ĐÁNH GIÁ GIÁ TRỊ của HOS TEST TRÊN các mẫu TINH TRÙNG bất ĐỘNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THANH THẢO

§¸nh gi¸ gi¸ trÞ cña HOS test
trªn c¸c mÉu tinh trïng bÊt ®éng
Chuyên ngành : Mô học - Phôi thai học
Mã số

: NT 62720101

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP BÁC SỸ NỘI TRÚ
Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS NGUYỄN KHANG SƠN

HÀ NỘI - 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THANH THẢO

§¸nh gi¸ gi¸ trÞ cña HOS test

trªn c¸c mÉu tinh trïng bÊt ®éng
Chuyên ngành : Mô học - Phôi thai học
Mã số

: NT 62720101

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP BÁC SỸ NỘI TRÚ

Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. NGUYỄN KHANG SƠN

HÀ NỘI - 2017
MỤC LỤC


ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN...........................................................................3
1.1.Tình hình vô sinh trên thế giới và tại Việt Nam..........................................3
1.1.1. Vô sinh nam do tinh trùng di động kém..........................................4
1.1.2. Thụ tinh trong ống nghiệm cổ điển (IVF) và tiêm tinh trùng vào
bào tương noãn (IVF/ICSI).............................................................5
1.2. Cấu tạo tinh trùng.......................................................................................8
1.2.1. Tinh trùng bình thường....................................................................8
1.2.2. Tinh trùng bất thường....................................................................11
1.2.3. Tinh dịch đồ..................................................................................11
1.3. Một số phương pháp đánh giá khả năng sống của tinh trùng trước khi có
HOS Test.................................................................................................11
1.3.1. Phương pháp nhuộm eosin, eosin- nigrosin, trypan blue............12
1.3.2. Phương pháp kích thích cơ học.....................................................13
1.3.3. Kỹ thuật laser................................................................................13

1.3.4. Sử dụng pentoxyfiline...................................................................13
1.4. Nghiệm pháp HOS Test............................................................................15
1.4.1. Cấu tạo và chức năng màng bào tương, nguyên lý của HOS Test 15
1.5. Các nghiên cứu về HOS Test...................................................................20
1.6. Ứng dụng..................................................................................................26
1.6.1. Đánh giá mẫu tinh dịch................................................................26
1.6.2. HOS Test cũng đã được sử dụng như một tiêu chí dự đoán khả
năng thụ tinh của tinh trùng, góp phần chẩn đoán vô sinh nam....27
1.6.3. HOS Test giúp lựa chọn tinh trùng có sự toàn vẹn DNA cao........27
1.6.4. HOS Test có vai trò lớn trong lĩnh vực hỗ trợ sinh sản hiện nay .......31
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........35


2.1. Đối tượng..................................................................................................36
Mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn của 37 người đàn ông......................36
2.2. Phương pháp nghiên cứu..........................................................................36
2.2.1. Mô hình nghiên cứu......................................................................36
2.2.2. Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất.......................................................36
2.3.Qui trình nghiên cứu..................................................................................37
2.4. Chỉ tiêu nghiên cứu:.................................................................................38
2.5. Xử lý số liệu.............................................................................................38
2.6. Địa điểm và thời gian nghiên cứu............................................................38
2.7. Đạo đức nghiên cứu.................................................................................38
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU....................................................38
3.1. Kết quả về đặc điểm đối tượng nghiên cứu..............................................39
3.2. Tỉ lệ các dạng biểu hiện của phản ứng HOS Test theo thời gian..............39
3.3. Mối tương quan giữa tỉ lệ tinh trùng có phản ứng HOS với tỉ lệ tinh trùng
sống và tỉ lệ tinh trùng có hình thái bình thường....................................46
3.4. Xác định loại dung dịch HOS Test phù hợp và thời gian tối ưu khi ủ tinh
trùng trong dung dịch HOS Test.............................................................47

3.5. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và giá trị chẩn đoán dương của nghiệm
pháp HOS Test với dung dịch DD2, tại thời điểm 30 phút.....................50
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN............................................................................51
4.1. Bàn luận về đặc điểm đối tượng nghiên cứu............................................51
4.2. Các dạng phản ứng HOS Test..................................................................52
4.2.1. Tinh trùng có phản ứng HOS Test.................................................52
4.2.2. Các dạng biểu hiện của phản ứng HOS Test.................................52
4.3. Mối tương quan giữa tỉ lệ tinh trùng có phản ứng HOS Test và tỉ lệ tinh
trùng sống, tỉ lệ tinh trùng có hình thái bình thường...............................59
4.4. Loại dịch và thời gian thực hiện HOS Test phù hợp................................59


4.5. Giá trị phản ứng HOS Test.......................................................................64
4.6. Phương pháp HOS Test............................................................................67
4.6.1.Bàn luận về phương pháp HOST...................................................67
4.6.2.Quy trình........................................................................................67
KẾT LUẬN....................................................................................................69
KHUYẾN NGHỊ............................................................................................70
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Các dạng biểu hiện của phản ứng HOS Test trong dung dịch 1 thay
đổi theo thời gian..........................................................................41
Bảng 3.2. Các dạng biểu hiện của phản ứng HOS Test trong dung dịch 2 thay
đổi theo thời gian..........................................................................42
Bảng 3.3. Các dạng biểu hiện của phản ứng HOS Test trong dung dịch 3 thay
đổi theo thời gian..........................................................................43
Bảng 3.4. Các dạng biểu hiện của phản ứng HOS Test trong dung dịch 4 thay
đổi theo thời gian..........................................................................44

Bảng 3.5. Tỉ lệ phần trăm tinh trùng có phản ứng HOS ở bốn loại dung dịch
biến đổi theo thời gian...................................................................47
Bảng 3.6. Tỉ lệ phần trăm tinh trùng chết ở bốn loại dịch thay đổi theo thời
gian................................................................................................48
Bảng 3.7. Tỉ lệ tinh trùng (TT) có phản ứng HOS Test ở bốn loại dung dịch
khảo sát, tại thời điểm 30 phút......................................................49
Bảng 3.8. Giá trị của phản ứng HOS Test với dung dịch DD2.......................50


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Các dạng biểu hiện của phản ứng HOS Test trong dung dịch 1
thay đổi theo thời gian.................................................................41
Biểu đồ 3.2. Các dạng biểu hiện của phản ứng HOS Test trong dung dịch 2
thay đổi theo thời gian.................................................................42
Biểu đồ 3.3. Các dạng biểu hiện của phản ứng HOS trong dung dịch 3 thay
đổi theo thời gian........................................................................44
Biểu đồ 3.4. Các dạng biểu hiện của phản ứng HOS Test trong dung dịch 4
thay đổi theo thời gian.................................................................45
Biểu đồ 3.5. Mối tương quan giữa tỉ lệ tinh trùng có phản ứng HOS và tỉ lệ
tinh trùng có hình thái bình thường.............................................46
Biểu đồ 3.6. Mối tương quan giữa tỉ lệ tinh trùng có phản ứng sống và tỉ lệ
tinh trùng có phản ứng HOS Test................................................46
Biểu đồ 3.7. Tỉ lệ tinh trùng có phản ứng HOS Test ở bốn loại dung dịch khảo
sát, biến đổi theo thời gian..........................................................47
Biểu đồ 3.8. Tỉ lệ tinh trùng chết (eosin +) ở mỗi loại dung dịch HOS Test,
biến đổi theo thời gian.................................................................49


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu tạo siêu vi của tinh trùng.........................................................10

Hình 1.2. Các dạng biểu hiện của tinh trùng trong phản ứng HOS Test.........25
Hình 1.3. Các dạng biểu hiện của tinh trùng có phản ứng HOS Test dưới kính
hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần.................................25
Hình 3.1. Một số dạng biểu hiện của phản ứng HOS Test..............................40
Hình 3.2. Hình ảnh tinh trùng có cuộn đuôi nhưng vẫn bắt màu eosin...........48


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Kỹ thuật ICSI ra đời là một phương pháp điều trị hiệu quả cho những
cặp vợ chồng vô sinh, đặc biệt nguyên nhân do nam giới với tinh trùng rất ít,
yếu kèm hình dạng bất thường cao hoặc tinh trùng thu nhận từ mào tinh, tinh
hoàn. Tinh trùng tươi hoặc trữ đông sau lọc rửa được lựa chọn để tiêm vào
trứng dựa trên hình thái và khả năng di động của chúng. Tuy nhiên, trong
nhiều trường hợp, mẫu tinh trùng thu nhận được bất động hoàn toàn gây khó
khăn cho việc lựa chọn này. Thực tế cho thấy, một số trường hợp mẫu tinh
trùng bất động hoàn toàn vẫn có một tỉ lệ đáng kể tinh trùng sống. Việc lựa
chọn một cách ngẫu nhiên hay chỉ dựa vào hình thái tinh trùng trong các mẫu
tinh trùng bất động hoàn toàn để thực hiện ICSI gây giảm đáng kể tỉ lệ thụ
tinh và có thai. Để cải thiện kết quả ICSI trong những trường hợp này, nhiều
phương pháp đã được mô tả để lựa chọn tinh trùng bất động nhưng còn sống.
Một số phương pháp để xác định tinh trùng sống: kỹ thuật nhuộm eosin,
trypan blue, kích hoạt tinh trùng bằng cách bổ xung pentoxyfilline, kích thích
cơ học - kỹ thuật laser, tuy nhiên tất cả những phương pháp này đều có nhược
điểm là gây độc cho tinh trùng, ảnh hưởng đến khả năng sống của tinh trùng
[1]. HOS Test ra đời đã khắc phục được các hạn chế trên.
Khi đưa tế bào vào trong môi trường áp lực thẩm thấu thấp (môi trường
nhược trương) thì nước sẽ đi vào trong tế bào để cân bằng áp lực giữa bên
trong và bên ngoài màng tế bào; tế bào nào sống với chức năng màng còn

nguyên vẹn sẽ có biểu hiện trương phồng lên. Ứng dụng điều này năm 1984,
Jeyendran và cộng sự đã thử nghiệm đánh giá tính toàn vẹn chức năng màng
bào tương tinh trùng người bằng dung dịch có áp suất thẩm thấu thấp [2].
Màng tinh trùng không chỉ có vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất,
đảm bảo sự sống cho tinh trùng mà nó còn rất cần thiết trong quá trình thụ


2

tinh của trứng và tinh trùng như tham gia vào quá trình hoạt hóa tinh trùng,
phản ứng cực đầu, giúp tinh trùng bám trên bề mặt trứng.
Nghiệm pháp HOS Test (Hypo- Osmotic Swelling Test, HOS Test,
HOST) ban đầu được xem như một tiêu chí đánh giá về tỷ lệ sống của tinh
trùng trên những mẫu tinh trùng hoàn toàn bất động, đã được WHO 2010 ghi
nhận là phương pháp đánh giá tỷ lệ sống, được áp dụng rộng rãi cho các xét
nghiệm tinh dịch. Sau đó được dùng để đánh giá khả năng thụ tinh của mẫu
tinh trùng [3]. Với sự phát triển mạnh mẽ của ngành hỗ trợ sinh sản hiện nay,
HOS Test có vai trò quan trọng trong việc phát hiện tinh trùng sống trong mẫu
tinh trùng bất động hoàn toàn với mục đích sử dụng tinh trùng sống đó để
tiêm vào bào tương của noãn (ICSI). Sự kết hợp HOS Test với ICSI đã làm
tăng hiệu quả của các chu kỳ ICSI với mẫu tinh trùng bất động hoàn [2], [4].
Trong những trường hợp mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn, việc kiểm
tra sự sống của tinh trùng rất quan trọng, quyết định sự thành công của IVF.
Chọn nhầm tinh trùng chết để ICSI sẽ đưa đến tỉ lệ thụ tinh thấp và không
tạo được phôi. Với mong muốn đánh giá một cách đầy đủ giá trị của HOS
Test trên các tinh trùng bất động, làm tăng tỉ lệ thành công trong các chu kỳ
ICSI, đặc biệt với các mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn, chúng tôi thực
hiện đề tài “Đánh giá giá trị của HOS Test trên các mẫu tinh trùng bất
động” với mục tiêu: Đánh giá giá trị của HOS Test trên các mẫu tinh
trùng bất động.

CHƯƠNG 1


3

TỔNG QUAN
1.1.Tình hình vô sinh trên thế giới và tại Việt Nam
Vô sinh là tình trạng một cặp vợ chồng quan hệ tình dục đều, không
dùng bất cứ biện pháp tránh thai nào mà không có thai tự nhiên trong thời
gian một năm (ở phụ nữ < 35 tuổi) hoặc không có thai tự nhiên sau 6 tháng (ở
phụ nữ >35 tuổi) [5]. Vô sinh ảnh hưởng tới tâm lý, tình hình kinh tế, dẫn đến
các tổn thương về mặt y học, căng thẳng, đặc biệt trong một xã hội như chúng
ta mà vấn đề sinh được con rất được chú trọng.
Vô sinh và các vấn đề về suy giảm khả năng sinh sản đã và đang là mối
quan tâm lớn của các nhà y học, là một vấn đề lâm sàng có ý nghĩa lớn, ảnh
hưởng tới 8-12% các cặp vợ chồng trên toàn thế giới. Trong tất cả các trường
hợp vô sinh, khoảng 40- 50% là vô sinh nam- vô sinh do yếu tố nam giới. Các
bất thường có thể đơn độc hoặc kết hợp với nhau như mật độ tinh trùng thấp, khả
năng di động kém, hình thái bất thường. Tỉ lệ vô sinh ở các nước kém phát triển
cao hơn và nguyên nhân chủ yếu do ảnh hưởng của các bệnh truyền nhiễm [6].
Mặc dù chưa có số liệu chính xác về tỉ lệ vô sinh toàn cầu, nhưng ước
tính gần 72,4 triệu cặp vợ chồng trên toàn thế giới gặp vấn đề về sinh sản.
Theo ước tính của WHO (World Health Organization- Tổ chức y tế thế giới)
có khoảng 60.000.000 - 80.000.000 cặp vợ chồng trên toàn thế giới bị vô sinh.
Kết quả thay đổi giữa các khu vực khác nhau trên thế giới và nó ảnh hưởng
tới 8- 12% các cặp vợ chồng trên toàn thế giới. Trong những thập kỉ gần đây,
tỉ lệ vô sinh ngày càng tăng. Khoảng 10% các cặp vợ chồng ở Mỹ được định
nghĩa là vô sinh dựa trên không có thai sau 1 năm quan hệ tình dục đều mà
không dùng các biện pháp bảo vê. Tại Mỹ, theo trung tâm quốc gia về thống

kê y tế, khả năng sinh sản suy giảm ở phụ nữ tăng 2,7 triệu, từ 4,56 triệu năm


4

1982 lên 7,26 triệu năm 2002. Hơn nữa tỉ lệ sinh sản của nam giới dưới 30
tuổi cũng suy giảm 15% trên toàn thế giới [7], [8].
Theo thống kê ở Anh, nguyên nhân vô sinh do nam giới dao động từ 1957% các cặp vợ chồng hiếm muộn [9]. Tại Việt Nam, nghiên cứu của Nguyễn
Thị Được và Nguyễn Thị Thanh Mai (2001) trên 220 cặp vợ chồng vô sinh
đến khám tại phòng khám sản Đại học Y Thái Bình nhận thấy tỷ lệ vô sinh do
chồng chiếm 43,2% [10], [11]. Như vậy vô sinh nam chiếm khoảng 35%,
trong đó hơn 90% các nguyên nhân đều dẫn đến kết quả gây bất thường tinh
trùng. Người ta ước tính các bất thường của tinh trùng về sản xuất hay hoạt
động chức năng chiếm từ 35- 50% các trường hợp vô sinh [12].
Nam giới với các thông số tinh dịch đồ thấp hơn giá trị bình thường của
WHO được xem là có yếu tố vô sinh nam. Đáng kể nhất trong số này là mật
độ thấp (oligospermia), di động kém (asthenospermia), hình thái bất thường
(teratospermia). Các yếu tố khác cũng được quan tâm như bệnh lý tiền liệt
tuyến, túi tinh…[13], [14], [15], [16], [17].
1.1.1. Vô sinh nam do tinh trùng di động kém
Asthenozoospermia là thuật ngữ chỉ tình trạng tinh trùng của nam giới di
động kém. Nguyên nhân của tình trạng này có thể do các bất thường về trao
đổi chất ảnh hưởng tới di động của tinh trùng, bất thường đuôi như đuôi gập,
đuôi cuộn, bất thường siêu cấu trúc trong cấu tạo của đuôi, bất thường đoạn
cổ…Việc tinh trùng di động kém ảnh hưởng rất lớn đến khả năng thụ tinh
giữa noãn và tinh trùng. Trong thụ tinh tự nhiên, muốn thụ tinh được tinh
trùng phải bơi qua cả một quãng đường dài để tới nơi thụ tinh, mà khả năng
bơi của tinh trùng phụ thuộc rất lớn vào tính toàn vẹn của đuôi [15].
Trong quá trình trưởng thành tự nhiên của tinh trùng, khả năng di động
của tinh trùng được hoàn thiện khi tinh trùng qua mào tinh. Sự di động của

tinh trùng có vai trò rất quan trọng để tinh trùng di chuyển từ âm đạo tới vòi


5

trứng, xuyên qua lớp tế bào hạt để tham gia thụ tinh. Do đó, có mối liên quan
rõ ràng giữa khả năng di động của tinh trùng và khả năng có thai tự nhiên.
Trong những trường hợp tinh trùng di động kém tỉ lệ thụ tinh thường rất
thấp, thậm chí không có thai tự nhiên. Đặc biệt với các mẫu tinh trùng bất
động hoàn toàn thì mong ước có con của chính họ của các cặp vợ chồng vô
sinh do tinh trùng bất động hoàn toàn là không thể. Thật may mắn làm sao,
với sự tiến bộ của y học, sự phát triển mạnh mẽ của lĩnh vực hỗ trợ sinh sản
thì nguyện vọng của các cặp vợ chồng trên có thể trở thành sự thật.
1.1.2. Thụ tinh trong ống nghiệm cổ điển (IVF) và tiêm tinh trùng vào bào
tương noãn (IVF/ICSI)
1.1.2.1. Thụ tinh trong ống nghiệm cổ điển (IVF- In Vitro Fertilization)
Em bé IVF đầu tiên trên thế giới ra đời năm 1978. Đến nay, đã có
khoảng 4 triệu trẻ ra đời từ IVF và hàng năm trên toàn thế giới có gần một
triệu trường hợp IVF và các kỹ thuật tương đương được thực hiện. Ở các
nước phát triển như Bắc Âu, Tây Âu và Úc, có từ 1- 5% trẻ mới sinh ra đời
hàng năm là từ IVF. IVF đã làm thay đổi quan niệm của nhân loại về sinh sản.
Với các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản, quan hệ tình dục và sinh sản để duy trì nòi
giống có thể được tách biệt thành hai vấn đề riêng biệt. Ngoài ra việc có con
của một cặp vợ chồng có thể có sự tham gia của người thứ 3: cho noãn, cho
tinh trùng, mang thai hộ…[4].
Từ những năm 1930, việc nghiên cứu hiện tượng thụ tinh giữa noãn và
tinh trùng động vật bậc cao trong môi trường bên ngoài cơ thể (in- vitro) đã
được chú ý. Năm 1959, Chang lần đầu tiên thành công trong việc cho thụ tinh
giữa tinh trùng và noãn động vật có vú (thỏ) trong điều kiện phòng thí
nghiệm. Đây được xem là thành tựu quan trọng nhất trong lịch sử phát triển

của IVF vì nó chứng minh noãn và tinh trùng của động vật có thể thụ tinh
được bên ngoài cơ thể.


6

R.G. Edwards, người Anh, là một trong những nhà khoa học tiên phong
trong việc nghiên cứu về IVF trên người. Năm 1966, Edwards cùng một
nhóm nhà khoa học Mỹ đứng đầu là giáo sư Howard Jones, lần đầu tiên công
bố trường hợp lấy được noãn người qua phẫu thuật nội soi tại Mỹ. Đến năm
1971, Steptoe và Edwards ở Anh lần đầu tiên báo cáo nuôi cấy được phôi
nang người trong ống nghiệm và chuyển các phôi này vào buồng tử cung
người phụ nữ. Đến năm 1976, sau hàng trăm trường hợp thất bại, bác sĩ
Steptoe và tiến sĩ Edwards công bố trường hợp có thai đầu tiên từ IVF ở
người trên thế giới. Năm 1978, em bé đầu tiên từ IVF, Louise Brown ra đời đã
đánh dấu bước đầu cho sự phát triển của IVF trên người [4].
Kỹ thuật IVF được thực hiện để điều trị hiếm muộn cho các cặp vợ
chồng có các chỉ định sau: tắc vòi trứng, bất thường về số lượng và chất
lượng tinh trùng, lạc nội mạc tử cung, hiếm muộn không rõ nguyên nhân…
Ngoài ra IVF còn được chỉ định cho các trường hợp xin noãn, chẩn đoán di
truyền tiền làm tổ.
Trong thời gian đầu, IVF được chỉ định chủ yếu cho vô sinh nữ. Dần dần
IVF được áp dụng cho các trường hợp thiểu năng tinh trùng. Tuy nhiên các thử
nghiệm áp dụng IVF cho vô sinh nam, đặc biệt các trường hợp có bất thường
tinh trùng nặng, không có tinh trùng, tinh trùng sau rã đông…cho kết quả khá
thất vọng với tỉ lệ thụ tinh giữa noãn và tinh trùng rất thấp và nhiều trường hợp
hoàn toàn không có thụ tinh. Với mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn thì không
áp dụng IVF được. Rõ ràng là số lượng, chất lượng và khả năng di động của
tinh trùng ảnh hưởng rất lớn đến sự thành công của phương pháp. Kỹ thuật
ICSI ra đời năm 1992 đã tạo ra một bước ngoặt lớn trong lĩnh vực hỗ trợ sinh

sản, đặc biệt với vô sinh nam [18], [19].


7

1.1.2.2. Tiêm tinh trùng vào bào tương của noãn (ICSI- Intra Cytoplasmic
Sperm Injection)
Năm 1992 kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI) được báo
cáo thành công lần đầu tiên tại Bỉ bởi Palermo và cộng sự. Trong kỹ thuật này
các tác giả tiêm trực tiếp một tinh trùng vào bào tương noãn để hỗ trợ sự thụ
tinh. Các thử nghiệm đầu tiên cho thấy sau khi tiêm tinh trùng vào bào tương
noãn, tế bào noãn vẫn có thể hồi phục, sự thụ tinh diễn ra và phôi sau đó phát
triển khá tốt. Tỉ lệ có thai lâm sàng của kỹ thuật ICSI luôn cao hơn so với kỹ
thuật IVF cổ điển, mặc dù số lượng và chất lượng tinh trùng kém. Sự thành
công này đã thực sự là một cuộc cách mạng trong điều trị vô sinh nam. Nếu
như trong sinh lý tự nhiên người đàn ông cần sản xuất ra hàng chục triệu đến
hàng trăm triệu tinh trùng trong một lần phóng tinh để có thể thụ tinh với một
noãn trong vòi trứng thì với kỹ thuật ICSI, sự thụ tinh có thể diễn ra giữa duy
nhất một tinh trùng với một noãn. Cho đến nay, do vấn đề vô sinh nam ngày
càng phổ biến đi kèm với hiệu quả của kỹ thuật ICSI được cải thiện không
ngừng, ICSI đã dần dần trở thành kỹ thuật được thực hiện nhiều nhất tại các
trung tâm hỗ trợ sinh sản. Hiện nay, đặc biệt tại một số trung tâm lớn, ICSI
còn được áp dụng thay thế hoàn toàn kỹ thuật IVF cổ điển ngay cả đối với các
trường hợp không liên quan đến vô sinh nam [15], [19], [20], [21].
Với sự ra đời của ICSI, những cặp vợ chồng vô sinh do yếu tố nam giới
bao gồm cả tinh trùng di động kém có thể có thai của chính họ. Tỉ lệ thụ tinh và
có thai của những trường hợp này cao nếu tinh trùng di động được chọn để ICSI.
Tuy nhiên, với các tinh trùng bất động hoàn toàn, việc lựa chọn ngẫu
nhiên tinh trùng bất động để ICSI làm tỉ lệ thành công sau ICSI đều giảm hẳn.
Trong những trường hợp này việc tìm ra phương pháp giúp phát hiện tinh

trùng bất động nhưng còn sống để tiêm vào bào tương noãn mà không ảnh


8

hưởng tới sự sống của tinh trùng, trứng cũng như sự phát triển của phôi là cực
kỳ quan trọng.
1.2. Cấu tạo tinh trùng [22]
1.2.1. Tinh trùng bình thường
Nằm ở lòng ống sinh tinh và có hai loại: loại mang thể nhiễm sắc X và
loại mang thể nhiễm sắc Y. Từ một tinh bào 1 qua hai lần phân chia của quá
trình giảm phân sinh ra 4 tinh trùng.
Tinh trùng có cấu tạo bình thường dài khoảng 60µm và gồm ba đoạn là
đầu, cổ và đuôi.
- Đầu hình bầu dục, hơi dẹt, dài 4- 5µm, rộng 2µm. Nhân lớn chiếm gần
hết đầu tinh trùng.
- Cổ là đoạn ngắn và hẹp, gắn thẳng trục với đầu.
- Đuôi dài khoảng 55µm, chia làm 3 đoạn:
+ Đoạn trung gian: dài khoảng 4- 5µm. Giữa đoạn trung gian và đoạn
chính, màng tế bào dày lên tạo thành vòng Zensen.
+ Đoạn chính: dài nhất, khoảng 45µm, gồm một dây trục nằm ở trung
tâm, vây quanh bởi một bao sợi xơ và bọc ngoài bởi màng tế bào.
+ Đoạn cuối: dài khoảng 2- 3µm, tạo thành bởi dây trục được bọc bởi
màng tế bào.
Quan sát dưới kính hiển vi điện tử:
- Đầu tinh trùng chứa nhân ở phần phình nằm về phía giáp với cổ. Đoạn
2/3 trước của nhân được chụp bởi túi cực đầu có hình cái mũ. Thành túi có
cấu tạo màng kép, gồm hai lá ngoài và trong. Lòng túi chứa nhiều enzyme có
tác dụng tiêu huỷ các chướng ngại vật bao quanh noãn chín để tinh trùng tiến
vào bào tương của noãn khi thụ tinh: hyaluronidase, neuramidase, acrosin...

Ở lá ngoài của túi cực đầu và phần bào tương phía trước lá này có một
loại protein đặc hiệu gọi là protein gắn vào noãn nguyên phát (primary egg


9

binding protein) có tác dụng gây ra kết dính giữa đầu tinh trùng và màng
trong suốt bọc noãn trong quá trình thụ tinh. Ở lá trong của túi cực đầu có một
loại protein đặc hiệu khác gọi là protein gắn vào noãn thứ phát (secondary egg
binding protein) có tác dụng gắn màng kép của túi cực đầu với màng trong
suốt bọc noãn khi lớp bào tương mỏng ở phía trước túi cực đầu đã bị tiêu huỷ
và lá ngoài của túi cực đầu bị rách trong quá trình tiếp xúc với màng trong
suốt. Những protein này mang tính đặc hiệu cho loài, do đó sự gắn kết giữa
tinh trùng và màng trong suốt của noãn chỉ xảy ra ở động vật cùng loài.
- Ở cổ có tấm đáy, hố cắm, tiểu thể trung tâm và 9 cột chia đoạn xếp
thành hình ống. Dây trục nằm chính giữa cổ chạy suốt từ cổ đến chỗ tận cùng
của đuôi. Có 9 sợi đặc nối tiếp với 9 cột chia đoạn và tiến về phía đuôi tinh
trùng. Những ti thể hình que dài, xếp thành một hàng nằm ở phía bên ngoài và
song song với cột chia đoạn ở đoạn trên cổ và sợi đặc ở đoạn đuôi.
- Đuôi:
+ Đoạn trung gian có dây trục nằm chính giữa, 9 sợi đặc bao xung
quanh. Bao ti thể được cấu tạo bởi những ti thể xếp với nhau theo kiểu xoắn
ốc, cuốn quanh dây trục, được bọc bởi màng tế bào.
+ Đoạn chính: từ trung tâm ra ngoại vi gồm: dây trục, 9 sợi đặc, bao xơ,
màng tế bào.
+ Đoạn cuối: cấu trúc rất đơn giản, chỉ gồm dây trục bọc ngoài bởi màng
tế bào.
Phần đuôi tinh trùng chính là nơi chứa các thành phần cần thiết cho hoạt
động trao đổi chất và di động. Tinh trùng tự di động được là nhờ các vi sợi ở
đuôi tinh trùng. Các tinh trùng di động được chắc chắn là tinh trùng sống. Tuy

nhiên, không phải tất cả tinh trùng không di động đều là tinh trùng chết. Tinh
trùng còn sống mà không di động được thường do các bất thường nặng của


10

tinh trùng, đặc biệt là các bất thường về đuôi như gập cổ, đoạn cổ không cân
đối, đuôi ngắn, đuôi cuộn, đuôi gập, tế bào chất còn dư ở đuôi [29].

Hình 1.1. Cấu tạo siêu vi của tinh trùng.

1.2.2. Tinh
trùng bất thường

I. Thiết đồ đứng dọc toàn bộ tinh trùng; II. Phóng to một phần đoạn đầu, cổ và một
phần đoạn trung gian của tinh trùng ở hình I; III. Thiết đồ ngang đoạn cổ tinh trùng
theo đường A ở hình II; IV. Thiết đồ ngang đoạn trung gian theo đường B ở hình II; V.
Thiết đồ ngang đoạn chính ở hình I; VI. Thiết đồ ngang đoạn cuối theo đường D ở hình
I.
1. Đầu; 2. Cổ; 3. Đoạn trung gian; 4. Đoạn chính ; 5. Đoạn cuối; 6. Túi cực đầu; 7.
Khoảng dưới túi cực đầu; 8. Màng nhân; 9. Nếp gấp màng nhân; 10. Tấm đáy
(capitellum); 11. Cột chia đoạn; 12. Tiểu thể trung tâm gần; 13. Ti thể dài; 14. Ti thể tạo
thành bao ti thể hình lò xo; 15. Lưới nội bào; 16. Giọt bào tương; 17. Sợi đặc; 18. Dây
trục (axonema); 19. Vòng Zensen; 20. Bao xơ; 21. Cột dọc.


11

Trong tinh dịch bình thường, tinh trùng có cấu tạo bất thường chiếm
khoảng dưới 70% và gồm những loại chính:

+ Tinh trùng chưa trưởng thành: có khá nhiều bào tương ở đầu, cổ và đuôi.
+ Tinh trùng có cấu tạo hình thái học bất thường: đầu to hay nhỏ, tròn
hay nhọn.
+ Tinh trùng già : đầu lỗ rỗ vì bào tương có nhiều không bào chứa sắc tố.
+ Tinh trùng thoái hoá: đầu bị biến dạng hay bị teo hoặc có hai đầu,
hai đuôi. [4]
1.2.3. Tinh dịch đồ
Chỉ số tinh dịch đồ bình thường theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), năm
2010 [3]
- Màu sắc trắng đục, đồng nhất.
- Thời gian ly giải 15- 60 phút ở nhiệt độ 37⁰C
- Thể tích ≥1,5ml
- pH ≥7,2
- Mật độ tinh trùng ≥15 triệu/ml
- Tổng số tinh trùng mỗi lần phóng tinh ≥39 triệu
- Tổng di động tiến tới ≥32% hay tổng di động tiến tới và không tiến tới ≥40%
- Tỉ lệ sống ≥58%
- Tỉ lệ tinh trùng hình thái bình thường ≥4
1.3. Một số phương pháp đánh giá khả năng sống của tinh trùng trước
khi có HOS Test
Đã có nhiều kỹ thuật đã được thực hiện nhằm phân biệt tinh trùng bất
động nhưng sống với tinh trùng bất động và chết sử dụng trong ICSI để cơ hội
có thai của các cặp đôi là lớn nhất. Một số kĩ thuật như nhuộm chất màu, sử
dụng pentoxyfiline, kích thích cơ học, sử dụng laser. Tuy nhiên mỗi phương
pháp đều có ưu, nhược điểm riêng.


12

1.3.1. Phương pháp nhuộm eosin, eosin- nigrosin, trypan blue [23]

Một số chất nhuộm quan sát được dưới kính hiển vi trường sáng như
eosin, eosin- nigrosin, trypan blue, hoặc với kính hiển vi huỳnh quang một số
chất được dùng như propidium iodine, hoechst, ethidium homodimer- 1, YoPro- 1 đều được dùng để nhuộm tinh trùng nhằm phân biệt tinh trùng sống,
tinh trùng chết.
 Nguyên lý: Dựa trên sự toàn vẹn về cấu trúc màng tế bào. Khi nhuộm
màu, tế bào nào bị tổn thương cấu trúc màng tế bào đồng nghĩa là tế bào đã
chết, chất màu qua được màng tế bào vào bên trong nội bào dẫn đến tế bào có
màu theo chất nhuộm. Tế bào nào còn sống, không tổn thương cấu trúc màng
thì tế bào không bắt màu.
 Phương pháp: Pha 0,5g eosin và 3g nigrosin trong 30ml nước cất. Nhỏ hai
giọt dung dịch nhuộm vào một giọt tinh dịch trên lam sạch. Trộn đều và phủ
lamen, quan sát dưới kính hiển vi ở độ pháng đại 400 lần. Đếm số tinh trùng
sống là những tinh trùng mà phần đầu không bị nhuộm màu và số tinh trùng
chết là những tinh trùng mà phần đầu bị nhuộm màu trên tổng số 200 tinh
trùng.
 Ưu điểm: Đơn giản, dễ thực hiện ở mọi labo, rẻ tiền, độ nhạy và độ đặc
hiệu cao. Ban đầu được dùng để kiểm tra tế bào nào chết, tế bào nào còn
sống. Sau đó được WHO khuyến cáo dùng để đánh giá nhanh chóng tỉ lệ tinh
trùng sống trong một mẫu tinh dịch, một thông số quan trọng trong đánh giá
tinh dịch đồ.
 Nhược điểm: Các kỹ thuật nhuộm dẫn tới chết tế bào, chất nhuộm màu
ảnh hưởng tới sự sống của tinh trùng cũng như sự thụ tinh của noãn, phát triển
của phôi, do đó các tinh trùng đã bị nhuộm màu không sử dụng được cho các
kỹ thuật hỗ trợ sinh sản.
1.3.2. Phương pháp kích thích cơ học


13

 Nhược điểm: phụ thuộc vào độ “cứng” của tinh trùng, tinh trùng có khả

năng hồi phục về trạng thái hình dạng ban đầu hay không. Nó cũng phụ thuộc
rất lớn vào kỹ thuật cũng như kinh nghiệm của người làm. Thêm vào đó
phương pháp chỉ dựa trên tính chất vật lý mà không chú ý tới tính toàn vẹn
hóa học của màng tinh trùng.
1.3.3. Kỹ thuật laser [24]
 Nguyên lý, phương pháp: Kỹ thuật laser sử dụng tia laser đơn ngắn bước
sóng 1,48µm, tốc độ 6- 7ms chiếu trực tiếp tới phần cuối của đuôi tinh trùng.
Tinh trùng nào sống biểu hiện bằng phần cuối của đuôi uốn cong lại tại vị trí
chiếu tia laser trong khi tinh trùng chết thì không uốn cong.
 Ưu điểm: Laser là một phương pháp an toàn để lựa chọn tinh trùng sống
nhưng bất động. Tỉ lệ thụ tinh, phôi chia cũng như tỉ lệ trẻ sinh sống khi áp
dụng laser để lựa chọn tinh trùng bất động nhưng sống cao hơn khi lựa chọn
tinh trùng ngẫu nhiên. Sử dụng tia laser tỉ lệ thụ tinh tăng từ 20,4% lên đến
45,4%.
 Nhược điểm: đắt, và không phải ở đơn vị labo nào cũng làm được.
Phương pháp chỉ dựa trên tính chất vật lý mà không chú ý tới tính toàn vẹn
hóa học của màng tinh trùng.
1.3.4. Sử dụng pentoxyfiline [25]
Nhiều nghiên cứu cũng đã báo cáo về việc sử dụng pentoxyfiline để làm
tăng cường khả năng di động và khả năng thụ tinh của tinh trùng trên các mẫu
có tỉ lệ di động thấp nhưng có ít nghiên cứu trên các mẫu tinh trùng bất động
hoàn toàn.
 Nguyên lý: Pentoxifilline là một chất ức chế 3’,5’- nucleotide
phosphodiesterase, giúp tinh trùng di động bằng cách kéo dài thời gian tồn tại của
cAMP trong tế bào, chất cần bổ sung trong quá trình hoạt động của tinh trùng.


14

 Phương pháp: Trộn tinh dịch với pentoxifilline nồng độ 7,2mM theo tỉ lệ

1:1, ủ ấm 30 phút trong tủ 37 oC có 5% CO2, 95% O2. Sau ủ ấm nhỏ một giọt
lên buồng đếm và đánh giá tỉ lệ di động của mẫu sau ủ.
 Ưu điểm: Với những mẫu tinh dịch có tỉ lệ tinh trùng di động thấp
pentoxifilline có tác dụng khởi động sự di động của tinh trùng, làm tăng tỉ lệ
tinh trùng di động. Pentoxifilline có tác dụng làm tăng tỉ lệ tinh trùng di động
trong các trường hợp khuyết trục sợi đuôi (hội chứng lông bất động), khuyết
tật về emzyne ( thiếu proten- carboxyl methylase), khuyết thiếu chức năng
đuôi tinh trùng, các mẫu tinh dịch bất thường nặng về di động, tinh trùng lấy
từ mào tinh, tinh hoàn qua MESA, TESE. Tuy nhiên với các trường hợp tinh
trùng bất động hoàn toàn vẫn cần có phương pháp giúp phát hiện tinh trùng
sống ví dụ như HOS Test. Pentoxifilline làm tăng tỉ lệ di động từ 51,8% lên
70,8% so với nhóm không sử dụng thì tỉ lệ di động không thay đổi. Trước đây
pentoxifilline được sử dụng khá rộng rãi trong các labo để làm tăng tỉ lệ di
động trong các mẫu tinh dịch làm IVF mà có tỉ lệ tinh trùng di động thấp. Kết
quả cho thấy tỉ lệ thụ tinh và có thai trong các mẫu có sử dụng pentoxifilline
tương đương với các mẫu có tỉ lệ tinh trùng di động trong giới hạn bình
thường. Nhìn chung pentoxifilline chủ yếu sử dụng trong các chu kỳ IVF cổ
điển với các mẫu tinh trùng có tỉ lệ tinh trùng di động thấp.
 Nhược điểm: ảnh hưởng của pentoxyfiline lên trứng, lên sự phát triển của
phôi vẫn chưa được đánh giá đầy đủ và có thể gây hại tới phôi. Phương pháp
này cũng chỉ áp dụng với các mẫu vẫn có tỉ lệ tinh trùng di động thấp, một số
mẫu bất động nhưng vẫn còn tiềm năng di động sau khi sử dụng
pentoxyfilline. Với những mẫu bất động hoàn toàn thì không áp dụng được.
Để khắc phục những nhược điểm trên, HOS Test đã được phát triển. Ưu
điểm là phát hiện được tinh trùng bất động mà còn sống, không làm chết tinh
trùng cũng như không ảnh hưởng tới sự sống của tinh trùng, sự thụ tinh của
noãn, phát triển của phôi.


15

1.4. Nghiệm pháp HOS Test
1.4.1. Cấu tạo và chức năng màng bào tương, nguyên lý của HOS Test [26]
Màng tế bào là ranh giới ngăn tế bào sống với môi trường xung quanh
nó. Màng tế bào điều khiển sự vào ra của vật chất xuyên qua màng. Giống
như các màng sinh học khác nó là màng thấm chọn lọc cho phép một số chất
đi qua dễ dàng hơn những chất khác. Màng tế bào được cấu tạo bởi lipids,
proteins, carbohydrates. Trên màng có các kênh protein xuyên màng kết hợp
với tính linh hoạt mềm dẻo của màng giúp vận chuyển vật chất qua màng có
tính chọn lọc.
1.4.1.1. Hiện tượng khuếch tán- thẩm thấu qua màng tế bào- áp suất thẩm thấu
Thẩm thấu là sự khuyếch tán của dung môi từ dung dịch có nồng độ thấp
sang dung dịch có nồng độ cao hơn qua màng.
Áp suất thẩm thấu là lực đẩy của các phân tử dung môi từ dung dịch có
nồng độ thấp đến dung dịch có nồng độ cao qua màng.
Quá trình thẩm thấu giữa hai dung dịch sẽ tiếp tục cho đến khi nồng độ
của hai dung dịch bằng nhau.
Khi nồng độ của hai dung dịch cân bằng nhau thì sẽ không có
sự khuyếch tán của dung môi qua màng, tạo cân bằng áp suất thẩm thấu
 Hiện tượng khuếch tán
Khuếch tán (Gradient nồng độ) là hiện tượng chất khuếch tán vận
chuyển từ nơi có nồng độ cao sang nơi có nồng độ thấp, nhờ năng lượng
chuyển động nhiệt.
Các yếu tố ảnh hưởng đến sự khuếch tán:
- Bản chất của chất khuếch tán: tỉ lệ thuận với độ hoà tan trong lipid
nhưng tỉ lệ nghịch với trọng lượng phân tử.
- Nhiệt độ: tỉ lệ thuận với nhiệt độ, nhiệt độ tăng làm tăng chuyển động
của phân tử và ion trong dung dịch.

16

- Trạng thái của màng: tỉ lệ nghịch với độ dày của màng nhưng tỉ lệ
thuận với số kênh trên 1 đơn vị diện tích màng.
- Sự khuếch tán của 1 chất khác xảy ra đồng thời.
- Ảnh hưởng của sự chênh lệch nồng độ: tỷ lệ thuận với sự chênh lệch
nồng độ hai bên màng.
Có các hình thức khuếch tán sau:
- Khuếch tán đơn giản (simple diffiusion) theo 2 cách:
+ Khuếch tán qua lớp lipid kép: chất khuếch tán hoà tan trong lipid: các
chất bản chất là lipid, oxy, dioxyt carbon (CO2), NH3, vitamin tan trong dầu A,
D, E, K, Alcool, rượu…Nước mặc dù không hoà tan trong lipid kép của màng
nhưng phần lớn nước qua đi lớp lipid màng rất nhanh. Người ta cho rằng do
kích thước phân tử quá nhỏ trong khi động năng của chúng rất lớn nên nước
thấm qua rất nhanh, làm phần kỵ nước chưa kịp ngăn cản thì phân tử nước đã
qua rồi. Các phân tử có kích thước quá nhỏ có thể qua lớp lipid kép giống như
nước.
+ Khuếch tán qua các kênh protein: một phần nhỏ nước, các chất hoà tan
trong nước, các ion Na+, K+, H+… đi qua các kênh protein của màng. Các
kênh này chọn lọc chất khuếch tán do đặc điểm về đường kính, hình dạng và
diện tích ở mặt trong của kênh. Ngoài ra, cổng của kênh và sự đóng mở các
kênh giúp cho sự kiểm soát tính thấm của kênh: Na + ưu thế ở ngoại bào và
cánh cổng của kênh này đóng ở mặt ngoài màng tế bào. Ion K+ thì ngược lại.
- Khuếch tán được gia tốc: chất khuếch tán là chất hữu cơ không tan
trong lipid và có kích thước phân tử lớn, đặc biệt là glucose, acid
amin. Insulin kích thích tốc độ khuếch tán gấp 10- 20 lần. Có thể vận chuyển
các monosaccarid khác như Galactose, mantose, xylose, arbinose.
Cơ chế khuếch tán được gia tốc như sau: phân tử khuếch tán đến gắn lên
điểm gắn của chất mang. Chất mang thay đổi cấu hình mở kênh hướng về

17

phía ngược lại. Chuyển động nhiệt của phân tử chất khuếch tán sẽ tách nó ra
khỏi receptor và di chuyển về bên kia màng.
- Khác nhau giữa khuếch tán đơn giản và khuếch tán có gia tốc:
Khuếch tán được gia tốc khác khuếch tán đơn giản là tốc độ khuếch tán
tỷ lệ với nồng độ chất khuếch tán nhưng nó đạt đến một giá trị giới hạn
(Vmax), mặc dù nồng độ chất khuếch tán vẫn tiếp tục tăng. Trong khi đó
khuếch tán đơn giản, tốc độ khuếch tán tăng tỷ lệ thuận với nồng độ chất
khuếch tán tăng.
Nguyên nhân hạn chế tốc độ tối đa trong khuếch tán có gia tốc là do số
lượng các vị trí gắn trên protein mang có hạn, chất khuếch tán phải kết nối với
điểm gắn, thời gian để protein mang thay đổi cấu hình là nguyên nhân chính
giới hạn tốc độ tối đa của khuếch tán có gia tốc.

 Hiện tượng thẩm thấu (Gradient áp suất thẩm thấu= ASTT)
Sự thẩm thấu là sự chuyển động của các phân tử dung môi (trong cơ thể
chủ yếu là nước, trong bài này đề cập chính là nước) qua màng tế bào theo
hướng từ nơi có áp suất (nồng độ) thẩm thấu thấp đến nơi có áp suất (nồng
độ) thẩm thấu cao hơn.
Theo luật Van’t Hoff định nghĩa ASTT của một dung dịch tỉ lệ thuận với
nồng độ thẩm thấu theo công thức P= R.T.C trong đó R là hằng số khí lý
tưởng, T là nhiệt độ tuyệt đối, C là nồng độ thẩm thấu.
Trong sinh lý, đơn vị đo nồng độ thẩm thấu là Osmolarity, 1 Osmol =
1000 mosmol.
Sự thẩm thấu thực chất là một quá trình khuếch tán của các phân tử dung
môi (ở đây là nước). Sự thẩm thấu diễn ra rất nhanh, nhằm cân bằng nồng độ
thẩm thấu giữa trong và ngoài tế bào hay các ngăn dịch trong cơ thể.
Độ lớn của áp suất thẩm thấu phụ thuộc vào nồng độ các phân tử bé và

ion. Dung dịch nhược trương (hypotonic) là dung dịch có áp suất thẩm