Nghiên cứu hoàn thiện qui trình nhân giống in vitro cây lan hài hồng (paphiopedilum delenatii) đặc hữu quí hiếm của việt nam

LỜI CẢM ƠN




Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Tiến sĩ Lê Quang Luân,
người không chỉ hướng dẫn em bước đầu trên con đường nghiên cứu khoa học mà
còn dìu dắt em trên ngưỡng cửa bước vào đời.
Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu và quí thầy cô trường Đại học Nha
Trang, đặc biệt là các thầy cô trong khoa Chế biến đã dạy dỗ em trong suốt thời
gian vừa qua.
Xin cảm ơn cô Hà, cô Nụ và chị Vang trong Phòng Sinh học đã luôn quan
tâm, chỉ bảo và giúp đỡ trong thời gian làm luận văn tốt nghiệp.
Xin cảm ơn tập thể lớp 45SH, cảm ơn những người bạn đã cùng tôi sánh
bước trên giảng đường đại học.
Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình và những người thân yêu đã nuôi dưỡng,
yêu thương, quan tâm và chăm sóc người con này.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 30/10/2007
Sinh viên thực hiện
Hồ Ngọc Văn

MỤC LỤC

Lời cảm ơn
Danh mục chữ viết tắt
Danh mục bảng
Danh mục hình ảnh
Lời mở đầu
Chương 1. Tổng quan tài liệu 1
1.1. Khái quát về phương pháp vi nhân giống 1
1.1.1. Khái niệm về phương pháp nhân giống in vitro 1
1.1.2. Môi trường nuôi cấy 1
1.1.2.1. Các muối khoáng đa lượng 2
1.1.2.2. Các muối khoáng vi lượng 3
1.1.2.3. Các vitamin 4
1.1.2.4. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 5
1.1.2.5. Các chất bổ sung 9
1.1.3. Những vấn đề thường găp trong nhân giống in vitro 9
1.1.3.1. Tính bất định về mặt di truyền 9
1.1.3.2. Sự nhiễm mẫu 10
1.1.3.3. Sự hóa thủy tinh thể 10
1.1.3.4. Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu 10
1.1.4. Các ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô 11
1.1.4.1. Ưu điểm 11
1.1.4.2. Nhược điểm 12
1.1.5. Các ứng dụng của nuôi cấy in vitro trong nghiên cứu và ứng dụng trong
nông nghiệp 12
1.1.5.1. Vi nhân giống 12
1.1.5.2. Sản xuất và bảo quản giống cây sạch bệnh 13
1.1.5.3. Bảo quản giống in vitro 13
1.1.5.4. Biến dị tế bào soma 13

1.1.5.5. Lai đơn bội 13




1.2. Khái quát về cây Lan hài 13
1.2.1. Giới thiệu về họ Lan 13
1.2.2. Giới thiệu về Lan hài 14
1.2.2.1. Nguồn gốc và quan hệ họ hàng của Lan hài 15
1.2.2.2. Hình thái của Lan hài 15
1.2.2.3. Vòng đời 18
1.2.2.4. Sinh thái 19
1.2.2.5. Phân bố địa lý 20
1.2.2.6. Hiện trạng cây Lan hài Việt Nam 21
1.2.3. Giới thiệu một vài loài Lan hài đặc hữu của Việt Nam 24
1.2.3.1. Paphiopedilum vietnamense 24
1.2.3.2. Paphiopedilum helenae 25
1.2.3.3. Paphiopedilum villosum 26
1.2.3.4. Paphiopedilum hangianum 27
1.2.3.5. Vài nét về cây Lan hài hồng 28
Chương 2. Vật liệu và phương pháp 34
2.1. Vật liệu 34
2.1.1. Mẫu cấy 34
2.1.2. Địa điểm thực hiện đề tài 34
2.1.3. Phòng thí nghiệm và các dụng cụ 34
2.1.4. Môi trường nuôi cấy 35
2.1.5. Điều kiện nuôi cấy 35
2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm 35
2.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát điều kiện xử lí mẫu 35
2.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của các loại môi trường MS, VW

và KC kết hợp với IBA đến khả năng nẩy mầm của hạt hài hồng 37
2.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của sự kết hợp các chất ĐHST 2,4D
và TDZ đến khả năng tạo callus của Lan hài hồng 38
2.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của các chất ĐHST 2,4D, BA, NAA
và TDZ đến khả năng nhân nhanh PLB Lan hài hồng 40
2.2.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của các chất ĐHST BA, TDZ và



NAA đến quá trình nhân nhanh chồi cây Lan hài hồng 41
2.2.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của các loại môi trường khác nhau
đến khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh của Lan hài hồng 42
2.2.7. Xử lí thống kê số liệu 43
Chương 3. Kết quả và thảo luận 44
3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát điều kiện xử lí mẫu 44
3.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của các loại môi trường MS, VW và KC kết
hợp với IBA đến khả năng nẩy mầm của hạt hài hồng 47
3.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của sự kết hợp các chất ĐHST 2,4D và TDZ
đến khả năng tạo callus của Lan hài hồng 49
3.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của các loại ĐHST thực vật 2,4D, BA, NAA
và TDZ đến khả năng nhân nhanh PLB Lan hài hồng 51
3.5. Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của các chất ĐHST BA, TDZ và NAA đến
quá trình nhân nhanh chồi cây Lan hài hồng 53
3.6. Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của các loại môi trường khác nhau đến khả
năng tái sinh cây hoàn chỉnh của cây Lan hài 55
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận 57
2. Kiến nghị 58
Tài liệu tham khảo
Phụ lục

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Các nhóm Lan hài Việt Nam xếp theo thứ hạng bảo tồn của IUCN 22
Bảng 2.1. Nghiệm thức khử trùng đỉnh sinh trưởng Lan hài hồng 36
Bảng 2.2. Nghiệm thức khử trùng mẫu cành phát hoa Lan hài hồng 36
Bảng 2.3. Nghiệm thức khử trùng trái Lan hài hồng dùng Ca(Ocl)
2
37
Bảng 2.4. Nghiệm thức ảnh hưởng của các loại môi trường khác nhau đến
khả năng nẩy mầm của hạt hài hồng 38
Bảng 2.5. Nghiệm thức ảnh hưởng của sự phối hợp các chất ĐHST đến
khả năng tạo callus Lan hài hồng 39
Bảng 2.6. Nghiệm thức ảnh hưởng của các loại ĐHST đến khả năng
nhân nhanh PLB Lan hài hồng 40
Bảng 2.7. Nghiệm thức ảnh hưởng của các loại ĐHST đến khả năng
nhân nhanh chồi Lan hài hồng 41
Bảng 2.8. Nghiệm thức các loại môi trường ảnh hưởng đến khả năng
tái sinh cây Lan hài hồng 42
Bảng 3.1. Tình trạng mẫu đỉnh sinh trưởng cây Lan hài hồng sau khi khử trùng 44
Bảng 3.2. Tình trạng mẫu cành phát hoa cây Lan hài hồng sau khi khử trùng
và nuôi cấy 6 tuần 45
Bảng 3.3. Tình trạng mẫu trái Lan hài hồng qua khử trùng và gieo hạt sau 10 tuần .46
Bảng 3.4. Kết quả ảnh hưởng của các loại môi trường khác nhau đến
khả năng nẩy mầm của hạt hài hồng 48
Bảng 3.5. Kết quả ảnh hưởng của các chất ĐHST ảnh hưởng đến khả năng

tạo callus Lan hài hồng 50
Bảng 3.6. Kết quả ảnh hưởng của các loại ĐHST đến khả năng
nhân nhanh PLB Lan hài hồng 52
Bảng 3.7. Kết quả ảnh hưởng của các loại ĐHST đến khả năng
nhân chồi cây Lan hài hồng 54
Bảng 3.8. Kết quả ảnh hưởng của các loại môi trường đến khả năng
tái sinh cây Lan hài 56





DANH MỤC HÌNH ẢNH


Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của auxin 7
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của cytokinin 8
Hình 1.3. Nữ hài hiệp – Loài Lan hài đã bị tuyệt chủng 23
Hình 1.4. Hoa Paphiopedilum vietnamense 24
Hình 1.5. Hoa Paphiopedilum helenae 25
Hình 1.6. Hoa Paphiopedilum villosum 26
Hình 1.7. Hoa Paphiopedilum hangianum 27
Hình 1.8. Cây và hoa Lan hài hồng 28
Hình 1.9. Hình thái Lan hài 29
Hình 1.10. Hoa Paphiopedilum ngoài tự nhiên 30
Hình 2.1. Hoa Lan hài hồng 34
Hình 3.1. Mẫu Lan hài sống và phát triển tốt sau khi vào mẫu 47
Hình 3.2. Sự hình thành callus của cây Lan hài 51
Hình 3.3. Sự hình thành PLB của mẫu Lan hài 52
Hình 3.4. Sự hình thành cụm chồi ở cây Lan hài 54

Hình 3.5. Cây Lan hài hồng (Paphiopedilum delenatii) được tái sinh hoàn chỉnh
trong ống nghiệm 56



DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT




2,4D: acid 2,4 Dichlorophenoxy acetic
BA: 6-Benzylaminopurine
ĐHST: Điều hòa sinh trưởng
IAA: 3-Indolacetic acid
IBA: 3-Indolbutyric acid
IUCN: Tổ chức bảo tồn thiên nhiên Quốc tế
KC: Knudson C
LS: Linsmainer và Skoog, 1965
MS: Murashige và Skoog, 1962
NAA: Naphtalenacetic acid
TDZ: 1-phenyl-1-3-(1,2,3-Thiathidiazol-5-yl)
urea
VW: Vacin và Went, 1949




Lời mở đầu

Đã từ lâu, người phương Đông đã tôn hoa Lan là “vương giả chi hoa” và
người phương Tây cũng đã tôn hoa Lan là “nữ hoàng của các loài hoa”. Hoa Lan đã
thực sự chinh phục người phương Đông và người phương Tây bởi chính cấu trúc kì
diệu và sự đa dạng về màu sắc, hình dáng và hương thơm quyến rũ của nó. Hiện
nay, nhu cầu trồng và thưởng thức hoa Lan của con người ngày càng cao bởi không
chỉ vì những điều nêu trên mà còn bởi độ bền hoa, nếu được giữ đúng điều kiện
nhiệt độ, độ ẩm thì hoa Lan có thể còn nguyên hương nguyên sắc từ hai tuần cho
đến hai tháng thậm chí đến bốn tháng.
Trong số các loại hoa Lan thì Lan hài hồng (Paphiopedilum delenatii) là một
loại Lan rất đặc biệt bởi cấu trúc hoa có một không hai của chúng. Cánh hoa giữa
hình chiếc hài nằm ở vị trí thấp nhất của hoa tạo nên một vẻ ngoài rất đặc sắc, màu
sắc hoa toát lên vẻ mềm mại và hết sức quyến rũ. Không chỉ hoa mà lá của Lan hài
hồng cũng rất dặc sắc bởi những khảm xanh tím tựa như vải nhung hoặc gấm.
Những điều đó tạo cho Lan hài hồng một nét đẹp rất cao sang và quý phái. Và đặc
biệt hơn nữa khi đây là loài đặc hữu và quí hiếm của Việt Nam. Vẻ đẹp của Lan hài
hồng làm cho chúng rất được ưa chuộng trên thị trường của cả thế giới. Cũng bởi
chính vẻ đẹp và giá trị của nó dẫn đến việc thu thập khai thác Lan hài hồng diễn ra
một cách ồ ạt làm cho loài hoa quý hiếm này đang ngày càng cạn kiệt ngoài tự
nhiên.
Đã từ lâu, người ta đã tiến hành nhân giống các loài Lan bằng nhiều phương
pháp khác nhau như gieo hạt, tách mầm nhưng những phương pháp này vẫn còn
nhiều nhược điểm như chất lượng cây không đồng đều, chất lượng cây thấp và số
lượng cây ít,…Để khắc phục được điều này, người ta đã tiến hành nhân giống bằng
phương pháp nuôi cấy in vitro để tạo ra số lượng cây lớn, chất lượng cao, đồng đều
và sạch bệnh. Đây là điều mà phương pháp truyền thống không thực hiện được.
Hiện nay, nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro đang phát triển mạnh mẽ, đặc
biệt là ở Đà Lạt, nơi mà điều kiện khí hậu rất phù hợp cho việc nhân giống in vitro.

Đối với cây Lan hài, mặc dù đã có một số công trình công bố về kết quả vi
nhân giống loại cây này nhưng đa số các nhà khoa học trên thế giới đều cho rằng
việc nhân giống in vitro cây Lan hài là hết sức khó khăn. Ở Việt Nam, vấn đề này
cũng đang rất được quan tâm và đã có những kết quả nghiên cứu bước đầu nhưng
chủ yếu là tập trung vào kỹ thuật gieo hạt trong ống nghiệm. Việc nhân giống loài
cây này còn nhiều vấn đề phải giải quyết. Đối với cây Lan hài hồng, nhiều tài liệu
đã cho thấy, việc nhân giống loài hoa này hiện nay chủ yếu được thực hiện bằng
phương pháp tách mầm hoặc gieo hạt in vitro. Cho đến nay chưa có tài liệu nào
công bố qui trình hoàn chỉnh phục vụ nhân giống in vitro loại cây quý hiếm này.
Chính vì vậy, đề tài “nghiên cứu hoàn thiện qui trình nhân giống in vitro cây
Lan hài hồng (Paphiopedilum delenatii) đặc hữu quí hiếm của Việt Nam” là vấn đề
hết sức cần thiết và cấp bách hiện nay nhằm bảo tồn nguồn tài nguyên quốc gia quí
hiếm này cũng như tạo tiền đề cho việc nhân giống đại trà loại hoa hết sức có giá trị
này cho thị trường trong nước và xuất khẩu.




1

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái quát về phương pháp vi nhân giống
1.1.1. Khái niệm về phương pháp nhân giống in vitro
Thuật ngữ “nuôi cấy mô tế bào thực vật” được dùng một cách rộng rãi để nói
về việc nuôi cấy tất cả các phần của thực vật (mô, cơ quan, tế bào đơn) trong điều
kiện vô trùng. Hệ thống nuôi cấy mô tế bào thực vật thường được dùng để nghiên
cứu tất cả các vấn đề liên quan đến thực vật như sinh lí học, sinh hóa học, di truyền
học và cấu trúc thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật cũng được mở rộng để nhân
giống vô tính một cách kinh tế các loại cây trồng quan trọng và có giá trị kinh tế.

Nuôi cấy mô là nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi
trường dinh dưỡng thích hợp (như đường, muối khoáng, vitamin và các chất điều
hòa sinh trưởng) trong điều kiện vô trùng.
Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi và cơ quan từ mô như lá, hoa
hoặc rễ.
Ngày nay, kỹ thuật nuôi cấy mô được sử dụng rộng rãi trong công tác giống
và cây trồng, cung cấp các loại giống cây trồng chất lượng cao.
1.1.2. Môi trường nuôi cấy
Môi trường được sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật là tổ hợp gồm nhiều
thành phần: muối, vitamin, axit amin, chất điều hòa sinh trưởng, đường, agar hay
gelrite và nước. Tất cả các thành phần này thực hiện một hay nhiều chức năng trong
quá trình phát triển in vitro của thực vật.
Các chất khoáng có mặt trong môi trường nuôi cấy được các tế bào thực vật
sử dụng như là các yếu tố cơ bản để tổng hợp nên các phân tử hữu cơ hay là chất
xúc tác trong các phản ứng enzyme. Các dạng ion của muối đóng vai trò rất quan
trọng trong việc vận chuyển các phân tử ion hóa trong cơ thể thực vật, trong việc
điều hòa áp suất thẩm thấu và duy trì điện thế ở trong cây [7], [16].
Tùy theo các loại cây khác nhau mà thành phần môi trường có thể thay đổi
để thích hợp với từng loại cây. Môi trường còn thay đổi tùy theo sự phát triển
phân hóa của mô nuôi cấy, tùy thuộc vào mục đích ta muốn duy trì mô ở trạng
thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm hay tái sinh cây hoàn chỉnh, môi trường nuôi cấy
phải thay đổi nhiều hay ít.



2

Tuy nhiên, tất cả môi trường nuôi cấy đều bao gồm 5 thành phần cơ bản:
 Đường làm nguồn cacbon.
 Các muối khoáng đa lượng.

 Các muối khoáng vi lựơng.
 Các vitamin.
 Các chất điều hòa sinh trưởng.
Ngoài ra một số nhà nghiên cứu còn thêm một số chất hữu cơ có thành phần
xác định (acid amin, EDTA,…) hoặc không xác định (nước dừa, dịch chiết nấm
men, dịch chiết khoai tây,…).
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, do mô thực vật không có khả năng quang
hợp nên trong môi trường nuôi cấy phải bổ sung thêm đường làm nguồn cacbon để
thực vật làm nguyên liệu tổng hợp nên các chất hữu cơ cần thiết cho quá trình phân
chia tế bào, tăng sinh khối. Hai loại đường thường được sử dụng trong nuôi cấy mô
là saccharose và glucose nhưng saccharose được dùng phổ biến hơn.
1.1.2.1. Các muối khoáng đa lượng
Nhu cầu về muối khoáng của mô tế bào thực vật tách rời không khác nhiều
so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp
là nitơ, canxi, photpho, kali, magie, sắt,…
Nguồn nitơ (N): N là nguồn nguyên liệu để tế bào tổng hợp các axit amin,
protein cho hoạt động sống của chúng. Trong môi trường nuôi cấy, N được cung
cấp dưới các dạng muối như: KNO
3
, NH
4
NO
3
, (NH
4
)
2
SO
4
,

Nguồn lưu huỳnh (S): S cần thiết cho tế bào để tổng hợp nên lipit, tham gia
vào cầu nối disulfua trong cấu trúc phân tử protein và là thành phần của một số axit
amin. Trong môi trường nuôi cấy, S được bổ sung dưới dạng ion SO
4
2-
.
Nguồn photpho (P): P là thành phần quan trọng trong sự sinh trưởng, P cần
thiết cho sự phân chia tế bào, sự tạo hoa và trái, sự phát triển của rễ. P có liên quan
đến sự tổng hợp đường, tổng hợp tinh bột trong lục lạp vì P là thành phần của các
hợp chất cao năng tham gia vào các quá trình phân giải hay tổng hợp các chất hữu
cơ trong tế bào. Hai dạng photpho thường dùng nhất là NaH
2
PO
4
.7H
2
O và KH
2
PO
4
.
Nguồn kali (K): K làm tăng quá trình quang hợp và thúc đẩy vận chuyển
gluxit từ phiến lá vào các cơ quan khác. K còn giúp cây cứng cáp và tăng khả năng



3

đề kháng sâu bệnh. K còn ảnh hưởng đến sự hô hấp tế bào. Người ta cung cấp kali
cho mô nuôi cấy dưới dạng kali nitat (KNO

3
), kali clorua (KCl) và kali
dihydrophotphat (KH
2
PO
4
).
Nguồn canxi (Ca): Ca có mặt rất nhiều trong vách tế bào và màng tế bào. Ca
có mặt trên vách tế bào và khả năng dao động có hạn của Ca từ màng tế bào vào tế
bào chất (cytoplasm).
Hàm lượng Ca ở màng tế bào và vách tế bào lớn giúp cho vách tế bào vững
vàng và điều chỉnh cấu trúc màng tế bào.
Sự có mặt của Ca
2+
cũng rất quan trọng trong khả năng đối kháng với sự
nhiễm nấm. Sự ổn định của màng tế bào chịu ảnh hưởng rất lớn bởi ion Ca
2+
. Sự
thiếu hụt Ca
2+
sẽ làm tăng các quá trình giải phóng các hợp chất ra khỏi màng tế
bào. Ca được cung cấp dưới dạng canxi nitrat (Ca(NO
3
)
2
.4H
2
O), canxi clorua
(CaCl
2

.6H
2
O hoặc CaCl
2
.2H
2
O).
Nguồn magiê (Mg): Mg là thành phần cấu trúc của diệp lục tố, có tác dụng
sâu sắc và nhiều mặt đến quá trình quang hợp, phụ trợ cho nhiều enzyme liên quan
trong biến dưỡng cacbonhydrat sự tổng hợp axit nucleic…
Ion Mg
2+
có tính linh động rất cao, hầu hết ion Mg
2+
đều được sử dụng trong
việc điều hòa pH nội bào và ổn định cân bằng anion và cation. Ngoài ra Mg còn là
nguyên tử trung tâm của phân tử diệp lục.
Việc thiếu hụt Mg
2+
sẽ ngăn cản quá trình tổng hợp ARN. Kết quả là cấu trúc
và chức năng của lục lạp sẽ bị ảnh hưởng nhanh chóng khi xảy ra sự thiếu hụt Mg.
Magiê là nguyên tố không thể thiếu được trong quá trình trao đổi năng lượng
của thực vật bởi vì nó có vai trò quan trọng trong việc tổng hợp ATP.
Magiê được cung cấp dưới dạng magiê sunfat (MgSO
4
.7H
2
O) [4], [7], [16].
1.1.2.2. Các muối khoáng vi lượng
Nhu cầu về muối khoáng vi lượng của mô thực vật trong nuôi cấy là lĩnh vực

còn ít được nghiên cứu. Rất ít các nguyên tố vi lượng đã được chứng minh là không
thể thiếu được đối với sự phát triển của mô và tế bào.
Tuy nhiên, trong môi trường nuôi cấy vẫn bổ sung các nguyên tố vi lượng
cho mô tế bào phát triển.



4

Nguồn Bo (B): có thể khẳng định giống như canxi, nguyên tố Bo cũng có vai
trò quan trọng trong việc tổng hợp vách tế bào cũng như trong việc ổn định sự vững
chắc của vách tế bào và màng tế bào.
Sự thiếu hụt Bo sẽ kiềm hãm sự phát triển chiều dài rễ sơ cấp ngay lập tức.
Hơn nữa, Bo còn tham gia vào quá trình trao đổi chất của phenol và sự tổng hợp
lignin bằng cách tạo ra các borat ester ổn định giữa axit boric và axit phenolic.
Clo (Cl): vai trò của ion Cl
-
là điều hòa áp suất thẩm thấu và tái tạo điện tích.
Ion Cl
-
tham gia vào quá trình đóng mở khí khổng. Thiếu Cl
-
làm khí khổng mở liên
tục là nguyên nhân gây nên sự mất nước. Cl có vai trò quan trọng trong việc điều
hòa áp suất thẩm thấu của không bào có liên quan đến quá trình trương nước.
Sắt (Fe): những môi trường cổ điển thường dùng Fe dưới dạng clorua sắt
(FeCl
2
, FeCl
3

.6H
2
O), sunfat sắt (FeSO
4
.7H
2
O, Fe(SO
4
)
3
), sitrat sắt (Fe(C
4
H
4
O
6
)).
Hiện nay hầu hết các phòng thí nghiệm điều dùng sắt ở dạng chelat kết hợp với Na
2
-
etylen diamintetra acetat (EDTA).
Đồng (Cu): Đồng được cây trồng hấp thu dưới dạng ion Cu
2+
hay là các phức
hợp Cu. Trong tế bào, Cu là thành phần của các phản ứng oxy hóa – khử. Sự thiếu
hụt Cu sẽ làm giảm hoạt động của các enzyme có chứa đồng.
Mangan (Mn): Mn là nguyên tố vi lượng quan trọng nhất gần như luôn luôn
có mặt trong tất cả các môi trường nuôi cấy. Mn tác động hóa học tương tự Mg nên
có thể thay thế Mg trong một số hệ thống enzym [5], [4], [7], [16].
1.1.2.3. Các vitamin

Vitamin được bổ sung vào cây dưới nhiều dạng và nồng độ khác nhau, có
chức năng xúc tác trong các phản ứng enzyme. Trên thực tế các phức hợp này là rất
cần thiết cho một vài phản ứng sinh hóa. Tất cả các loại môi trường dùng để nuôi
cấy đều chứa thiamin (vitamin B1).
Inositol cũng được đề cập tới như môt loại vitamin có tác dụng kích thích sự
sinh trưởng và phát triển của cây một cách đáng kể [17].
Các vitamin thường dùng là: myo-inositol, acid nicotinic (vitamin PP),
pyridoxine HCl (vitamin B
6
), thiamin HCl (vitamin B
1
)…





5

1.1.2.4. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, thực vật không những cần các chất
protein, gluxit, lipit, axit nucleic,… để cấu trúc nên tế bào, mô và cung cấp năng
lượng cho hoạt động sống mà còn cần rất nhiều các chất có hoạt tính sinh lí như
vitamin, enzym và nhất là các chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST). Trong số đó các
ĐHST có vai trò rất quan trọng trong quá trình sinh trưởng, phát triển và hoạt động
sinh lí của cây.
Chất ĐHST thực vật (đôi khi còn được gọi là phytohocmon) là các chất hữu
cơ có bản chất hóa học khác nhau được tổng hợp với một lượng rất nhỏ trong các cơ
quan, bộ phận nhất định của cây để điều hòa các hoạt động sinh lí cũng như quá
trình sinh trưởng và phát triển của cây nhằm duy trì mối quan hệ hài hòa giữa các cơ

quan, các bộ phận trong cơ thể thực vật.
Các chất ĐHST thực vật tham gia vào quá trình phân chia tế bào, phân hóa
các mô, phát sinh phôi, tác dụng lên chức năng của DNA và RNA làm ảnh hưởng
mạnh đến những quá trình chủ yếu của hoạt động sống thực vật như quá trình sinh
tổng hợp các enzym, hô hấp, dinh dưỡng rễ, quang hợp,…[8]. Chính vì vậy chúng
có tác dụng điều hòa sinh trưởng phát triển của cây. Các chất ĐHST thực vật bao
gồm những nhóm chất sau:
a. Auxin
Auxin là chất điều hòa sinh trưởng được nghiên cứu đầu tiên với việc xác
định cấu trúc hóa học đầu tiên vào năm 1934.
Auxin là chất xúc tác cho sự sinh trưởng của cây trồng, có phổ hoạt động
rộng hơn giberelin. Tác động sinh lí của auxin đối với thực vật rất phức tạp. Các mô
thực vật khác nhau có phản ứng khác nhau đối với tác động của auxin. Hoạt động
của auxin tùy thuộc vào nồng độ và sự tác động tương hỗ giữa chúng với các chất
ĐHST khác [4].
Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi
cấy để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát
sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được sử dụng phối hợp với cytokinin. Khi nồng độ
cytokinin cao hơn auxin thì sẽ có sự tạo chồi từ mẫu cấy. Ngược lại, khi nồng độ của
auxin cao hơn hoặc khi chỉ xử lí với auxin thì rễ sẽ được tạo thành [4], [5].



6

Auxin đẩy mạnh sự sinh trưởng thông qua sự kéo dài tế bào. Hiệu quả này là
do chúng thúc đẩy các hoạt động của enzym, làm gia tăng tính đàn hồi của thành tế
bào làm cho sự thâm nhập của nước vào trong tế bào được dễ dàng, giảm sức đề
kháng của thành tế bào và tế bào tự kéo dài ra. Auxin hoạt hóa các quá trình sinh
tổng hợp các chất cao phân tử (protein, xenluloza, pectin,…) và ngăn cản sự phân

giải chúng (Grodizinxki, 1981). Vì vậy, chúng có tác dụng làm chậm trễ quá trình
già hóa, kích thích ra rễ và xúc tiến sự sắp xếp của những rễ bất định.
Nồng độ sử dụng của auxin có liên quan chặt chẽ đến sự chiếu sáng, nhiệt độ
và sự có mặt của các chất điều hòa sinh trưởng khác.
Vai trò của auxin trong nuôi cấy mô được công bố bởi Skoog và Miller vào
năm 1957. Ông thấy rằng mô tủy của cây thuốc lá có khả năng tạo chồi ở môi
trường có nồng độ cytokinin cao và auxin thấp, tạo rễ trong môi trường có nồng độ
cytokinin thấp và auxin cao. Một vài năm sau đó, sự hình thành phôi sinh dưỡng
bằng các nuôi cấy mô trong môi trường có chứa 2,4-D được phát hiện. Có thể lưu ý
rằng auxin chỉ được sử dụng trong giai đọan khởi đầu của sự hình thành rễ bất định
và phát sinh phôi sinh dưỡng, sau đó trở thành chất ức chế ngăn cản sự phát triển
của các cơ quan và phôi mới được hình thành.
Auxin còn kích thích hình thành rễ trên các đoạn cắt của thân, phát triển các
nhánh rễ và sự phản biệt hóa các mô để tạo rễ trong nuôi cấy mô.
Các chất ĐHST trong nhóm auxin được biết đến như IBA (3-Indolbutyric
acid); IAA (3-Indolacetic acid); NAA (Naphtalenacetic acid); 2,4D (acid 2,4
Dichlorophenoxy acetic).
NAA (Naphtalenacetic acid) có tác dụng làm tăng hô hấp của tế bào và mô
nuôi cấy, tăng hoạt tính enzym và ảnh hưởng mạnh đến trao đổi chất của nitơ, tăng
khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong môi trường. NAA là một auxin nhân
tạo, có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên IAA [4].
Nhiều kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng: NAA tác động ở mức độ phân tử tế
bào theo cơ chế:
 Thứ nhất, NAA gắn với phân tử enzym và kích thích enzym hoạt động,
Sarkissian đã phát hiện tác dụng của auxin lên citrat synthetase còn Yamaki thông
báo rằng auxin kích thích hoạt tính của ATPase.



7

 Thứ hai, NAA tác động vào gen và các enzym phân giải acid nucleic [5].
IBA là auxin tổng hợp, chúng ổn định hơn nhiều so với IAA và thường dùng
trong môi trường nuôi cấy tạo rễ để tái sinh cây hoàn chỉnh. IBA là chất được ứng
dụng rộng rãi trong nhân giống thương mại. IBA là chất nhạy cảm với ánh sáng,
chính vì vậy mà nó cần phải được bảo quản trong các lọ tối trong tủ lạnh.
Các chất thuộc nhóm auxin:

NAA IAA IBA
Naphtalenacetic acid 3-Indolacetic acid 3-Indolbutyric acid
Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của auxin
b. Cytokinin
Cytokinin được phát hiện trong quá trình nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật
vào năm 1945-1955. Nhưng đến năm 1965, Miller mới tách được chất có hoạt
tính sinh học này với tên gọi là kinetin, sau đó mới xác định được cấu trúc hóa
học của nó. Cytokinin là chất ĐHST thực vật có tác dụng đẩy mạnh sự sinh
trưởng của cây trồng.
Cytokinin có khả năng kích thích sự phân chia tế bào, tính đặc hiệu của nó là
kích thích quá trình phân bào giảm nhiễm. Bên cạnh đó, cytokinin có vai trò quan
trọng trong quá trình phân hóa tế bào và tạo mới các cơ quan. Để thực hiện được
quá trình phân hóa tế bào và tạo mới các cơ quan thì cytokinin phải được kết hợp
với auxin hoặc giberelin. Nếu vắng mặt auxin hoặc giberelin thì quá trình phân hóa
các tế bào và tạo mới các cơ quan sẽ không có hiệu quả bởi vì auxin thúc đẩy quá
trình nhân đôi DNA và cytokinin cho phép tách rời các nhiễm sắc thể [5].
Trong nuôi cấy in vitro, cytokinin đẩy mạnh quá trình hình thành chồi mầm
trong nhiều mô, bao gồm mô sẹo (callus).
Cytokinin rất có hiệu quả trong vai trò kích thích tạo chồi trực tiếp hoặc gián
tiếp trên thực vật nguyên vẹn cũng như trên mô thực vật nuôi cấy in vitro.

8

Tác dụng này của cytokinin đôi khi hiệu quả hơn khi kết hợp với auxin. Một
tỉ lệ thích hợp giữa auxin và cytokinin sẽ có hiệu quả trên sự phát sinh hình thái
mẫu cấy.
Tuy nhiên, nồng độ cytokinin cao thường cản hoặc làm chậm sự tạo rễ, đồng
thời cũng ngăn cản sự tăng trưởng của rễ và cản hiệu quả kích thích tạo rễ của
auxin. Vì lí do này mà người ta thường không sử dụng cytokinin trong môi trường
kích thích sự ra rễ của chồi để tạo cây con.
Những kết quả nghiên cứu về cytokinin cho thấy cytokinin là sản phẩm bình
thường trong hoạt động sống của thực vật, nó tham gia trực tiếp vào các giai đoạn
quan trọng của quá trình trao đổi chất, quá trình nẩy mầm của hạt và sinh trưởng
của cây con [4], [5], 16].
Đại diện chính của cytokinin là kinetin được phát hiện trong dịch thủy phân
nấm men. Đặc trưng nhất của chất này là ngăn cản sự mất màu của lá trong tối, tăng
cường sự xâm nhập của dòng chất dinh dưỡng và thúc đẩy sự phân chia tế bào khi
nuôi cấy tế bào rời.
Ngoài ra, trong nuôi cấy môi thường sử dụng hai chất thuộc nhóm cytokinin
là BA (6-benzylaminopurin) và TDZ (1-phenyl 3-(1-2,3 thiadiazol-5 yl) urea).
Các chất thuộc nhóm cytokinin:

BAP Kinetin TDZ
6-Benzylaminopurine 6-Furfuryl aminopurine 1-phenyl-3-(1,2,3-
Thiadiazol-5-yl) urea
Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của cytokinin
c. Giberelin
Giberelin là một nhóm trong các chất ĐHST thực vật gồm hơn 80 hợp chất
khác nhau. Hoạt động của mỗi chất phụ thuộc vào khả năng di chuyển qua mô hoặc
sự biến đổi nó thành một dạng hoạt động khác.

9

Acid giberelic (GA
3
) và hỗn hợp giữa GA
3
và GA
7
là những giberelin duy nhất
có giá trị thương phẩm do chúng thường được sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật.
Mô cấy thực vật nói chung tăng trưởng và phát triển không cần thiết đến sự
hiện diện của giberelin trong môi trường nuôi cấy. Nhưng GA
3
thường được sử
dụng trong nuôi cấy tế bào có mật độ thấp.
Khi bổ sung giberelin vào môi trường nuôi cấy mô thực vật thì sẽ làm giảm
bớt hoặc ngăn cản sự tạo chồi, rễ bất định và phát sinh phôi soma.
Acid giberelic có ảnh yếu lên sự phân hóa tế bào in vitro ngoài sự tác động
của auxin. Tuy nhiên, sự tăng trưởng của chồi từ đỉnh sinh trưởng và mẫu cấy chồi
cũng có thể được tăng thêm khi bổ sung acid giberelic [4], [16].
1.1.2.5. Các chất bổ sung
Trong môi trường nuôi cấy mô, ngoài những thành phần môi trường dinh
dưỡng cơ bản còn bổ sung thêm một số yếu tố khác như:
Các hợp chất hữu cơ: trong một số môi trường nuôi cấy thường bổ sung một
số chất hữư cơ có thành phần không xác định nhằm cung cấp thêm một số chất cần
thiết cho mô phát triển. Các chất hữu cơ bổ sung có thể là nước dừa, dịch chiết nấm
men, pepton,….Nước dừa thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy chủ yếu

cung cấp myo-inositol và một số acid amin, lượng nước dừa bổ sung thường từ 10%
đến 20% thể tích môi trường.
Than hoạt tính: bổ sung than hoạt tính vào môi trường có tác dụng khử độc,
giữ ẩm. Trong môi trường nuôi cấy, than hoạt tính có vai trò hấp thụ các
polyphenol, do vậy nó có tác dụng hạn chế hiện tượng hóa nâu mẫu. Than hoạt tính
thường dùng trong môi trường nuôi cấy các loại cây Phong lan, Địa lan, Lan hài,…
với lượng dùng thường là 1g/lít môi trường.
Agar: môi trường nuôi cấy cần bổ sung agar để làm đặc môi trường. Tùy vào
môi trường nuôi cấy loại cây yêu cầu độ cứng môi trường khác nhau mà lượng agar
bổ sung dao động từ 8-15g cho một lít môi trường.
1.1.3. Những vấn đề thường gặp trong nhân giống in vitro
1.1.3.1. Tính bất định về mặt di truyền
Tính bất định về mặt di truyền là do tác động của một số chất kích thích sinh
trưởng. Tần số biến dị thường khác nhau và không lặp lại. Tần số biến dị trong nuôi



10

cấy mô sẹo thường cao hơn nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Tần số biến dị xảy ra còn
phụ thuộc vào các yếu tố:
 Kiểu di truyền hay giống cây nuôi cấy.
 Loại mô cấy.
 Số lần cấy chuyển nhiều hay ít [5].
1.1.3.2. Sự nhiễm mẫu
Do môi trường nuôi cấy có nhiều chất dinh dưỡng cho mô tế bào thực vật
phát triển thì đồng thời nó cũng là môi trường thích hợp cho các loài nấm và vi
khuẩn phát triển.
Sự nhiễm mẫu xảy ra có thể là do nồi hấp không đạt yêu cầu, yêu cầu về điều
kiện vô trùng trong phòng cấy không đảm bảo hoặc cũng có thể là do thao tác của

người nuôi cấy.
1.1.3.3. Sự hóa thủy tinh thể
Hiện tượng thủy tinh thể là một dạng bệnh lí của cây bị mất nước khi chuyển
cây từ môi trường in vitro ra môi trường ngoài.
Để hiện tượng thủy tinh thể được hạn chế ta cần phải:
 Giảm bớt sự hút nước của cây trong in vitro bằng cách tăng nồng độ đường
trong môi trường cấy hoặc dùng các chất có áp suất thẩm thấu cao.
 Tránh gây thương tổn trên mẫu cấy khi khử trùng.
 Giảm hàm lượng ethylen trong bình nuôi cấy bằng cách thông gió tốt, tăng
cường ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng cấy [5].
1.1.3.4. Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu
Thường chúng ta thấy đó là hiện tượng hóa nâu hay hóa đen mẫu. Sinh trưởng
của mẫu bị chậm lại, thậm chí hư mẫu.
Hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có chứa nhiều chất tanin hay polyphenol,
chúng có nhiều trong mô già hơn mô non.
Các phương pháp làm giảm sự hóa nâu mẫu:
 Tách các phân tử phenol ra khỏi môi trường.
 Ngăn chặn hoạt động của enzym phenolaza.
 Giảm lượng phenol có sẵn trong mẫu bằng môi trường lỏng giống môi
trường rắn.



11

 Chuẩn bị mẫu có vết cắt nhỏ.
 Gây vết thương nhỏ nhất trên mẫu khi khử trùng.
 Sử dụng mô mẫu cấy nhỏ từ mô non [5].
1.1.4. Các ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô
1.1.4.1. Ưu điểm

Phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô được sử dụng rất rộng rãi bởi có
những ưu điểm sau:
 Tạo ra số lượng lớn cây đồng nhất về mặt di truyền.
 Có thể nhân giống từ bất cứ bộ phận nào của cây.
 Khắc phục được đặc tính khó nhân giống, hệ số nhân giống thấp và tính bất
thụ ở cây trồng, rút ngắn thời gian nhân giống.
 Kiểm soát được các yếu tố gây bệnh cho cây, tạo ra các dòng cây sạch bệnh.
 Ứng dụng vào lĩnh vực di truyền nhằm tạo ra những giống mới mà phương
pháp truyền thống không làm được như: giống đơn bội, giống đa bội,…
 Là công cụ giúp bảo tồn và phát triển nguồn gen thực vật.
 Là công cụ để nghiên cứu đặc tính sinh lí thực vật.
Bên cạnh đó, việc áp dụng phương pháp nhân giống in vitro còn có những
thuận lợi như:
 Cảm ứng được sự trẻ hóa của mô, do vậy sự sinh trưởng của những cây nuôi
cấy in vitro thường mạnh hơn vì chúng đã được trẻ hóa và sạch bệnh.
 Nhân giống vô tính in vitro nhanh hơn nhân giống ex vitro.
 Một số cây bị mất khả năng sinh sản hữu tính như các cây đơn bội, cây bất
thụ đực, cây bất thụ do đột biến,… có thể được duy trì và nhân giống nhờ
phương pháp nhân giống in vitro.
 Phương pháp nhân giống in vitro đặc biệt hữu dụng để tạo ra các ngân hàng gen.
Các tế bào trần và huyền phù tế bào là đối tượng hữu dụng trong việc lai soma.
 Do cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện hoàn toàn thích hợp ( nguồn
dinh dưỡng và điều kiện môi trường) nên có thể sản xuất cây con quanh năm.
 Có thể sử dụng cây mẹ in vitro để sử dụng cho các bước nhân giống tiếp theo.
 Nuôi cấy in vitro chỉ sử dụng mẫu cấy ban đầu rất nhỏ nên có điều kiện để
chọn mẫu được kỹ càng.



12

 Các cây sạch bệnh có thể dễ dàng trao đổi với các nơi khác nhau do cây có
kích thước nhỏ và không trồng trong đất.
1.1.4.2. Nhược điểm
Bên cạnh các ưu điểm ở trên thì nhân giống in vitro còn có những nhược
điểm như:
 Việc nhân giống in vitro đòi hỏi có kỹ thuật cao, phòng nuôi cấy yêu cầu về
trang thiết bị đắt tiền, yêu cầu cao về mức độ vô trùng.
 Kiểu gen thực vật không ổn định trong một số hệ thống nuôi cấy.
 Đặc biệt đối với một số loại cây thân gỗ, việc cảm ứng rễ rất khó thực hiện.
 Việc chuyển cây từ ống nghiệm ra vườn ươm rất khó thực hiện. Cây dễ bị
héo do khí khổng hoạt động không ổn định. Cây rất dễ bị sâu bệnh tấn công,
vì vậy giá thể dùng làm môi trường sống của cây cần được xử lí cẩn thận. Tỉ
lệ sống của cây con khi chuyển ra vườn ươm rất thấp.
 Đối với một số mô, việc vô trùng mẫu trước khi đưa vào cấy rất khó thực hiện.
 Khả năng tái sinh cây có thể bị mất do việc cấy chuyền mô sẹo nhiều lần.
 Phương pháp nhân giống in vitro tốn nhiều công lao động làm giá thành của
sản phẩm tăng cao.
1.1.5. Các ứng dụng của nuôi cấy in vitro trong nghiên cứu và ứng dụng trong
nông nghiệp
1.1.5.1. Vi nhân giống
Nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro được áp dụng phổ biến
trong nông nghiệp nhờ có hệ số nhân nhanh hơn phương pháp thông thường.
Vi nhân giống được ứng dụng để:
 Phục tráng giống cây trồng bị bệnh.
 Nhân nhanh các giống cây trồng mà khả năng nhân giống thông thường
khó khăn.
 Nhân nhanh số lượng lớn các cây giống trong thời gian ngắn và đảm bảo đặc
tính di truyền của bố mẹ.

13

1.1.5.2. Sản xuất và bảo quản giống cây sạch bệnh
Nuôi cấy in vitro có khả năng sản xuất hàng loạt cây sạch bệnh từ những cây
bị nhiễm virus nhờ kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Cây sạch bệnh có khả năng
nhân nhanh, trao đổi giống và bảo quản in vitro.
1.1.5.3. Bảo quản giống in vitro
Phương thức duy nhất an toàn cho lai giống và tạo giống mới là phải có ngân
hàng giống. Giữ tập đoàn giống cho đến nay là một vấn đề nan giải cho những cây
trồng nhân vô tính hay cây đa bội. Bảo quản in vitro trong thời gian dài bằng
phương pháp sinh trưởng chậm bước đầu đã giải quyết được một phần. Hạn chế của
phương pháp này là có những biến đổi về mặt di truyền do thời gian nuôi cấy kéo
dài [5].
1.1.5.4. Biến dị tế bào soma
Cây để tái sinh in vitro từ nuôi cấy cơ quan, mô sẹo và protoplast thường có
những thay đổi về hình thái hay nói một cách khác là biến dị tế bào soma.
Những thay đổi qua nuôi cấy in vitro có thể do tình trạng sinh lí mẫu cấy, thể
bội của cây trồng, trao đổi chéo DNA, thời gian, điều kiện nuôi cấy và môi trường
nuôi cấy… Những biến dị tế bào soma thu được này có thể dẫn đến hình thành
giống mới qua chọn dòng. Phương thức chọn dòng này có thể thu ngắn một nữa thời
gian chọn giống mới.
1.1.5.5. Lai đơn bội
Cây đơn bội được tạo ra qua nuôi cấy hạt phấn và túi phấn. Cây đơn bội thể
hiện được đặc tính thuần khiết của giống, và là nguyên liệu hoàn hảo được sử dụng
trong lai giống [5].

1.2. Khái quát về cây Lan hài
1.2.1. Giới thiệu về họ Lan
Họ Lan (Orchidaceae) thuộc bộ măng tây, lớp một lá mầm, là một trong
những họ đỉnh cao của sự tiến hóa của các họ cây có hoa. Trên thế giới hiện có
khoảng 25000 đến 30000 loài hoa Lan, gồm khoảng 800 chi. Họ Lan có khu vực
phân bố vô cùng rộng lớn, từ xích đạo đến Bắc cực, từ đồng bằng cho đến các vùng
băng tuyết, song nhiều hơn cả là vùng nhiệt đới và á nhiệt đới nhất là ở Châu Á,
Châu Phi, Châu Mỹ La Tinh [1], [7].



14

Hoa Lan mọc ở nhiều nơi và được chia làm 4 loại sau đây:
 Epiphytes: Phong lan bám vào cành hay thân cây.
 Terestrials: Địa lan mọc dưới đất.
 Lithophytes: Thạch lan mọc ở các kẽ đá.
 Saprophytes: Hoại lan mọc trên lớp rêu hay gỗ mục.
1.2.2. Giới thiệu về Lan hài
Lan hài là một nhóm rất khác biệt. Chúng có thể dễ dàng nhận ra bởi cấu
trúc hoa khác thường với một cánh hoa ở giữa hình túi sâu trông giống một chiếc
hài (trong chuyên môn gọi là môi hay cánh môi) nằm ở vị trí thấp nhất của hoa,
tạo nên một vẻ bề ngoài rất đặc sắc. Và do vậy, nó trở thành tên chung của nhóm
này. Cũng như vậy, tên Latin của chi Lan hài lớn nhất, Paphiopedilum, có thể dịch
nghĩa là “chiếc hài của Paphos”. Paphos là nơi sinh của Aphrodite, vị thần của tình
yêu và cái đẹp trong thần thoại Hy Lạp (còn được gọi là thần Vệ nữ), và pedilon là
một từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là cái hài hay chiếc giày. Chiếc môi đặc sắc và hình
dạng khác thường của hoa làm cho Lan hài dễ dàng phân biệt với tất cả các loài
Lan khác.
Một số lớn các loài Lan hài và các dòng lai nhân tạo từ chúng đã được trồng

và trở thành một trong các nhóm cây cảnh phổ biến nhất tại nhiều quốc gia. Mặc dù
vậy, phần lớn các loài này đều rất hiếm gặp trong tự nhiên. Phần lớn chúng phân bố
ở các nơi sống hiểm trở không đến được như các vách đá dựng đứng tại các vùng
núi hay mỏm đá gần thác nước, hay trong tán của các cây gỗ cao. Ngoại trừ rất ít
trường hợp, các loài Lan hài là một cấu phần không thể thiếu của rừng nguyên sinh
và chúng có thể bị tuyệt chủng một cách nhanh chóng và không thể phục hồi được
khi các quần xã thực vật tự nhiên bị con người phá hủy. Vì lí do đó, có rất ít người
đã từng nhìn thấy các loài thực vật quyến rũ này tại nơi sống tự nhiên của chúng
vốn chỉ còn tồn tại ở một vài vùng rừng nguyên thủy còn sót lại.
Trong các vùng núi ở Việt Nam, nơi còn sót lại của những mảnh rừng nguyên
sinh đa dạng nhất, các loài Lan hài rất phong phú. Mặc dù là nhóm rất hiếm, tính đa
dạng của Lan hài Việt Nam cao hơn bất cứ nơi nào khác trên thế giới. Nhiều loài
của Việt Nam không chỉ rất hiếm mà còn là các loài đặc hữu hẹp, là báu vật quốc
gia có tầm quan trọng quốc tế.



15

1.2.2.1. Nguồn gốc và quan hệ họ hàng của Lan hài
Lan hài là một nhánh nhỏ nhưng nỗi bật trong quá trình tiến hóa của Lan. Họ
Lan (Orchidaceae) thể hiện một trong những dòng chuyên hóa nhất của thực vật có
hoa. Có vẻ như tất cả các loài Lan đều bắt nguồn từ tổ tiên kiểu Hypoxis có sáu
mảnh bao hoa (ba mảnh bao hoa vòng ngoài gọi là lá đài và ba mảnh bao hoa vòng
trong gọi là cánh hoa) và sáu nhị đực (ba nhị đực ở vòng ngoài và ba nhị đực ở vòng
trong). Một số xu hướng chuyên hóa về hình thái có thể quan sát được trong sự tiến
hóa và hình thành của các nhóm Lan khác nhau.
Lan hài đại diện cho một dòng tiến hóa riêng với hai nhị đực còn tồn tại trong
hoa với kiểu thích nghi tiến hóa thụ phấn nhờ côn trùng. Môi hình túi của Lan hài
giữ vai trò như một cái bẫy đối với tác nhân thụ phấn [3].

1.2.2.2. Hình thái của Lan hài
Các loài Lan hài có thể có hình dạng bên ngoài rất đa dạng. Ở đây chủ yếu
vào các loài Lan hài nhiệt đới Châu Á có phân bố tại Việt Nam, tất cả đều thuộc về
chi Paphiopedilum.
a. Dạng cây
Các loài Paphiopedilum là các loài thân cỏ có kích thước trung bình với thân
bị thu rất ngắn mang nhiều lá mọc thành hai hàng xếp hình quạt. Tất cả các loài đều
có thân rễ nhưng thường rất ngắn. Tuy nhiên, một số loài như P. malipoense và P.
micranthum lại hình thành thân rễ kéo dài liên kết rất nhiều gốc với nhau hình thành
một mạng lưới ngầm dưới đất. Đối với những loài này một dòng sinh sản vô tính
cũng có thể bao phủ tới một vài mét vuông nếu như có điều kiện sống thuận lợi [3].
b. Lá
Lá của các loài Paphiopedilum thường có dạng lá dài gấp đôi, hình trứng
ngược hay bầu dục thuôn và mở rộng. Mỗi lá có đốt ở gốc, dưới đó là bẹ lá hình chữ
V xếp lợp xít lên nhau trên thân. Mặt trên của lá có thể có màu xanh lá cây cùng
màu, hay khảm bởi các mảng xanh lá cây đậm nhạt không đều nhau với các gân lá
màu xanh lá cây thẫm nỗi rõ. Mặt dưới lá của hầu hết các loài có các đốm tím dày
đặc. Ở một số loài khác, các vệt tím xỉn chỉ thấy rõ ở phần gốc lá. Rất ít loài có mặt
dưới lá màu xanh lá cây. Đặc điểm và mật độ của vết khảm màu trên lá rất khác
nhau ở mỗi loài.



16

Mép lá non của một số loài, ví dụ ở P. malipoense có thể có lông. Lá của các
loài điển hình cho điều kiện sống khô như P. helenae và P. dianthum đều dày, mọng
nước và cứng [3].
c. Cụm hoa
Cụm hoa của các loài Paphiopedilum thường thẳng đứng hay cong. Phần lớn

các loài thường chỉ có một hoa riêng lẽ. Một số loài như P. dianthum có cụm hoa
gồm nhiều hoa, thường từ hai đến năm hoa. Một số ít loài khác thường có một hoa
trong cụm hoa, ví dụ P. delenatii và P. concolor, nhưng lại phát triển thành cụm hoa
với hai hoa trong điều kiện thuận lợi. Phần lớn các loài còn lại thường chỉ có một
hoa riêng lẻ. Trục cụm hoa của hầu hết các loài đều có lông tơ dày và ngắn.
Lá hoa của cụm hoa gập đôi và có hình dạng rất khác nhau tùy từng loại, từ
hình mũi giáo hay hình trứng và có chóp nhọn đến hình bầu dục tròn. Lá hoa
thường có ít lông tơ hơn các phần khác của cụm hoa nhưng nói chung thường có
lông ở mép và lông cứng dọc gân ở giữa mặt ngoài lá. Lá hoa nhẵn có ở loài P.
dianthum [3].
d. Hoa
Hoa của các loài Paphiopedilum có hai lá đài ở vòng ngoài: một lá đài lưng
(dorsalsepal) và một lá đài hợp (synsepal) và ba cánh hoa ở vòng trong. Lá đài lưng
thường lớn, hướng thẳng lên trên và thường nỗi bật với các vạch hay chấm ở mặt
trong. Đôi khi nó ôm lấy phía trên môi hình túi tạo thành nắp trên che cho môi khỏi
bị nước mưa chảy vào. Đối với các loài khác, nó dựng thẳng và có vai trò như một
lá cờ.
Lá đài lưng nằm đối diện với lá đài hợp ở vị trí thấp hơn và hướng xuống
phía dưới được hình thành bởi sự dính lại hoàn toàn của hai lá đài bên. Nguồn gốc
của lá đài hợp được thể hiện rõ bởi nó có hai gân chính và hai sống khum lên theo
chiều dọc ở mặt ngoài.
Lá đài hợp nằm phía sau của môi thường có một màu tối xỉn và kém nỗi bật
hơn hẳn so với lá đài lưng. Cả lá đài lưng và lá đài hợp đều thường có lông tơ dày ở
mặt ngoài.