Nghiên cứu tìm kiếm các hoạt chất gây độc tế bào ung thư từ loài san hô mềm menella woodin ở vùng biển cô tô

viÖn HµN L¢M khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam

ViÖn c«ng nghÖ sinh häc

CHÂU NGỌC ĐIỆP

NGHIÊN CỨU TÌM KIẾM CÁC HOẠT CHẤT
GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ TỪ LOÀI SAN
HÔ MỀM MENELLA WOODIN Ở VÙNG BIỂN
CÔ TÔ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2019


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Châu Ngọc Điệp

NGHIÊN CỨU TÌM KIẾM CÁC HOẠT CHẤT GÂY
ĐỘC TẾ BÀO UNG THƢU TỪ LOÀI SAN HÔ MỀM

MENELLA WOODIN Ở VÙNG BIỂN CÔ TÔ
Chuyên ngành: Hóa sinh học
Mã số: 9420116

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS. Nguyễn Hoài Nam
Viện Hóa sinh biển
2. PGS.TS. Đỗ Thị Thảo
Viện Công nghệ sinh học

Hà Nội, 2019


Lời cảm ơn
Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Nguyễn Hoài
Nam và PGS.TS. Đỗ Thị Thảo là hai thầy đã hướng dẫn tận tình, chu đáo, chia sẻ
những kinh nghiệm quí báu và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này.
Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam và Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương - Phân Viện Viễn
đông Liên Xô, Viện Hàn lâm Khoa học Nga, Liên Bang Nga đã tạo điều kiện cho tôi
làm việc, hoàn thành các thủ tục giấy tờ và học tập trong phòng thí nghiệm để thực
hiện tốt luận án này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới tập thể Phòng Dược liệu biển, Viện Hóa sinh
biển đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án này
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện
Công nghệ Sinh học, đã giúp đỡ tôi hoàn thành các nghiên cứu về hoạt tính sinh
học.
Tôi xin cảm ơn GS.TS. Valentin A. Stonik và các cộng sự Viện Hóa sinh Hữu
cơ Thái Bình Dương đã giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập tại Viện.
Tôi xin cảm ơn GS.TS. Đỗ Công Thung và các cán bộ kiêm thợ lặn Viện Tài
nguyên và Môi trường biển, đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thu
mẫu ngoài biển.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới cơ sở đào tạọ Viện Công nghệ sinh
học và ThS. Bùi Thị Hải Hà cán bộ phụ trách đào tạo đã giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình học tập ở đây.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã cổ vũ, động viên
tôi hoàn thành luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày … tháng …. năm 2019
Tác giả
NCS. Châu Ngọc Điệp
i


Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện, một số kết quả có được
cùng cộng tác với các cộng sự khác
Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực, một số kết quả lần đầu tiên
được công bố trên tạp chí khoa học chuyên ngành có uy tín với sự đồng ý và cho
phép của các đồng tác giả
Phần còn lại chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác
Hà Nội, ngày … tháng …. năm 2019
Tác giả

NCS. Châu Ngọc Điệp

ii


MỤC LỤC
Lời cảm ơn…………………………………………………………………………………………...
Lời cam đoan………………………………………………………………………………………..
MỤC LỤC…………………………………………………………………………………………....
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT……………………………..

DANH MỤC CÁC BẢNG……………………………………………………………………..
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ..............................................................................
ĐẶT VẤN ĐỀ.....................................................................................................................................
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN......................................................................................................
1.1.
1.1.1.
1.1.2.
1.1.3.
1.2.

Đặc điểm chung về san hô mềm.................................................................
Đặc điểm sinh học của san hô mềm........................................................................

Đặc điểm sinh sản..................................
Đặc điểm phân bố............................................................................................................

Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính gây

bào ung thƣ của giống Menela.................................................................
1.2.1.

Tình hình nghiên cứu trên thế giới...........

1.2.2. Tình hình nghiên cứu về một số loài san hô mềm ở Việt Nam.................
1.3.

Giới thiệu về loài san hô mềm Menella woodin..................................

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........................
2.1.

Vật liệu nghiên cứu............................................................................................

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu...................................................................................................
2.2.1.

Phương pháp xử lý mẫu, tạo dịch chiết..................................................

2.2.2.

Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hóa học......................................

2.2.3.

Phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư.........................

2.2.4.

Phương pháp xác định hoạt tính ức chế sản sinh ROS ...................................

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU...........................................................................
3.1.

Thu mẫu, xử lý mẫu, tạo dịch chiết..........................................................

3.2.

Sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của mẫu dịch chiết

3.3.

Phân lập các hợp chất từ loài Menella woodin...........................

iii


3.4 Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập đƣợc....................37
3.4.1.

Hợp chất MW1 (Menellsteroid E): 1β,3β,5α,11β

tetrahydroxycholestan-6-one (chất mới).................................................................. 37
3.4.2.

Hợp chất MW2 (Menellsteroid F): Cholest-24-ene-3β,5α,6β,11βtetraol (chất mới).............................................................................................................. 38

3.4.3.

Hợp chất MW3 (Menellsteroid G): 24-methylcholest-24(28)-ene-3β,

5α,6β,11β-tetraol (chất mới)......................................................................................... 39
3.4.4.

Hợp chất MW4 (Menellsteroid H): 24-Norcholest-22(E)-ene

3β,5α,6β,11β-tetraol (chất mới).................................................................................. 40
3.4.5.

Hợp chất MW5: cholest-3β,5α,6β,11β-tetraol....................................................... 41

3.4.6.

Hợp chất MW6: Menellsteroid B............................................................................... 41

3.4.7.

Hợp chất MW7: (22E,24S)-24-methyl-5α-cholesta-7,22 diene-

3β,5α,6β,9-tetraol............................................................................................................. 42
3.4.8.

Hợp chất MW8: (1S,2R,8S,10R)-1,8-epoxy-2-hydroxy-guaian-3,5,7trien-12,8-olide (chất mới)............................................................................................ 42

3.4.9.

Hợp chất MW9: (1R,2S,8S,10R)-1,2-dihydroxy-8-methoxy-guaian3,5,7-trien-12,8-olide (chất mới)................................................................................ 43

3.4.10. Hợp chất MW10: Menelloide F (chất mới)............................................................ 44
3.4.11. Hợp chất MW11: Menelloide G (chất mới)............................................................ 45
3.4.12. Hợp chất MW12: Menverin A..................................................................................... 46
3.4.13. Hợp chất MW13: Menverin B..................................................................................... 46
3.4.14. Hợp chất MW14: Menverin C..................................................................................... 46
3.4.15. Hợp chất MW15: Menverin F...................................................................................... 47
3.4.16. Hợp chất MW16: Menelloide B.................................................................................. 47
3.4.17. Hợp chất MW17: 1S*,4S*,5S*,10R*-4,10-Guaianediol................................... 48
3.5. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các hợp chất phân lập
đƣợc............................................................................................................................................... 48
3.6. Xác định hoạt tính ức chế sản sinh ROS...................................................................... 49
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU................................................ 51

iv


4.1. Hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết thô................................................................... 51

4.2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập đƣợc............................. 51
4.2.1.

Hợp chất MW1: Menellateroid E (1β,3β,5α,11β

tetrahydroxycholestan-6-one) (chất mới)................................................................ 51
4.2.2.

Hợp chất MW2: Menellsteroid F (Cholest-24-ene-3β,5α,6β,11β-

tetraol) (chất mới)............................................................................................................. 53
4.2.3.

Hợp chất MW3: Menellsteroid G (24-methylcholest-24 (28)-ene3β,5α,6β,11β-tetraol) (chất mới)................................................................................... 54

4.2.4.

Hợp chất MW4: Menellsteroid H (24-Norcholest-22(E)-ene3β,5α,6β,11β-tetraol) (chất mới)................................................................................... 55

4.2.5.

Hợp chất MW5: cholest-3β,5α,6β,11β-tetraol....................................................... 56

4.2.6.

Hợp chất MW6: Menellsteroid B (cholest-22-ene-3β,5α,6β,11βtetraol)................................................................................................................................... 58

4.2.7.

Hợp chất MW7: (22E,24S)-24-methyl-5α-cholesta-7,22-diene-

3β,5α,6β, 9-tetraol............................................................................................................ 59
4.2.8.

Hợp chất MW8: (1S,2R,8S,10R)-1,8-epoxy-2-hydroxy-guaian-3,5,7trien-12,8-olide (chất mới)............................................................................................ 61

4.2.9.

Hợp chất MW9: (1R,2S,8S,10R)-1,2-dihydroxy-8-methoxy-guaian-3,
5,7-trien-12,8-olide (chất mới).................................................................................... 64

4.2.10. Hợp chất MW10: Menelloide F (chất mới)............................................................ 67
4.2.11. Hợp chất MW11: Menelloide G (chất mới)............................................................ 69
4.2.12. Hợp chất MW12: Menverin A..................................................................................... 71
4.2.13. Hợp chất MW13: Menverin B..................................................................................... 72
4.2.14. Hợp chất MW14: Menverin C..................................................................................... 73
4.2.15. Hợp chất MW15: Menverin F...................................................................................... 74
4.2.16. Hợp chất MW16: Menelloide B.................................................................................. 76
4.2.17. Hợp chất MW17: 1S*,4S*,5S*,10R*-4,10-Guaianediol................................... 77
4.3. Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các hợp chất phân lập đƣợc..............80
4.4. Hoạt tính ức chế sản sinh ROS......................................................................................... 80

v

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................................... 82
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN..................... 83
TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH....................................................................... 84
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................................ 89
PHỤ LỤC

vi


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
Ac
CC
CD
CH2Cl2
CHCl3
13

1

C-NMR

1

H- H COSY
CTPT
DEPT
ESI-MS
Et
EtOAc

Hep-G2
HL-60
HMBC
1

H-NMR

vii


HPLC

HR-ESI-MS
IC50
IR
J (Hz)
KB
LD50
LNCaP
LU-1
MCF-7
Me
MeOH
Mp
MPLC
n-Hexane
NIH/3T3
NOESY
OD
OMe

viii


Ph
SK-Mel-2
SRB
TLC
TMS
UV
δ (ppm)
[α]D

ix


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1.

Các loại thuốc điều trị ung thư đã được FDA chứng nhận thương

mại có nguồn gốc từ sinh vật biển 16
Bảng 1.2.

Một số hợp chất tiềm năng cho trị liệu ung thư từ san hô mềm..............16

Bảng 3.1.

Kết quả xác định giá trị IC50 của mẫu MW..................................................... 33

Bảng 3.2.

Số liệu phổ NMR của hợp chất MW1............................................................... 37

Bảng 3.3.

Số liệu phổ NMR của hợp chất MW2............................................................... 38

Bảng 3.4.

Số liệu phổ NMR của hợp chất MW3............................................................... 39

Bảng 3.5.

Số liệu phổ NMR của hợp chất MW4............................................................... 40

Bảng 3.6.

Số liệu phổ NMR của hợp chất MW8............................................................... 43

Bảng 3.7.

Số liệu phổ NMR của hợp chất MW9............................................................... 43

Bảng 3.8.

Số liệu phổ NMR của hợp chất MW10............................................................ 44

Bảng 3.9.

Số liệu phổ NMR của hợp chất MW11............................................................ 45

Bảng 3.10. Kết quả xác định giá trị IC50 của các hợp chất được lựa chọn

49

Bảng 4.1.

Số liệu phổ NMR của hợp chất MW5............................................................... 57

Bảng 4.2.

Số liệu phổ NMR của hợp chất MW6............................................................... 58

Bảng 4.3.

Số liệu phổ NMR của hợp chất MW7............................................................... 60

Bảng 4.4.

Số liệu phổ NMR của hợp chất MW12............................................................ 71

Bảng 4.5.

Số liệu phổ NMR của hợp chất MW13............................................................ 72

Bảng 4.6.

Số liệu phổ NMR của hợp chất MW14............................................................ 74

Bảng 4.7.

Số liệu phổ NMR của hợp chất MW15............................................................ 75

Bảng 4.8.

Số liệu phổ NMR của hợp chất MW16............................................................ 76

Bảng 4.9.

Số liệu phổ NMR của hợp chất MW17............................................................ 77

x


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1.

Sơ đồ phả hệ của giống Menella........................................................................... 5

Hình 1.2.

Các dạng tập đoàn san hô mềm chủ yếu............................................................ 6

Hình 1.3.

Cấu trúc hóa học của các hợp chất (1-8)............................................................ 8

Hình 1.4.

Cấu trúc hóa học của các hợp chất (9-17).......................................................... 9

Hình 1.5.

Cấu trúc hóa học của các hợp chất (18-23)..................................................... 10

Hình 1.6.

Cấu trúc hóa học của các hợp chất (24), (25) và (26)................................. 10

Hình 1.7.

Cấu trúc hóa học của các hợp chất (27), (28), (29), (30), (31), (32)............11

Hình 1.8.

Cấu trúc hóa học của các hợp chất (33), (34), (35), (36), (37),

(38) và (39) 11
Hình 1.9.

Cấu trúc hóa học của các hợp chất (40-66)..................................................... 12

Hình 1.10. Cấu trúc hóa học của các hợp chất (67-75)..................................................... 13
Hình 1.11. Cấu trúc hợp chất cholest-1β,3β,5α,6β-tetrol (80)....................................... 15
Hình 1.12. Cấu trúc hóa học của các hợp chất (93-100) phân lập từ loài
Cladiella sp. 18
Hình 1.13. Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ loài Lobophytum
sp. và loài Lobophytum leavigatum

18

Hình 1.14. Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ loài Sinularia
leptoclados 19
Hình 1.15. Cấu trúc vi xương của loài Menella woodin................................................... 21
Hình 2.1.

Mẫu san hô mềm Menella woodin thu thập ở quần đảo Cô Tô...............22

Hình 2.2.

Sơ đồ tạo dịch chiết thô và dịch chiết phân đoạn......................................... 24

Hình 3.1.

Sơ đồ đồ phân bố san hô mềm ở quần đảo Cô Tô........................................ 31

Hình 3.2.

Sơ đồ phân bố san hô mềm theo độ sâu tại cồn ngầm Bắc Hồng
Vàn và dải đá ngầm Vàn Chảy ở Cô Tô 32

Hình 3.3.

Mô tả loài Menella woodin................................................................................... 32

Hình 3.4.

Sơ đồ chiết phân đoạn mẫu san hô mềm Menella woodin........................34

Hình 3.5.

Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn H3............................................... 35

xi


Hình 3.6.

Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn H4............................................... 36

Hình 3.7.

Mức độ biểu hiện của ROS trong đại thực bào được kích thích
bởi LPS

50

Hình 4.1.

Cấu trúc hóa học của hợp chất MW1................................................................ 52

Hình 4.2.

Các tương tác COSY (▬), HMBC ( ) và NOE (

) chính của hợp

chất MW1

52

Hình 4.3.

Cấu trúc hóa học của hợp chất MW2................................................................ 53

Hình 4.4.

Các tương tác COSY (─), HMBC ( ) và NOE (

) chính của
hợp chất MW2

54

Hình 4.5.

Cấu trúc hóa học của hợp chất MW3................................................................ 54

Hình 4.6.

Một số tương tác HMBC của hợp chất MW3................................................ 55

Hình 4.7.

Cấu trúc hóa học của hợp chất MW4................................................................ 55

Hình 4.8.

Một số tương tác HMBC của hợp chất MW4................................................ 56

Hình 4.9.

Cấu trúc hóa học của hợp chất MW5................................................................ 56

Hình 4.10. Cấu trúc hóa học của hợp chất MW6................................................................ 58
Hình 4.11. Cấu trúc hóa học của hợp chất MW7................................................................ 59
Hình 4.12. Cấu trúc hóa học của hợp chất MW8................................................................ 61
Hình 4.13. Các tương tác COSY (─), HMBC ( ) và NOE (

) chính của
hợp chất MW8

62

Hình 4.14. Phổ ECD thực tế của MW8 và tính toán lý thuyết của các dạng
đồng phân

63

Hình 4.15. Cấu trúc hóa học của hợp chất MW9................................................................ 65
Hình 4.16. Các tương tác COSY (─), HMBC ( ) và NOE (

) chính của
hợp chất MW9

65

Hình 4.17. Phổ ECD thực tế của MW9 và tính toán lý thuyết của các dạng
đồng phân

66

Hình 4.18. Cấu trúc hóa học của hợp chất MW10.............................................................. 67
Hình 4.19. Các tương tác HMBC ( ) và NOE (

) chính của MW10.....................68

Hình 4.20. Phổ CD của hợp chất MW10................................................................................ 69

xii


Hình 4.21. Cấu trúc hóa học của hợp chất MW11.............................................................. 69
Hình 4.22. Các tương tác COSY (─), HMBC ( ) và NOE (

) chính của
hợp chất MW11

70

Hình 4.23. Cấu trúc hóa học của hợp chất MW12.............................................................. 71
Hình 4.24. Cấu trúc hóa học của hợp chất MW13.............................................................. 72
Hình 4.25. Cấu trúc hóa học của hợp chất MW14.............................................................. 73
Hình 4.26. Các tương tác HMBC chính của hợp chất MW14....................................... 73
Hình 4.27. Cấu trúc hóa học của hợp chất MW15.............................................................. 74
Hình 4.28. Các tương tác HMBC chính của hợp chất MW15....................................... 75
Hình 4.29. Cấu trúc hóa học của hợp chất MW16.............................................................. 76
Hình 4.30. Các tương tác HMBC chính của hợp chất MW16....................................... 77
Hình 4.31. Cấu trúc hóa học của hợp chất MW17.............................................................. 77

Hình 4.32. Các tương tác HMBC chính của hợp chất MW17....................................... 78
Hình 4.33. Cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được từ loài Menella
woodin

79

xiii


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư là một trong những căn bệnh nguy hiểm nhất trên toàn thế giới và là
nguyên nhân phổ biển gây tử vong đứng thứ 2 sau tim mạch. Nó được định nghĩa là
một nhóm bệnh đặc trưng bởi sự phát triển không kiểm soát và lây lan của các tế
bào bất thường. Theo báo cáo của Hiệp hội ung thư Hoa kỳ có khoảng 1,7 triệu ca
ung thư mới được chuẩn đoán năm 2016, trong đó có khoảng 600.000 người Mỹ
chết vì ung thư. Theo báo cáo mới nhất của Viện nghiên cứu phòng chống ung thư
Việt Nam, mỗi năm số bệnh nhân mới mắc ung thư ở Việt Nam là 150.000 người,
trong đó có 75.000 người tử vong, con số này có xu hướng tăng trong những năm
tiếp theo. Bởi vậy việc tìm kiếm thuốc đặc trị cũng như thuốc hỗ trợ điều trị và các
tác nhân dự phòng hóa học là hết sức cần thiết và cấp bách.
Các hợp chất tự nhiên đã được chứng minh là một nguồn nguyên liệu vô
cùng tuyệt vời cho sự khám phá và phát triển các loại thuốc mới. Từ dịch chiết của
các loại vi sinh vật, thực vật và sinh vật biển, các nhà khoa học đã tìm thấy rất nhiều
đặc tính dược lý quý giá. Nhiều trong số đó đã được thử nghiệm lâm sàng trong
điều trị các bệnh ở người và có thể phân loại thành nhóm các sản phẩm có nguồn
gốc tự nhiên, bán tổng hợp hoặc tổng hợp toàn phần sử dụng trong thử nghiệm lâm
sàng hoặc nghiên cứu các đặc tính dược lý mới. Từ năm 1981 đến năm 2014, có tới
73% thuốc chống ung thư có mặt trên thị trường hiện nay có nguồn gốc thiên nhiên

hoặc được tổng hợp theo mẫu hình cấu trúc của hợp chất tự nhiên. Từ năm 1940 đến
2014 đã có 246 loại thuốc chống ung thư đã được phê duyệt và trong số này có 207
loại được thiết kế dựa trên những dạng có cấu trúc phân tử nhỏ, loại trừ các thuốc có
kích thước phân tử lớn và vacxin. Hơn nữa 77,3% (160 trong 207) những loại thuốc
chống ung thư này có nguồn gốc từ tự nhiên, cho thấy rằng các hợp chất tự nhiên là
nguồn nguyên liệu đóng góp chính cho nghiên cứu các loại thuốc chống ung thư.
Ưu điểm của các hợp chất tự nhiên biển so với những phân tử tổng hợp là chúng
được hình thành bên trong hệ thống sống và tạo ra phục vụ mục đích sinh tồn, bảo
vệ cơ thể và lợi thế cạnh tranh trong hệ sinh thái của chúng, do đó các hợp chất này
thể hiện hoạt tính dược lý thú vị. Hơn nữa, các hợp chất này có cấu trúc


2

hóa học rất độc đáo trong hầu hết các loại sinh vật biển, điều này cho thấy điều kiện
sống khắc nghiệt trong môi trường biển có thể đã tạo nên những hợp chất này. Cho
tới nay, đã có gần 25.000 hợp chất đã được phân lập từ sinh vật biển và công bố
khoa học, trong đó có hơn 10.000 có hoạt tính sinh học, các hoạt chất này có nguồn
gốc từ hải miên, da gai, san hô mềm, động vật thân mềm. Do vậy, sàng lọc tìm kiếm
các hoạt chất có tác dụng diệt tế bào ung thư là bước đi đầu tiên nhưng là bắt buộc
đối với quá trình phát triển thuốc mới. Thông qua các bước sàng lọc hoạt tính sinh
học có thể chọn ra những đối tượng có triển vọng để nghiên cứu tiếp theo (chiết
tách hoạt chất, nghiên cứu cấu trúc, các nghiên cứu in vitro, các nghiên cứu về độ an
toàn, cơ chế tác dụng dược lý…) lựa chọn được dược liệu và hoạt chất sạch cho
những nghiên cứu lâm sàng sâu hơn, toàn diện hơn.
Trong hơn 30 năm qua, các nghiên cứu về các hợp chất chuyển hóa thứ cấp
từ sinh vật biển đã được nghiên cứu rộng rãi, đã tìm ra rất nhiều hợp chất có cấu
trúc và hoạt tính sinh học. Cho đến nay đã có rất nhiều thuốc mới điều trị ung thư có
nguồn gốc sinh vật biển đã được FDA Hoa Kỳ chứng nhận và bán trên thị trường do
các hãng lớn trên thế giới cung cấp như thuốc điều trị ung thư có tên thương mại

®

®

như Prialt (Ziconotide), Halaven (Eribulin mesylate), Yondelis® (Trabectedin).
Đại dương là nơi sinh sống của 34 trong 36 ngành sinh vật trên trái đất với
hơn 300.000 loài động thực vật đã được biết đến. Đây chính là nguồn cung cấp vô
số các sản phẩm tự nhiên quý giá từ các loài sinh vật biển như rong biển, ruột
khoang, rêu biển, thân mềm, da gai và từ các loài vi khuẩn biển. Việt Nam nằm
2

trong khu vực biển Thái Bình Dương, sở hữu hơn 1 triệu km vùng biển. Với bờ
biển dài trên 3.260 km từ Bắc xuống Nam, đứng thứ 27 trong số 157 quốc gia ven
biển, các quốc đảo và các lãnh thổ trên thế giới. Kết quả thống kê đến nay đã thông
báo có trên 12.000 loài động thực vật biển ở Việt Nam, trong đó có rất nhiều loài có
độc tố hoặc có hoạt tính sinh học tốt. Do vậy, hướng nghiên cứu các công nghệ chiết
xuất, phân lập các hoạt chất theo định hướng hoạt tính sinh học từ các nguồn dược
liệu biển có trữ lượng lớn như rong biển, hải sâm, san hô mềm được quan tâm đặc
biệt. Các nghiên cứu trước đây đã cho thấy, vùng biển nước ta là một trong số


3

các vùng biển có hệ đa dạng sinh học phong phú nhất. Đồng thời, san hô mềm có sự
phân bố rất dồi dào và đa dạng, tuy nhiên cho tới nay, ở nước ta các công trình
nghiên cứu các hợp chất thứ cấp từ các loài san hô mềm vẫn còn ở mức độ khiêm
tốn.
Do đó, chúng tôi quyết định lựa chọn đề tài trong khuôn khổ luận án Tiến sỹ:
“Nghiên cứu tìm kiếm các hoạt chất gây độc tế bào ung thƣ từ loài san hô mềm
Menella woodin ở vùng biển Cô Tô”

Mục tiêu nghiên cứu chính của đề tài luận án gồm:
-

Đánh giá một số hoạt tính sinh học của dịch chiết tổng nhằm định hướng cho
các nghiên cứu tiếp theo.

-

Nghiên cứu tách chiết, xác định cấu trúc hóa học và hoạt tính gây độc tế bào
ung thư của một số hợp chất sạch phân lập được từ loài san hô mềm Menella
woodin thu thập ở vùng biển Cô Tô - Quảng Ninh.


4

CHƢƠNG 1:

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Đặc điểm chung về san hô mềm

1.1.1. Đặc điểm sinh học của san hô mềm
Vị trí phân loại bộ san hô mềm (Alcyonacea) trong hệ thống phân loại
San hô mềm thuộc giới động vật (Animalia), ngành ruột khoang (Cnidaria Coenlenterata), lớp san hô (Anthozoa), phân lớp san hô tám ngăn (Octocorallia),
bộ Alcyonacea. Bộ san hô mềm Alcyonacea có 34 họ, 307 giống, khoảng 3000 loài
được mô tả, phân bố ở khắp các vùng biển trên thế giới, trong đó có 23 họ phân bố
ở vùng nước nhiệt đới (Fabricius K, 2001).
San hô mềm nằm trong lớp Anthozoa và được chia thành ba phân lớp, tùy
theo số xúc tu (tua cảm) hoặc những đường đối xứng, và một loạt các bộ tương ứng

với kiểu xương ngoài, loại tế bào châm và phân tích di truyền ti thể. Phân lớp san hô
với 8 xúc tu được gọi là san hô tám ngăn (Octocorallia) bao gồm các bộ san hô
mềm (Alcyonacea) phân bố phổ biến ở vùng biển Thái Bình Dương - Ấn Độ
Dương, bộ san hô lam (Helioporacea), bộ san hô lông chim (Pennatulacea) (Hình
1.1) (Tursch B, 1976).
Những loài có nhiều số xúc tu lớn hơn 8 và là bội của 6 được gọi là phân lớp
san hô sáu ngăn (Hexacorallia), nhóm này bao gồm các loài san hô đá (san hô tạo
rạn) (Scleractinia), và phân lớp hải quỳ (Ceriantharia). Giống Menella nằm trong
họ Plexauridae. Giống Menella gồm 26 loài phân bố tập trung ở vùng biển Ấn Độ
Dương, Thái Bình Dương (Williams GC, 1992).
Cấu trúc tập đoàn san hô mềm: Tập đoàn san hô mềm: khởi đầu cá thể đầu
tiên mọc nhiều nhánh rỗng, trên đó hình thành các cá thể mới. Tiếp theo tầng keo ở
nách của các nhánh phát triển mạnh, liên kết cá thể con và cá thể mẹ thành một
khối, trong khi hệ thống ống nối các khoang vị được hình thành cùng với sự liên kết
các vi xương tạo thành một hệ thống chung của tập đoàn (Trần Thái Bái, 2004). Lớp
ngoài của tập đoàn là các polip và lớp mô bảo vệ, lớp bên trong chứa các mô,


5

khoang dạ dày, kênh nội bào, vi xương. San hô mềm có có cấu tạo đơn giản, chúng
liên kết các cá thể (polip) với nhau thành dạng tập đoàn.
Lớp san hô
(Anthrozoa)

B

Phân bộ Holaxonia
Họ Plexauridae
Giống Menella

Hình 1.1. Sơ đồ phả hệ của giống Menella
(Nguồn: Tursch B, 1976)
Toàn bộ tập đoàn được nâng đỡ bởi các vi xương nhỏ nằm rải rác trong cơ
thể, các vi xương này có kích thước hiển vi không liên kết với nhau nên cơ thể san


6

hô rất mềm. Vì vậy chúng được gọi là san hô mềm khác hẳn với san hô cứng có bộ
xương đá vôi cứng và vững chắc (Fabricius K, 2001).
Cấu tạo của một polip bao gồm một rãnh hầu, 1 vành với 8 tua miệng dạng
lông chim và 8 vách ngăn tạo thành 8 khoang vị ứng với 8 tua miệng phía ngoài.
Ngăn cạnh rãnh hầu gọi là ngăn định hướng. Hai gờ cơ của vách ngăn giới hạn ngăn
này xếp hướng vào nhau ở mặt trong của ngăn. Các gờ cơ ở trên vách ngăn còn lại
được xếp theo hai hướng ngược nhau kể từ ngăn định hướng, theo kiểu đuổi nhau từ
vách ngăn này sang vách ngăn tiếp theo. Số lượng tua miệng và vách ngăn không
thay đổi trong quá trình sinh trưởng (Trần Thái Bái, 2004).

A

B

C

D

Hình 1.2. Các dạng tập đoàn san hô mềm chủ yếu
A: dạng phiến bám; B: dạng phễu; C: dạng cây; D: dạng bụi

(Nguồn: Đậu Văn Thảo, 2014)

Hình thái tập đoàn: Trong khi hình thái của polip là khá đồng nhất ở các
loài trong san hô mềm thì hình thái của tập đoàn lại rất đa dạng, ngay kể cả trong
một loài cũng có những sai khác tùy thuộc vào môi trường mà loài đó sinh sống.
Các hình dạng có thể chia thành các nhóm chính sau: dạng khảm nạm, dạng màng,
dạng phiến gấp, dạng phễu, dạng khối, phân thùy, dạng ngón, dạng cây, dạng quạt,
dạng bụi và trong thực tế có những dạng tập đoàn với hình dạng chuyển tiếp giữa
các dạng trên (Hình 1.2).
1.1.2. Đặc điểm sinh sản
Sinh sản hữu tính: Phần lớn san hô mềm, cơ quan sinh sản đực và cái là
riêng biệt ở tập đoàn. Tuy nhiên, có vài loài san hô mềm, như loài Heteroxenia và
Xenia là lưỡng tính, trong cơ thể trưởng thành chứa cả cơ quan sinh sản đực và cái.


7

San hô mềm sinh sản hữu tính theo ba hình thức: phát tán trứng và tinh trùng, ấu
trùng san hô nở bên trong, ấu trùng nở bên ngoài (Fabricius K, 2001).
Sinh sản vô tính: Sinh sản vô tính tính thường chiếm ưu thế ở san hô mềm.
Nó là quá trình phân chia, phân tách từ tập đoàn ban đầu hình thành tập đoàn mới.
Một số tập đoàn san hô mềm bố mẹ phát triển theo kiểu thân bò tách dần so với vị
trí ban đầu, khi chúng gắn vào nền đáy xa tập đoàn bố mẹ, chúng nhanh chóng phát
triển và tái tạo thành tập đoàn độc lập có kích thước tương tự như tập đoàn san hô
ban đầu (Fabricius K, 2001).
1.1.3. Đặc điểm phân bố
Các rạn san hô Việt Nam nằm trên vùng nước trong, nông, độ sâu tới 20 m,
mặc dù không có các rạn san hô cực lớn nhưng các rạn san hô Việt Nam có đặc tính
đa dạng cao, phong phú và có đặc tính khu vực về sinh thái rõ rệt, điều này chỉ ra
sự tồn tại của các phần dị dưỡng bên trong của các loài. Vùng biển có độ đục cao,
tầm nhìn tới 2 m độ sâu, rất ít loài san hô mềm và tảo cộng sinh, vùng này có sự
phân bố số ít của tập đoàn Briareum và Sinularia. Ở vùng biển có độ trong từ 2

- 5 m, có sự phân bố của các loài Clavularia, Briareum, Sinularia, Sarcophyton và

Klyxum. Vùng biển có độ trong 5 - 8m nước là vùng có mức độ phong phú san hô
mềm cao nhất (Fabricus KE, 2000)
1.2. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào
ung thƣ của giống Menella
1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
San hô mềm là một trong những động vật biển không xương sống quan
trọng, đã là tâm điểm chú ý của các nhà hóa học trong những thập kỷ qua. Một số
lượng lớn các nghiên cứu công bố về các chất chuyển hóa thứ cấp đã phân lập được
từ các loài san hô mềm bao gồm sesquiterpenoid, diterpenoid, steroid và các
glycoside, alkaloid và những hợp chất khác (Berrue F, 2009; Blunt JW, 2008; 2009;
Zhang W, 2003). Nhiều trong số các hợp chất này thể hiện hoạt tính sinh học như
chống ung thư, kháng khuẩn, sốt rét, hoạt tính chống bám dính (Chai XY, 2012;
Zhang W, 2003).


8

Giống Menella (họ Plexauridae) được cho là một trong những giống san hô
mềm phổ biến ở khu vực Biển Đông. Đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa
học và hoạt tính sinh học về các loài san hô mềm từ giống Menella, kết quả tìm thấy
nhiều hợp chất dạng guaiane sesquiterpenoids (Chai XY, 2010; Kao SY, 2011a; Kao
SY, 2011b; 2011c; Li L, 2008; Sung PJ, 2012; Zhang W, 2004), polyhydroxylated
steroid (Chai XY, 2011; Chai XY, 2010; Zhang W, 2006b), briarane diterpenoids
(Chai XY, 2011; Chai XY, 2010) và một số hợp chất khác thuộc giống này (Deng
SZ, 1997).
1.2.1.1. Lớp chất sesquiterpenoid
Năm 2004, Zhang và cộng sự công bố 04 hợp chất dạng guaiane lactone là
menverin A (1), menverin B (2), menverin C (3) và menverin D (4) từ loài Menella

verrucosa (Brundin) (Zhang W, 2004). Đây cũng là kết quả phân lập đầu tiên từ loài
san hô mềm này tại thời điểm đó. Tất cả các hợp chất đều có dạng liên hợp αmethyl-substituted, α, β-unsaturated, γ-lactone moiety, C(8)=C(9) liên hợp với γlactone moiety, một nhóm exocyclic methylene ở vị trí C(4). Tiếp đó, năm 2008,
Liang Li và các tác giả đã phân lập được 04 hợp chất sesquiterpenoid dạng guaiane
lactone là 1-epimenverin B (5), menverin F (6), 1-deoxymenverin F (7) và menverin
G (8) từ loài san hô mềm Menella sp. thu thập từ vịnh Lingshui, tỉnh Hainan, Trung
Quốc. Các hợp chất phân lập đều có dạng liên hợp α-methyl-substituted, α, βunsaturated, γ-lactone moiety, γ-lactone moiety, một nhóm exocyclic methylene ở vị
trí C(4) (Li L, 2008).

(1) R1=H, R2=OH, R3=CH3
(2) R1=H, R2=CH3, R3=OH
(3) R1=OH, R2=OH, R3=CH3
(8)
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của các hợp chất (1 – 8)
(Nguồn: Zhang W, 2004; Li L, 2008)


9

Năm 2011, từ các phân đoạn dịch chiết của loài Menella sp. thu thập ở vùng
biển phía Nam Đài Loan đã phân lập được 08 hợp chất sesquiterpenoids bao gồm (–
)-hydroxylindestrenolide (9), gồm (+)-hydroxylindestrenolide (10) (Kao SY, 2011a),
menelloides A–E (11-15) (Kao SY, 2011b; 2011c; Lee CH, 2012), (+)
chloranthalactone B (16) (Kao SY, 2011b) và hợp chất seco-germacrane anhydride
(17) (Sung PJ, 2012).
Cũng từ loài Menella sp., năm 2013, Guo Z và cộng sự đã phân lập và xác
định cấu trúc của bốn hợp chất sesquiterpenoid là subergorgic acid (18), subergorgic
acid methyl ester (19), 2β-hydroxyl subergorgic acid methyl ester (20) và
suberosenol A (21) (Guo Z, 2013).

(9)

(10)

(11)

(12)

(13)

(14)

(15)

(16)

(17)

Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của các hợp chất (9 - 17)
(Nguồn: Kao SY, 2011a; Kao SY, 2011b; Kao SY, 2011c; Lee CH, 2012;
Sung PJ, 2012)
Năm 2014, hợp chất menecubebane A (22) cũng được phân lập từ loài từ loài
Menella kanisa Grassoff thu thập tại Hainan, Trung Quốc (Chen M, 2014). Tiếp tục
nghiên cứu trên loài này, năm 2016, Qi Peng và cộng sự đã phân lập thêm 01 hợp
chất dạng sesquiterpenoids là menecubebane B (23) từ loài Menella sp. thu thập tại
vùng đảo Leizhou, Trung Quốc (Peng Q, 2016).


10

(18) R=OH

(19) R=OCH3
Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của các hợp chất (18 - 23)
(Nguồn: Guo Z, 2013; Chen M, 2014; Peng Q, 2016)
1.2.1.2. Lớp chất steroid
Năm 1997, hợp chất 3β-hydroxy-5α-pregnane-20-one (24) dạng steroid đầu
tiên phân lập từ loài san hô mềm Menella spinifera Kukenthal thu thập tại vùng biển
phía Nam Trung Quốc (Deng SZ, 1997). Tiếp đó, năm 2006, nhóm nghiên cứu của
Zhang W và cộng sự đã phân lập được hai hợp chất dạng polyoxygenated steroid là
menellsteroid A (25) và menellsteroid B (26) (Zhang W, 2006b) từ loài Menella
verrucosa Brundin.

Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của các hợp chất (24), (25) và (26)
(Nguồn: Zhang W, 2006)
Năm 2010, khảo sát thành phần hóa học trên loài Menella sp. thu thập tại đảo
Meishan, tỉnh Hainan, Trung Quốc, Chai XY và các tác giả đã phân lập và xác định
cấu trúc hóa học được một tetrahydroxysteroid là menellsteroid C (27), một hợp
chất tự nhiên lần đầu tiên được phân lập 1β,3β,5α-trihy droxy-cholestan-6-one,
menellsteroid D (28) và 04 hợp chất dạng steroid cholestan-3β,5α,6β-triol (29),
cholestan-1β,3β,5α,6β-tetrol (30), nephalsterol (31), cholestan-3β-5-en-6-one (32)
và hợp chất menellsteroid A (26) cũng được tìm thấy ở loài san hô mềm này (Chai
XY, 2010).