J =11,0; 5,7 Hz, δC 68,3, HC-3), 3,41 (dd, J
=3,7; 2,2 Hz; δC 76,4, CH-6), 4,11 (br dd, J =6,5, 3,2 Hz; δC 69,4, CH-11) và một tín
hiệu carbon bậc bốn tại δC 77,5. Sự tương đồng về số liệu phổ giữa hai hợp chất cho
phép xác định hai hợp chất này có cùng cấu trúc nhân steroit 3β,5α,6β,11β-tetraol.
Tương tự như ở hợp chất MW2, năm nhóm metyl cũng được xác định trên các

phổ của MW3 tại δH 0,92, s; δC 14,9, Me-18; δH 1,37, s; δC 20,3, Me-19; và δH 0,98, d, J
=6,5 Hz; δC 19,2, Me-21. Các tín hiệu xuất hiện thêm trên phổ 1H-NMR tại δH 4,64 (br
s) và 4,71 (br s) được gán cho nhóm metilen của liên kết đôi ở đầu mạch ( δC 106,9 và


16
157,8). Các dữ kiện đã nêu, cùng với tín hiệu proton metyl tại δH 1,02 (6H, d, J =6,8
Hz) có tương tác HMBC với tín hiệu cacbon tại δC 157,8 và tương tác HMBC của các
proton của nhóm olefin metilen với C-23 (δC 32,2) và C-25 (δC 34,9), chứng minh hợp
chất MW3 có cấu trúc mạch nhánh dạng 24-methylene-cholestane. Phân tích các dữ
kiện phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều như HSQC, HMBC, COSY và NOESY và
các dữ kiện đã thu được, cấu trúc hóa học 24-methylcholest-24(28)-ene-3β,5α,6β,11βtetraol được xác định cho hợp chất MW3, một chất mới.
4.1.4. Hợp chất MW4: Menellsteroid H (24-Norcholest-22(E)-ene-3β,5α,6β,11βtetraol) (chất mới)
Hợp chất MW4 cũng được phân lập dưới dạng chất bột màu trắng với công
thức phân tử C26H44O4, được xác định bằng phổ HR-ESI-MS tại m/z 443,3124 [M+Na]+
(tính toán lý thuyết cho công thức C26H44O4Na: 443,3137).
Số liệu phổ NMR của MW4 tương tự như các số liệu của hợp chất
menellsteroid B (Zhang W, 2006b), ngoại trừ sự mất đi các tín hiệu của nhóm CH 2-24.
Tương tác HMBC (đo trong C5D5N) của các proton Me-26 và Me-27 (δH 0,9, 6H, d, J
=6,8 Hz) với C-25 (δC 32,3) và C-23 (δC 135,1) cũng như tương tác của proton Me-21
(δH 1,08, 3H, d, J =6,6 Hz) với C-17 (δC 57,1), C-20 (δC 40,5) và C-22 (δC 134,4) chứng
minh cấu trúc hóa học của MW4 là 24-norcholest-22(E)-ene-3β,5α,6β,11β-tetraol, một
chất mới.

Hình 4.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất MW4
4.1.5. Hợp chất MW5: cholest-3β,5α,6β,11β-tetraol
Phổ 1H và 13C-NMR của MW5 tương tự như phổ của các hợp chất MW2-MW4.
Sự khác biệt giữa các hợp chất chỉ được ghi nhận ở các tín hiệu của mạch nhánh. Trên
phổ 1H-NMR xuất hiện các tín hiệu của ba nhóm oximetin tại δH 3,98 (1H, tt, J = 11,0,
5,5 hz, H-3), 3,42 (1H, dd, J = 3,8, 2,4 Hz, H-6) và 4,22 (1H, dd, J = 6,5, 3,3 Hz, H-11)

và hai nhóm metyl bậc ba (mỗi tín hiệu 3H, s) tại 0,91 (H-18) và 1,36 (H-19). Ngoài ra,


17
sự xuất hiện 3 tín hiệu cacbon bậc hai (mỗi tín hiệu 3H, d, J = 6,5 Hz) tại 0,94 (H-21),
0,87 (H-26) và 0,88 (H-27) gợi ý cho cấu trúc mạnh nhánh dạng cholesterol. Sự phù
hợp về số liệu phổ 13C-NMR với các số liệu tương ứng đã được công bố cho phép xác
định MW5 chính là cholest-3β,5α,6β,11β-tetraol (Zhang W, 2006b).
4.1.6. Hợp chất MW6: Menellsteroid B (cholest-22-ene-3β,5α,6β,11β-tetraol)
Hợp chất MW6 cũng được phân lập dưới dạng chất bột màu trắng. Các phổ
NMR của nó chứng minh đây là một hợp chất steroit có phần nhân steroit trùng với các
hợp chất MW2-MW5, chỉ khác cấu trúc của mạch nhánh. So sánh số liệu phổ 13C-NMR
với các số liệu đã được công bố, kết hợp phân tích chi tiết các tương tác trên phổ cộng
hưởng từ hạt nhân hai chiều HSQC, HMBC, COSY và ROESY cho phép khẳng định
hợp chất MW6 chính là Menellsteroid B (Zhang W, 2006b).
4.1.7. Hợp chất MW7: (22E,24S)-24-methyl-5α-cholesta-7,22-diene-3β,5,6β,9-tetraol
Các phổ NMR của MW7 cũng đặc trưng cho một hợp chất polyhydroxysteroit.
Trên phổ 1H và 13C-NMR xuất hiện các tín hiệu đặc trưng của hai nhóm oximetin, hai
carbon bậc bốn mang oxi, hai nhóm metyl bậc ba, bốn nhóm metin bậc hai và một liên
kết đôi ngoại vòng bị thế hai vị trí. Sự phù hợp về số liệu phổ NMR của MW7 với các
số liệu đã được công bố cho phép xác định hợp chất này chính là (22E,24S)-24-methyl5α-cholesta-7,22-diene-3β,5,6β,9-tetraol (Migliuolo A, 1990).
4.1.8. Hợp chất MW8: (1S,2R,8S,10R)-1,8-epoxy-2-hydroxy-guaian-3,5,7-trien-12,8olide (chất mới)
Hợp chất MW8 được phân lập dưới dạng chất dầu màu vàng nhạt, [α] 26D +217,3
(c 0,15, CHCl3), Công thức phân tử của nó C15H16O4 được xác định bằng phổ khối
lượng phân giải cao HR-ESI-MS tại m/z 283,0938 [M+Na]+, tính toán lý thuyết cho
công thức C15H16O4Na+, 283,0941, Phổ UV xuất hiện pic hấp phụ mạnh ở 309 chứng
minh cho sự có mặt của cấu trúc liên hợp, Các phổ NMR chứng minh sự có mặt của ba
nhóm metyl, một metilen, bốn metin và bảy carbon bậc bốn bao gồm hai carbon mang
ôxi, bốn >C= và một >C=O, Hai tín hiệu metyl singlet trên phổ 1H-NMR (δH 1,91 và
1,98) có tương tác HSQC với các cacbon tại δC 8,2 (Me-13) và 12,3 (Me-14), trong khi

tín hiệu metyl doublet (δH 0,85) tương tác với carbon tại δC 15,1 (Me-15), Nhóm
oximetin được xác định bởi các tín hiệu cộng hưởng tại δH 4,53 và δC 75,7, Cùng với
các tín hiệu của một carbonyl γ-lactone tại δC 171,7 (C-12) và một nhóm ketal tại δC
107,0 (C-8), các số liệu phổ NMR cho phép dự đoán MW8 là một sesquitecpen có cấu
trúc khung guaiane có chứa hệ liện hợp triene, nhóm chức γ-lactone, ketal và oximetin.


18

Hình 4.5. Cấu trúc hóa học của hợp chất MW8
Vị trí của nhóm oximetin tại C-2 được xác định bằng tương tác HMBC giữa H2 và C-3, C-4, C-5 và C-10. Các tín hiệu proton ở vùng trường thấp tại δH 6,23 (H-3) và
6,37 (H-6) có tương tác HSQC với các tín hiệu tại δC 139,2 và 109,1. Tương tác xa
HMBC giữa H-3 và C-1, C-2, C-4, C14; H3-14 và C-3, C-4, C-5; H-6 và C-1, C-5, C-6,
C-7 và giữa H3-13 và C-7, C-11, C-12 chứng minh sự có mặt của cấu trúc liên hợp trien
với hai nhom metyl tại C-4 và C-11. Xem xét công thức phân tử của MW8 cùng với dữ
liệu mô hình hóa phân tử và giá trị độ dịch chuyển hóa học C-1 (δC 90,5) và C-8 (δC
107,0), gợi ý cho sự có mặt của một cầu epoxy tại C-1/C-8. Các tín hiệu của nhóm
metilen (δH 1,68 (dd, J =12,7, 6,4 Hz), 2,68 (dd, J =12,7, 11,2 Hz) và δC 38,8) được gán
cho CH2-9 trên cơ sở các tương tác HMBC của H2-9 với C-15, C-10, C-8 và C-7. Các
dữ kiện đã nêu chứng minh chính xác cấu trúc phẳng của MW8.
Lập thể tuyệt đối tại vị trí C-2 được xác định bằng phương pháp Mosher cải tiến
(Seco JM, 2004). Xử lý MW8 với (R)(-)- và (S)(+)-α-methoxy-α (trifluoromethyl)
phenylacetyl chloride cho các dẫn xuất tương ứng là (S)- và (R)-MTPA ester. Các tín
hiệu 1H-NMR của các dẫn xuất MTPA ester được xác định bằng phổ COSY. Phân tích
số liệu ΔδH(S–R) cho thấy sự thay đổi tăng độ dịch chuyển hóa học của H-3 (+0.14 ppm)
và H3-14 (+0.07 ppm) và giảm của H 2-9 (H-9a: −0.02 ppm, H9b: −0.02 ppm), chứng
minh cấu hình 2R của MW8. Lập thể của cầu epoxy được xác định là β (1S,8S) trên cơ
sở phân tích phổ ROESY experiment. Tương tác NOE rõ ràng từ H-2 sang cả Me-15 và
H-10 đã được ghi nhận. Phân tích mô hình tối ưu hóa năng lượng cho cả hai dạng lập
thể 1S,2R,8S và 1R,2R,8R cho thấy các tương tác NOE trên chỉ phù hợp cho lập thể β

của nhóm epoxy. Phù hợp với tương tác NOE giữa Me-15 và H-9a (δH 1,68, dd, J
=12,7; 6,4 Hz) và và giá trị hằng số tương tác, H-10 (δH 2.59, dquint J =11,2, 6,6 Hz)
nằm ở vị trí cis với H-9b (δH 2,68, dd, J =12,7; 6.4 Hz), tuy nhiên việc xác định từng
proton của H2-9 là α hay β là không thể do đó các dữ kiện trên chưa đủ để quy kết cấu
hình tại C-10. Tính toán hóa lượng tử (Quantum-chemical calculations) sử dụng B3LYP
(Stephens PJ, 1994) cùng với hệ cơ bản 6-311G(d,p) và PCM (polarisation-continuum


19
model) (Miertuš S, 1981), thực hiện trong gói phần mềm Gaussian 03W được sử dụng
cho các nghiên cứu sâu hơn về lập thể của MW8. Cụ thể, lý thuyết TD-DFT (timedependent density functional) được sử dụng cho các tính toán của phổ ECD. Các biến
thể GIAO của lý thuyết đã được sử dụng để tính hằng số chắn đẳng hướng NMR. So
sánh các phổ ECD theo lý thuyết thống kê trung bình của các dạng đồng phân
1S,2R,8S,10R (1a), 1S,2R,8S,10S (1b), 1R,2S,8R,10S (1c) và 1R,2S,8R,10R (1d) (các
dạng đồng phân này có thể có tương tác NOE tương tự nhau) với phổ ECD thực tế cho
thấy sự phù hợp giữa phổ thực tế với phổ tính toán của 1a và 1b, chứng minh cấu hình
tuyệt đố 1S,2R,8S của MW8, hoàn toàn phù hợp với kết quả phổ ROESY và phương
pháp Mosher. Tuy nhiên, phổ ECD tính toán lý thuyết của 1a và 1b quá giống nhau nên
cũng chưa đủ cơ sở khoa học để xác định lập thể tại C-10.
So sánh giá trị độ dịch chuyển hóa học thực tế và theo tính toán của C-9, C-10
và Hα-9, Hβ-9 cũng như so sánh giá trị hằng số tương tác tính toán theo lý thuyết
2

JH9α,H9β, 3JH9α,H10 và 3JH9β,H10 với các giá trị thực tế ghi nhận được cho phép xác định

chính xác lập thể tại C-10. Cụ thể, giá trị tính toán δC C-9 (1a) = 44,4, δC C-10 (1a) =
47,3; δC C-9 (1b) = 46,7, δC C-10 (1b) = 437 ppm cho thấy sự khác biệt của giá trị độ
dịch chuyển hóa học giữa hai dạng đồng phân: ∆δC(10-9) = δC10 − δC9: ∆δC(10-9) (1a) = +2,9
ppm, trong khi ∆δC(10-9) (1b) = −3,0 ppm.
Giá trị tương ứng thực tế thu được là ∆δC(10-9) (MW8) = +1.2 ppm. Giá trị hằng

số tương tác spin-spin tính toán là: 2JH9α,H9β (1a) = −11,9, 3JH9α,H10 (1a) = 5,4, 3JH9β,H10 (1a)
= 10,1 và 2JH9α,H9β (1b) = −12,1, 3JH9α,H10 (1b) = 8,3, 3JH9β,H10 (1b) = 3,2 Hz. Các giá trị tính
toán cho dạng đồng phân 1a hoàn toàn phù hợp với giá trị thực tế ghi nhận được 2JH9a,H9b
(MW8) = 11,2 Hz, 3JH9a,H10 (MW8) = 6,4 và 3JH9b,H10 (MW8) = 11,2 Hz. Các dữ kiện đã
nêu cho phép xác định cấu hình của H-9a tại δH 1,68 là α, H-9b tại δH 2,68 là β và Me15 là α. Điều này, cùng với kết quả phổ ROESY chứng minh cấu hình tuyệt đối của
MW8 là 1S,2R,8S,10R. Hơn nữa, giá trị [α]D của 1S,2R,8S,10R- MW8 trong CDCl3
được tính toán theo phương pháp B3LYP/6-311G(d,p) (Stephens PJ, 1994). Dấu dương
và và giá trị thống kê trung bình [α]D,calc = +513,7 phù hợp với giá trị thực tế [α]D,exp =
+217,3. Từ tất cả các dữ kiện đã nêu, cấu trúc hóa học của MW8 được chứng minh là
(1S,2R,8S,10R)-1,8-epoxy-2-hydroxy-guaian-3,5,7-trien-12,8-olide. Đây là một hợp
chất mới.
4.1.9. Hợp chất MW9: (1R,2S,8S,10R)-1,2-dihydroxy-8-methoxy-guaian-3,5,7-trien12,8-olide (chất mới)


20
Phổ HR-ESI-MS của hợp chất MW9 xuất hiện pic ion giả phân tử tại m/z
315,1202 [M+Na]+ cho phép xác định công thức phân tử của nó là C 16H20O5. Phân tích
các tín hiệu trên phổ 1H và 13C-NMR (CDCl3) cho phép xác định hợp chất này có cấu
trúc tương tự MW8, nhưng MW9 có hai nhóm OH và một nhóm metoxi. Tuy nhiên, các
tín hiệu H-10, H-9 và và một proton trao đổi bị chồng lấp tại δH 2,36 và do đó dung môi
đo NMR được chuyển sang C6D6.

Hình 4.6. Cấu trúc hóa học của hợp chất MW9
1

Thực tế, phổ H-NMR đo trong C6D6 (Bảng 3.9) xuất hiện thêm một tín hiệu CH 3
singlet tại δH 2,85, có tương tác HSQC với tín hiệu cacbon tại δC 49,8, trong khi tín hiệu
C-1 tại δC 79,2 bị dịch chuyển mạnh về phía vùng trường cao khi so sánh với tín hiệu
của MW8. Nhóm metoxi được xác định tại C-8, dựa trên tương tác HMBC của O Me
với C-8. Ngoài ra, các phổ 2D-NMR bao gồm COSY, HSQC và HMBC cùng với phổ

khối lượng chứng minh cho sự có mặt của cấu guaian-12,8-olide liên hợp trien với hai
nhóm OH tại C-1 và C-2 và một nhóm metoxi tại C-8.
Tuy nhiên, giá trị độ quay cực âm lớn ([α] 26D −205,7) cùng với phổ ECD đảo
ngược so với MW8 cho phép dự đoán sự thay đổi rất lớn về hóa lập thể giữa hai hợp
chất. Theo tính toán cho thấy, phổ ECD phụ thuộc rất lớn vào lập thể của vòng 7 cạnh
và dạng hình học của hệ trien. Do cấu trúc của vòng 7 cạnh rất linh động, việc lựa chọn
sự khác nhau có thể có của các dạng lập thể để phù hợp với tất các các số liệu NMR và
ECD thực nghiệm trở thành vấn đề rất khó giải quyết. Do đó, cấu hình tương đối và
tuyệt đối của MW9 được xác định dựa trên sự so sánh về phổ NMR và ECD được tính
toán cho các cấu dạng bền của các dạng đồng phân của MW9 với các số liệu thực tế đo
được.
Lập thể tương đối của MW9 được dự đoán trên cơ sở phân tích hằng số tương
tác và kết quả phổ ROESY. Tín hiệu tương tác NOE rõ ràng giữa proton metoxi với H-9
tại δH 2,16 (dd, J =13,7, 1,7 Hz) ở kỹ thuật đo 1D NOE, trong khi hằng số tương tác
giữa H-9 tại δH 2.35 (dd, J =13.7, 11.6 Hz) và H-10 δH 2.27 (dqd, J =11.6, 6.6, 1.7 Hz)
khẳng định rõ ràng vị trí trans-diaxial giữa H-10 và H-9 tại δH 2.35 (JH9,H10 = 11.6 Hz)
nếu vòng 7 cạnh có cấu hình dạng ghế bền. Tương quan NOE giữa H-2 và cả hai H-10


21
và Me-15 cũng như giữa Me-15 và H 2-9 chứng minh cả hai nhóm OH và Me-15 đều
nằm về cùng một phía so với mặt phẳng chính của phân tử, trong khi nhóm metoxi nằm
ở phía đối diện.
So sánh số liệu phổ NMR tính toán và thực tế cho thấy chỉ có cấu trúc
1R*,2S*,8S*,10R* với vị trí equatorial của nhóm Me-15 là phù hợp với tất cả các dữ
kiện phổ NMR thu được, bao gồm các hằng số tương tác 2JH9α,H9β, 3JH9α,H-10 và 3JH9β,H-10;
tỷ lệ của các hằng số ζ1 = 3JH9β,H10/3JH9α,H10; giá trị độ dịch chuyển hóa học δC (C-15); dấu
và giá trị của tương quan về độ dịch chuyển hóa học ΔδC(10-9) = δC10 − δC9. Gán số liệu
NMR đã thu được với bất cứ dạng đồng phân nào khác đều nhận được sự sai khác rất
lớn về hằng số tương tác và giá trị ΔδC(10-9) giữa tính toán và thực tế. Thêm nữa, tính

toán phổ ECD cho dạng đồng phân 1R,2S,8S,10R của MW9 sử dụng lý thuyết TDDFTB3LYP/6-311G(d,p) và PCM, cho thấy sự tương đồng về đường cong CD so với phổ
ECD thực tế đo được và sự đảo ngược so với phổ ECD tính toán cho dạng đồng phân
1S,2R,8R,10S
Như vậy, so sánh chi tiết các số liệu thực tế thu được với các số liệu tính toán
theo lý thyết cho phép xác định cấu trúc hóa học của MW9 là (1 R,2S,8S,10R)-1,2dihydroxy-8-methoxy-guaian-3,5,7-trien-12,8-olide. Điều này được khẳng định thêm
sau khi tính toán giá trị [α]D trong CHCl3 của dạng lập thể 1R,2S,8S,10R-MW9 sử dụng
phương pháp B3LYP-SCRF/6-311G(d,p). Dấu âm và giá trị trung bình thống kê lớn
[α]D,calc = −594o phù hợp với số liệu thực tế đã đo được [α]D,exp = −207o. Hợp chất MW9
là một chất mới.
4.1.10. Hợp chất MW10: Menelloide F (chất mới)
Hợp chất MW10 được phân lập dưới dạng dầu với công thức phân tử, C 15H18O4,
được xác định bằng phổ HR-ESI-MS tại m/z 285,1098 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho
công thức C15H18O4Na+, 285,1097) và 297,0911 [M+Cl]− (tính toán lý thuyết cho công
thức C15H18O4Cl−, 297,0899).

Hình 4.7. Cấu trúc hóa học của hợp chất MW10


22
Các phổ NMR của MW10 đặc trưng cho một hợp chất sesquitecpen dạng khung
guaiane, một thành phần hóa học chính của các loài Menella (Li L, 2008; Zhang W,
2004). Trên phổ 13C-NMR (đo trong CDCl3) xuất hiện 15 tín hiệu cacbon bao gồm một
liên kết đôi ở đầu mạch [δC 154,2 (C-4) và 106,8 (C-14)], một liên kết đôi bị thế hoàn
toàn [δC 157,4 (s, C-7) và 126,0 (C-11)], một cacbon đioxi [δC 106,2 (C-8)], một cầu
epoxy [δC 6IV.2.1 (d, C-9) và 63,2 (s, C-10)], một cacbonyl lacton [δC 172,5 (C-12)] và
hai nhóm metyl bậc ba [δC 8,2 (C-13) và 25,5 (C-15)]. Các tín hiệu proton và cacbon
của một nhóm metyl bị dịch chuyển rất mạnh về phía vùng trường cao tại δH 1,82 (H13) và δC 8,2 (C-13) chứng minh cho vị trí liên kết của nó lên một liên kết đôi và nằm
cạnh nhóm cacbonyl lacton. Nhận định này được khẳng định bằng các tương tác
HMBC của H-13 (δH 1,82) với C-7 (δC 157,4), C-11 (δC 126,0) và C-12 (δC 172,5).
Tương tác xa HMBC của H-6 (δH 2,28 và 2,37) với C-7 (δC 157,4), C-8 (δC 106,2) và

C-11 (δC 126,0); H-9 (δH 3,34) với C-1 (δC 48,1), C-7 (δC 157,4) và C-15 (δC 25,5); và
của H-15 (δH 1,41) với C-1 (δC 48,1), C-9 (δC 64,1) và C-10 (δC 63,2), chứng minh cho
vị trí của cacbon đioxi và cầu epoxoy tương ứng tại C-8 và C-9/C-10. Phân tích chi tiết
các tương tác HMBC khác cho phép xác định được cấu trúc phẳng của MW10 giống
với 1-deoxymenverin F và menverin G (Li L, 2008). Tuy nhiên, so sánh số liệu phổ
NMR của các hợp chất này cho thấy sự khác biệt về độ dịch chuyển hóa học (Bảng
3.10). Các phổ 1D và 2D-NMR của MW10 được tiến hành đo lại trong dung môi
DMSO-d6. Trên phổ NOESY (đo trong DMSO-d6), proton H-15 (δH 1,33) có tương tác
với H-1 (δH 2,45) và H-9 (δH 3,24) gợi ý cho cấu hình β của H-1, H-3 và nhóm metyl C15. Để xác định lập thể của H-5, phổ NOE different đã được đo. Kích sung vào tín hiệu
proton H-1 (δH 2,45) và H-5 (δH 2,38) đều gây ra hiệu ứng tăng cường tín hiệu H-15 (δH
1,32) chứng minh rằng H-1, H-5 và nhóm metyl C-15 đều nằm về cùng một phía.
Cấu hình β của nhóm hydroxyl tại C-8 được xác định bằng phổ CD với sự xuất
hiện đỉnh âm π-π* Cotton trong vùng λ 205–235 nm ([θ]226 = −12304) (Li L, 2008;
Uchida and Kuriyama, 1974). Ngoài ra, hiệu ứng ảnh hưởng mạnh của pyridine
(Demarco PV, 1968) với tín hiệu H-9 (Δδ −0.41) từ nhóm hydroxyl tại C-8 chứng minh
chúng nằm cùng phía. Như vậy, cấu trúc hóa học của MW10 đã được xác định cho một
chất mới và được đặt tên là menelloide F.


23
4.1.11. Hợp chất MW11: Menelloide G (chất mới)
Hợp chất MW11 được phân lập dưới dạng chất bột vô định hình và có công
thức phân tử C15H18O5 được xác định trên cơ sở píc ion tại m/z 301,1044 [M+Na]+ nhận
được trên phổ HR-ESI-MS. Phân tích số liệu phổ 1H và 13C-NMR cũng cho thấy đây là
một hợp chất dạng khung guaiane.

Hình 4.8. Cấu trúc hóa học của hợp chất MW11
Phổ

13

C-NMR và HSQC chứng minh sự có mặt của một nhóm cacbonyl γ-

lactone tại δC 171,8, cacbon hemiacetal tại δC 105,5, ba cacbon mang ôxi (δC 62,7, 76,7
và 77,5), một liên kết đôi ở đầu mạch tại δC 151,9 và 107,0, một liên kết đôi bị thế hoàn
toàn (δC 125,9, 156,9), hai nhóm metyl (δC 8,5, 20,7), ba nhóm metilen (δC 24,3, 30,2,
31,6) và một nhóm metin tại δC 41,7, Phân tích chi tiết các số liệu phổ 1D và 2D-NMR
cho thấy sự tương đồng giữa MW11 và menverine F (Li L, 2008) chỉ khác nhau ở vị trí
của các nhóm chức ôxi. Vị trí của các nhóm hydroxyl được xác định dựa trên các
tương tác HMBC của proton trao đổi tại δH 4,59 (C8-OH) và C-8 (δC 105,5), C-9 (δC
77,5) và tại δH 2,86 (C9-OH) với C-9 (δC 77,5) và C-10 (δC 62,7). Cầu epoxy xuất hiện
thêm tại C-1/C-10 được khẳng định dựa trên phân tích độ bất bão hòa cũng như sự phù
hợp về độc dịch chuyển hóa học của C-8 (δC 105,5), C-1 (δC 76,7) và Me-15 (δH 1,60;
δC 20,7). Vị trí của các nhóm chức khác được chứng minh bằng phổ COSY và HMBC,
phân tích chi tiết các tương tác trên phổ 1H-1H COSY cho phép xác định các mảnh cấu
trúc H2-2/ H2-3 và H-5/H2-6. Tín hiệu tương tác xa HMBC của Me-13 với ba cacbon
(C-7, C-11 và C-12), Me-15 với C-10, H-9 với C-1, C-7, C-8 và C-10 cũng như của H 214 với C-3, C-4 và C-5 cho phép xác định chính xác cấu trúc phẳng của MW11.
Cấu hình của nhóm hydroxyl tại C-8 được xác định là β (8R) trên cơ sử hiệu
ứng Cotton âm nhận được trên phổ CD trong vùng bước sóng λ 205–235 nm [θ]224 =
−9833 (Li L, 2008; Uchida I, 1974). Ngoài ra, tương quan NOE nhận được giữa H-9
(δH 4,33) và proton trao đổi tại δH 4,59 (HOC-8)/H-5 (δH 2,88), giữa Me-15 (δH 1,60) và
H-9 (δH 4,33)/Hβ-2 (δH 2,25) và giữa H-5 (δH 2,88) và Hβ-2 (δH 2,25)/Hβ-6 (δH 2,80).
Các dữ kiện này chứng minh H-5, H-9, Me-15 và nhóm hydroxyl tại C-8 đều có cấu


24
hình β, trong khi nhóm 1,10-oxirane và nhóm hydroxyl tại C-9 có cấu hình α. Như vậy,
hợp chất MW11 được xác định là một chất mới và được đặt tên là menelloide G.
4.1.12. Hợp chất MW12: Menverin A
Phổ 1H và 13C-NMR của MW12 tương tự như các phổ tương ứng của MW11,

Sự khác biệt dễ nhận thấy nhất là sự mất đi các tín hiệu của hai nhóm oximetin và một
carbon mang oxy và thay vào đó là các tín hiệu của một nhóm metin [δC 55,41] và một
liên kết đôi bị thế ba vị trí [δC 148,79 (C, C-8) và 119,45 (CH, C-9)/δH 5,79 (1H, s, H9)] trên các phổ của MW12 so với MW11. Từ các dữ kiện thu được, số liệu phổ 13CNMR của MW12 được so sánh với các số liệu đã được công bố của hợp chất menverin
A, một sesquitecpen dạng khung guaiane đã được phân lập từ loài Menella verrucosa
(Zhang W, 2004). Sự phù hợp hoàn toàn về số liệu phổ NMR giữa hai hợp chất cho
phép khẳng định hợp chất MW12 chính là menverin A.
4.1.13. Hợp chất MW13: Menverin B
Hợp chất MW13 được phân lập dưới dạng dầu không màu. Các phổ NMR của
nó cũng đặc trưng cho một hợp chất sesquitecpen dạng khung guaiane. Số liệu phổ 13CNMR của MW13 gần như trùng khớp so với các số liệu tương ứng của MW12, ngoại
trừ sự dịch chuyển rất mạnh về phía vùng trường cao của tín hiệu cacbon của nhóm
metyl C-15 tại δC 22,48 trên phổ của MW13 so với tín hiệu tương ứng tại δC 29,85 (C15) trên phổ của MW12. So sánh số liệu phổ 13C-NMR của MW13 với các số liệu đã
được công bố, kết hợp với phân tích chi tiết các phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều
COSY, HMBC và ROESY cho phép khẳng định hợp chất này chính là menverin B
(Zhang W, 2004).
4.1.14. Hợp chất MW14: Menverin C
Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của MW14 tương tự như các số liệu tương ứng của
MW13 cho phép dự đoán hai hợp chất có cấu trúc hóa học tương tự nhau. Sự khác biệt
dễ nhận thấy nhất về số liệu phổ giữa hai hợp chất là sự xuất hiện tín hiệu của một
carbon bậc bốn mang ôxi (δC 85,23) trên các phổ của MW14 thay cho một nhóm metin
trên các phổ của MW13. Tương tác xa HMBC nhận được giữa H-15 (δH 1,55) và C-1
(δC 85,23)/C-9 (δC 116,30)/C-10 (δC 73,55) chứng minh vị trí của nhóm hydroxyl xuất
hiện thêm tại C-1. Phân tích chi tiết các tương tác HMBC khác cùng với sự phù hợp
hoàn toàn về số liệu phổ 13C-NMR của MW14 với các số liệu đã được công bố cho
phép xác định hợp chất này chính là menverin C (Zhang W, 2004).
4.1.15. Hợp chất MW15: Menverin F


25
Các phổ NMR của MW15 tương tự như các phổ của MW10 cho phép dự đoán
hai hợp chất có cấu trúc hóa học tương tự nhau. Sự khác biệt dễ nhận thấy nhất là sự

xuất hiện tín hiệu của một cacbon mang ôxi (δC 83,63) trên các phổ của MW15 thay
cho một nhóm metin trên các phổ của MW10. Tương tác xa HMBC nhận được giữa H15 (δH 1,50) và C-1 (δC 83,63)/C-9 (δC 65,39)/C-10 (δC 62,50) chứng minh vị trí của
nhóm hydroxyl xuất hiện thêm tại C-1. Ngoài ra, sự phù hợp về số liệu phổ 13C-NMR
của MW15 với các số liệu đã được công bố kết hợp với phân tích chi tiết các tương tác
HMBC, cho phép xác định hợp chất MW15 chính là menverin F (Li L, 2008).
4.1.16. Hợp chất MW16: Menelloide B
Các phổ NMR của MW16 cũng đặc trưng cho một hợp chất sesquitecpen dạng
khung guaiane, Ngoài ra, sự phù hợp về số liệu phổ 13C-NMR của MW16 với các số
liệu đã được công bố kết hợp với phân tích chi tiết các tương tác HMBC, cho phép xác
định hợp chất MW16 chính là Menelloide B (Kao SY, 2011).
4.1.17. Hợp chất MW17: 1S*,4S*,5S*,10R*-4,10-Guaianediol
Các phổ NMR của MW17 cũng đặc chưng cho một hợp chất sesquiterpene.
Trên phổ 1H-NMR và 13C-NMR xuất hiện các tín của hai cacbon mang ôxi [δC 80,23
(C-4) và 75,29 (C-10)], một liên kết đôi bị thế ba vị trí [δC 121,34 (CH, C-6) 149,65 (C,
C-7)/δH 5,50 (1H, br d, J = 2,0 Hz, H-6)], và hai nhóm metyl bậc ba [δC 22,56 (C-14) và
21,44 (C-15)/δH 1,21 (H-14) và 1,29 (H-15), mỗi tín hiệu 3H, s]. Ngoài ra, hai nhóm
metyl bậc hai cũng được xác định bởi tín hiệu proton cộng hưởng tại δH 0,98 (6H, d, J =
7,0 Hz, H-12 và H-13). Từ các dữ kiện thu được, số liệu phổ 13C-NMR được so sánh
với các số liệu đã được công bố của hợp chất 1S*,4S*,5S*,10R*-4,10-guaianediol, một
sesquitecpen đã được phân lập từ loài san hô mềm Sinularia sp (Zhang GW, 2006a). Sự
phù hợp hoàn toàn về số liệu phổ kết hợp với phân tích chi tiết các tương tác HMBC
cho phép xác định hợp chất MW17 chính là 1S*,4S*,5S*,10R*-4,10-guaianediol.
4.3. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư thử nghiệm của các hợp chất phân lập được
Kết quả cho thấy, trong 17 hợp chất sạch thì có 4 hợp chất thể hiện hoạt tính tốt
nhất là MW1, MW4, MW6 và MW10. Hợp chất MW1 có mức hoạt tính tốt nhất với giá
trị IC50 = 3,02 - 4,69 µg/ml trên tất cả các dòng tế bào ung thư khác nhau, MW4 có mức
hoạt động với giá trị IC 50 = 6,72 - 12,65 µg/ml và MW6 có giá trị IC 50 = 8,05 - 14,40
µg/ml, còn hợp chất MW10 thể hiện hoạt tính trung bình trên các dòng tế bào ung thư
với giá trị IC50 trong khoảng 25,49 - 55,63 µg/ml.