Phát hiện người lành mang gen bệnh và chẩn đoán trước làm tổ bệnh hemophilia a bằng kỹ thuật microsatellite DNA tt

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
1. Tính cấp thiết của đề tài
Cùng với sự phát triển của nền kinh tế xã hội, tỷ lệ vô sinh ngày càng
gia tăng và là nỗi lo cho nhiều cặp vợ chồng. Ra đời vào những năm 1970
của thế kỷ trước, có thể nói phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm “in
vitro fertilization - IVF” đã trở thành cứu cánh cho nhiều cặp vợ chồng vô
sinh mong muốn có đứa con. Phương pháp này đã mang lại niềm vui,
niềm hạnh phúc cho bao cặp vợ chồng khắp nơi trên thế giới, tuy nhiên
không phải cặp vợ chồng nào cũng may mắn sinh được những đứa con
mong muốn bằng phương pháp này. Tỷ lệ thành công của phương pháp
này chỉ đạt hơn 35% tùy theo từng quốc gia. Có rất nhiều yếu tố ảnh
hưởng đến sự thành công của phương pháp này như: tuổi bố mẹ, tình
trạng sức khỏe, tinh thần tâm lý, chất lượng tinh trùng và trứng… và đặc
biệt chất lượng phôi sau khi thụ tinh. Các phôi có thể bất thường nhiễm
sắc thể (NST) thường hay NST giới tính đều làm giảm khả năng mang
thai sau khi cấy phôi vào buồng tử cung, có thể gây sảy thai hoặc sinh ra
những đứa con không khỏe mạnh. Để làm giảm tỷ lệ sinh ra những đứa
con không khỏe mạnh và làm tăng tỷ lệ thành công của phương pháp thụ
tinh trong ống nghiệm, thời gian gần đây các nhà khoa học đã áp dụng
quy trình sàng lọc phôi “Pre-Implantion Genetic Diagnosis, PGD” còn
gọi là “chẩn đoán di truyền trước làm tổ” nhằm có được những phôi tốt
nhất cho quá trình chuyển phôi.
Hemophilia A (bệnh ưa chảy máu) là bệnh di truyền do thiếu hụt
hoặc bất thường chức năng của các yếu tố đông máu VIII. Hemophilia
A là bệnh di truyền alen lặn trên NST X không có alen trên NST Y, nên
người mẹ mang gen bệnh sẽ di truyền cho con trai và biểu hiện bệnh
trên lâm sàng. Theo thống kê của tổ chức hemophilia A thế giới, hiện
nay có khoảng 250.000 bệnh nhân mắc bệnh hemophilia A và chỉ có
khoảng 50.000 được điều trị đặc hiệu. Tại Việt Nam, ước tính có

khoảng 6000 người bị bệnh hemophilia A và khoảng 30.000 người
mang gen bệnh hemophilia. Biểu hiện lâm sàng chủ yếu là chảy máu ở
bất kỳ nơi nào trên cơ thể, và chảy máu kéo dài: chảy máu khớp, chảy
máu trong cơ, chảy máu não, chảy máu trong cổ và ngực… Mức độ
biểu hiện trên lâm sàng liên quan trực tiếp nồng độ yếu tố VIII trong
huyết tương.
Việc tầm soát trước sinh bệnh hemophilia A là việc làm hết sức quan
trọng giúp cho việc sinh ra những đứa trẻ hoàn toàn khỏe mạnh. Việc xác


2

định đột biến gen gây bệnh, sàng lọc người lành mang gen bệnh và chẩn
đoán trước sinh bệnh hemophilia A đã được nghiên cứu khá nhiều ở Việt
Nam.Việc quản lý bệnh nhân và người mang gen của bệnh lý này là tiền
đề vững chắc để triển khai thành công quy trình chẩn đoán trước làm tổ
trong sàng lọc phôi. Phương pháp này sẽ giúp giảm biến chứng và di
chứng cho người mẹ khi mang thai bệnh lý, giảm chấm dứt thai kỳ do
phát hiện bệnh ở thai nhi khi chẩn đoán tiền sản, mang lại niềm vui hạnh
phúc cho các cặp vợ chồng mang gen bệnh, đồng thời giảm tỷ lệ mắc
bệnh ở cộng đồng. Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử, đã có rất
nhiều kỹ thuật được áp dụng để phát hiện các đột biến gây bệnh
hemophilia A như multiplex polymerase chain reaction (PCR), kỹ thuật
lai huỳnh quang tại chỗ (FISH). Kỹ thuật microsatellite DNA là kỹ thuật
sử dụng các primer gắn huỳnh quang của short tandem repeat (STR)
marker và phân tích kích thước của chúng thông qua điện di mao quản
trên máy giải trình tự gen để xác định các bất thường về nhiễm sắc thể.
Kỹ thuật này có nhiều ưu điểm do tính bền vững cao, dễ dàng phát hiện
dị hợp tử mà không cần xác định các đột biến trực tiếp, vì vậy sẽ giảm
được chi phí cho gia đình bệnh nhân. Hiện nay kỹ thuật này còn khá mới

mẻ ở Việt Nam ứng dụng trong chẩn đoán các bệnh lý di truyền.
2. Mục tiêu của đề tài
1. Xác định người lành mang gen bệnh hemophilia A bằng kỹ thuật
microsatellite DNA.
2. Chẩn đoán trước làm tổ cho những người mẹ mang gen bệnh
hemophilia A bằng kỹ thuật microsatellite DNA.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Bệnh lý di truyền là nhóm bệnh mặc dù không phổ biến như một số
nhóm bệnh khác nhưng thực tế cho thấy hàng năm có lượng lớn những
đứ trẻ sinh ra bị dị tật hoặc mắc các bệnh lỹ di truyền. Hemophilia A là
bệnh khó điều trị và để lại hậu quả rất nặng nề về sức khỏe, tinh thần
cũng như chất lượng cuộc sống. Vì vậy vấn đề đặt ra là phải giải quyết
sớm nhất nhằm giảm tỷ lệ sinh con bị bệnh. Bệnh hemophilia A di truyền
qua nhiều thế hệ và nhiều người mắc bệnh trong cùng gia đình.Việc xác
định đột biến gen và phát hiện người lành mang gen bệnh là cần thiết để
có tư vấn thích hợp giúp ngăn ngừa và làm giảm tỉ lệ mắc bệnh. Chẩn
đoán trước sinh là biện pháp được thực hiện phổ biến ở Việt Nam cho
bệnh lý di truyền nói chung, bệnh hemophilia A nói riêng giúp cho các bà
mẹ có khả năng sinh những đứa con khỏe mạnh, kỹ thuật này rẻ tiền, tuy
nhiên việc sinh con khỏe mạnh còn phụ thuộc vào xác suất ngẫu nhiên


3

của những lần mang thai, trong trường hợp thai nhi bị bệnh phải đình chỉ
thai nghén ở những tuổi thai lớn hơn 17 tuần. vì vậy ảnh hưởng đến tâm
sinh lý và sức khỏe người mẹ. Chẩn đoán trước làm tổ sẽ giúp chủ động
chọn phôi không bị bệnh để cấy vào buồng tử cung. Nghiên cứu này đã
sử dụng kỹ thuật microsatellite DNAtrong chẩn đoán trước làm tổ bệnh
hemophilia A. Đây là kỹ thuật gián tiếp phát hiện các alen đột biến dị hợp

tử mà không cần xác định các đột biến trực tiếp
4. Cấu trúc luận án
- Luận án được trình bày trong 139 trang (không kể tài liệu tham
khảo và phần phụ lục). Luận án được chia làm 6 phần:
+ Đặt vấn đề: 3 trang
+ Chương 1: Tổng quan tài liệu 42 trang
+ Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 18 trang
+ Chương 3: Kết quả nghiên cứu 45 trang
+ Chương 4: Bàn luận 30 trang
+ Kết luận: 1 trang
+ Kiến nghị: 1 trang
Luận án gồm 4 bảng, 35 hình. Sử dụng 107 tài liệu tham khảo gồm
tiếng Việt và tiếng Anh. Phần phụ lục gồm: Bảng mã acid amin, Bảng
tổng kết sử dụng 4 marker khuếch đại cho 112 thành viên ( bệnh nhân +
người nhà bệnh nhân) và danh sách 35 bệnh nhân hemophilia A và 77
thành viên nữ gia đình hemophilia A


4

Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG BỆNH HEMOPHILIA A
1.1.1. Định nghĩa
Bệnh hemophilia A là một bệnh di truyền do thiếu hụt hoặc bất
thường chức năng của các yếu tố đông máu trong huyết tương - thiếu
hụt yếu tố VIII gây bệnh hemophilia A, thiếu hụt yếu tố IX gây bệnh
hemophilia B, thiếu hụt yếu tố XI gây bệnh hemophilia C. Bệnh
hemophilia A là bệnh rối loạn đông máu di truyền hay gặp nhất.
1.1.2. Chẩn đoán bệnh

 Chẩn đoán xác định
- Dựa vào lâm sàng: Có vết bầm tím, tụ máu, chảy máu.
- Dựa vào tiền sử gia đình
- Dựa vào xét nghiệm máu:
+ Số lượng tiểu cầu bình thường, PT (Prothrombin Time: thời gian
prothrombin) bình thường, fibrinogen bình thường, APTT (Activated
Partial Thromboplastin Time: thời gian thromboplastin một phần hoạt
hóa) kéo dài > 1,5 giá trị bình thường.
+ Hoạt tính yếu tố VIII huyết tương giảm dưới 40%.
+ Yếu tố Von Willebrand bình thường
+ Các xét nghiệm khác: Mixtest xác định kháng thể kháng yếu tố VIII.
 Chẩn đoán mức độ bệnh
Nồng độ yếu tố VIII
Mức độ
Biểu hiện chảy máu
(%) (hoạt tính(UI/ml))
Chảy máu tự nhiên không liên
Nặng
<1% (<0,01)
quan đến chấn thương, thường
(Chiếm 70%)
chảy máu ở khớp và cơ.
Chảy máu tự nhiên hoặc liên
Trung bình
quan đến chấn thương nhỏ.
1-5% (0,01-0,05)
(Chiếm 15%)
Chảy máu nặng sau chấn
thương, phẫu thuật.
Nhẹ

Chảy máu sau chấn thương
> 5-40% (0,04-0,4)
(Chiếm 15%)
lớn hoặc phẫu thuật.


5

1.2. ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ CƠ SỞ PHÂN TỬ HEMOPHILIA A
1.2.1. Cơ chế di truyền bệnh hemophilia A
Đây là một bệnh di truyền liên kết với giới tính: Ở nam chỉ có một
NST giới tính X nên nếu NST giới tính X mang gen bệnh thì lượng yếu
tố VIII tạo ra không đủ và người đó bị bệnh hemophilia A. Đối với nữ
giới nhờ có hai NST X nên nếu một NST X mang gen bệnh thì gen
bình thường trên NST còn lại vẫn tổng hợp yếu tố VIII bình thường.
Người phụ nữ không bị bệnh nhưng mang một gen bị bệnh sẽ truyền
cho con trai và người con trai sẽ bị bệnh, nếu truyền cho con gái thì
người con gái sẽ trở thành người mang gen bệnh.

Hình 1.1: Sơ đồ di truyền của người mẹ mang gen kết hôn với bố bình thường

Hình 1.2: Sơ đồ di truyền của người mẹ bình thường kết hôn với bố bị bệnh

1.2.2. Cơ sở phân tử học bệnh hemophilia A


6

Từ năm 1984, nghiên cứu của Vehar và cộng sự đã cho thấy những
hiểu biết đầy đủ về cấu trúc phân tử gen F8 tổng hợp protein yếu tố

VIII, mở đường cho các nghiên cứu về cơ chế phân tử bệnh Hemophilia
A và các dạng đột biến gen F8 gây bệnh.
Trong con đường đông máu nội sinh, yếu tố VIII đóng vai trò là
đồng yếu tố với yếu tố IX hoạt hóa (IXa) với sự có mặt của Ca 2+ và
phospholipid tiểu cầu hoạt hóa yếu tố X thành Xa, từ đó tác động nên sự
hình thành thrombin từ prothrombin, giúp cho quá trình tạo và cố định
fibrin từ fibrinogen, hoàn thiện quá trình tạo cục máu đông cùng với
tiểu cầu và yếu tố thành mạch.Việc thiếu hụt hoặc bất thường chức năng
yếu tố VIII làm ngừng trệ dòng thác đông máu theo con đường nội sinh,
dẫn đến tình trạng chảy máu kéo dài, không cầm ở bệnh nhân
hemophilia A.
1.3. NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH HEMOPHILIA A
Hemophilia A là bệnh rối loạn di truyền do gen lặn nằm trên nhiễm
sắc thể giới tính X, gây nên do đột biến yếu tố VIII. Việc chẩn đoán
người lành mang gen bệnh là rất quan trọng để ngằn ngừa sự ra đời
của những đứa trẻ bị bệnh hemophilia A.
1.3.1. Đặc điểm chung người mang gen bệnh
Người lành mang gen bệnh là người mang một nhiễm sắc thể X có
đột biến gen F8 và một nhiễm sắc thể X bình thường. Biểu hiện lâm
sàng có thể nặng hoặc nhẹ.
Vì vậy người phụ nữ chắc chắn mang gen bệnh khi có một trong các
điều kiện: Có bố bị bệnh hemophilia A; Có ít nhất hai con trai bị bệnh
hemophilia A; Có một con trai bị bệnh hoặc có câu hoặc em trai bị
bệnh hoặc một người đàn ông có quan hệ huyết thống bị bênh
hemophilia A; Có một người con trai bị bệnh và trong gia đình chắc
chắn có một người phụ nữ mang gen bệnh.
Người phụ nữ có khả năng mang gen bệnh khi có ít nhất một người
bên họ ngoại bị bệnh nhưng không có con bị bệnh, hoặc có một con trai
bị bệnh Hemophilia A mà không có thành viên nào khác bị bệnh.

7

1.4. PHƯƠNG PHÁP THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM (IVF)
VÀ QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN TRƯỚC LÀM TỔ (PGD)
1.4.1. Phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (IVF)
Sự thành công của phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm được
đánh dấu bằng sự ra đời của đứa trẻ đầu tiên theo phương pháp này vào
năm 1978. Tính trung bình ở các nước như Thụy Điển, Úc và Hoa Kỳ
thì cứ khoảng 50-80 trẻ thì có một trẻ được sinh ra bằng phương pháp
thụ tinh trong ống nghiệm. Hàng năm có khoảng hơn 120 nghìn cặp vợ
chồng ở Hoa Kỳ thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm. Trong tương lai,
số trẻ ra đời bằng phương pháp này sẽ còn tăng cao bởi sự gia tăng độ
tuổi trung bình khi kết hôn, độ tuổi trung bình khi mang thai lần đầu và
sự gia tăng về tỷ lệ vô sinh của các cặp vợ chồng trên thế giới.
1.4.2. Quy trình chẩn đoán gen trước làm tổ (PGD)
Kỹ thuật PGD hiện nay là một kỹ thuật hoàn chỉnh, cho phép các
cặp vợ chồng có nguy cơ truyền các bệnh lý di truyền cho con có thể có
cơ hội sinh con không mắc bệnh mà không phải chẩn đoán tiền sản sau
khi mang thai và bỏ thai khi phát hiện bệnh lý ở thai. Kỹ thuật PGD
dựa trên việc phát hiện các bất thường di truyền ở phôi (in-vitro) và chỉ
cấy trở lại vào lòng tử cung các phôi không có các bất thường về di
truyền.
1.4.2.3. Chỉ định của chẩn đoán trước làm tổ
Ngày nay PGD được áp dụng để chẩn đoán cho khoảng 170 bệnh lý
khác nhau. Càng ngày các nhà khoa học càng xác định được nhiều gen
liên quan đến các bệnh lý và xác định các dạng đột biến gây bệnh của
các gen này. Điều này cho phép PGD chẩn đoán xác định các phôi không
có các gen bệnh để chọn lọc và cấy các phôi này vào tử cung. Các đối
tượng khi thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm được khuyến khích sử

dụng quy trình này bao gồm: i) Các cặp vợ chồng mang gen gây bệnh di
truyền trên nhiễm sắc thể thường hoặc liên kết với nhiễm sắc thể giới
tính. ii) Những người có sự bất thường về cấu trúc nhiễm sắc thể như
mất đoạn, đảo đoạn, lặp đoạn và chuyển đoạn. iii) Phụ nữ lớn tuổi, phụ
nữ tiếp xúc với hóa chất, phóng xạ… để tránh những bất thường về
nhiễm sắc thể có thể xảy ra và di truyền cho con của họ. iv) Phụ nữ có
tiền sử xảy thai, thai lưu nhiều lần. v) Các cặp vợ chồng đã được thực
hiện phương pháp IVF trước đó nhưng không thành công mà không rõ
nguyên nhân


8

1.4.3. Các phương pháp và kỹ thuật sinh học phân tử mới nhất áp
dụng trong việc chẩn đoán trước làm tổ
1.4.3.1. PCR và Multiplex-PCR
PCR là kỹ thuật đầu tiên được áp dụng vào PGD bởi Handyside và
cộng sự vào năm 1990 khi xác định các đoạn trình tự lặp lại trên nhiễm
sắc thể Y để xác định giới tính của phôi trong chẩn đoán các bệnh di
truyền liên kết với NST giới tính và chuyển các phôi không mắc bệnh
vào tử cung.
1.4.3.2. Fluorescence in situ hybridization (FISH)
Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) là kỹ thuật di truyền tế bào
– phân tử, sử dụng đầu dò DNA gắn huỳnh quang lai với trình tự DNA
đặc hiệu đích trên nhiễm sắc thể của tế bào ở gian kỳ hoặc các nhiễm
sắc thể ở kỳ giữa, qua đó phát hiện được sự có mặt hay vắng mặt của
một đoạn gen nào đó bằng kính hiển vi huỳnh quang
1.4.3.3. Microsatellite DNA
Microsatellite DNA được phát triển dựa trên kỹ thuật PCR tiêu chuẩn
với việc sử dụng các primer có gắn huỳnh quang và máy giải trình tự gen

(automated DNA sequencer) để xác định các sản phẩm PCR. Với các
đầu dò huỳnh quang đặc hiệu cùng với kỹ thuật tăng cường hình ảnh
thông qua máy vi tính nên các đoạn DNA khuếch đại gắn huỳnh quang
có thể được phát hiện ở nồng độ thấp hơn rất nhiều so với việc xác định
DNA trên gel điện di agarose hay acrylamide. Kỹ thuật này có độ chính
xác và độ tin cậy cao kể cả khi thực hiện phản ứng để xác định các gen
mang đột biến ở thể dị hợp tử. Trong những năm gần đây, kỹ thuật này
được phát triển thêm một bước nữa khi sử dụng các marker đa hình
(polymorphic marker) trên các nhiễm sắc thể để xác định sự có mặt của
các alen khác nhau. Kỹ thuật này dựa trên các thông tin đa hình của các
đoạn trình tự lặp ngắn (short tandem repeat: STRs).


9

CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu: 35 gia đình bệnh nhân hemophilia A:
- 35 bệnh nhân hemophilia A đã được xác định đột biến gen tại
Trung tâm nghiên cứu Gen – Protein, Trường Đại học Y Hà Nội.
- 35 người mẹ bệnh nhân.
- 42 thành viên nữ (bà ngoại, bà họ, bác gái, dì, chị, em gái....) có cùng
huyết thống với bệnh nhân.
- Lựa chọn 12 gia đình bệnh nhân được chẩn đoán xác định là bệnh
hemophilia A gồm: cặp vợ chồng có nguyện vọng sinh con bằng kỹ
thuật PGD và bệnh nhân hemophilia A (người con trai hoặc thành viên
gia đình).
* Tiêu chuẩn chẩn đoán hemopphilia A:
+ Lâm sàng:
- Chảy máu: Chảy máu khó cầm sau chấn thương, va chạm hay chảy

máu tự nhiên.
- Vị trí: Chảy máu trong khớp, cơ hoặc một số vị trí khác.
- Tính chất: Thường chảy máu tái phát.
- Tiền sử: có tiền sử chảy máu kéo dài hoặc trong gia đình có người
thân bị chảy máu khó cầm.
+ Cận lâm sàng:
- APTT kéo dài.
- Định lượng FVIII, IX giảm dưới 30%.
- Thời gian máu chảy bình thường.
- Số lượng tiểu cầu và độ tập trung tiểu cầu bình thường.
- Prothrombin bình thường.
- Yếu tố von Willebrand bình thường.
* Tiêu chuẩn loại trừ:
+ Bệnh nhân mắc bệnh Von-Willebrand.
+ Các bệnh lý di truyền gây kéo dài APTT: giảm yếu tố XI, XII, prekallikrelin.
+ Bệnh lý lưu hành kháng FVIII: bệnh tự miễn (lupus).
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả cắt ngang.
2.3. Thời gian địa điểm nghiên cứu
+ Trung tâm nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội.
+ Thời gian từ 12/2015 – 5/2018


10

2.4. Đạo đức trong nghiên cứu
Đề tài đã được thông qua Hội đồng đạo đức của Trường Đại học Y Hà
Nội học theo Quyết định số số 187/HĐĐĐHYHN, ngày 20/02/2016
2.5. Kinh phí thức hiện đề tài
Đề tài được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài nhánh

cấp nhà nước “Xây dựng quy trình chẩn đoán trước làm tổ bằng kỹ
thuật microsatellte DNA để sàng lọc một số bệnh lý di truyền liên kết
nhiễm sắc thể giới tính” thuộc thuộc chương trình KC04.17/11-15.
2.6. Quy trình và các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: Thu thập thông tin
bệnh nhân theo bệnh án nghiên cứu. Kỹ thuật tách chiết DNA từ các
mẫu máu ngoại vi. Kỹ thuật giải trình tự xác định đột biến gen, quy
trình phát hiện người lành mang gen bệnh bằng kỹ thuật microsatellite
Dna, Quy trình chẩn đoán trước làm tổ bệnh hemophilia A bằng kỹ
thuật microsatellite DNA. Quy trình nghiên cứu theo sơ đồ.
SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU


11

* Thiết kế nghiên cứu trên những gia đình làm PGD


12

Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. KẾT QUẢ PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN F8 BỊ
ĐỘT BIẾN BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE DNA
3.1.1. Kết quả xác định marker dị hợp tử gen F8 trên bệnh nhân
và người lành mang gen bệnh bằng kỹ thuật microsatellite DNA
Biểu đồ 3.1: Kết quả đồng hợp tử và đồng hợp tử của STR
Nhận xét: Kết quả cho thấy với việc sử dụng 4 marker FXS 1108,
DXS 9897, F8int22, DXS9901 thì hai marker DXS9897 và DXS9901
cho tỷ lệ dị hợp tử cao hơn 55,2%. Vì vậy trong nghiên cứu sẽ ưu

tiên sử dụng marker này trước.
3.1.2. Kết quả phát hiện người lành mang gen F8 bị đột biến bằng
kỹ thuật microsatellite DNA
Kết quả đối chiếu hai phương pháp xác định người lành mang gen
bệnh hemophilia A
Bảng 3.1. So sánh kết quả phát hiện người lành mang gen bệnh
bằng 2 phương pháp
Bệnh
nhân

Exon

HA16 14
HA30 8

Dạng đột biến

c.4996-4997insA
Thr1904Asn fs*2
c.1095-1096insG

HA37 14

c.5092T>C
p.lle1698 Thr

HA50 14

c. 4026G>T
p. Glu1342stop

HA61 4

Thành
viên gia
đình

Mẹ
Dì
Bác gái
Mẹ
Em gái
Mẫu ối
Mẹ
Chị gái
Mẹ
Bác
Chị họ 1
Chị họ 2

c. 435-450del15bp)
Mẹ
p.135 -139 Tyr-Val

Microsatellite
DNA
Không
Không
Mang
Mang

mang
mang
gen
gen
gen
gen
Sequencing

+

+
-

+
+
+

+
+
+

+
+
+
+

+
+
+
+

-

-

+

+

+

+


13

Nhận xét: Kết quả cho thấy, kết quả phát hiện người lành mang
gen bệnh bằng kỹ thuật giải trình tự gen và kỹ thuật MicrosatelliteDNA hoàn toàn trùng khớp nhau.

Hình 3.1. Hình ảnh giải trình tự gen của gia đình mã số HA16
(Mũi tên đỏ chỉ vị trí đột biến)
Nhận xét: Hình ảnh giải trình tự exon 14 gen F8 của người mẹ và bác
của bệnh nhân HA16 xuất hiện các đỉnh chồng lên nhau sau điểm đột
biến c.4996-4997insA, chứng tỏ mẹ và bác bệnh nhân mang gen F8
đột biến ở trạng thái dị hợp tử. Dì bệnh nhân không xuất hiện các đỉnh
đột biến, nên dì bệnh nhân là người bình thường.


14

Hình 3.2. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi
DXS9901 và DXS9897 của gia đình HA16
Nhận xét: Kết quả trên cho thấy ở vùng trình tự lặp lại DXS 9798,
DXS9901, mẹ của bệnh nhân xuất hiện 2 đỉnh, mỗi đỉnh tương ứng
với 1 alen. Ở đỉnh trùng với đỉnh của bệnh nhân chính là đỉnh của alen
đột biến, tức là bệnh nhân sẽ nhận alen đột biến này từ người mẹ, mẹ
bệnh nhân mang gen F8 đột biến ở trạng thái dị hợp tử. Bác bệnh nhân
xuất hiện 2 đỉnh trùng với alen đột biến của bệnh nhân nên bác bệnh
nhân mang gen bệnh. Dì bệnh nhân xuất hiện hai đỉnh không trùng với
bệnh nhân, nên dì bệnh nhân là người bình thường.
Kết quả xác định người lành mang gen bệnh bằng kỹ thuật
microsatellie DNA
Bảng 3.3. Tỷ lệ phát hiện người lành mang gen bệnh bằng kỹ thuật
microsatellite-DNA


15

Mang gen Không mang gen
Tổng
bệnh
bệnh
số
n (%)
n (%)
Mẹ bệnh nhân
35(100)
0(0)
35
Thành viên nữ khác

33(78,6)
9 (21,4)
42
Tổng
68/77(88,3)
9/77 (11,7)
77
Chú thích: Thành viên nữ khác bao gồm: em gái, chị, dì, bác gái, bà
ngoại, chị họ, em họ của bệnh nhân
3.2. KẾT QUẢ CHẨN ĐOÁN TRƯỚC LÀM TỔ BỆNH
HEMOPHILIA BẰNG KỸ THUẬT MICROSATTELITE DNA
Thành viên gia đình

Hình 3.3. Kết quả multiplex PCR xác định phôi nam bình thường
gia đình HA28
Nhận xét: Kết quả trên cho thấy xuất hiện 2 đỉnh ở vùng marker
giới tính Amel tương ứng với nhiễm sắc thể giới tính X và Y, và 1 đỉnh
ở vùng marker giới tính SRY tương ứng với nhiễm sắc thể giới tính Y
chứng tỏ đây là phôi nam.
Với marker FXS1108, ở phôi xuất hiện đỉnh kích thước 166bp
tương ứng với đỉnh của alen bình thường, không xuất hiện đỉnh kích
thước 177bp tương ứng với đỉnh của alen đột biến. Tương tự như vậy,
với marker DXS9897 ở phôi cũng xuất hiện đỉnh 260 bp tương ứng với
đỉnh của alen bình thường, không xuất hiện đỉnh kích thước 256bp
tương ứng với đỉnh của alen đột biến. Kết quả này khẳng định đây là
phôi nam bình thường không mang alen đột biến gen F8 của người mẹ.


16

Hình 3.4. Kết quả multiplex PCR xác định phôi nam bệnh lý
gia đình HA28
Nhận xét: Kết quả trên cho thấy xuất hiện 1 đỉnh ở vùng marker giới
tính SRY tương ứng với nhiễm sắc thể giới tính Y, chứng tỏ đây là phôi
nam. Với marker FXS 1108, ở phôi xuất hiện đỉnh kích thước 177bp
tương ứng với đỉnh của alen bệnh lý trùng với đỉnh alen của bệnh nhân,
không xuất hiện đỉnh kích thước 166bp tương ứng với đỉnh của alen bình
thường. Tương tự như vậy, với marker DXS9897 ở phôi cũng xuất hiện
đỉnh 256 bp tương ứng với đỉnh của alen bệnh lý trùng với đỉnh alen của
bệnh nhân, không xuất hiện đỉnh kích thước 260 bp tương ứng với đỉnh
của alen bình thường. Với kết quả trên có thể khẳng định đây là phôi
nam bệnh lý mang alen đột biến gen F8 của người mẹ.

Hình 3.5. Kết quả multiplex PCR xác định phôi nữ mang gen
gia đình HA28
Nhận xét:


17

Kết quả trên cho thấy xuất hiện 1 đỉnh 103 bp ở vùng marker giới
tính Amel X, đây là marker khuếch đại nhiễm sắc thể X, có vùng trình
tự lặp lại giống nhau giữa 2 nhiễm sắc thể X, nên chỉ có 1 đỉnh. Kết
quả này chứng tỏ đây là phôi nữ.
Với marker DXS FXS1108, ở phôi xuất hiện kích thước 177bp
tương ứng với đỉnh của alen đột biến (alen bệnh lý). Tương tự như vậy,
với marker DXS9897 ở phôi cũng xuất hiện đỉnh đỉnh kích thước 256
bp tương ứng với đỉnh của alen đột biến. Cả 2 marker đều không xuất
hiện đỉnh của alen bình thường. Kết quả này có thể khẳng định đây là
phôi nữ mang gen

Hình 3.6. Kết quả multiplex PCR xác định phôi nữ không mang gen
gia đình HA28
Nhận xét:
Kết quả trên cho thấy xuất hiện 1 đỉnh 103 bp ở vùng marker giới
tính Amel X, đây là marker khuếch đại nhiễm sắc thể X, có vùng trình
tự lặp lại giống nhau giữa 2 nhiễm sắc thể X, nên chỉ có 1 đỉnh. Kết
quả này chứng tỏ đây là phôi nữ.
Với marker DXS1108, ở phôi xuất hiện kích thước 166bp tương
ứng với đỉnh của alen bình thường. Tương tự như vậy, với marker
DXS9897 ở phôi cũng xuất hiện đỉnh kích thước 260 bp tương ứng với
đỉnh của alen bình thường. Cả 2 marker đều không xuất hiện đỉnh của


18

alen bệnh lý. Kết quả này có thể khẳng định đây là phôi nữ không
mang gen.


19

* Sơ đồ phả hệ phôi của gia đình HA28

Hình 3.7. Sơ đồ phả hệ gia đình HA28
Nhận xét:
Gia đình HA28 sau khi thụ tinh trong ống nghiệm, sinh thiết thôi
chẩn đoán thu được 01 phôi nam bình thường (II 2), 01 phôi nữ bình
thường (II5), 01 phôi nam bất thường (II3), 01 phôi nữ mang gen bệnh (II4).

20

* Tỷ lệ phôi sau chẩn đoán gen bằng kỹ thuật microsatellite DNA
Biểu đồ 3.2: Tỷ lệ phôi bất thường và không bất thường về gen
Nhận xét: Với việc sử dụng kỹ thuật microsatelite DNA trong chẩn
đoán trước làm tổ của 12 gia đình bệnh nhân Hemophilia A có nguyện
vọng sinh con khỏe mạnh. Trong tổng số 75 phôi được sinh thiết đển làm
xét nghiệm chẩn đoán gen, có 26/75 phôi phát hiện mang đột biến gen
gây bệnh hemophilia A, gồm phôi nam và phôi nữ bị bệnh, chiếm tỷ lệ
34,7%. Còn lại 49/75 phôi, chiếm tỷ lệ 65,3%, có kiểu hình bình thường;
gồm phôi nam, nữ bình thường và phôi nữ mang gen.
Chương 4
BÀN LUẬN
* Kết quả xác định người lành mang gen bệnh bằng kỹ thuật
microsatellite DNA
Bệnh hemophilia A là bệnh di truyền do thiếu hụt hoặc bất thường
chức năng của yếu tố VIII, với tỷ lệ 1-2 trong 10.000 trên toàn thế giới,
không có sự khác biệt về chủng tộc. Từ năm 1984, từ nghiên cứu của
Gitschite và cộng sự đã cho thấy những hiểu biết đầy đủ về cấu trúc
phân tử gen F8 tổng hợp protein yếu tố VIII: Gen F8 là một trong những
gen lớn của cơ thể, có kích thước 186 kb gồm 26 exon. Yếu tố FVIII là
một glycoprotein lớn có chức năng như một đồng yếu tố cần thiết cho
sự kích hoạt phân giải protein của yếu tố X kích hoạt bởi yếu tố IX
trong con đường đông máu nội sinh. Gen F8 mã hóa cho protein FVIII
gồm 2332 acid amin và có trọng lượng phân tử khoảng 300 kD. Khi
gen F8 bị đột biến, tế bào giảm hoặc mất khả năng tổng hợp yếu tố
FVIII gây nên bệnh hemophilia A. Hiểu biết đầy đủ về cấu trúc phân tử
gen F8 mở đường cho các nghiên cứu về cơ chế bệnh học phân tử
hemophilia A và các dạng đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia .

Sự ra đời và phát triển của sinh học phân tử giúp phát hiện ra các
dạng, các vị trí đột biến trên gen F8 gây bệnh hemophilia A. Hiện nay,
hàng năm có rất nhiều đột biến mới được công bố trên cơ sở dữ liệu
HAMSTeRS (Hemophilia A Mutation, Search, Test and Resource Site)


21

là trang quản lý thông tin về bệnh hemophilia A của nước Anh: đến
tháng 1/2013 đã có 2158 đột biến ở các vị trí khác nhau trên gen F8
được công bố, hay trên cơ sở dữ liệu của CDC (The Centers for
Disease Control and Prevention) là trang quản lý thông tin của Hoa Kỳ
về bệnh hemophilia A có tổng số 2556 vị trí đột biến gây bệnh đã được
công bố.
Hiện nay trên thế giới đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để
phát hiện người lành mang gen bệnh hemophilia A. Năm 2004, Lê Nhật
Minh và cộng sự nghiên cứu người lành mang gen bệnh hemophilia A
bằng cách sử dụng kỹ thuật enzym cắt giới hạn (PCR-RFLP). Năm 2014,
Bùi Thị Thu Hương và cộng sự sử dụng kỹ thuật I-PCR và kỹ thuật giải
trình tự gen để xác định người lành mang gen bệnh ở những gia đình đã
xác định được đột biến chỉ điểm trên bệnh nhân... Hiện nay, việc phát
hiện người lành mang gen bệnh thường được thực hiện bằng kỹ thuật
phát hiện đột biến trực tiếp trên gen F8 dựa vào đột biến chỉ điểm của
bệnh nhân. Tuy nhiên, chi phí cho việc phát hiện đột biến gen F8 khá cao
do kích thước của nó lớn (186kb) với 26 exon và hông phải bệnh nhân
nào cũng có điều kiện xét nghiệm gen, ngoài ra trong số những bệnh nhân
được xét nghiệm gen, vẫn còn một tỉ lệ nhất định (khoảng hơn 10%) bệnh
nhân chưa phát hiện được đột biến gen F.
Xuất phát từ thực tế đó nhóm nghiên cứu của chúng tôi thực hiện
phương pháp gián tiếp microsatellite-DNA xác định người lành mang

gen bệnh hemophilia A trên các thành viên nữ trong gia đình bệnh nhân
hemophilia A chưa xác định đột biến chỉ điểm để xác định được các
marker dị hợp tử và có hướng tư vấn di truyền và chẩn đoán trước làm
tổ cho những gia đình có nhu cầu sinh con hoàn toàn khỏe mạnh.
Nghiên cứu thực hiện trên 112 thành viên các gia đình hemophilia A
với việc sử dụng 4 STR thu được tỷ lệ dị hợp tử ở STR DXS 9897 và
DXS 9901 là cao nhất 55,2%, còn STR F8in22 và FXS1108 tỷ lệ dị hợp
tử thấp hơn. Điều đó càng khẳng định tính đa hình càng cao thì tỷ lệ dị
hợp tử càng tăng. Vì vậy với việc sử dụng các STR có tính đa hình cao
thì khả năng phát hiện người lành mang gen bệnh càng cao có ý nghĩa
trong việc quản lý bệnh nhân hemophilia A nói riêng và bệnh lý di
truyền nói chung. Như vậy với việc phát hiện tính đa hình cao của các
STR sẽ được ứng dụng trong phát hiện người lành mang gen và chẩn


22

đoán trước làm tổ bệnh lý di truyền.
Như vậy khi thực hiện đồng thời 2 kỹ thuật sequencing và
Microsatellite-DNA trên các thành viên trong 5 gia đình bệnh nhân
HA61, HA16, HA37, HA30, HA50 đã xác định được đột biến chỉ điểm
chúng tôi cũng thu được cùng kết quả là 13 thành viên nữ (mẹ, bà
ngoại, bác gái, chị bệnh nhân) mang gen bệnh và 3 thành viên nữ (mẫu
ối của mẹ bệnh nhân, chị họ bệnh nhân) không mang gen bệnh. Như
vậy, quy trình kỹ thuật microsatellite-DNA có sử dụng 4 cặp mồi
DXS9897, DXS9901, FXS1108, DXS9901, F8int22 đã được đánh dấu
huỳnh quang để khuyếch đại các vùng trình tự lặp lại STR được chuẩn
hóa quy trình multiplex PCR, sản phẩm khuếch đại PCR được điện di
trên hệ thống sequencing của hãng Beckman coulter rồi phân tích kết
quả bằng phần mềm Genome lab system như chúng tôi xây dựng để

xác định người lành mang gen bệnh hemophilia A là đúng và cho kết
quả chính xác với phương pháp giải trình tự gen. Vì vậy quy trình kỹ
thuật microsatellite-DNA đã được chuẩn hóa để áp dụng trong chẩn
đoán trước làm tổ. Với kỹ thuật microsatellite DNA có nhiều ưu điểm
hơn so với các kỹ thuật khác do có tính bền vững cao hơn, yêu cầu thao
tác kỹ thuật ít hơn, phù hợp với chẩn đoán có cỡ mẫu lớn, các chẩn
đoán trước làm tổ mẫu DNA tách chiết từ tế bào. Kỹ thuật này đang là
phương pháp hữu hiệu để phát hiện người lành mang gen bệnh ở Việt
Nam. Sự thành công của kỹ thuật này mở ra một ứng dụng mới trong
việc giảm sinh ra những đứa con bị bệnh bằng cách tư vấn chẩn đoán
trước làm tổ.
Nghiên cứu được thực hiện với 35 gia đình hemophilia A với 77
thành viên nữ, không sử dụng đột biến chỉ điểm mà chỉ dựa vào chẩn
đoán lâm sàng. Sử dụng kỹ thuật microsatellite DNA xác định các alen
đột biến. Kết quả cho thấy 35/35 người mẹ mang gen đột biến ở trạng
thái dị hợp tử chiếm 100% và 68/77 thành viên nữ là người lành mang
gen đột biến F8.
35/35 người mẹ mang gen bệnh (chiếm 100%). Kết quả xác định tình
trạng mang gen của người mẹ rất quan trọng: nếu người mẹ mang gen bệnh
có thể truyền bệnh cho con trai và truyền gen bệnh cho con gái của họ,,
bệnh có thể di truyền qua nhiều thế hệ và có nhiều người mắc bệnh trong
cùng một gia đình. Không có trường hợp người mẹ không mang gen bệnh


23

nên đột biến gen F8 ở người con bị bệnh không thể là hiện tượng
khảmhoặc đột biến mới phát sinh (denovo mutation), các thành viên nữ
trong gia đình bệnh nhân đều có nguy cơ mang gen bệnh.
68/77 người lành mang gen bệnh trên 35 gia đình bệnh nhân

hemophilia A (chiếm 88,3%) kết quả này cao hơn nghiên cứu của Shetty
S (2001) trên 102 gia đình bệnh nhân hemophilia A (Ấn Độ) thấy một tỷ
lệ người lành mang gen bệnh là 64,5%, cao hơn nghiên cứu của Bùi Thị
Thu Hương (2014) trên 50 gia đình bệnh nhân hemophilia A thấy một tỷ
lệ người lành mang gen bệnh là 53,6. Có sự khác biệt này có thể do kết
quả thu được trên cỡ mẫu còn nhỏ nên chưa thể kết luận được, cũng có
thể do đối tượng trong các nghiên cứu có tiền sử bệnh khác nhau, mà
các thành viên nữ trong gia đình có tiền sử bệnh càng rõ ràng thì có
nguy cơ mang gen bệnh cao hơ. Trong nghiên cứu này của chúng tôi
các thành viên nữ trong gia đình hemophillia A chưa đến đầy đủ tham
gia nghiên cứu có thể có những thành viên nữ trong gia đình bệnh nhân
còn mặc cảm hay lo sợ nên chưa đến kiểm tra để xác định tình trạng
mang gen. Với 68 người mang gen bệnh cần được tư vấn và tư vấn di
truyền, ngăn ngừa sinh ra những đứa trẻ bị bệnh hemophilia A, tăng
hiệu quả trong tác phòng ngừa bệnh tật.
Việc xác định người lành mang gen bệnh rất quan trọng, bởi nếu
người mẹ mang gen bệnh thì mẹ có tính chất di truyền, truyền gen bệnh
cho con trai biểu hiện bệnh trên lâm sàng.
Qua nghiên cứu cho thấy những người phụ nữ mang gen bệnh cần
phải có kế hoạch dự phòng để đảm bảo sức khỏe chung và sức khỏe
sinh sản nói riêng nhằm nâng cao chất lượng cuộc sống bản thân, gia
đình và xã hội. Kết quả có 9 phụ nữ không mang gen bệnh, sẽ giúp cho
9 người phụ nữ hoàn toàn yên tâm thoát khỏi nỗi ám ảnh bệnh tật, lo
lắng trong cuộc sống. Người phụ nữ với thiên chức làm mẹ rất vất vả,
những người phụ nữ mang gen bệnh hemophilia A còn có nỗi ám ảnh,
nỗi lo lắng và sự vất vả hơn rất nhiều, lo cho việc sinh ra đứa con bị
bệnh, khó khăn trong việc sinh đẻ do nguy cơ chảy máu sản khoa. Tuy
nhiên còn có khó khăn nữa là có những người phụ nữ không biết mình
mang gen bệnh do thiếu hiểu biết về bệnh và không được tuyên truyền
tư vấn hôn nhân. Mặc dù đây không phải là kỹ thuật sinh học phân tử

đầu tiên xác định người lành mang gen bệnh. Năm 2014 Bùi Thị thu


24

Hương và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật I-PCR phát hiện người lành
mang gen bệnh dựa vào đột biến chỉ điểm, kỹ thuật này cho kết quả
chính xá. Tuy nhiên với kỹ thuật này phải dựa vào đột biến chỉ điểm
trên bệnh nhân bằng kỹ thuật sequencing là một kỹ thuật khó, vất vả và
tốn kém. Trong khi đó gia đình các bệnh nhân hemophilia A đều là
những gia đình khó khăn, nên việc thực hiện được kỹ thuật I-PCR để
phát hiện đột biến sẽ bị hạn chế. Vì vậy kỹ thuật microsatellite DNA ra
đời nhằm giúp cho những bệnh nhân hemophilia A có khả năng thực
hiện được cao hơn vì kỹ thuật này nhanh chóng, đơn giản để phân tích
liên kết bệnh hemophillia A trong các gia đình không thể xác định được
các đột biến.
Kết quả chẩn đoán trước làm tổ
Việc phát hiện người lành mang gen bệnh là cơ sở quan trọng để tiến
hành chẩn đoán trước sinh nhằm phát hiện sớm những thai nhi mang gen
bệnh, giảm sinh ra những đứa trẻ bị bệnh. Với việc tầm soát trước sinh
được thực hiện bằng cách lấy mẫu ối ở tuần thai 15-18, đã được nghiên
cứu bằng kỹ thuật I-PCR. Tuy nhiên, với việc sàng lọc khi mang thai có
nhược điểm là nếu xác định được thai nhi đó bị bệnh sẽ phải đình chỉ thai
khi tuần thai đã quá lớn, ảnh hưởng đến tâm sinh lý của người mẹ, ảnh
hưởng chất lượng của những lần mang thai sau. Vì vậy, kỹ thuật chẩn
đoán trước làm tổ giúp cho các cặp vợ chồng có khả năng sinh ra được
những đứa con hoàn toàn khỏe mạnh mà không phải đình chỉ thai. Đối
tượng cần chẩn đoán trước làm tổ trong nghiên cứu của chúng tôi là
những người phụ nữ mang gen bệnh đã từng hoặc chưa từng sinh con bị
bệnh hemophillia A đã được xác định có mang gen bệnh ở trạng thái dị

hợp tử bằng kỹ thuật microsattellite DNA. Nghiên cứu thực hiện trên 75
phôi bào sinh thiết, kết quả thu được 49/75 (65,3%)phôi bình thường,
26/75 (34,7%) phôi bất thường. Điều này cho thấy: nếu không có chẩn
đoán gen trước làm tổ thì xác suất sinh ra những đứa trẻ bị bệnh trong
cộng đồng là 34,7% là nỗi gánh nặng cho gia đình và xã hội. Như vậy
cùng với sự phát triển của đất nước, các kỹ thuật sinh học phân tử ngày
càng phát triển, từ việc phát hiện ra được các đột biến gen trực tiếp trên
bệnh nhân, đến việc chấn đoán sớm thai phụ ở tuần thai thứ 15 làm ảnh
hưởng đến chất lượng, tâm sinh lý của người phụ nữ, ngày nay kỹ thuật
microsatellite DNA ra đời đã giải quyết được những hạn chế của những


25

phương pháp đó. Vì vậy, việc sinh ra một đứa trẻ khỏa mạnh trên những
gia đình có người mắc bệnh hemophilia A là điều không còn khó khăn
nữa. Đối với những gia đình khó khăn về con cái, sự mong mỏi có đứa
con rất lớn, mặc dù phôi sinh thiết là phôi mang gen bệnh.Những phôi
thai này sau khi lớn lên chắc chắn sẽ phải tư vấn di truyền chẩn đoán
trước sinh, chẩn đoán trước làm tổ.
KẾT LUẬN
Từ kết quả nghiên cứu có thể đưa ra một số kết luận sau:
1. Phát hiện người lành mang gen F8 bị đột biến bằng kỹ thuật
microsatellite DNA
Trong 35 gia đình có con bị bệnh hemophilia A đã được chẩn đoán lâm sàng:
- 35/35 người mẹ mang gen F8 đột biến ở trạng thái dị hợp tử,
chiếm tỷ lệ 100%
- 33/42 thành viên nữ (gồm bà ngoại, bác, dì, chị, em gái…) mang
gen bệnh ở trạng thái dị hợp tử, chiếm tỷ lệ 78,6%; 9/42 thành viên nữ
không mang gen bệnh, chiếm tỷ lệ 21,4%.

2. Chẩn đoán trước làm tổ bệnh hemophilia A bằng kỹ thuật
microsatellite DNA
12/35 thai phụ là người lành mang gen bệnh được thực hiện chẩn
đoán trước làm tổ.
- Tổng số phôi được xét nghiệm gen là 75 phôi, trong đó số phôi
bất thường về gen chiếm 34,7%, số phôi bình thường chiếm 65,3%.
- 9/12 người mẹ bệnh nhân có phôi bình thường sau khi phân tích gen.