Nghiên cứu nhân giống in vitro cây mật nhân (eurycoma longifolia jack)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG
----------

PHẠM THỊ XUÂN DIỆU

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO
CÂY MẬT NHÂN (EURYCOMA
LONGIFOLIA JACK)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

1


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Hiện nay, nhu cầu của con người về nguồn dược liệu ngày càng tăng. Cây
dược liệu là nguồn cung cấp thuốc chữa bệnh quan trọng nhất cho phần lớn dân số
trên thế giới [34]. Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới có đến 80% người dân
vẫn dựa chủ yếu vào các phương pháp chữa bệnh truyền thống bằng các cây thảo
dược [34]. Tuy nhiên, các loài cây dược liệu trong tự nhiên đang bị giảm về số
lượng và chất lượng bởi sự khai thác quá mức; các điều kiện ngày càng bất lợi của
môi trường tự nhiên,… dẫn đến nhiều loài cây dược liệu quý hiếm bị tuyệt chủng,
ảnh hưởng đến nguồn cung cấp dược liệu bền vững cho con người [11].
Cây mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) là một trong số các loài cây dược
liệu được biết đến nhiều ở Đông Nam Á do đặc tính tăng cường sức khoẻ tình dục
và có hiệu quả như gây độc tế bào, chống sốt rét, chống lở loét, chống thúc đẩy các
khối u và là tác nhân chống ký sinh trùng [21]. Tại Việt Nam, nó được gọi là “cây
bá bệnh” hay “cây mật nhân” có mặt trong vườn quốc gia Bái Tử Long, một số rừng

ở Tây nguyên. Bộ phận dùng là rễ, vỏ thân và quả được dùng để làm thuốc. Tuy
nhiên, đây là loài cây rất khó trồng, những hạt giống có tỷ lệ nảy mầm thấp và cần
phải có thời gian dài để nảy mầm do phôi còn ở trạng thái còn non tại thời điểm
phát tán. Mặc khác loài cây này đang biến mất dần dần do sự khai thác bừa bãi rễ
cây làm nguyên liệu cho việc sản xuất thuốc. Vì vậy, loài cây này cần phải được
nhanh chóng nhân lên hàng loạt trên quy mô thương mại để đáp ứng với nhu cầu
của ngành công nghiệp dược phẩm [21].
Công nghệ sinh học là công cụ quan trọng trong nhân giống và cải thiện di
truyền của cây dược liệu bằng cách áp dụng kỹ thuật chẳng hạn như tái sinh in vitro
và biến đổi di truyền, nó cũng có thể được khai thác để sản xuất các chất trao đổi
thứ cấp nhờ sử dụng thực vật như một lò phản ứng sinh học [34]. Việc ứng dụng
công nghệ sinh học đặc biệt là công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật được xem
là phương án có triển vọng nhất để nhân nhanh, bảo tồn và phát triển nhiều nguồn
gen cây thuốc quý hiếm.
Hiện nay, trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu về nuôi cấy in
vitro trên cùng đối tượng cây mật nhân [16, 21]. Tuy nhiên, ở Việt Nam việc nhân

2


giống loài cây này bằng kỹ thuật in vitro hầu như chưa có công trình nào công bố.
Xuất phát từ cơ sở trên chúng tôi chọn đề tài: “ Nghiên cứu nhân giống in
vitro cây mật nhân (Eurycoma longifolia Jack)”
2. Mục đích nghiên cứu
Xác định môi trường thích hợp để tái sinh cây con in vitro hoàn chỉnh từ hạt
cây mật nhân làm cơ sở cho việc nhân nhanh giống loài cây thuốc quý này.
3. Nội dung nghiên cứu
 Khảo sát hiệu quả khử trùng của các dung dịch HgCl2 (0,1%) và NaClO
(5,25%) đối với hạt mật nhân.
 Khảo sát ảnh hưởng của KIN và BA đến khả năng nảy mầm của hạt mật

nhân.
 Khảo sát ảnh hưởng của KIN đến khả năng tái sinh chồi in vitro cây mật
nhân.
 Khảo sát ảnh hưởng của KIN và IBA đến khả năng tạo rễ in vitro cây mật
nhân.

3


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nhân giống in vitro ở thực vật
Thuật ngữ nhân giống in vitro hay còn gọi là vi nhân giống được sử dụng đặc
biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu
bằng nhiều bộ phận khác nhau của thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều
kiện vô trùng trong các ống nghiệm hoặc trong các loại bình nuôi cấy [7].
Kỹ thuật nhân giống in vitro nhằm mục đích sau:
- Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý, hiếm nhằm tạo vật liệu cho công
tác tạo giống.
- Nhân nhanh với hiệu quả kinh tế cao các loài hoa, cây cảnh, cây ăn quả
không trồng bằng hạt.
- Nhân nhanh các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại rau, cây
cảnh và cây trồng khác.
- Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quý của cây lấy gỗ, cây làm thuốc, cây
ăn quả, rau xanh.
- Nhân nhanh trong điều kiện vô trùng, cách ly tái nhiễm kết hợp với làm
sạch bệnh virus.
- Bảo quản các tập đoàn giống vô tính và các loài cây giao phấn trong ngân
hàng gen
1.1.1. Các giai đoạn chính trong quá trình nhân giống in vitro
 Giai đoạn chuẩn bị

Mục đích của giai đoạn này là tạo ra nguồn mẫu sạch để phục vụ cho các
bước tiếp theo. Giai đoạn này coi như là một bước thuần hoá vật liệu để nuôi cấy.
Cây giống được đưa ra khỏi nơi phân bố tự nhiên để chúng thích ứng với môi
trường mới, đồng thời giảm bớt khả năng nhiễm bệnh của mẫu nuôi cấy và chủ
động trong công tác nhân giống. Trong trường hợp cần thiết có thể làm trẻ hoá vật
liệu giống.
 Giai đoạn cấy khởi động
Mục đích của giai đoạn này là tạo ra các chồi mới từ các mô nuôi cấy. Khi đã
có nguồn nguyên liệu nuôi cấy, cần tiến hành lấy mẫu và xử lý trong những điều
kiện vô trùng. Người ta thường dùng một số hoá chất như HgCl2, Ca(OCl)2, NaOCl,

4


H2O2, để khử trùng mẫu cấy. Tuỳ thuộc vào từng loại vật liệu mà chọn hoá chất,
nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp. Về nguyên tắc, mô nuôi cấy có thể là bất
kỳ bộ phận nào của cây (thân, rễ, lá, hoa, quả…) nhưng theo Blatt thì mô lấy từ các
phần non của cây có khả năng nuôi cấy thành công cao hơn mô lấy từ các bộ phận
trưởng thành khác (Blat K. M. và Hwanok Ma, 2004). Vì vậy, người ta thường lấy
chồi đỉnh hay chồi nách để nuôi cấy in vitro.
Ngoài ra, khi lựa chọn mô nuôi cấy cần chú ý tuổi sinh lý của mô càng thấp
thì độ trẻ hoá cao, nuôi cấy dễ thành công. Các mô lấy ở thời kỳ sinh trưởng mạnh
của cây trong mùa sinh trưởng cho khả năng tái sinh tốt hơn (Anoleson, 1980). Đối
với mẫu dễ bị hoá nâu khi nuôi cấy có thể bổ sung than hoạt tính hoặc polyvinin
pyrroline (PVP) vào môi trường [5]. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ
mô nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Kết quả của giai đoạn
này phụ thuộc vào việc chọn bộ phận nuôi cấy, cho nên khi lấy mẫu cần đảm bảo
các nguyên tắc nêu trên. Giai đoạn này thường kéo dài từ 4 - 6 tuần.
 Giai đoạn nhân nhanh
Một trong những ưu điểm của phương pháp nhân giống in vitro so với các

phương pháp nhân giống khác có hệ số nhân cao. Vì vậy, có thể coi đây là giai đoạn
then chốt của toàn bộ quá trình nhân giống. Hệ số nhân ở giai đoạn này biến động
từ 5-50 lần tuỳ thuộc vào loài cây, môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp.
Trong giai đoạn này vai trò của các chất điều hoà sinh trưởng (Auxin, Cytokinin) là
cực kỳ quan trọng để sản sinh ra lượng cây con tối đa mà vẫn đảm bảo sức sống và
bản chất di truyền của cây. Theo nguyên tắc chung thì môi trường có nhiều
Cytokinin sẽ kích thích tạo chồi. Chế độ nuôi thường là 25-270C và 10-16h/ngày,
cường độ chiếu sáng 1000 lux. Yêu cầu của giai đoạn này là tạo ra số lượng cây con
tối đa trong thời gian ngắn nhưng vẫn đảm bảo sức sống và bản chất di truyền của
cây.
 Tạo cây hoàn chỉnh (ra rễ)
Đây là giai đoạn chuẩn bị cho cây con chuyển ra ngoài hệ thống vô trùng
khi đã đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ giai đoạn 3 sang môi
trường tạo rễ. Thường sau 2-3 tuần ở các chồi này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây
hoàn chỉnh. Môi trường tạo rễ thường giảm lượng Cytokinin và tăng lượng Auxine

5


để tạo điều kiện cho sự ra rễ của chồi cây. Người ta thường dùng các chất NAA
(Acid α- naphty axetic), IBA (Acid β - indol butyric), IAA (Acid β - indol acetic) ở
nồng độ 1mg/L - 5mg/L để tạo rễ cho hầu hết các loại cây trồng bằng phương pháp
nuôi cấy mô. Giai đoạn này thường kéo dài từ 2-4 tuần lễ, sau đó được chuyển sang
môi trường Auxin để rễ phát triển.
Ở giai đoạn này cây con rất nhạy cảm với ẩm độ và bệnh tật do hoạt động
của rễ và lá mới phát sinh rất yếu, cây chưa chuyển sang giai đoạn tự dưỡng.
 Đưa cây ra môi trường tự nhiên
Đây là giai đoạn chuyển dần cây con in vitro ra nhà kính rồi ra ngoài trời.
Cây mô được chuyển từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng, nên phải
tập cho cây quen dần với môi trường tự nhiên, tránh sự thay đổi đột ngột làm cây có

thể bị sốc hoặc chết. Khi cây con đã cứng cáp và đạt những tiêu chuẩn nhất định về
chiều cao, số lá và số rễ thì đưa ra ngoài giá thể. Giá thể tiếp nhận cây in vitro phải
đảm bảo tơi, xốp, thoáng nước và sạch bệnh. Phải giữ ẩm cho cây mới đưa từ bình
nuôi ra, cần duy trì độ ẩm >50% để cây con không mất nước và làm giàn che để
tránh ánh sáng quá mạnh. Sau 2-3 ngày đưa ra ngoài cây mô sẽ sinh trưởng ổn định,
chăm sóc cây mô tương tự chế độ chăm sóc cây hom hoặc cây từ hạt.
Tóm lại, quá trình nhân giống in vitro có thể được chia thành các giai đoạn
như trên nhưng kết quả của mỗi giai đoạn không tách biệt nhau mà có sự kế thừa
của giai đoạn trước. Trong các giai đoạn trên thì giai đoạn chuẩn bị môi trường là
đặc biệt quan trọng, giai đoạn này ảnh hưởng xuyên suốt và quyết định sự thành
công hay thất bại của quá trình nhân giống.
1.1.2. Ảnh hưởng của môi trường và điều kiện nuôi cấy
 Môi trường nuôi cấy
Trong nuôi cấy in vitro, môi trường nuôi cấy và điều kiện bên ngoài được
xem là vấn để quyết định sự thành bại của quá trình nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy
được xem là phần đệm để cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự tăng
trưởng và phân hoá mô trong suốt quá trình nuôi cấy in vitro. Cho đến nay, đã có
nhiều môi trường dinh dưỡng được tìm ra (MS-62, WPM, WV3, N6, B5, LS…) tuỳ
thuộc vào đối tượng và mục đích nuôi cấy. Vấn đề lựa chọn môi trường thích hợp
cho cây sinh trưởng và phát triển tối ưu trong từng giai đoạn của nuôi cấy mô là rất

6


quan trọng. Môi trường nuôi cấy của hầu hết các loài thực vật bao gồm các muối
khoáng đa lượng, vi lượng, nguồn các bon, các acid amine và các chất điều hoà sinh
trưởng (cũng có thể bổ sung thêm một số chất phụ gia khác như than hoạt tính, nước
dừa …) tuỳ từng loài, giống, nguồn gốc mẫu, thậm chí từng cơ quan trên cùng cơ
thể mà dinh dưỡng cần cho sự sinh trưởng tối ưu của chúng khác nhau. Vì vậy, vấn
đề cần lựa chọn môi trường thích hợp cho sinh trưởng, phát triển tối ưu cho từng

giai đoạn của hệ mô trong nuôi cấy mô rất quan trọng, số lượng và các loại hoá chất
phải cần độ chính xác cao và phù hợp cho từng giai đoạn, đối tượng cụ thể.
+ Nguồn các bon: trong nuôi cấy mô, các tế bào chưa có khả năng quang hợp
để tổng hợp nên chất hữu cơ do vậy người ta phải đưa vào môi trường một lượng
hợp chất các bon nhất định để cung cấp năng nượng cho tế bào và mô (Debengh,
1991). Nguồn cácbon ở đây là các loại đường khoảng 20-30 mg/L có tác dụng giúp
mô tế bào thực vật tổng hợp các hợp chất hữu cơ, giúp tế bào tăng sinh khối, ngoài
ra nó đóng vai trò là chất thẩm thấu chính của môi trường. Người ta thường sử dụng
2 loại đường đó là saccarose và glucose.
+ Nguồn Nitơ: tỷ lệ nguồn nitơ tuỳ thuộc vào loài cây và trạng thái phát triển
mô. Thông thường, nguồn nitơ được đưa vào môi trường ở hai dạng là HN4+ và NO3
(nitrat). Trong đó, việc hấp thụ NO3 của các tế bào thực vật tỏ ra có hiệu quả hơn so
với NH4. Nhưng đôi khi NO3 gây ra hiện tượng “kiềm hóa” môi trường vì vậy giải
pháp sử dụng phối hợp cả 2 nguồn nitrơ với tỷ lệ hợp lý được sử dụng rộng rãi nhất.
 Các chất kích thích sinh trưởng
Các Phytohormon là những chất có tác dụng điều hoà sinh trưởng và phát
triển của thực vật. Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và
phát triển của thực vật như: phân chia, biệt hoá tế bào… ngoài ra còn có ảnh hưởng
đến quá trình lão hoá mô và nhiều quá trình khác. Các phytohormon có thể chia
thành 5 nhóm: Auxine, Cytokinin, Giberillin, Ethylen, Abscisic acid. Chúng là yếu
tố quan trọng nhất trong môi trường quyết định đến sự thành công của kết quả nuôi
cấy.
+ Auxin: Nhóm này gồm có các chất chính là: IBA (3-Indol butyric acid),
IAA (Indol acetic acid), NAA (Nathyl acetic acid),… trong nuôi cấy mô thực vật

7


Auxin thường được sử dụng để kích thích sự phân chia tế bào, biệt hoá rễ, hình
thành callus, kìm hãm sự phát triển chồi và tạo ra các rễ phụ [14].

+ Cytokinin: Được bổ sung vào môi trường chủ yếu để kích thích sự phân
chia tế bào và quyết định sự phân hoá chồi bất định từ callus và cơ quan. Các hợp
chất thường sử dụng là: Kinetine (6- Furfuryl aminopurine - C10H9N05), BAP (6Benzyl amino purine), Zip (Izopentenyl adenin), Zeatin… Trong các chất này thì
Kinetin và BAP được sử dụng phổ biến nhất vì chúng có hoạt tính cao và giá thành
rẻ. Tuỳ vào từng hệ mô và mục đích nuôi cấy mà Cytokinin được sử dụng ở các
nồng độ khác nhau. Ở nồng độ thấp (10-7- 10-6M) chúng có tác dụng kích thích sự
phân bào, ở nồng độ 10-6- 10-5M chúng kích thích sự phân hoá chồi. Trong nuôi cấy
mô để kích thích sự nhân nhanh người ta thường xử dụng Cytokinin với nồng độ 106

- 10-4 [3].
 Điều kiện nuôi cấy
+ Ánh sáng: Đây là yếu tố cần thiết cho sự phát triển và phát sinh hình thái

của các mô nuôi cấy. Ánh sáng có ảnh hưởng tới mẫu cấy thông qua thời gian chiếu
sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng. Thời gian chiếu sáng có vai trò
quan trọng trong quá trình phát triển của mô nuôi cấy. Với đa số các loài cây, thời
gian chiếu sáng thích hợp là 8-12 h/ngày.
Cường độ ánh sáng ảnh hưởng đến quá trình phát sinh hình thái mô nuôi cấy.
Cường độ ánh sáng cao kích thích sinh trưởng của callus trong khi cường độ thấp
gây nên sự tạo chồi (Ammirato, 1986). Nhìn chung, cường độ ánh sáng thích hợp
cho mô nuôi cấy là từ 1000 - 7000 lux (Moresin, 1974).
Bên cạnh thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng thì chất lượng ánh sáng
cũng ảnh hưởng khá rõ tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. Ánh sáng đỏ làm
tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng, còn ánh sáng xanh thì ức
chế sự vươn cao của chồi nhưng lại ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của callus.
Chính vì vậy mà trong phòng thí nghiệm thường sử dụng ánh sáng của đèn huỳnh
quang với cường độ 2000 - 3000 lux.
+ Nhiệt độ: là nhân tố có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào và các quá
trình trao đổi chất của mô nuôi cấy, đồng thời nó có ảnh hưởng tới sự hoạt động của
Auxin, do đó làm ảnh hưởng đến khả năng ra rễ của cây mô. Theo kết quả nghiên

8


cứu của Vonanorld (1982) thì nếu nhiệt độ ngày/đêm là 200 C/150C hoặc 200C/180C
tỷ lệ ra rễ đạt được khoảng 33%, thậm chí còn thấp hơn. Ở nhiệt độ trung bình thì
hoạt động trao đổi chất tốt hơn. Còn ở nhiệt độ cao lại kích thích ra nhiều tế bào
không có tổ chức. Trong nuôi cấy mô, nhiệt độ thường được duy trì ổn định, ban
ngày từ 25 - 300C và ban đêm từ 17 - 200C.
1.1.3. Các nghiên cứu nhân giống in vitro cây dược liệu
 Trên thế giới
Nuôi cấy mô tế bào thực vật được hình thành và phát triển từ những năm 80
của thế kỉ XX và được ứng dụng chủ yếu trong các lĩnh vực: Nhân giống vô tính in
vitro, nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng để tạo cây sạch bệnh, bảo quản
nguồn gen in vitro, tạo phôi vô tính và hạt nhân tạo… [2].
Kỹ thuật nuôi cấy mô đã được trên 600 công ty lớn trên thế giới áp dụng và
đã nhân được khoảng 500 triệu cây giống trong 1 năm ở các công ty giống cây trồng
khác nhau. Dự kiến trên thị trường cây giống, kỹ thuật nuôi cấy mô thu được
khoảng 15 tỉ USD/năm và tốc độ tăng trưởng của thị trường này hàng năm vào
khoảng 15% [2].
Trong những năm gần đây, quy trình nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in
vitro được nhiều cơ sở khoa học nghiên cứu và hoàn thiện trên các đối tượng khác
nhau như: cây rừng, cây lương thực, thực phẩm, cây ăn quả, hoa, cây cảnh, cây
dược liệu… Gần đây, việc ứng dụng các thành tựu công nghệ sinh học trong nhân
giống, tạo dược liệu in vitro ở các loài cây thuốc quý đang được quan tâm và đã đạt
một số thành tựu, chẳng hạn như:
G. Rout và cs (2007) nghiên cứu nhân nhanh cây Lài tàu (Nyctanthes
arbortristis) - họ cỏ roi ngựa (Verbenaceae) từ chồi nách. Tỷ lệ vi chồi/mẫu cấy lớn
nhất (6,65 chồi/mẫu) ở môi trường MS có bổ sung 1,5 mg/L BA, 50 mg/L Ads và
0,1 mg/L IAA sau 4 tuần nuôi cấy. Tỷ lệ ra rễ lớn nhất trên môi trường MS bổ sung

0,25 mg/L IBA; 0,1 mg/L IAA và 2% sucrose. Khoảng 70% các cây con đã ra rễ
sống sót trong nhà kính [31].
Sharma và Neetu (2007) đã áp dụng phương pháp nhân giống vô tính in vitro
để bảo tồn cây Rau đắng (Bacopa monnieri L. Penn) là một loài thảo dược thuộc họ
Scrophulariaceae. Đây là cây thuốc bỗ não tốt nhất trong các phương thuốc của Ấn

9


Độ và các phương thuốc truyền thống khác, có tác dụng bổ thần kinh, trị chứng mất
ngủ và tình trạng bồn chồn, lo lắng. Kết quả nghiên cứu cho thấy môi trường MS có
bổ sung 4 mg/L BA và 0,4 mg/L NAA hoặc môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L
BA và 0,5 mg/L NAA là tốt nhất để cấy gây và nhân nhanh chồi in vitro từ chồi
nách. Môi trường MS bổ sung 7 mg/L agar và 20 mg/L đường hoặc môi trường MS
bổ sung 8 mg/L agar và 20 mg/L đường là môi trường tái sinh rễ tốt nhất [33].
Nadha và cs (2007) nghiên cứu nhân nhanh cây dầu dài Ấn Độ (Tylophora
indica) thuộc họ Thiên lý (Asclepiadaceae). Các tác giả đã nghiên cứu khả năng tái
sinh chồi in vitro từ đoạn mắt thân cây dầu dài Ấn Độ trên môi trường MS bổ sung
BA (10-6 - 4x10-6 mg/L), CM (15%). Kết quả tốt nhất đạt được là 45 - 50 chồi trên
môi trường MS có bổ sung 2x10-6mg/L BA sau 7 - 8 tuần nuôi cấy. Khi tăng thêm
nồng độ BA thì số chồi bị suy giảm. Sau đó các chồi được cấy trên môi trường MS
bổ sung IBA và IAA để tạo rễ, kết quả tổt nhất ở môi trường MS bổ sung 4x10-6
mg/L IBA [26].
Nhóm tác giả Animesh và cs (2007) tái sinh in vitro cây Cam thảo dây
(Abrus precatorius L.) thuộc họ Cánh bướm (Papilionaceae) từ callus trên môi
trường MS có bổ sung 3,0 mg/L BA + 5mg/L KIN + 0,5 mg/L NAA. Cây này có
tác dụng chữa nóng sốt, chữa say, giải độc cơ thể, rễ được dùng làm thuốc nhầy để
chữa bệnh lậu, kinh nguyệt quá nhiều [15].
Theo nghiên cứu của nhóm tác giả người Ấn Độ là Panda MK và cs (2007)
trên cây nghệ (Curcuma longa) thì phần trăm mẫu bật chồi cao nhất đạt 85,8% ở

nồng độ 3 mg/L BA và tỉ lệ chồi/mẫu cao (7,6 chồi/mẫu) [28].
Năm 2008, Khalafalla M. M. và Daffalla H. M. đã nhân giống thành công
cây Keo (Acacia Senegal (L.) Wild) thuộc họ Trinh nữ, vỏ chứa tanin dùng để trị
các vết thương, vết loét. Sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS, có bổ sung 1,0
mg/L BA cho tỉ lệ bật chồi cao nhất (5,3 chồi /mẫu) và tỉ lệ ra rễ chỉ đạt 25% ở môi
trường có 1,0 mg/L IBA [22].
U. Salma và cs (2008) đã nghiên cứu tại Bangladesh về nhân giống cây Ba
gạc Ấn Độ (Rawolfia serpentien L. Benth) có chứa 28 alkaloid khác nhau có tác
dụng hạ huyết áp, an thần, gây ngủ…. trên tổ hợp BA và NAA. Sau thời gian nuôi
cấy đã thu được một số chồi/mẫu cao nhất ở tổ hợp 1,5 mg/L BA và 0,2 mg/L

10


NAA. Tỉ lệ mẫu tạo rễ in vitro cao nhất ở ½ MS có bổ sung 1,0 mg/L IAA và 1,0
mg/L IBA [32].
Năm 2009, một nhóm tác giả người Malaysia đã nghiên cứu nhân nhanh cây
Gynura procumbens (Lour.) Merr để chiết xuất hoạt chất sinh học. Cây này thường
nhân giống bằng cách giâm cành, nhưng phương pháp này không thể đáp ứng được
nhu cầu sử dụng chúng. Kết quả thu được cho thấy môi trường bổ sung 0,5 mg/L
NAA + 2,0 mg/L BA có 18 chồi con/mẫu chồi phát sinh. Toàn bộ chồi con tạo rễ
sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS không có chất điều hoà sinh trưởng [18].
Theo kết qủa nghiên cứu của Arumon và RoyChowdhury (2009) đã nghiên
cứu nhân giống cây Lô hội (Aloe Vera sp.). Một loài cây có tác dụng trong cả đông
y và tây y, chữa được các bệnh ở trẻ em, táo bón, tăng cường tiêu hoá và có tác
dụng sát trùng vết thương, thông tiện, thanh nhiệt, nhức đầu…. Sau 5 tuần nuôi cấy
cho thấy tỉ lệ bật chồi cao (78,01%) trên ba môi trường có bổ sung 2 mg/L IBA, 0,1
mg/L BA, tổ hợp 0,5 mg/L KIN và 0,2 mg/L NAA [25].
Theo nghiên cứu của nhóm tác giả người Hàn Quốc: Sang và cs (2009) đã tái
sinh cây Địa hoàng (Rehmannia glutinosa L.) thuộc họ hoa mõm sói

(Scrophulariaceae) có tác dụng lợi tiểu, chữa bệnh đái tháo đường, thiếu máu, suy
nhược cơ thể…trên môi trường MS có bổ sung 1 mg/L TDZ và 0,1 mg/L NAA và
3g/L Gelrite thì tỉ lệ mẫu tái sinh đạt 73% nhằm làm cơ sở nhân nhanh cây Địa
hoàng [29].
Năm 2010, Hemant và cs đã tiến hành nhân giống cây Cannabis sativa L. Là
một loại dược liệu quan trọng bằng phương pháp bọc chồi nách Cannabis sativa L.
trong dịch alginate. Cây tái sinh tốt nhất trên môi trường cơ bản Murashige và
Skoog bổ sung thidiazuron (TDZ 0,5 micron) và PPM (0.075%) trong điều kiện in
vitro [23].
Nghiên cứu của Chandra và cs (2010) nhân giống cây Cannabis sativa Elite
cho sản xuất Δ9 Tetrahydrocannabinol (THC) bằng sử dụng Công cụ công nghệ
sinh học.. Báo cáo này mô tả vai trò của công nghệ sinh học trong nhân giống loài
Cannabis sativa để sản xuất Δ9 THC bao gồm sàng lọc các kiểu gen năng suất cao,
nhân giống loài cây này bằng cách sử dụng các công cụ công nghệ sinh học, so sánh

11


giữa cây vi nhân giống với cây ngoài tự nhiên và sinh sản sinh dưỡng thực vật cho
mục đích kiểm soát chất lượng [19].
Gần đây các nhà khoa học Ấn Độ đã tiếp cận việc ứng dụng công nghệ sinh
học cho nhân giống các loài cây dược liệu quan trọng ở vùng sa mạc Thar
Rajasthan. Các loài cây như loài Ceropegia, Caralluma, Calotropis, Leptadenia,
Tylophora, Pueraria, Mucuna, Vitex và Sarcostemma là nguồn nhiên liệu có giá trị,
là thức ăn gia súc, gỗ, thuốc, phân sinh học (Endophytic rizobia) và rau quả để duy
trì cuộc sống ở đây [30].
 Ở Việt Nam:
Việt Nam có hàng ngàn cây thuốc quý hiếm được ghi tên trong danh lục đỏ.
Nhiều cây thuốc quý có nguy cơ bị tuyệt chủng do bị khai thác mạnh phục vụ cho
việc sản xuất trên quy mô công nghiệp. Để bảo tồn nguồn gen những cây thuốc quý

này, quy trình nhân giống cây dược liệu được nhiều tác giả nghiên cứu hoàn thiện
như:
Nhân giống vô tính các dòng Kava (Piper methysticum G. Forster) có hoạt
tính sinh học cao [6].
Nguyễn Thị Kim Uyên, Trần Văn Minh (2007) đã nhân giống cây Thanh hao
(Artemisia annua L.) trên môi trường LV và nhận thấy, môi trường có bổ sung BAP
0,3mg/L chồi phát triển về cả chiều cao và số lượng. Khi bổ sung BAP, NAA và
2,4-D riêng rẽ không kích thích phát sinh phôi soma nhưng khi bổ sung NAA và
2,4-D riêng rẽ lại kích thích tạo rễ. Bổ sung kết hợp BAP 0,5mg/L và NAA
0,5mg/L cho tế bào soma phát sinh đồng đều; cả BAP, NAA và 2,4-D đều có tác
dụng kích thích tăng tế bào soma và môi trường thích hợp nhất cho nuôi cấy tăng
sinh tế bào soma là môi trường LV có bổ sung BAP 0,5mg/L + NAA 0,5mg/L [13].
Năm 2007, Bùi Thị Tường Thu và Trần Văn Minh nghiên cứu nuôi cấy đỉnh
cây Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc). Chồi đỉnh và đốt thân cây Thông đỏ (1-2
năm tuổi) được sử dụng trong nuôi cấy in vitro. Chồi non phát sinh sau 45 ngày
nuôi cấy trên môi trường MS + 5mg/L BA + 1mg/L KIN. Chồi non được nuôi cấy
phát sinh rễ trên môi trường WPM + 1mg/L NAA + 50mg/L Rhizopon say 75 ngày
nuôi cấy. AgNO3 thích hợp cho nuôi cấy ức chế sự hoá nâu mẫu. Chồi đỉnh chiếm
ưu thế trong quá trình phát sinh và sinh trưởng của chồi bên [10].

12


Quách Diễm Phương và cs (2007) công bố công trình nghiên cứu nhân giống
in vitro cây Bắt ruồi (Drosera burmanni Vahl.) để thu hợp chất quinone. Hạt sau
khi khử trùng nuôi cấy trên môi trường ½ MS. Cây con sau khi nảy mầm được cắt
đốt và nuôi cấy trong ½ MS lỏng lắc. Kết quả cho thấy khi nuôi cấy trên môi trường
lỏng, 100% mẫu cấy sống, lá tăng trưởng xanh tốt và tạo nhiều chồi [9].
Ứng dụng kỹ thuật nhân giống in vitro để bảo tồn và nhân nhanh cây dược
liệu điển hình nhất ở Việt Nam là nghiên cứu nhân giống bảo tồn cây Thuỷ tùng

(Glyptostrobus pensilis) của Nguyễn Thành Sum (2007). Thuỷ tùng được xem như
là hoá thạch sống của ngành hạt Trần, là loài cây thuốc nằm trong sách Đỏ Thế giới.
Số cá thể này còn lại quá ít, quá trính tái sinh tự nhiên kém (0,02%), hạt lép không
ươm được, hoa không thụ phấn. Mẫu vật được sử dụng là chồi ngọn và mẫu thân,
trong môi trường WPM bổ sung 0,5 mg/L BA mẫu cho khả năng nhân chồi cao. Khi
cấy mẫu trên môi trường WPM bổ sung 0,5 mg/L IBA sau 8 tuần nuôi cấy suất hiện
callus trắng, hơi xốp có hình dạng của rễ [1].
Phạm Thị Bích Ngọc và Phan Ngô Hoang (2008) nghiên cứu sự phát sinh
chồi từ callus cây dây chiều (Tetracera scandens L.) là một nguồn dược liệu quan
trọng, góp phần điều trị một số bệnh như: phù thận, lợi tiểu, gout… Callus được tạo
ra từ lá trên môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung 2,5 mg/L 2,4Dvà 0,5 mg/L BA. Trước khi cảm ứng tạo chồi, callus được tăng trưởng trên môi
trường có bổ sung 0,5 mg/L BA và 0,5 mg/L GA3. Sự phát sinh chồi xảy ra trên môi
trường MS có bổ sung BA 0,7mg/L và IAA 0,1 mg/L. Số chồi phát sinh đạt 26
chồi/khối callus (có nguồn gốc từ 0,3 cm2 mô lá) [8].
Năm 2010, Nguyễn Thanh Tùng và cs đã nghiên cứu nhân giống in vitro cây
Qua lâu (Trichosanthes kirilowii) là loài dược liệu quý chứa nhiều hợp chất hóa học
có giá trị như triterpenoid, sterol và đặc biệt là các protein bất hoạt ribosome như
karasurin, trichosanthin (TCS), Trichosanthes anti-HIV protein (TAP 29) có hoạt
tính ức chế khối u và kháng virus (bao gồm cả HIV). Hạt được khử trùng bằng javel
trong 5 phút, sau đó cấy lên môi trường cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962) bổ
sung 1,5 mg/L kinetin. Sau 4 tuần nuôi cấy, tỷ lệ hạt không nhiễm có nảy mầm đạt
87,9%. Đỉnh sinh trưởng và chồi bên in vitro được cấy lên môi trường nhân nhanh
bổ sung N6-benzyladenine purine (BAP), kinetin, naphthaleneacetic acid (NAA) và

13


nước dừa (CW) riêng rẽ hay kết hợp. Kết quả nhân chồi tốt nhất đạt được khi nuôi
cấy chồi bên trên môi trường MS bổ sung 1,0 mg/L BAP và 20% nước dừa (19,87
chồi/chồi bên). Chồi in vitro tạo rễ trên môi trường ½ MS không bổ sung chất

KTST (5,67 rễ/chồi). Cây in vitro đạt tiêu chuẩn được chuyển ra đất sau 4 tuần nuôi
cấy. Cây con được trồng trên giá thể đất thịt và cát (1:1) cho tỷ lệ sống sót cao nhất
đạt 77,5% [12].
Nguyễn Thị Ngọc Hương và Võ Thị Bạch Mai (2010) nghiên cứu sự phát
sinh hình thái chồi trong nuôi cấy in vitro cây nhàu (Morinda citrifolia L.) là cây
dược liệu quý được dùng để chữa nhiều loại bệnh như mất ngủ, đau lưng, huyết áp
cao…nhằm phục vụ cho mục đích nhân giống loài cây này trong tương lai. Kết quả
cho thấy sự phát sinh hình thái chồi ở cây nhàu trải qua 3 giai đoạn. Trong quá trình
này Zeatin 1mg/L kích thích sự hình thành sơ khởi chồi trong tối (sau 2 tuần) nhanh
hơn BA ở cùng nồng độ. Khi phối hợp NAA 0,1 mg/L và zeatin 1 mg/L sẽ làm chồi
chậm xuất hiện (sau 5 tuần). Kết quả đo hô hấp và hoạt tính chất điều hoà tăng
trưởng thực vật cũng được thảo luận để làm rõ những thay đổi sinh lý trong hình
thành chồi [4].
1.2. Vài nét về cây mật nhân
1.2.1. Đặc điểm hình thái
Mật nhân là loài cây gỗ nhỏ, cao từ 2 – 8m, cá biệt có cây cao hơn. Thân
nhỏ, ít phân cành, lá kép lông chim một lần lẻ, mọc so le. Mỗi lá kép gồm từ 21 –
41 lá chét, mọc đối, hình bầu dục, cuống lá rất ngắn, gốc lá thuôn, đầu nhọn, mặt
trên bóng, mặt dưới có lông màu xám. Hoa chùm kép mọc ở thân hoặc đầu cành,
cuống có lông màu rỉ sắt. Hoa màu vàng hoặc đỏ nâu mọc thành chùm, đơn tính
khác gốc nên mỗi cây chỉ trổ hoa đực hoặc hoa cái. Hoa nở vào tháng 3-4. Đài hoa
có 5 -6 lá đài nhỏ hình tam giác, có tuyến ở lưng. Tràng hoa 5, cũng có tuyến. Bầu
có 5 noãn, hơi dính ở gốc. Quả hạch, hình trứng dài 1 – 2cm, rộng 0,5 – 1cm, vỏ
nhẵn có rãnh dọc, khi chín quả màu đỏ sẫm chứa 1 hạt.
1.2.2. Phân bố
Mật nhân là loài cây mọc hoang ở vùng núi, trong các rừng thưa, dưới tán
các cây gỗ lớn. Phân bố rộng rãi tại Đông Nam Á ở các nước như Malaysia, Ấn Độ,
Trung Quốc, Indonesia, Philipin và Thái Lan [17].

14

Tại Việt Nam, mật nhân có mặt trong vườn quốc gia Bái Tử Long, khu Bảo
tồn thiên nhiên Đồng Sơn-Kỳ Thượng, Hoành Bồ, Quảng Ninh, một số rừng ở Tây
nguyên. Trong đó có cả ở Quảng Nam như các huyện Phước Sơn, Đông Giang, Tây
Giang, Nam Giang.
1.2.3. Công dụng
Mật nhân là một cây thuốc quan trọng và tất cả các bộ phận của cây đều
được sử dụng cho sản xuất thuốc chữa bệnh (Jiwajinda và cs, 2002; Osman và cs,
2003). Lá được sử dụng để điều trị tiêu chảy, sốt, sưng tuyến, chảy máu, bệnh phù,
ho dai dẳng, tăng huyết áp, giảm đau trong xương và bệnh sốt rét. Vỏ nghiền thành
bột được sử dụng để điều trị vết thương, u nhọt, lở loét do bệnh giang mai và đau
đầu. Rễ được nghiền thành bột hoặc dịch chiết từ rễ được sử dụng như thuốc bổ cho
phụ nữ để phục hồi sau khi sinh (Bedir và cs, 2003) [17].
Từ rễ, một số hợp chất đã được tìm thấy như các quassinoids, canthin-6alkaloids, alkaloids b-Carboline, type triterpenes tirucallane, các dẫn xuất của
squalene và biphenylneolignans. Một số các thành phần này đã được chứng minh là
có khả năng gây độc tế bào, chống sốt rét, chống các khối u, hạ sốt và ức chế hoạt
động tăng trưởng thực vật (Ismail và cs, 1999; Jagananth và cs, 2000, Jiwajinda và
cs, 2002;. Abd, 2007). Ngoài ra, các chất chiết xuất từ cây này đã được cho là tăng
tính cường dương ở nam giới và năng lực tình dục (Gimlette và cs, 1977), nghiên
cứu thực hiện bởi Rosli và cs [20].
Ở Việt Nam, cây này được sử dụng để điều trị các bệnh như: Vỏ rễ cây mật
nhân có vị rất đắng nên sử dụng làm thuốc tẩy giun sán, trị sốt rét, kiết lỵ, ngộ độc,
đầy bụng, giải say rượu, giải độc và điều hòa huyết áp. Vỏ thân làm thuốc bổ, chữa
ăn uống không tiêu, nôn, đầy, ỉa chảy, gần như vị Hậu phác và còn được dùng giải
độc do tích rượu. Vỏ cùng với rễ dùng chữa nhức mỏi, đau lưng, đau bụng kinh của
phụ nữ. Quả dùng chữa lỵ và ỉa chảy. Quả chín ăn được. Lá dùng nấu nước tắm trị
ghẻ, lở ngứa. Ngoài ra trong vỏ và rễ cây mật nhân giúp tăng năng lượng hoạt động
và sức bền cơ thể. Khả năng tăng cường sinh lý, tăng cường sức khỏe tình dục của
mật nhân được ứng dụng trong một số dược thảo.

1.2.4. Các nghiên cứu về cây mật nhân

15


Nghiên cứu của Chan LK và cs (2002) chỉ ra rằng những hạt giống với vỏ
quả trong cứng gieo trong hỗn hợp đất và cát theo tỉ lệ 1:1 chỉ bắt đầu nảy mầm sau
43 ngày sau khi gieo và tiếp tục nảy mầm trong khoảng thời gian 99 ngày. Hỗn hợp
đất và cát (1:1) là tương đương như sự kết hợp đất cát tự nhiên đã được tối ưu cho
sự nảy mầm của hạt mật nhân. Tuy nhiên, khi vỏ quả trong của hạt giống bị loại bỏ,
các hạt giống nảy mầm trong hai tuần qua nuôi cấy trên môi trường cơ bản MS.
Những hạt giống còn xanh được loại bỏ các vỏ quả trong dường như nảy mầm
nhanh hơn những hạt chín khi được nuôi cấy trên môi trường cơ bản MS. Tất cả các
cây con nảy mầm in vitro có cùng một mô hình tăng trưởng về chiều cao cây giống,
số lá và đường kính thân cây không phân biệt so với các phương pháp nảy mầm
trong tự nhiên trong khoảng thời gian 120 ngày [16].
Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Chan LK và cs đã đánh giá hiệu quả từ
sinh khối tế bào cây mật nhân và sản xuất các hợp chất alkaloids, 9-hydroxycanthin6-one và 9-methoxycanthin-6-one. Đồng thời để xác định công thức phù hợp có thể
làm tăng sinh khối tế bào và sản xuất các hợp chất alkaloids thông qua nuôi cấy
huyền phù cũng đã được thực hiện [17].
Việc nuôi cấy huyền phù đã được chuẩn bị bằng cách cấy 0,5g FW (trọng
lượng tươi) của tế bào thu được từ mẻ đầu tiên của nuôi cấy huyền phù được chuẩn
bị từ nuôi cấy callus trong môi trường lỏng MSB . Nồng độ khác nhau của chitosan,
NaH2PO4, Na2CO3 và polyvinylpyrrolidone (PVP) đã được thêm vào để tối ưu hóa
sinh khối tế bào và sản xuất alkaloid. Môi trường MSB trung bình bổ sung với
100mg/L chitosan có ý nghĩa quan trọng trong tăng trọng sinh khối tế bào mặc dù
lượng cao 150mg/L chitosan cho sản lượng cao nhất 9-hydroxycanthin-6-one
(0,44%) nhưng lại làm giảm sinh khối tế bào. Việc bổ sung 2 mg/L và 20 mg/L
NaH2PO4 tạo ra sản lượng cao nhất trong sinh khối tế bào và sản xuất alkaloid
tương ứng. Tuy nhiên, việc bổ sung Na2CO3 nồng độ khác nhau và

polyvinylpyrrolidone cho thấy hiệu quả ức chế sự phát triển của tế bào và không ý
nghĩa trong sản xuất alkaloid [17] .
Một nghiên cứu khác của Noormi RS (2005) về khả năng tạo callus từ nuôi
cấy mô cây mật nhân và sản xuất 9- Methoxycanthin-6-one từ callus của loài cây
này. Phân tích định tính sử dụng TLC cho thấy rằng 9-methoxycanthin-6-one đã

16


được tìm thấy trong lá, cuống lá, thân, rễ, sợi rễ, lá mầm và phôi của cây còn
nguyên vẹn. Phân tích định lượng sử dụng HPLC cho thấy nồng độ cao nhất của 9methoxycanthin-6-one đã được tìm thấy trong rễ. 9-methoxycanthin-6-one cũng có
mặt trong các callus có nguồn gốc từ nuôi cấy các mô khác nhau. Nồng độ cao nhất
được tìm thấy trong callus có nguồn gốc từ sợi rễ (7,12 mg/g DW mô). Từ việc so
sánh giữa các dữ liệu của các callus và các bộ phận của cây tự nhiên thì nồng độ 9methoxycanthin-6-one trong callus cao hơn 73,7% [27].
Khả năng của các callus để sản xuất 9-methoxycanthin-6-one trong các loại
môi trường cơ bản khác nhau (Murashige và Skoog, Gamborg, Schenk và
Hildebrandt và White) được kiểm tra và xác định. Môi trường MS cơ bản cho được
hàm lượng cao nhất 9-methoxycanthin-6-one (3,8 mglg DW). Do đó, môi trường
MS được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu. Những ảnh hưởng của nguồn carbon
khác nhau như glucose, sucrose, fructose, sorbitol và mannitol [(0, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0
và 5.0% (w/v)] đến sản xuất 9-methoxycanthin-6-one được nghiên cứu một cách
riêng biệt. 2% (w / v) fructose thúc đẩy sản xuất 9-methoxycanthin-6-one (4,59
mglg DW) và đã đạt được năng suất cao nhất so với nguồn carbon khác được thử
nghiệm. Một loạt các nghiên cứu đã được tiến hành để kiểm tra ảnh hưởng của nồng
độ khác nhau (0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 và 5,0 mg / L 2,4-D, picloram, dicamba, NAA và
IAA) trong phát sinh callus và sản xuất 9-methoxycanthin-6-one. Việc bổ sung 3,0
mg/L dicamba tăng sản xuất 9-methoxycanthin-6-one. Những ảnh hưởng khác nhau
của các giá trị pH (5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 và 8,0) đến sinh trưởng và sản xuất 9methoxycanthin-6-one trong nuôi cấy callus cây mật nhân cũng đã được quan sát.
Hàm lượng 9-methoxycanthin 6-one thu được cao nhất ở pH 5,5 là 1,53 mg/g DW)
[27].

Hiện nay, ngoài các nghiên cứu về nuôi cấy tế bào và thu hoạt chất sinh
học từ đối tượng này, người ta đang chú trọng nghiên cứu các phương pháp nhân
giống nhanh cây mật nhân nhằm bảo tồn và phát triển nguồn gen cây thuốc quý này.
Nghiên cứu của Sobri và cs (2005) cho thấy tỷ lệ tái sinh cao nhất (90%) và
nhiều chồi hình thành thu được với môi trường cơ bản MS bổ sung 5,0 mg/l KIN.
Rễ hình thành sau 14 ngày ngày nuôi cấy trong môi trường MS cơ bản có bổ sung

17


0,5 mg/l IBA. Cây con tái sinh từ nuôi cấy mô thực vật có khả năng sống sót tốt và
không có sự khác biệt về hình thái học từ các cây mẹ [21].
Nghiên cứu của Maziah và cs (2010) nhằm xác định và tối ưu hóa auxin để
kích thích tạo callus từ nuôi cấy các bộ phận lá, cuống lá, thân, rễ, rễ sợi, lá mầm và
đoạn phôi của cây mật nhân đã đạt được thành công bằng sử dụng các auxin khác
nhau như 2,4-D, IAA, NAA, picloram và dicamba. Các mô nuôi cấy được quan sát
trong một tháng. Các kết quả tổng thể từ các thí nghiệm cho thấy 2,4-D là auxin
thích hợp nhất [24].
Năm 2011, Monica và cs đã nghiên cứu và phân tích đặc điểm hình thái mô
của hạt giống mật nhân bằng kính hiển vi cho thấy cấu trúc hạt giống của cây thuốc
quan trọng này ở các giai đoạn phát triển khác nhau. Các cấu trúc hạt giống mật
nhân bao gồm lớp biểu bì, lớp hạ bì, lớp nhu mô dự trữ và lớp tiền tượng tầng. Lá
mầm phát triển thành một hệ thống mạch phức tạp và chia thành mặt lưới. Các giai
đoạn phát triển hạt giống và phát triển của hệ thống mạch trong quá trình nảy mầm
cung cấp các thông tin thực tế và chính xác về giai đoạn phát triển lá mầm của cây
mật nhân [20].
Ở Việt Nam cho đến nay vẫn chưa có một công trình nghiên cứu nào về sản
xuất hợp các chất sinh học cũng như nhân giống in vitro cây mật nhân bằng kỹ thuật
nuôi cấy mô tế bào thực vật.

18


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là cây mật nhân thuộc họ Thanh thất (Simaroubaceae),
bộ Sapindales. Sử dụng hạt đã được thụ phấn 3 tháng tuổi từ cây mật nhân ngoài tự
nhiên (tại huyện Tiên Phước, tỉnh Quảng Nam) để làm nguyên liệu thực nghiệm.
Đề tài được tiến hành nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học
Thực vật, khoa Sinh-Môi trường, trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng từ
tháng 7 năm 2011 đến tháng 5 năm 2012.
b

a

Hình 1: (a):Cây mật nhân tự nhiên; (b Hạt mật nhân 3 tháng tuổi
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hạt cây mật nhân
Nảy mầm in vitro của hạt
Tạo chồi in vitro
Tạo rễ in vitro-cây hoàn chỉnh

2.2.1. Vô trùng mẫu vật nuôi cấy
Quả được ngâm trong nước ấm khoảng 45 phút và tách lấy hạt, sau đó ngâm
hạt trong dung dịch xà phòng từ 5-7 phút rồi rửa sạch dưới vòi nước chảy trong 20

19

phút. Hạt được khử trùng bằng cồn 70% trong 3 phút, tiếp đến khử trùng (lần 1)
bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 15 phút hoặc dung dịch NaClO 5,25% trong 20
phút. Tách vỏ hạt và khử trùng (lần 2) bằng dung dịch HgCl2 0,1% từ 2-3 phút hoặc
dung dịch NaClO 5,25% từ 7-10 phút. Cuối cùng, rửa lại 3 lần bằng nước cất vô
trùng. Hạt sau khi vô trùng, dùng dao nhọn tách bỏ lớp vỏ lụa trong cùng và cấy
trên môi trường MS để đánh giá hiệu quả khử trùng hạt.
2.2.2. Nảy mầm của hạt
Mẫu hạt vô trùng được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung KIN (1,0-5,0
mg/L) và BA (1,0-5,0 mg/L) riêng lẻ để khảo sát khả năng nảy mầm in vitro qua các
chỉ tiêu tỉ lệ phần trăm nảy mầm và thời gian nảy mầm của hạt.
2.2.3. Tạo chồi in vitro
Các chồi in vitro (dài khoảng 0,5 cm) nảy mầm từ hạt trên môi trường MS
được cấy trên môi trường MS bổ sung KIN (1,0-5,0 mg/L) để tạo chồi in vitro. Sau
4 tuần nuôi cấy, đánh giá khả năng tái sinh chồi thông qua các chỉ tiêu: số chồi/mẫu
cấy, chiều cao của chồi, số lá/chồi.
2.2.4. Tạo rễ in vitro
Chồi in vitro có 2 mắt lá (dài khoảng 2cm) được cấy trên môi trường MS bổ
sung IBA (0,1-0,5mg/L) và KIN (1,0-5,0 mg/L) để tạo rễ in vitro. Sau 6 tuần nuôi
cấy, đánh giá khả năng hình thành rễ thông qua các chỉ tiêu: số rễ/chồi, chiều dài rễ.
Tất cả các môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH = 5,8 trước khi khử trùng
trong nồi hấp vô trùng ở 121oC trong 15 phút. Mẫu sau khi cấy được nuôi trong
điều kiện: nhiệt độ 25±2oC, cường độ chiếu sáng 2000 Lux, thời gian chiếu sáng 10
giờ/ ngày.
2.2.5. Xử lý thống kê
Mỗi thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần. Số liệu thực nghiệm được xử lí
thống kê theo phương pháp Ducan’s test (p<0,05) bằng phần mềm SAS (ver.9.1).

20

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Đánh giá hiệu quả khử trùng hạt nuôi cấy
Điều kiện vô trùng quyết định sự thành công ban đầu của quá trình nuôi cấy
in vitro. Do đó, mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy ngoài việc chọn từ cây sạch bệnh,
khoẻ mạnh thì cần phải tiến hành khử trùng mẫu. Việc khử trùng phải đảm bảo sạch
nấm, vi khuẩn nhưng không làm chết mẫu.
Chúng tôi tiến hành khử trùng hạt mật nhân bằng 2 chất khử trùng là HgCl2
(0,1%) và NaClO (5,25%) ở các khoảng thời gian khác nhau. Kết quả được trình
bày ở bảng 1.
Bảng 1. Ảnh hưởng của các phương pháp khử trùng đến hiệu quả vô trùng mẫu
cấy.
Quy trình khử trùng

Hiệu quả vô trùng

Cồn

HgCl2 0,1%

NaClO 5,25%

Tỉ lệ

Tỉ lệ

Tỉ lệ mẫu

70%

(phút)

(phút)

mẫu

mẫu

sống vô

nhiễm

chết

trùng

(%)

(%)

(%)

(phút)

Lần 1

Lần 2

Lần 1

Lần 2

3

15

2

-

-

25,00

28,40

46,60

3

15

3

-

-

0

92,50

7,50

3

-

-

20

7

6,00

65,00

29,00

3

-

-

20

10

0

77,00

23,00

Chú thích: Lần 1: khử trùng bề mặt ngoài của hạt; Lần 2: khử trùng hạt sau khi
tách vỏ hạt ngoài.
Qua bảng 1 chúng tôi nhận thấy: sự phối hợp của dung dịch cồn 70% và
HgCl2 0,1% hoặc NaClO 5,25% với các khoảng thời gian khác nhau ảnh hưởng
khác nhau đến tỉ lệ nhiễm, chết và sống sót của hạt nuôi cấy.
Khi mẫu vật được xử lý bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong thời gian 2 phút
khử trùng lần 2 thì tỷ lệ mẫu sống vô trùng cao (46,6%), tỷ lệ mẫu nhiễm giảm còn
25% (Hình 2a). Khi tăng thời gian xử lý lên 3 phút thì tỷ lệ mẫu nhiễm là 0%. Tuy
nhiên, tỉ lệ mẫu chết cao (92,5 %), do mức thẩm thấu của chất khử trùng vào bên
trong hạt tăng, làm phôi có dấu hiệu trương phồng rồi hóa trắng, chồi không phát
sinh, hai lá mầm không tách ra (Hình 2b).
21


a

b

Hình 2: (a): Hạt nảy mầm sau 15 ngày trên môi trường MS; (b): Mẫu hạt hoá trắng
sau 2 tuần khi khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong thời gian 3 phút ở lần 2.
Đối với phương pháp khử trùng bằng dung dịch NaClO 5,25%, khi xử lý
mẫu trong thời gian 7 phút ở lần 2, tỷ lệ mẫu nhiễm 6%, tỷ lệ mẫu sống 29%. Khi
tăng thời gian khử trùng lên 10 phút, tỷ lệ mẫu nhiễm 0%, tuy nhiên, tỷ lệ mẫu sống
vô trùng giảm xuống còn 23%.
Theo nghiên cứu sơ bộ về khả năng nảy mầm của hạt mật nhân, Chan LK và

cs (2002) đã khử trùng bề mặt hạt mật nhân bằng dung dịch NaClO 5,25% với thời
gian khử trùng lần 2 trong 10 phút. Kết quả thu được là 30% hạt nảy mầm trên môi
trường cơ bản MS [16]. Kết quả mà chúng tôi thu được tương tự như kết quả nghiên
cứu của Chan LK và cs về hiệu quả khử trùng hạt bằng dung dịch NaClO (5,25%).
Như vậy, trong hai phương pháp khử trùng ở trên, phương pháp khử trùng
bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 2 phút ở lần 2 cho hiệu quả khử trùng hạt tốt nhất.
3.2. Ảnh hưởng của KIN và BA đến khả năng nảy mầm của hạt
Hạt sau khi khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong thời gian 2 phút ở
lần 2 được cấy trên môi trường MS có bổ sung KIN (1,0-5,0 mg/L) và BA (nồng độ
1,0-5,0 mg/L) riêng lẻ để khảo sát khả năng nảy mầm của hạt. Kết quả được trình
bày trong bảng 2.

22


Bảng 2. Ảnh hưởng của KIN và BA đến khả năng nảy mầm của hạt mật nhân.
Chất KTST
(mg/L)

Khả năng nảy mầm của hạt
Thời gian nảy mầm

Tỷ lệ nảy mầm

(ngày)

(%)

KIN

BA

-

-

15

46,60

1,0

-

23

6,67

2,0

-

22

20,00

3,0

-

21

23,33

4,0

-

16

33,30

5,0

-

20

29,00

-

1,0

0

0,0

-

2,0

0

0,0

-

3,0

0

0,0

-

4,0

0

0,0

-

5,0

0

0,0

Kết quả bảng 2 cho thấy, tỷ lệ hạt nảy mầm tốt nhất thu được trên môi trường
MS đạt 46,60% sau 15 ngày. Các chất KTST KIN và BA ở nồng độ từ 1,0 - 5,0
mg/L ảnh hưởng khác nhau đến khả năng nảy mầm của hạt. Môi trường bổ sung BA
gây ức chế sự nảy mầm của hạt, lá mầm có hiện tượng hoá nâu và phôi không phát
triển. Đối với môi trường bổ sung 4,0 mg/L KIN cho tỷ lệ nảy mầm đạt 33,30%,
thời gian nảy mầm sau 16 ngày. Tuy nhiên khi tăng nồng độ KIN lên 5,0 mg/L thì
gây ức chế sự nảy mầm hạt (chỉ đạt 29%) và thời gian nảy mầm kéo dài đến sau 20
ngày. Ở các nồng độ KIN thấp hơn thì tỷ lệ nảy mầm của hạt giảm dần và thời gian
nảy mầm kéo dài hơn.
Ngoài ra, kết quả còn cho thấy ở các môi trường khác nhau thì hình thái mầm
của hạt cũng khác nhau. Hạt nảy mầm trên môi trường MS thì rễ mọc dài, chồi mầm
sinh trưởng nhanh và ít lá (Hình 3a).Trong khi đó, trên môi trường có bổ sung KIN
thì rễ có xu hướng phát sinh mạnh hơn so với chồi, rễ to và ngắn, chồi mầm tạo lá
sớm (Hình 3b). Theo nghiên cứu của Danial và cs (2011) cho thấy sự hiện diện của
chất KTST nội sinh trong hạt mật nhân ảnh hưởng đến khả năng nảy mầm của hạt
làm cho hình thái chồi mầm của hạt cũng thay đổi [20].
23


a

b

Hình 3: (a): Hình thái của hạt nảy mầm trên môi trường MS; (b): Hình thái của hạt
nảy mầm trên môi trường bổ sung 5,0 mg/L KIN
Như vậy dựa vào tỉ lệ nảy mầm, thời gian nảy mầm và hình thái chồi mầm
chúng tôi chọn môi trường MS là môi trường thích hợp nhất cho khả năng nảy mầm
của hạt mật nhân. Chan LK và cs (2002) khi nghiên cứu sự nảy mầm in vitrro của
hạt mật nhân ở Malaysia cũng nhận thấy hạt nảy mầm tốt trên môi trường MS
không bổ sung chất KTST [16].

3.3. Ảnh hưởng của KIN đến khả năng nhân chồi in vitro
Chồi in vitro dài khoảng 0,5cm cấy trên môi trường MS có bổ sung KIN
(1,0-5,0 mg/L) để khảo sát khả năng nhân chồi in vitro. Sau 4 tuần nuôi cấy, kết quả
được trình bày ở bảng 3.
Bảng 3. Ảnh hưởng của KIN đến khả năng nhân chồi in vitro cây mật nhân sau 4
tuần nuôi cấy.
KIN

Khả năng nhân chồi in vitro
Số

Chiều cao

chồi/mẫu

chồi (cm)

-

1,00b

0,49b

0.94b

1,0

1,00b

0,50b

1,00b

2,0

1,50b

0,75b

1,00b

3,0

1,00b

1,00ab

1,00b

4,0

2,00b

1,40ab

2,20b

5,0

3,60a

2,30a

4,60a

(mg/L)

Số lá

Chú thích: Các chữ cái khác nhau trên cùng 1 cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa
thống kê của trung bình mẫu với p<0,05.

24


Kết quả trình bày ở bảng 3 cho thấy, KIN (1,0-5,0 mg/L) có ảnh hưởng khác
nhau đến khả năng nhân chồi in vitro so với môi trường MS. Trên môi trường MS
có bổ sung 4,0 mg/L KIN và 5,0 mg/L KIN đều kích thích phát sinh chồi mới in
vitro. Số chồi đạt cao nhất là 3,60 chồi/mẫu trên môi trường bổ sung 5,0 mg/L KIN
sau 4 tuần nuôi cấy, chiều cao và số lá tương ứng đạt 2,30cm và 4,60 lá (Hình 4). Ở
nồng độ KIN thấp hơn (1,0 - 3,0 mg/L) thì khả năng nhân chồi in vitro giảm, chồi
sinh trưởng chậm và hầu như không hình thành chồi mới.
Theo nghiên cứu của Hussein và cs (2005) khi nuôi cấy chồi đỉnh của cây
mật nhân in vitro trên môi trường MS có bổ sung 5,0 mg/L KIN thu được số chồi
cao nhất là 4,0 chồi/mẫu. Môi trường có bổ sung 4,0 mg/L KIN hệ số nhân chồi đạt
3,0 - 4,0 chồi/mẫu [21]. Như vậy, kết quả nghiên cứu của chúng tôi về khả năng tái
sinh chồi tương tự với kết quả nghiên cứu của Hussein và cs (2005). Như vậy, KIN
có ảnh hưởng tốt trong quá trình nhân chồi in vitro cây mật nhân.

Hình 4: Chồi mới tái sinh trên môi trường MS+ 5,0 mg/L KIN

sau 4 tuần nuôi cấy.

3.4. Ảnh hưởng của KIN và IBA đến khả năng tạo rễ in vitro
Chồi in vitro có 2 mắt lá (dài khoảng 2cm) được cấy trên môi trường MS bổ
sung IBA (0,1-0,5mg/L) và KIN (1,0-5,0 mg/L) để tạo rễ in vitro. Sau 6 tuần nuôi
cấy, kết quả được trình bày ở bảng 4.

25